CN113171390A - 牛大力在制备治疗肝纤维化药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从牛大力中提取得到的有效部位在制备治疗肝纤维化的药物中的用途，其特征在于：从牛大力中提取得到的有效部位是石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位中的一种或多种的组合。正丁醇部位诱导肝星状细胞发生凋亡的比率最高，强于其他部位，因此，牛大力正丁醇部位抗肝纤维化作用最强。
Description
技术领域：
本发明属于医药技术领域，进一步地属于民族医药技术领域，更具体涉及牛大力的药效学应用，即牛大力在制药用途领域的应用。
背景技术：
壮医药是壮族先民长期与疾病斗争过程中所形成的经验结晶，是壮族灿烂文化的重要组成部分，在壮民族的生息繁衍中发挥着重要作用。牛大力是我国壮医的特色药物之一，在民间常用牛大力治疗腰腿痛，风湿骨痛，肺结核，慢性肝炎和慢性胃炎。
本发明涉及的牛大力为蝶形花科植物美丽崖豆藤Millettia speciosa Champ.的干燥的根。性甘，平。有舒筋活络，补虚润肺之功效，民间用于腰腿痛，风湿痛，慢性肝炎，肺结核的治疗。现代研究发现牛大力具有保护急性肝损伤，调节免疫功能，以及镇咳平喘的作用。
从国内外研究现状和发展趋势来看，与牛大力相关报道主要集中在以下几方面：
(1)生药学方面:牛大力在民间被称为“甜牛大力”，而在市场上发现一种与牛大力相混淆的品种，习称“苦牛大力”。陈黄保对甜牛大力和苦牛大力进行生药鉴定对比研究，发现甜牛大力与苦牛大力名称虽相近，但其来源、性状、显微及成分有明显不同。
(2)药材培育方面:壮族民间还使用牛大力做药膳，市场上对牛大力的需求量大，目前野生牛大力已面临资源枯竭。王祝年等采用成熟种子为材料进行组织培养以快速繁殖牛大力，而时群等则对牛大力茎段进行组织培养，将牛大力培养过程中所出现的污染率控制在20％以内。
(3)牛大力化学成分及提取工艺方面:宗鑫凯等对牛大力的乙醇提提取物进行分离纯化，通过理化性质和波谱分析分别鉴定为：异甘草素、高丽槐素、紫檀素、美迪紫檀素、高紫檀素。国外也有报道从牛大力的根部，分离得到2种新的齐墩果烷型三萜皂苷和2个已知的紫檀烷型化合物。蔡红兵等采用超声提取牛大力多糖，并通过正交试验法确定出牛大力多糖的最佳提取工艺。
(4)药理作用研究方面：牛大力具有保护急性肝损伤、调节免疫功能作用、镇咳平喘作用。
现有技术CN103040924A公开了一种牛大力提取物及其在制备治疗骨质疏松药物中的应用。所述牛大力提取物是将牛大力的根烘干并粉碎成粉末，然后用醇(即甲醇或乙醇)回流提取，过滤提取液，减压回收尽溶剂，获得浸膏状牛大力提取物。上述有效部位可以进一步用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取获得醇提物的细分有效部位。但是没有公开其在肝纤维化中的任何作用。
现有技术CN110917238A公开了一种牛大力全成分提取物及其制备方法和应用，牛大力提取物的制备方法包括以下步骤：提供牛大力原料；将牛大力原料进行粉碎，得到牛大力粉碎物；将牛大力粉碎物与水混合并进行乳化搅切，得到牛大力匀浆液；将牛大力匀浆液进行固液分离，得到牛大力分离液和牛大力分离渣；将牛大力分离渣与醇水溶液混合，并采用低温高压差连续提取技术进行提取，得到牛大力醇溶液；牛大力分离液和牛大力醇溶液即为牛大力提取物。该现有技术同样没有涉及本申请的有效部位，也没有公开在肝纤维化中的任何作用。
现有技术CN104367759A公开了一种治疗肝硬化的药物组合物及其制备方法。该药物组合物是由如下重量份的中药原料制备而成的：黑老虎、刺桐、岗梅、黄柏、救必应、山龙眼寄生、沙梨树寄生、水榕木寄生、白背枫、牛大力、五指山参、黄脚鸡、蒲葵、草扣、小肠风、海风藤、陈皮、丹参、藿香、香附、绞股兰、石上柏。本发明药物组合物能有效缓解肝硬化患者的各种症状。该现有技术并没有给出牛大力自身具有治疗肝纤维化的作用。
为了进一步研究壮药牛大力药理作用，发明人对牛大力进行了预初实验研究，包括急性毒性实验和保肝护肝的药效实验。结果提示：牛大力水提取物的最大耐受量大于1000g/Kg，相当于人拟用日剂量110倍；醇提取物的最大而受量大于1700g/Kg，相当于人拟用日剂量的186倍。牛大力无明显毒性，常用日剂量安全。因此，迄今为止，牛大力对肝纤维化的有效部位及其抗肝纤维化的机理尚未完全确定。
肝纤维化(Hepaticfibrosis,HF)是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,是所有慢性肝病的共同病理基础。正常肝脏细胞含有肝细胞、库普弗细胞、肝窦内皮细胞、肝星形细胞(HSC)，目前,学者们普遍认为HSC是肝脏合成细胞外基质(ECM)的主要细胞,HSC的活化与增殖是肝纤维化形成的中心环节,该环节包括细胞增生并合成ECM、释放胶原酶及其抑制物等过程。研究表明,在肝纤维化恢复阶段,主要是表现为激活状态的HSC凋亡而不是表型的转化。因此，抑制HSC增殖、诱导其凋亡是抗纤维化的重要策略。(参见“肝星形细胞与肝纤维化的研究进展”，王宏宾等，青海医学院学报，第29卷，第2期，2008年)
现有技术“牛大力水提物对斑马鱼药物性肝纤维化损伤的保护作用”(周楚莹，《新中医》，2018年12月)公开了牛大力水提物对药物性肝纤维化损伤的保护作用是通过抑制肝 细胞凋亡、减少胶原纤维沉积实现的(参见摘要的结论部分)。但是，发明人经过深入研究出人意料的发现，首先牛大力水提取物事实上基本没有治疗肝纤维化作用，其不是牛大力治疗肝纤维化的有效部位；其次，牛大力正丁醇等有效部位也不是通过抑制肝细胞凋亡发挥治疗肝纤维化作用，事实正相反，牛大力正丁醇等有效部位是通过诱导肝星形细胞的凋亡，从而发挥治疗肝纤维化的作用，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种从牛大力中提取得到的有效部位在制备治疗肝纤维化的药物中的用途，其特征在于：从牛大力中提取得到的有效部位是石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位中的一种或多种的组合。
进一步地，提供一种从牛大力中提取得到的有效部位在制备治疗肝纤维化的药物中的用途，其特征在于：从牛大力中提取得到的有效部位是乙酸乙酯部位和正丁醇部位中的一种或多种的组合。
进一步地，提供一种从牛大力中提取得到的有效部位在制备治疗肝纤维化的药物中的用途，其特征在于：从牛大力中提取得到的有效部位是正丁醇部位。
进一步地，提供一种从牛大力中提取得到的有效部位在制备治疗肝纤维化的药物中的用途，其特征在于：所述从牛大力中提取得到的有效部位在制备诱导肝星状细胞发生凋亡的药物中用途。
进一步地，提供一种从牛大力中提取得到的有效部位在制备治疗肝纤维化的药物中的用途，其特征在于：石油醚部位的提取方法为取牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集石油醚萃取液，挥干石油醚后得石油醚部位。
进一步地，提供一种从牛大力中提取得到的有效部位在制备治疗肝纤维化的药物中的用途，其特征在于：乙酸乙酯部位的提取方法为取牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集乙酸乙酯萃取液，挥干乙酸乙酯后得乙酸乙酯部位。
进一步地，提供一种从牛大力中提取得到的有效部位在制备治疗肝纤维化的药物中的用途，其特征在于：正丁醇部位的提取方法为取牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集正丁醇萃取液，挥干正丁醇后得正丁醇部位。
作为可选的技术方案，本发明从牛大力中提取得到的有效部位可以作为唯一活性成分，在制备治疗肝纤维化的药物中的使用。进一步地，本发明从牛大力中提取得到的有效部位可以作为活性成分的一种，与其他活性成分一起，在制备治疗肝纤维化的药物中的使用。
显然的，在制备治疗肝纤维化的药物的过程中，可以加入本领域中常规的辅料，例如赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂等。
更进一步地，可以制备为的药物剂型为口服剂型或非口服剂型。所述口服剂型可以是片剂、胶囊剂、口服液、溶液剂、混悬剂、颗粒剂等；所述非口服剂型可以是注射剂、粉针剂、透皮吸收剂、栓剂、喷雾剂等等。也可以是靶向制剂。还可以是缓释或控释制剂。
本发明出人意料的发现，牛大力的水提取部位并不是牛大力的治疗肝纤维化的最有效部位，而石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位在治疗肝纤维化中具有显著的效果，特别是可以显著的诱导肝星状细胞的凋亡，从而逆转肝纤维化，从而发挥治疗肝纤维化的作用。它们诱导肝星状细胞的凋亡率达到了32％以上。
更加出人意料的，本发明发现，牛大力的正丁醇部位具有卓越的治疗肝纤维化的技术效果，其诱导肝星状细胞的凋亡率达到了67％以上，其显著优于石油醚部位、乙酸乙酯部位，特别是可以显著的诱导肝星状细胞的凋亡，从而逆转肝纤维化，从而发挥治疗肝纤维化的作用。
同时，本发明还发现，不同提取方法获得的正丁醇部位，其诱导肝星状细胞的凋亡的效果也存在一定的差异，所述正丁醇部位可以采用如下方法制备：取牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物。依次用水、正丁醇进行萃取，收集正丁醇萃取液，挥干正丁醇后得正丁醇部位。该正丁醇诱导肝星状细胞的凋亡率达到了57.93％。但是，最有选地，本发明出人意料的找到了最优的制备正丁醇部位的方法，所得到的正丁醇部位具有更强的诱导肝星状细胞的凋亡的效果，其具体制备方法为：取牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集正丁醇萃取液，挥干正丁醇后得正丁醇部位。该部位诱导肝星状细胞的凋亡率达到了78.36％。
具体实施方式
实施例1牛大力正丁醇部位的制备1
取牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集正丁醇萃取液，挥干正丁醇后得正丁醇部位。
实施例2牛大力正丁醇部位的制备2
取牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物。依次用水、正丁醇进行萃取，收集正丁醇萃取液，挥干正丁醇后得正丁醇部位。
实施例3牛大力乙酸乙酯部位的制备
牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集乙酸乙酯萃取液，挥干乙酸乙酯后得乙酸乙酯部位。
实施例4牛大力石油醚部位的制备
牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集石油醚萃取液，挥干石油醚后得石油醚部位。
对比例1牛大力水部位的制备
牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水进行萃取，收集水萃取液，挥干水后得水部位。
实验例：牛大力不同部位对肝星状细胞的凋亡率的影响
利用BD流式细胞仪，分别检测四个提取部位对肝星状细胞的凋亡率。具体方法是：
1.细胞样品的准备：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50μl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。
2.用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4x结合缓冲液+12ml去离子水)；
3.用1x结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1-5×10 6/ml；
4.取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5分钟；
5.加入10μl 20ug/ml的碘化丙锭溶液(PI)，并加400μl PBS，立刻进行流式检测。
6.结果
牛大力不同部位对肝星状细胞的凋亡率的影响
其中*为与对比例1组比较具有统计学显著意义P＜0.05；Δ为与实施例4组比较具有统计学显著意义P＜0.05.
从上述结果可知，对比例1组基本不具有诱导肝星状细胞的凋亡的作用。而实施例1-4均有显著的诱导肝星状细胞的凋亡的作用，并且，实施例1-2组明显优于实施例3-4组。同时，在实施例1和实施例2组之间，实施例1组更优。
可见，本发明找到了牛大力中治疗肝纤维化的主要有效部位，即正丁醇部位，其显著优于其他有效部位。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种从牛大力中提取得到的有效部位在制备治疗肝纤维化的药物中的用途，其特征在于：从牛大力中提取得到的有效部位是石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位中的一种或多种的组合。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：从牛大力中提取得到的有效部位是乙酸乙酯部位和正丁醇部位中的一种或多种的组合。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：从牛大力中提取得到的有效部位是正丁醇部位。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述从牛大力中提取得到的有效部位在制备诱导肝星状细胞发生凋亡的药物中用途。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于：石油醚部位的提取方法为取牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集石油醚萃取液，挥干石油醚后得石油醚部位。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于：乙酸乙酯部位的提取方法为取牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集乙酸乙酯萃取液，挥干乙酸乙酯后得乙酸乙酯部位。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于：正丁醇部位的提取方法为取牛大力药材粗粉，用8倍量70％乙醇浸泡30min后，加热回流提取1.5h，趁热滤过，收集滤液，滤渣继续加热回流提取2次，将3次滤液合并后，回收乙醇，浓缩后得到牛大力的乙醇提取物，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，收集正丁醇萃取液，挥干正丁醇后得正丁醇部位。
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