CN113150068B - 一种肽类化合物、其应用及含其的组合物 - Google Patents

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CN113150068B CN202110327893.0A CN202110327893A CN113150068B CN 113150068 B CN113150068 B CN 113150068B CN 202110327893 A CN202110327893 A CN 202110327893A CN 113150068 B CN113150068 B CN 113150068B
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Abstract

本发明公开了一种肽类化合物、其应用及含其的组合物。本发明提供了一种如式III所示的肽类化合物、其药学上可接受的盐，该化合物在LY2510924的基础上提高了多肽活性和稳定性。

Description

一种肽类化合物、其应用及含其的组合物
技术领域
本发明涉及一种肽类化合物、其应用及含其的组合物。
背景技术
趋化因子受体CXCR4(chemokine receptor-4)属趋化因子家族，为G蛋白偶联的7次跨膜受体蛋白(GPCR)。CXCR4在多种肿瘤细胞系和组织中表达或过表达，包括乳腺、前列腺、肺、卵巢、结肠、胰腺、肾和脑，以及非何杰金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。基质细胞衍生因子(stroma-derived factor 1,SDF-1)，亦称CXCL12，是该受体的唯一配体。CXCL12能与CXCR4的N端特异性结合，并与CXCR4的第2胞外互相作用后启动下游信号通路形成CXCL12/CXCR4生物轴，在维持胚胎发育、介导免疫及炎症反应、调控造血、HIV感染、诱导血管生成、肿瘤侵袭转移等多种生理和病理过程中发挥重要作用。(Tamamura等Mini-Reviewsin Medicinal Chemistry,2006,6,989-995)
CXCR4受体作为药物靶点研究初期集中在HIV感染，近期发现在肿瘤病理过程中也发挥着重要作用。目前CXCR4在23种不同类型肿瘤中均发现有表达，这些肿瘤包括乳腺癌、肺癌、急性髓细胞性白血病(AML)、黑色素瘤、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤、多形性成胶质细胞瘤等等。说明CXCR4受体是肿瘤细胞表达最为普遍的趋化因子受体，与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及预后密切相关，针对CXCR4靶向治疗可望成为肿瘤基因治疗研究的新热点。
AMD3100(商品名为Plerixafor octahydrochloride)是第一个批准上市的小分子CXCR4拮抗剂药物(2008年)，更精确地说是CXCR4α拮抗剂和变构CXCR7受体激动剂。AMD3100作为一种罕用药上市，用于接受干细胞骨髓移植的多发性骨髓瘤和非霍金淋巴瘤等成年肿瘤患者的干细胞动员和移植环节。AMD3100能够快速有效动员骨髓造血干细胞和间充质干细胞，抑制肿瘤细胞的生长和转移，阻断HIV-1感染T淋巴细胞的结合位点，抑制某些炎症性和免疫性疾病进展。
CTCE-9908是CXCR4受体的多肽类拮抗剂，作为孤儿药上市应用于治疗骨肉瘤。Huang等人报道CTCE-9908能有效抑制乳腺癌的生长和转移(Journal of SurgicalResearch,2009,155,231–236)。能诱发卵巢癌细胞有丝分裂突变，当与紫杉醇共用时能启到叠加的细胞毒性作用。CTCE-9908也展示了显著的在抗血管生成活性，阻止肿瘤组织生长的所必须的新生血管。
Figure BDA0002995301620000021
LY2510924是内酰胺环肽CXCR4拮抗剂，对非霍奇金淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、小细胞肺癌、结肠癌、肾癌等都。表现显著的抗肿瘤活性。LY2510924与Durvalumab联合治疗固体肿瘤的临床1期研究正在进行中。而LY2510924联合carboplatin和etoposide治疗广泛范围的小细胞肺癌的临床II研究(NCT01439568)已经结束。
与多数有机小分子药物相比，多肽类药物具有生物活性高、用药剂量小、毒副作用低和代谢终产物为氨基酸等突出特点。与大分子的蛋白质或抗体药相比分子量较小，同样具有类似蛋白质的活性，功能更显着，可化学合成，产品纯度高，质量可控，较小的肽几乎没有免疫原性，药物开发前景非常好。多肽药物的研究与开发已经成为国际上新兴的生物高科技领域，具有极大的市场潜力。
发明内容
本发明是在LY2510924的基础上以提高多肽活性和稳定性为宗旨，提供了一种肽类化合物、其应用及含其的组合物。
本发明提供了一种如式III所示的肽类化合物、其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002995301620000031
其中，
Figure BDA0002995301620000032
为S构型、R构型或它们的混合物；
n为0或1；
Z1为
Figure BDA0002995301620000033
当Z1为
Figure BDA0002995301620000034
时，Z1碳原子为S构型；
Z2为
Figure BDA0002995301620000035
当Z2为
Figure BDA0002995301620000036
时，Z2碳原子为S构型；
Z3为
Figure BDA0002995301620000037
当Z3为
Figure BDA0002995301620000038
时，Z3碳原子为S构型；
Z4为
Figure BDA0002995301620000039
Z6为H或C1～C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，又例如异丙基)；
Z7为H、C1～C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，又例如异丙基)、C3～C6环烷基(例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基，又例如环己基)、或
Figure BDA00029953016200000310
其中R2为H或C1～C4烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基，又例如甲基)；
Z5为-C(＝O)-NH-<其左端与Z4连接、或、其左端与
Figure BDA00029953016200000311
连接>、-C(＝S)-NH-<其左端与Z4连接、或、与
Figure BDA00029953016200000312
连接>、-CH2-NR1-<其左端与Z4连接，其中R1为H或苄基>、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”(所述的杂原子可至少包含N，还可只为N；所述的杂原子数可为1或2个，还可为1个；所述的亚杂环烷基的元数可为5或6元，又可为5元；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”可为“杂原子至少包含N，杂原子数为1或2个，5或6元的亚杂环烷基”，又可为“杂原子为N，杂原子数为1个，5～6元的亚杂环烷基”，还可为亚四氢吡咯基或亚四氢吡啶基；所述的亚四氢吡咯基可为
Figure BDA0002995301620000041
<其左端与Z4连接>，又可为
Figure BDA0002995301620000042
<其左端与Z4连接>；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”中与Z4连接的原子可为C原子或N原子，又可为C原子；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”中与
Figure BDA0002995301620000043
连接的原子可为C原子或N原子，又可为N原子；当所述的亚杂环烷基为五元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与
Figure BDA0002995301620000044
的连接点”可互为邻位或间位，又可互为邻位；当所述的亚杂环烷基为六元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与
Figure BDA0002995301620000045
的连接点”可互为邻位、间位或对位，又可互为邻位)、氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”(所述的“氧代”是指环上的-CH2-被-C(＝O)-取代；所述的“氧代”的个数可为一个或多个<例如2个、3个或4个>，又可为一个；所述的杂原子可至少包含N，还可只为N；所述的杂原子数可为1或2个，还可为2个；所述的亚杂环烯基的元数可为5或6元，又可为5元；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”可为“杂原子至少包含N，杂原子数为1或2个，5或6元的亚杂环烯基”，又可为“杂原子为N，杂原子数为2个，5～6元的亚杂环烯基”，还可为亚2,3-二氢咪唑基，更可为
Figure BDA0002995301620000046
<其左端与Z4连接>；所述的“氧代或未氧代的杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”中与Z4连接的原子可为C原子或N原子，又可为C原子；所述的“氧代或未氧代的杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”中与
Figure BDA0002995301620000047
连接的原子连接的原子可为C原子或N原子，又可为N原子；当所述的亚杂环烯基为五元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与
Figure BDA0002995301620000048
的连接点”可互为邻位或间位，又可互为间位；当所述的亚杂环烯基为六元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与
Figure BDA0002995301620000051
的连接点”可互为邻位、间位或对位，又可互为间位；所述的“氧代的杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”可为
Figure BDA0002995301620000052
)、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”(所述的杂原子可至少包含N，还可只为N；所述的杂原子数可为2或3个，还可为3个；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5或6元的亚杂芳基”可为“杂原子至少包含N，杂原子数为2或3个，5或6元的亚杂芳基”或“杂原子至少包含N，杂原子数为1个，5或6元的亚杂芳基”；所述的“杂原子至少包含N，杂原子数为2或3个，5～6元的亚杂芳基”可为“杂原子为N，杂原子数为2或3个，5元的亚杂芳基”，又可为亚吡唑基、亚咪唑基或亚1,2,3-三氮唑基；所述的亚吡唑基可为
Figure BDA0002995301620000053
<其左端与Z4连接>；所述的亚咪唑基可为
Figure BDA0002995301620000054
<其左端与Z4连接>；所述的亚1,2,3-三氮唑基可为
Figure BDA0002995301620000055
<其左端与Z4连接>；所述的“杂原子至少包含N，杂原子数为1个，5或6元的亚杂芳基”可为“杂原子为N，杂原子数为1个，5元的亚杂芳基”，又可为亚吡咯基；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”中与Z4连接的原子可为C原子或N原子，又可为C原子；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”中与
Figure BDA0002995301620000056
连接的原子可为C原子或N原子，又可为N原子；当所述的亚杂芳基为五元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与
Figure BDA0002995301620000057
的连接点”可互为邻位或间位，又可互为间位；当所述的亚杂芳基为六元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与
Figure BDA0002995301620000058
的连接点”可互为邻位、间位或对位，又可互为间位)；
但其不为下述化合物：
Figure BDA0002995301620000061
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的n为0。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z1、Z2、Z3和Z4中至少一个(例如1个、2个或3个)为N原子，其余均为C原子(例如
Figure BDA0002995301620000062
)。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z1、Z2、Z3和Z4中仅一个为N原子，其余均为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z1、Z2、Z3和Z4中，仅Z1为N原子，其余均为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z1、Z2、Z3和Z4中，仅Z2为N原子，其余均为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z1、Z2、Z3和Z4中，仅Z3为N原子，其余均为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z1、Z2、Z3和Z4中，仅Z4为N原子，其余均为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z5为-C(＝O)-NH-、-C(＝S)-NH-或-CH2-NR1-。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z5为-C(＝O)-NH-，其左端与Z4连接；较佳地Z4为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z5为-C(＝S)-NH-<其左端与Z4连接；较佳地Z4为C原子>。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z5为-CH2-NR1-<其左端与Z4连接；较佳地Z4为C原子>。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”、氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z5为氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z6为H。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z7为H。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z7为C3～C6环烷基。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z7为
Figure BDA0002995301620000081
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
n为0或1；
Z1为
Figure BDA0002995301620000082
当Z1
Figure BDA0002995301620000083
时，碳原子为S构型；
Z2为
Figure BDA0002995301620000084
当Z2为
Figure BDA0002995301620000085
时，Z2碳原子为S构型；
Z3为
Figure BDA0002995301620000086
当Z3为
Figure BDA0002995301620000087
时，Z3碳原子为S构型；
Z4为
Figure BDA0002995301620000088
Z5为-C(＝O)-NH-、-C(＝S)-NH-、-CH2-NR1-、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”；
Z6为H或C1～C4烷基；
Z7为H、C1～C4烷基、C3～C6环烷基或
Figure BDA0002995301620000089
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
n为0或1；
Z1为
Figure BDA00029953016200000810
当Z1
Figure BDA00029953016200000811
时，碳原子为S构型；
Z2为
Figure BDA00029953016200000812
碳原子为S构型；
Z3为
Figure BDA0002995301620000091
碳原子为S构型；
Z4为
Figure BDA0002995301620000092
Z5为-C(＝O)-NH-、-C(＝S)-NH-、-CH2-NR1-、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”；
Z6为H或C1～C4烷基；
Z7为H、C1～C4烷基、C3～C6环烷基或
Figure BDA0002995301620000093
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：n为0或1；
Z1、Z2、Z3和Z4中至少一个(例如1个、2个或3个)为N原子，其余均为C原子；较佳地Z4为N原子；
Z5为-C(＝O)-NH-、-C(＝S)-NH-、-CH2-NR1-、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”；较佳地为-C(＝O)-NH-<其左端与Z4连接>；
Z6为H或C1～C4烷基；
Z7为H、C1～C4烷基、C3～C6环烷基或
Figure BDA0002995301620000094
较佳地为C1～C4烷基。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：n为0或1；
Z1、Z2、Z3和Z4均为C原子；
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”；
Z6为H或C1～C4烷基；
Z7为H、C1～C4烷基、C3～C6环烷基或
Figure BDA0002995301620000095
较佳地为C1～C4烷基。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：n为0或1；
Z1、Z2、Z3和Z4均为C原子；
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”；
Z6为H或C1～C4烷基；
Z7为H、C1～C4烷基、C3～C6环烷基或
Figure BDA0002995301620000101
较佳地为C1～C4烷基。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：n为0或1；
Z1、Z2、Z3和Z4均为C原子；
“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”；
Z6为H或C1～C4烷基；
Z7为H、C1～C4烷基、C3～C6环烷基或
Figure BDA0002995301620000102
较佳地为C1～C4烷基。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：n为0或1；
Z1、Z2、Z3和Z4均为C原子；
Z5为-CH2-NR1-；
Z6为H或C1～C4烷基；
Z7为H、C1～C4烷基、C3～C6环烷基或
Figure BDA0002995301620000103
较佳地为C1～C4烷基。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：n为0或1；
Z1、Z2、Z3和Z4均为C原子；
Z5为-C(＝O)-NH-或-C(＝S)-NH-；-C(＝O)-NH-或-C(＝S)-NH-左端均与
Figure BDA0002995301620000104
连接；
Z6为H或C1～C4烷基；
Z7为H、C1～C4烷基、C3～C6环烷基或
Figure BDA0002995301620000105
较佳地为C1～C4烷基。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
Z1和Z2均为
Figure BDA0002995301620000106
Z3和Z4中至少一个为N原子；
Z5为-C(＝O)-NH-、-C(＝S)-NH-、-CH2-NR1-、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”；较佳地为-C(＝O)-NH-<其左端与Z4连接>；
Z6为H或C1～C4烷基；
Z7为H、C1～C4烷基、C3～C6环烷基或
Figure BDA0002995301620000111
较佳地为C1～C4烷基。
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：n为0或1；
Z1为
Figure BDA0002995301620000112
当Z1为
Figure BDA0002995301620000113
时，Z2碳原子为S构型；
Z2为
Figure BDA0002995301620000114
Z3为
Figure BDA0002995301620000115
当Z3为
Figure BDA0002995301620000116
时，Z3碳原子为S构型；
Z4为
Figure BDA0002995301620000117
当Z3为
Figure BDA0002995301620000118
时，Z3碳原子为S构型；
Z5为-C(＝O)-NH-，其左端与Z4连接；
Z6为H或C1～C4烷基；
Z7为H、C1～C4烷基、C3～C6环烷基或
Figure BDA0002995301620000119
在某一技术方案里，所述的化合物III中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：所述的化合物III为如式I所示的化合物：
Figure BDA0002995301620000121
其中，Z2为
Figure BDA0002995301620000122
当Z2为
Figure BDA0002995301620000123
时，Z2碳原子为S构型；
Z3为
Figure BDA0002995301620000124
当Z3为
Figure BDA0002995301620000125
时，Z3碳原子为S构型；
Z4为
Figure BDA0002995301620000126
Z5为-C(＝O)-NH-<其左端与Z4连接>、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”(所述的杂原子可至少包含N，还可只为N；所述的杂原子数可为1或2个，还可为1个；所述的亚杂环烷基的元数可为5或6元，又可为5元；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”可为“杂原子至少包含N，杂原子数为1或2个，5或6元的亚杂环烷基”，又可为“杂原子为N，杂原子数为1个，5～6元的亚杂环烷基”，还可为亚四氢吡咯基或亚四氢吡啶基；所述的亚四氢吡咯基可为
Figure BDA0002995301620000127
<其左端与Z4连接>，又可为
Figure BDA0002995301620000128
<其左端与Z4连接>；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”中与Z4连接的原子可为C原子或N原子，又可为C原子；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”中与手性碳原子连接的原子可为C原子或N原子，又可为N原子；当所述的亚杂环烷基为五元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与手性碳原子的连接点”可互为邻位或间位，又可互为邻位；当所述的亚杂环烷基为六元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与手性碳原子的连接点”可互为邻位、间位或对位，又可互为邻位)、氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”(所述的“氧代”是指环上的-CH2-被-C(＝O)-取代；所述的“氧代”的个数可为一个或多个<例如2个、3个或4个>，又可为一个；所述的杂原子可至少包含N，还可只为N；所述的杂原子数可为1或2个，还可为2个；所述的亚杂环烯基的元数可为5或6元，又可为5元；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”可为“杂原子至少包含N，杂原子数为1或2个，5或6元的亚杂环烯基”，又可为“杂原子为N，杂原子数为2个，5～6元的亚杂环烯基”，还可为亚2,3-二氢咪唑基，更可为
Figure BDA0002995301620000131
<其左端与Z4连接>；所述的“氧代或未氧代的杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”中与Z4连接的原子可为C原子或N原子，又可为C原子；所述的“氧代或未氧代的杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”中与手性碳原子连接的原子可为C原子或N原子，又可为N原子；当所述的亚杂环烯基为五元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与手性碳原子的连接点”可互为邻位或间位，又可互为间位；当所述的亚杂环烯基为六元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与手性碳原子的连接点”可互为邻位、间位或对位，又可互为间位；所述的“氧代的杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”可为
Figure BDA0002995301620000132
)、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”(所述的杂原子可至少包含N，还可只为N；所述的杂原子数可为2或3个，还可为3个；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5或6元的亚杂芳基”可为“杂原子至少包含N，杂原子数为2或3个，5或6元的亚杂芳基”或“杂原子至少包含N，杂原子数为1个，5或6元的亚杂芳基”；所述的“杂原子至少包含N，杂原子数为2或3个，5～6元的亚杂芳基”可为“杂原子为N，杂原子数为2或3个，5元的亚杂芳基”，又可为亚吡唑基、亚咪唑基或亚1,2,3-三氮唑基；所述的亚吡唑基可为
Figure BDA0002995301620000133
<其左端与Z4连接>；所述的亚咪唑基可为
Figure BDA0002995301620000134
<其左端与Z4连接>；所述的亚1,2,3-三氮唑基可为
Figure BDA0002995301620000135
<其左端与Z4连接>；所述的“杂原子至少包含N，杂原子数为1个，5或6元的亚杂芳基”可为“杂原子为N，杂原子数为1个，5元的亚杂芳基”，又可为亚吡咯基；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”中与Z4连接的原子可为C原子或N原子，又可为C原子；所述的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”中与手性碳原子连接的原子可为C原子或N原子，又可为N原子；当所述的亚杂芳基为五元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与手性碳原子的连接点”可互为邻位或间位，又可互为间位；当所述的亚杂芳基为六元环时，“其与Z4的连接点”、和、“其与手性碳原子的连接点”可互为邻位、间位或对位，又可互为间位)；
但其不为下述化合物：
Figure BDA0002995301620000141
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4均为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中至少一个(例如1个、2个或3个)为N原子，其余均为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中仅一个为N原子，其余均为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中，仅Z2为N原子，其余均为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中，仅Z3为N原子，其余均为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中，仅Z4为N原子，其余均为C原子。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
Z5为-C(＝O)-NH-。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”、氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
Z5为氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4均为C原子；
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”、氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4均为C原子；
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4均为C原子；
Z5为氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4均为C原子；
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中至少一个(例如1个、2个或3个)为N原子，其余均为C原子；
Z5为-C(＝O)-NH-<其左端与Z4连接>。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中至少一个(例如1个、2个或3个)为N原子，其余均为C原子；
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”、氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中至少一个(例如1个、2个或3个)为N原子，其余均为C原子；
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中至少一个(例如1个、2个或3个)为N原子，其余均为C原子；
Z5为氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中至少一个(例如1个、2个或3个)为N原子，其余均为C原子；
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中仅一个为N原子，其余均为C原子；
Z5为-C(＝O)-NH-<其左端与Z4连接>。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中仅一个为N原子，其余均为C原子；
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”、氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中仅一个为N原子，其余均为C原子；
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中仅一个为N原子，其余均为C原子；
Z5为氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
所述的Z2、Z3和Z4中仅一个为N原子，其余均为C原子；
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
Z2为
Figure BDA0002995301620000171
Z3为
Figure BDA0002995301620000172
当Z3为
Figure BDA0002995301620000173
时，Z3碳原子为S构型；
Z4为
Figure BDA0002995301620000174
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，3～7元的亚杂环烷基”、氧代或未氧代的“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～4个，5～7元的亚杂环烯基”、或者、“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。
在某一技术方案里，所述的化合物I中某些取代基的定义可如下所述，未提及的取代基的定义均如上任一方案所述：
Z2为
Figure BDA0002995301620000175
Z3为
Figure BDA0002995301620000176
当Z3为
Figure BDA0002995301620000177
时，Z3碳原子为S构型；
Z4为
Figure BDA0002995301620000178
Z5为“杂原子为N、O和S中的一种或多种，杂原子数为1～3个，5～6元的亚杂芳基”。所述的化合物I可为下列任一化合物：
Figure BDA0002995301620000181
Figure BDA0002995301620000191
Figure BDA0002995301620000201
Figure BDA0002995301620000211
Figure BDA0002995301620000221
Figure BDA0002995301620000231
Figure BDA0002995301620000241
本发明还提供了一种上述的化合物I、其药学上可接受的盐在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗和/或预防与CXCR4相关的疾病。
所述的“与CXCR4相关的疾病”可为免疫性疾病、炎症性疾病、肺纤维化、HIV感染或癌症。
所述的炎症性疾病可为类风湿性关节炎。
所述的癌症可为乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、神经母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、多发性骨髓瘤、多形性成胶质细胞瘤、骨肉瘤或白血病。所述的白血病可为急性髓细胞性白血病。所述的肺癌可为小细胞肺癌。
本发明还提供了一种上述的化合物I、其药学上可接受的盐在制备CXCR4拮抗剂中的应用。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述的化合物I、其药学上可接受的盐，以及药用辅料。
所述的“化合物I、其药学上可接受的盐”的用量为治疗有效量。
所述的药用辅料可为药物生产领域中广泛采用的那些辅料。辅料主要用于提供一个安全、稳定和功能性的药物组合物，还可以提供方法，使受试者接受给药后活性成分以所期望速率溶出，或促进受试者接受组合物给药后活性成分得到有效吸收。所述的药用辅料可以是惰性填充剂，或者提供某种功能，例如稳定该组合物的整体pH值或防止组合物活性成分的降解。所述的药用辅料可以包括下列辅料中的一种或多种：粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂、填充剂、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。
本发明的药物组合物可根据公开的内容使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋或冻干工艺。
本发明所述的药物组合物可以配制用于任何形式给药，包括注射(静脉内)、粘膜、口服(固体和液体制剂)、吸入、眼部、直肠、局部或胃肠外(输注、注射、植入、皮下、静脉内、动脉内、肌内)给药。本发明的药物组合物还可以是控释或延迟释放剂型(例如脂质体或微球)。固体口服制剂的实例包括但不限于粉末、胶囊、囊片、软胶囊剂和片剂。口服或粘膜给药的液体制剂实例包括但不限于悬浮液、乳液、酏剂和溶液。局部用制剂的实例包括但不限于乳剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、糊剂、泡沫剂、洗剂、滴剂或血清制剂。胃肠外给药的制剂实例包括但不限于注射用溶液、可以溶解或悬浮在药学上可接受载体中的干制剂、注射用悬浮液和注射用乳剂。所述的药物组合物的其它合适制剂的实例包括但不限于滴眼液和其他眼科制剂；气雾剂：如鼻腔喷雾剂或吸入剂；适于胃肠外给药的液体剂型；栓剂以及锭剂。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
术语“药学上可接受的盐”指药学上可接受的有机或无机盐。示例性酸盐包括但不限于：硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1-1-亚甲基-双(2-羟基-3-萘甲酸盐))。本发明中所用化合物可与各种氨基酸形成药学上可接受的盐。合适的碱盐包括但不限于铝盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐、锌盐、铋和二乙醇胺盐。药学上可接受的盐的综述见Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use(P.Heinrich Stahl and Camille G.Wermuth,ed.,Wiley-VCH,2002)。
术语“晶型”是指在结晶时，分子在晶格空间的排列不同而形成的一种或多种晶体结构。
术语“溶剂合物”是一种晶体形式，除活性分子以外，它还包含一种或多种融入晶体结构中的溶剂分子。溶剂合物可包括化学计量量或非化学计量量的溶剂，并且溶剂中的溶剂分子可能以有序或非有序排列的形式存在。含有非化学计量量溶剂分子的溶剂合物可能是溶剂合物至少丢失一部分(但并非全部)溶剂分子得到的。在一个特定实施例中，一种溶剂合物是一种水合物，意味着化合物的结晶形式可包括水分子。
术语“前药”是指包含生物反应官能团的化合物的衍生物，使得在生物条件下(体外或体内)，生物反应官能团可从化合物上裂解或以其他方式发生反应以提供所述化合物。通常，前药无活性，或者至少比化合物本身活性低，使得直到将所述化合物从生物反应官能团上裂解后才能发挥其活性。生物反应官能团可在生物条件下水解或氧化以提供所述化合物。例如，前药可包含可生物水解的基团，可生物水解的基团实例包括但不限于可生物水解的磷酸盐、可生物水解的酯、可生物水解的酰胺、可生物水解的碳酸酯、可生物水解的氨基甲酸酯和可生物水解的酰脲。有关前药的综述参见，例如，J.Rautio et al.,NatureReviews Drug Discovery(2008)7,255-270and Prodrugs:Challenges和Rewards(V.Stella et al.ed.,Springer,2007)。
本发明的积极进步效果在于：本发明的肽类化合物的稳定性较佳且活性较佳。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1:WY-2
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-azaGly-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(5R,10S,13S,16S,19R,22S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-10-苄基-19-(3-胍基丙基)-13-(4-羟基苄基)-16-(4-(异丙基氨基)丁基)-22-(萘-2-基甲基)-3,8,11,14,17,20,23-七氧代-1,2,4,9,12,15,18,21-八氮杂环二十三烷-5-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000261
A:Fmoc-2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-OH(WY-2-I)的制备：
(5S,11R)-11-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙基)-1-(9氢-芴-9-基)-5-(萘-2-基甲基)-3,6,9-三氧代-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-氧代羧酸
Figure BDA0002995301620000271
步骤1.(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-(叔丁氧羰基氨基)戊二酸二酯(WY-2-B)
将(R)-5-叔丁氧基-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-氧代戊酸(2g,6.59mmol)、3-溴-1-丙烯(1.6g,13.19mmol)溶于DMF(30mL)中，缓慢加入碳酸钠(1.4g,13.19mmol),室温下搅拌4小时后，加入水(100mL)，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。有机相合并，用水(50mL×4)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，所得粗产品用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝9/1)，得标题化合物(2.1g,92.80％),为无色油状液体。LCMS(ESI)[M+23]+＝367.9.
步骤2:(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-氨基戊二酸二酯(WY-2-C)
将(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-(叔丁氧基羰基氨基)戊二酸二酯(2.1g,6.11mmol)放入250mL单口瓶中,然后缓慢加入氯化氢-乙酸乙酯溶液(2M,90mL)。反应液室温搅拌1小时。然后加入乙醚(400mL)稀释，浓缩到剩100mL体积时继续加入乙醚(400mL)旋蒸到100mL体积，如此反复三次后旋干，得标题化合物(1.5g,87.88％)，为黄色油状液体。该化合物直接用于下一步反应。LCMS(ESI)[M+H]+＝244.0.
步骤3:(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-异氰酰基戊二酸二酯(WY-2-D)
将三光气(1.125g,3.79mmol)溶于无水二氯甲烷(10mL)的溶液冷却至0℃，将(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-氨基戊二酸二酯的盐酸盐(1.842g,7.58mmol)溶于无水二氯甲烷(50mL)的溶液慢慢滴加进上述溶液中，混合物在0℃下搅拌1小时。将反应混合物用三乙胺(2.301g，22.74mmol)慢慢滴加淬灭，将混合物在室温下搅拌20分钟，得到含有标题化合物(约7.58mmol)的溶液，该溶液直接用于下一步反应。LC-MS无离子流和明显产品紫外吸收。
步骤4:(S)-叔丁基-2-(2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰基)肼基碳酸酯(WY-2-F)
将(S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酸(2.5g,5.72mmol)，叔丁氧羰基肼(756mg，5.72mmol)，HATU(2.829g，7.44mmol)，HOBT(1.159g，8.58mmol)溶于二氯甲烷(100mL),慢慢加入DIPEA(2.218g，17.16mmol)。反应液在室温下搅拌4小时。将反应混合物浓缩，所得残余物用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/1)得标题化合物(3g,95.08％),为白色固体。LCMS(ESI)[M+H-100]+＝452.1.
步骤5:(S)-(9氢-芴-9-基)甲基-1-肼基-3-(萘-2-基)-1-氧代丙基-2-基-氨基甲酸酯(WY-2-G)
将(S)-叔丁基-2-(2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰基)肼基碳酸酯(3g,5.44mmol)溶于二氯甲烷(50mL),慢慢加入氯化氢-二氧六环溶液(4N,50mL),反应液在室温下搅拌2小时。将反应混合物浓缩得标题化合物(2.4g,97.72％),为白色固体。所得固体直接用于下一步反应。LCMS(ESI)[M+H]+＝452.1.
步骤6:(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-(2-((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰基)肼基羰基氨基)戊二酸二酯(WY-2-H)
将(S)-(9氢-芴-9-基)甲基-1-肼基-3-(萘-2-基)-1-氧代丙基-2-基-碳酸酯的盐酸盐(2400mg,5.32mmol)和含有(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-异氰酰基戊二酸二酯的溶液(约7.58mmol，即步骤3得到的标题化合物的溶液)溶于二氯甲烷(25mL),反应液在室温下搅拌20分钟，然后三乙胺(1.613g，15.94mmol)慢慢加入反应液中，在室温下搅拌16个小时。将该反应液浓缩，剩余物加入水(100mL)，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。有机层合并，用水(50mL×3)洗涤，将有机相旋干并用硅胶柱层析分离纯化得标题化合物(1.5g,39.12％),为白色固体。LCMS(ESI)[M+H-56]+＝665.0.
步骤7:(5S,11R)-11-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙基)-1-(9氢-芴-9-基)-5-(萘-2-基甲基)-3,6,9-三氧代-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-氧代羧酸(WY-2-I)
将(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-(2-((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰基)肼基羰基氨基)戊二酸二酯(1.400g,1.94mmol)溶于二氯甲烷(50mL)，然后缓慢加入三氟乙酸(50mL)，反应液在室温下搅拌2小时。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的三氟乙酸，将剩余物用反相柱层析分离纯化(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)得标题化合物(650mg,50.41％),为白色固体。LCMS(ESI)[M+H-]+＝665.0.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.73(s,1H),9.94(s,1H),8.07(s,1H),7.83(q,J＝22.8Hz,7H),7.36-7.62(m,,8H),7.30(t,J＝3.52Hz,1H),7.19(t,J＝9Hz,1H),6.56(d,J＝7.6Hz,1H),5.86-5.93(m,1H),5.28(d,J＝16.0Hz,1H),5.18(d,J＝8.8Hz,1H),4.35-4.54(m,3H),4.08-4.17(m,4H),3.23(d,J＝9.6Hz,1H),2.99(t,J＝11.2Hz,1H).2.39(t,J＝6.4Hz,2H),2.01-2.05(m,1H),1.80-1.86(m,1H).
B:固相合成
将2.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用20mL20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH(225mg,0.5mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应40分钟。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液20ml反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-OH(483mg,0.75mmol),HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。在该树脂中加入Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(648mg,1mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时；该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作；树脂用DMF洗涤，得到[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，依次将Lys(iPr,Boc),Tyr(tBu),Phe等氨基酸引入，得到的树脂用DMF,二氯甲烷,甲醇,甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂，四三苯基膦钯(1.16g,1mmol),1,3-二甲基巴比妥酸(390mg,2.5mmol)加入40mL无水二氯甲烷中，该反应液在氩气的保护下室温反应3小时。反应结束后用三水二乙基二硫代氨基甲酸钠的DMF溶液(2g/400mL,50mL)，DIPEA的DMF溶液(2mL/400mL,50mL)和HOBT的DMF溶液(5.4g/400mL,50mL)依次洗涤树脂，并按相同顺序，用上述三种溶液再洗涤树脂5遍。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤后加入HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol),在室温下反应1.5小时。树脂用DMF，二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-(D-Glu)]]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:82/18-72/28，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Sunfire，C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000301
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到7.8mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:596.0
HPLC洗脱时间：11.03分钟
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65,洗脱液A为0.05％TFA的水溶液，洗脱液B为0.05％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例2:WY-3
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-NMe-azaGly-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(5R,10S,13S,16S,19R,22S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-10-苄基-19-(3-胍基丙基)-13-(4-羟基苄基)-16-(4-(异丙基氨基)丁基)-1-甲基-22-(萘-2-基甲基)-3,8,11,14,17,20,23-七氧代-1,2,4,9,12,15,18,21-八氮杂环二十三烷-5-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000302
A:Fmoc-2Nal-NMe-azaGly-[D-Glu(OAll)]-OH(WY-3-I)的制备：
(5S,11R)-11-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙基)-1-(9氢-芴-9-基)-7-甲基-5-(萘-2-基甲基)-3,6,9-三氧代-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-氧代羧酸
Figure BDA0002995301620000311
步骤1.(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-(叔丁氧基羰基氨基)戊二酸二酯(WY-3-B)
将(R)-5-叔丁氧基-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-氧代戊酸(2g,6.59mmol)、3-溴1-丙烯(1.6g,13.19mmol)溶于DMF(30mL)中，缓慢加入碳酸钠(1.4g,13.19mmol),室温下搅拌4小时后，加入水(100mL)，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。有机相合并，用水(50mL×4)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，所得粗产品用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯＝9/1)，得标题化合物(2.1g,92.80％),为无色油状液体。LCMS(ESI)[M+23]+＝367.9.
步骤2:(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-氨基戊二酸二酯(WY-3-C)
将(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-(叔丁氧基羰基氨基)戊二酸二酯(2.1g,6.11mmol)放入250mL单口瓶中,然后缓慢加入氯化氢-乙酸乙酯溶液(2M,90mL)。反应液室温搅拌1小时。然后加入400mL乙醚稀释，旋蒸到剩100mL体积时继续加入400mL乙醚，旋蒸到100mL体积，如此反复三次后旋干，得标题化合物(1.5g,87.88％),为黄色油状液体，直接用于下一步反应。LCMS(ESI)[M+H]+＝244.0.
步骤3:(S)-叔丁基-2-(2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰基)-2-甲基肼基碳酸酯(WY-3-E)
将(S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酸(3.5g,8mmol),叔丁氧羰基肼(1.171g，8mmol)，HATU(3.955g，10.4mmol)，HOBT(1.622g,12mmol)溶于二氯甲烷(150mL),慢慢加入二异丙基乙胺(3.120g，24mmol)。该反应液在室温下搅拌4小时后旋干，剩余物加入水(50mL)并用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。有机层合并，用水(50mL×3)洗涤，将有机相旋干并用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝3/2)得标题化合物(4g,88.40％),为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝565.8.
步骤4:(S)-(9氢-芴-9-基)甲基-1-(1-甲基肼基)-3-(萘-2-基)-1-氧代丙基-2-基-氨基甲酸酯(WY-3-F)
将(S)-叔丁基-2-(2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰基)-2-甲基肼基碳酸酯(4g,7.07mmol)溶于二氯甲烷(100mL),慢慢加入氯化氢-二氧六环溶液(4N,100mL),反应液在室温下搅拌5小时。将反应混合物浓缩旋干，加入乙酸乙酯(20mL)和石油醚(80mL)，打浆搅拌30分钟，过滤，用60mL石油醚/乙酸乙酯混合溶液(v:v＝4/1)分三次洗涤，收集滤饼并旋干，得标题化合物(3g,91.16％),为白色固体，所得固体直接用于下一步反应。LCMS(ESI)[M+H]+＝465.7.
步骤5:(S)-(9氢-芴-9-基)甲基-1-(异氰酰基(甲基)氨基)-3-(萘-2-基)-1-氧代丙基-2-基-氨基甲酸酯(WY-3-G)
将三光气(673mg,2.27mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)的溶液冷却至0℃，将(S)-(9氢-芴-9-基)甲基-1-(1-甲基肼基)-3-(萘-2-基)-1-氧代丙基-2-基-氨基甲酸酯的盐酸盐(2.29g,4.54mmol)溶于无水二氯甲烷(30mL)的溶液慢慢滴加进上述溶液中，得到的混合物在0℃下搅拌3小时。将反应混合物用三乙胺(1.377g，13.608mmol)慢慢滴加淬灭，将混合物在室温下搅拌20分钟，得到含有标题化合物(约4.54mmol)的溶液，该溶液直接用于下一步反应。LCMS(ESI)[M+H]+＝491.8.
步骤6:(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-(2-((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰基)-2-甲基肼基羰基氨基)戊二酸二酯(WY-3-H)
将(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-氨基戊二酸二酯的盐酸盐(1.267g,4.54mmol)和(S)-(9氢-芴-9-基)甲基-1-(异氰酰基(甲基)氨基)-3-(萘-2-基)-1-氧代丙基-2-基-氨基甲酸酯(WY-3-G)(约4.54mol，即步骤5得到的标题化合物的溶液)溶于二氯甲烷(50mL)，反应液在室温下搅拌20分钟，然后三乙胺(1.377g，13.61mmol)慢慢加入反应液中，该反应液在室温下搅拌16个小时。将反应液浓缩，剩余物加入水(100mL)，用乙酸乙酯(100mL×3)提取。有机层合并，用水(50mL×3)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，剩余物用硅胶柱层析分离纯化得标题化合物(1.6g,48％),为白色固体。LCMS(ESI)[M+23]+＝757.0.
步骤7:(5S,11R)-11-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙基)-1-(9氢-芴-9-基)-7-甲基-5-(萘-2-基甲基)-3,6,9-三氧代-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-氧代羧酸(WY-3-I)
将(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-(2-((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰基)-2-甲基肼基羰基氨基)戊二酸二酯(1550mg,2.11mmol)溶于二氯甲烷(50mL),然后缓慢加入三氟乙酸(50mL)，反应液在室温下搅拌2h。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的三氟乙酸，将混合物用反相柱分离纯化(C18柱，洗脱剂：含0.1％三氟乙酸的乙腈/水体系)得标题化合物(780mg,54.47％),为白色固体。LCMS(ESI)[M+H-]+＝678.7。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.73(s,1H),8.76(s,1H),7.72-7.86(m,7H),7.60(q,J＝15.2Hz,2H),7.20-7.46(m,,7H),7.15(d,J＝7.2Hz,1H),5.78(s,1H),5.19(t,J＝17.6Hz,2H),4.87(s,1H),4.21-4.40(m,3H),4.07(s,3H),3.16(s,1H),3.08(s,3H),2.78(s,1H),2.41(s,2H).1.97(d,J＝24.8Hz,2H).
B:固相合成
将2.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用20mL20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH(225mg,0.5mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应40分钟。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液20mL反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-2Nal-NMe-azaGly-[D-Glu(OAll)]-OH(400mg,0.75mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到2Nal-NMe-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。在该树脂中加入Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(648mg,1mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时；该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作；树脂用DMF洗涤，得到[D-Arg(Pbf)]-2Nal-NMe-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，依次将Lys(iPr,Boc),Tyr(tBu),Phe等氨基酸引入，得到的树脂用DMF,二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-NMe-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂，四三苯基膦钯(1.16g,1mmol),1,3-二甲基巴比妥酸(390mg,2.5mmol)加入80mL无水二氯甲烷中，该反应液在氩气的保护下室温反应3小时。反应结束后用三水二乙基二硫代氨基甲酸钠的DMF溶液(2g/400mL,50mL)，DIPEA的DMF溶液(2mL/400mL,50mL)和HOBT的DMF溶液(5.4g/400mL,50mL)依次洗涤树脂，并按相同顺序，用上述三种溶液再洗涤树脂5遍。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤后加入HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol),在室温下反应1.5小时。树脂用DMF，二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-NMe-azaGly-(D-Glu)]-Lys(iPr,Boc)-Rink AmideMBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:84/16-74/26，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Sunfire，C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000341
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到3.7mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:603.0
HPLC洗脱时间：10.73分钟
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65,洗脱液A为0.05％TFA的水溶液，洗脱液B为0.05％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例3:WY-4
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-Amtp]]-Lys(iPr)-NH2
(2R,7S,10S,13S,16R,19S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-7-苄基-16-(3-胍基丙基)-10-(4-羟基苄基)-13-(4-(异丙基氨基)丁基)-19-(萘-2-基甲基)-5,8,11,14,17,20-六氧代-1,6,9,12,15,18,21,24,25-九氮杂双环[21.2.1]二十六烷23(26),24-二烯-2-甲酰胺
Amtp＝(R)-2-(4-(aminomethyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)pentanedioic acid
Figure BDA0002995301620000342
A:Fmoc-2Nal-Amtp-OH(WY-4-G)的制备：
(R)-2-(4-(((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰胺基)甲基)-1氢-1,2,3-三氮唑-1-基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸:
Figure BDA0002995301620000351
步骤1.(R)-4-叠氮基-5-叔丁氧基-5-氧代丁酸(WY-4-B)
将(R)-4-氨基-5-叔丁氧基-5-氧代丁酸(1g,4.9mmol)、1氢-咪唑-1-磺酰基叠氮盐酸盐(1.55g,7.4mmol)、五水硫酸铜(246mg,1mmol)和碳酸钾(2.72g,19.7mmol)加入甲醇(400mL)中，形成的混合物在室温下搅拌过夜。然后减压除去溶剂，用0.5N盐酸将pH值调到2。得到的混合物用乙酸乙酯(3×200mL)提取。有机层合并，用饱和食盐水(200mL)洗涤，硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，得到标题混合物(1.2g,89％)，为无色油状物。LCMS(ESI)[M+Na]+＝251.9.
步骤2.(S)-(9氢-芴-9-基)甲基-3-(萘-2-基)-1-氧代-1-(丙-2-炔基氨基)丙基-2-基-氨基甲酸酯(WY-4-D)
将(S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基胺基)-3-(萘-2-基)丙酸(3g,6.9mmol)、丙炔胺(0.76g,13.7mmol)、HATU(2.87g,7.6mmol)和DIPEA(1.77g,13.7mmol)加入二氯甲烷(100mL)中，得到的混合物在室温下搅拌过夜。然后反应液过滤，滤液用饱和食盐水(20mL)洗涤，硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，得到标题混合物(2.3g,71％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝475.2.
步骤3.(R)-4-(4-(((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)甲酰胺基)-3-(萘-2-基)丙酰胺基)甲基)-1氢-1,2,3-三氮唑-1-基)-5-叔丁氧基-5-氧代丙酸(WY-4-E)
将(S)-(9氢-芴-9-基)甲-3-(萘-2-基)-1-氧代-1-(丙基-2-炔基胺基)丙基-2-基-氨基甲酸酯(2.69g,5.7mmol)、(R)-4-叠氮-5-叔丁氧基-5-氧代戊酸(1.3g,5.7mmol)、五水硫酸铜(284mg,1.1mmol)和抗坏血酸钠(450mg,2.3mmol)加入二甲基亚砜(60mL)和水(10mL)中，得到的混合物室温搅拌过夜。该混合物用0.5N的盐酸水溶液调节pH至2，并用乙酸乙酯(500mL)萃取。乙酸乙酯层用饱和食盐水(5×150mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝20/1)。纯化后得到标题化合物(2.1g,53％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝704.0.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.32(s,1H)；8.64(s,1H)；7.95(s,1H)；7.86-7.74(m,7H)；7.59(q,J＝7.1Hz,2H)；7.05-7.45(m,3H)；7.37(q,J＝8Hz,2H)；7.24(t,J＝7.4Hz,1H)；7.15(t,J＝7.4Hz,1H)；5.37(q,J＝5.1Hz,1H)；4.39-4.34(m,3H)；4.13-4.00(m,3H)；3.16(dd,J1＝13.4Hz,J2＝4Hz,1H)；3.01-2.95(m,1H)；2.42-2.05(m,4H)；1.38(s,9H).
步骤4.(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-(4-(((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基胺基)-3-(萘-2-基)丙酰胺基)甲基)-1氢-1,2,3-三唑-1-基)戊二酸二酯(WY-4-F)
将(R)-4-(4-(((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰胺基)甲基)-1氢-1,2,3-三唑-1-基)-5-叔丁氧基-5-氧代戊酸(1.3g,1.8mmol)、3-溴丙基-1-烯(448mg,3.7mmol)和碳酸钠(588mg,5.5mmol)加入DMF(30mL)中，得到的混合物室温搅拌3小时。反应液用乙酸乙酯(400mL)稀释，再分别用水(3×100mL)和饱和食盐水(2×100mL)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，得到的剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯＝2/3)。得到标题化合物(1.3g,95％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝744.4.
步骤5.(R)-2-(4-(((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰胺基)甲基)-1氢-1,2,3-三氮唑-1-基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸.(WY-4-G)
将(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-(4-(((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(萘-2-基)丙酰胺基)甲基)-1氢-1,2,3-三唑-1-基)戊二酸二酯(1.28g,1.7mmol)加入二氯甲烷(20mL)和三氟乙酸(20mL)中，得到的混合物室温搅拌6小时。该混合物浓缩，得到标题化合物(1.15g,97％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝688.0.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.85(s,1H)；8.63(t,J＝5.0Hz,1H)；7.96(s,1H)；7.86-7.73(m,7H)；7.60(q,J＝6.9Hz,2H)；7.51-7.45(m,3H)；7.40-7.34(m,2H)；7.24(t,J＝7.4Hz,1H)；7.15(t,J＝7.4Hz,1H)；5.90-5.83(m,1H)；8.42-8.38(m,1H)；5.28-5.16(m,2H)；4.51-4.50(m,2H)；4.40-4.35(m,3H)；4.13-4.08(m,3H)；3.19-3.15(m,1H)；3.01-2.95(m,1H)；2.51-2.46(m,1H)；2.37-2.26(m,2H)；2.22-2.15(m,1H).
B:固相合成
将2.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用20mL20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH(225mg,0.5mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应40分钟。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液20mL反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-2Nal-Amtp-OH(400mg,0.75mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到2Nal-Amtp-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。在该树脂中加入Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(648mg,1mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时；该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作；树脂用DMF洗涤，得到[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Amtp-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，依次将Lys(iPr,Boc),Tyr(tBu),Phe等氨基酸引入，得到的树脂用DMF,二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Amtp-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂，四三苯基膦钯(1.16g,1mmol),1,3-二甲基巴比妥酸(390mg,2.5mmol)加入80mL无水二氯甲烷中，该反应液在氩气的保护下室温反应3小时。反应结束后用三水二乙基二硫代氨基甲酸钠的DMF溶液(2g/400mL,50mL)，DIPEA的DMF溶液(2mL/400mL,50mL)和HOBT的DMF溶液(5.4g/40 0mL,50mL)依次洗涤树脂，并按相同顺序，用上述三种溶液再洗涤树脂5遍。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤后加入HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol),在室温下反应1.5小时。树脂用DMF，二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Amtp]]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:76/24-72/28，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Sunfire，C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000371
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到7.6mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:607.5
HPLC洗脱时间：10.66分钟
柱：SunFire C18,4.6×150mm,3.5um
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65,洗脱液A为0.01％TFA的水溶液，洗脱液B为0.01％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例4:WY-6
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-aza2Nal-Gly-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(8R,13S,16S,19S,22R)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-13-苄基-22-(3-胍基丙基)-16-(4-羟基苄基)-19-(4-(异丙基氨基)丁基)-2-(萘-2-基甲基)-3,6,11,14,17,20,23-七氧代-1,2,4-,7,12,15,18,21-八氮杂环二十三烷-8-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000381
A.Fmoc-[D-Arg(Pbf)]-aza2Nal-Gly-OH(WY-6-F)的制备:
(R)-1-(9氢-芴-9-基)-8-(萘-2-基甲基)-3,6,9-三氧代-5-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-氧代羧酸.
Figure BDA0002995301620000382
步骤1.叔丁基-2-(萘-2-基甲基)肼基碳酸酯(WY-6-B).
将2-萘甲醛(5g,32mmol)和叔丁基肼基碳酸酯(4.23g,3mmol)加入乙醇(200mL)中，混合物加热回流6小时。该混合物浓缩后溶于四氢呋喃(200mL)，再加入氢氧化钯-碳(20％，2g)，然后连接氢气发生器。该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌16小时。反应液过滤，滤液浓缩，得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯＝5/1)，得到标题化合物(6.9g,79％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+Na]+＝295.0.
步骤2.叔丁基-2-(2-(苄氧基)-2-氧代乙基氨基甲酰基)-2-(萘-2-基甲基)肼基碳酸酯(WY-6-C)
三光气(2.46g,8.3mmol)溶于二氯甲烷(50mL)的溶液冷却至0℃，上述溶液中加入苄基-2-氨基乙酸酯盐酸盐(3.34g,16.5mmol)和三乙胺(1.11g,11mmol)溶于二氯甲烷(60mL)的溶液，得到的混合物在0℃下搅拌2小时。然后在该混合物中加入三乙胺(7.24g,71.7mmol)，在0℃下搅拌30分钟。之后，加入叔丁基-2-(萘-2-基甲基)肼基碳酸酯(3g,11mmol)，得到的混合物室温搅拌过夜。在该混合物中加入饱和碳酸氢钠(200mL)，用二氯甲烷(3×200mL)萃取。有机层合并，用饱和食盐水(200mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。滤液浓缩，得到的剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯＝3/1)，得到标题化合物(4.7g,92％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+Na]+＝486.1.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.7(s,1H)；7.90-7.84(m,3H)；7.74(s,1H)；7.52-7.42(m,3H)；6.92(s,1H)；4.67(s,2H)；6.38(s,2H)；1.42(s,9H)；1.34(s,9H).
步骤3.苄基-2-(1-(萘-2-基甲基)肼基羰基氨基)乙酸酯(WY-6-D).
叔丁基-2-(2-(苄氧基)-2-氧代乙基氨基甲酰基)-2-(萘-2-基甲基)肼基碳酸酯(2.5g,5.4mmol)溶于六氟异丙醇(30mL)的混合物微波加热至100℃并反应1小时。得到的混合物浓缩，得到标题化合物的粗品(2g,91％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝364.1.
步骤4.(R)-苄基-1-(9氢-芴-9-基)-8-(萘-2-基甲基)-3,6,9-三氧代-5-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-羧酸酯(WY-6-E).
苄基-2-(1-(萘-2-基甲基)肼基羰基氨基)乙酸酯(1.9g,5.2mmol)，Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(5.09g,7.5mmol)和吡啶(5mL)溶于二氯甲烷(40mL)的溶液冷却至0℃，将三氯氧磷(1.6g,10.5mmol)加至上述溶液中，得到的反应液在0℃下搅拌2小时。得到的混合物浓缩，剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/乙酸乙酯＝2/3)。得到标题化合物(3.3g,63％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝994.4.
步骤5.Fmoc-[D-Arg(Pbf)]-aza2Nal-Gly-OH(WY-6-F)
(R)-1-(9氢-芴-9-基)-8-(萘-2-基甲基)-3,6,9-三氧代-5-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-氧代羧酸
将(R)-苄基-1-(9氢-芴-9-基)-8-(萘-2-基甲基)-3,6,9-三氧代-5-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-羧酸酯(3.3g,3.3mmol)和钯-碳(10％,1g)加入甲醇(100mL)中，再将该混合物连接氢气发生器。将该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌6小时。反应液过滤，滤液浓缩，得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)。得到标题化合物(1.7g,57％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝904.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.24(s,1H)；7.90-7.65(m,10H)；7.46-7.30(m,8H)；7.15-6.90(m,1H)；6.72-6.57(m,2H)；4.31-4.17(m,3H)；3.92-3.88(m,1H)；3.62-3.50(m,2H)；2.97-2.86(m,4H)；2.51-2.49(m,2H)；2.49(s,3H)；2.42(s,3H)；1.99(s,3H)；1.68 1.52(m,2H)；1.38-1.34(m,8H).
B.固相合成
将2.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用20mL20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH(255mg,0.5mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应40分钟。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液20ml反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-[D-Glu(OAll)]-OH 410mg,0.75mmol),HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。在该树脂中加入Fmoc-[D-Arg(Pbf)]-aza2Nal-Gly-OH(677mg,1mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时；该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作；树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-[D-Arg(Pbf)]-aza2Nal-Gly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-RinkAmide MBHA树脂。以类似的方式，依次将Lys(iPr,Boc),Tyr(tBu),Phe等氨基酸引入，得到的树脂用DMF,二氯甲烷,甲醇,甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-aza2Nal-Gly-OH-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂，四三苯基膦钯(1.16g,1mmol),1,3-二甲基巴比妥酸(390mg,2.5mmol)加入40mL无水二氯甲烷中，该反应液在氩气的保护下室温反应3小时。反应结束后用三水二乙基二硫代氨基甲酸钠的DMF溶液(2g/400mL,50mL)，DIPEA的DMF溶液(2mL/400mL,50mL)和HOBT的DMF溶液(5.4g/400mL,50mL)依次洗涤树脂，并按相同顺序，用上述三种溶液再洗涤树脂5遍。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤后加入HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol),在室温下反应1.5小时。树脂用DMF，二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-aza2Nal-Gly-(D-Glu)]]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:78/22-74/26，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xbridge BEH peptide,C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000411
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到27.9mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:596.1
HPLC洗脱时间：12.89分钟
洗脱条件：C
柱：XBridge Peptide BEH column C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65,洗脱液A为0.01％TFA的水溶液，洗脱液B为0.01％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例5.WY-7
[cyclo side[Phe-Tyr-azaLys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-Gly-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(5R,8S,14R,19S,22S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-19-苄基-5-(3-胍基丙基)-22-(4-羟基苄基)-2-(4-(异丙基氨基)丁基)-8-(萘-2-基甲基)-3,6,9,12,17,20,23-七氧代-1,2,4,7,10,13,18,21-八氮杂环二十三烷-14甲酰胺
Figure BDA0002995301620000412
A.Fmoc-Tyr(tBu)-azaLys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-OH(WY-7-M)的制备：
(5S,11R)-5-(4-叔丁氧苄基)-8-(4-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)丁基)-1-(9氢-芴-9-基)-3,6,9-三氧代-11-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-氧代羧酸.
Figure BDA0002995301620000421
步骤1.(R)-苄基-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)戊酸酯(WY-7-B).
将Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(5g,7.7mmol),苄溴(1.58g,9.3mmol)和碳酸钠(1.64g,15.4mmol)加入DMF(50mL)中，得到的混合物室温搅拌16小时。上述混合物中加入乙酸乙酯(300mL),然后用饱和食盐水(5×100mL)洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩。得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯＝2/1)，得到标题化合物(5.6g,98％)，为无色油状物。LCMS(ESI)[M+H]+＝739.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；7.84(d,J＝8.0Hz,1H)；7.70(d,J＝7.2Hz,2H)；7.41(t,J＝7.4Hz,2H)；7.35-7.30(m,8H)；6.66(s,1H)；6.43(s,1H)；5.09(s,2H)；4.32-4.26(m,2H)；4.21(t,J＝6.8Hz,1H)；4.10-4.06(m,1H)；3.06-2.99(m,2H)；2.92(s,2H)；2.48(s,3H)；2.42(s,3H)；1.99(s,3H)；1.75-1.70(m,1H)；1.62-1.57(m,1H)；1.44(s,2H)；1.38(s,6H).
步骤2.(R)-苄基-2-氨基-5-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)戊酸酯(WY-7-C).
将(R)-苄基-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)戊酸酯(5.6g,7.6mmol)加入二氯甲烷(50mL)和二乙胺(50mL)中，得到的混合物室温搅拌1小时。混合物浓缩，得到的剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到标题化合物(3.8g,97％)，为棕色油状物。LCMS(ESI)[M+H]+＝517.3.
步骤3.4-(异丙氨基)-丁烷-1-醇(WY-7-E).
将4-氨基丁烷-1-醇(10g,112mmol),丙酮(9.78g,169mmol)和醋酸(0.5mL)加入甲醇(100mL)中，得到的混合物室温搅拌3小时。在上述反应液中加入氰基硼氢化钠(10.6g,169mmol)，继续室温搅拌6小时。生成的混合物浓缩得到标题化合物的粗品(25g,80％)，为无色油状物，粗品不纯化直接用于下一步。LCMS(ESI)[M+H]+＝132.1.
步骤4.叔丁基-4-羟基丁基(异丙基)氨基甲酸酯(WY-7-F).
将4-(异丙基氨基)丁烷-1-醇(14.5g,110.7mmol),二碳酸二叔丁酯(36.2g,166mmol)和三乙胺(33.5g,332mmol)加入二氯甲烷(1000mL)中，得到的混合物室温搅拌过夜。生成的混合物浓缩，用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯＝4/1)，得到标题化合物(20.5g,80％)，为无色油状物。LCMS(ESI)[M+Na]+＝254.1.
步骤5.叔丁基-异丙基-(4-氧代丁基)氨基甲酸酯(WY-7-G).
一个干燥的三口瓶中加入干燥的二氯甲烷(40mL),用干冰-丙酮浴冷却至-78℃，然后依次滴加入草酰氯(4.12g,32mmol)和二甲基亚砜(5.06g,65mmol)。反应液保持在-78℃，搅拌1小时，然后滴加入叔丁基-4-羟基丁基(异丙基)氨基甲酸酯(5g,22mmol)溶于干燥二氯甲烷(20mL)的溶液。反应液继续在-78℃反应1.5小时，之后加入三乙胺(15.3g,152mmol)，反应液升至室温，搅拌30分钟。在反应液中加入水(100mL)，用二氯甲烷(3×200mL)萃取。有机层合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，得到标题化合物的粗品(5.3g,92％)，为无色油状物。粗品不纯化，直接用于下一步。LCMS(ESI)[M+Na]+＝252.0.
步骤6.苄基-2-(4-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)丁基)肼基碳酸酯(WY-7-H).
将叔丁基-异丙基(4-氧代丁基)氨基甲酸酯(5g,21.8mmol),苄基肼基碳酸酯(7.25g,43.7mmol)和乙酸(1mL)加入甲醇(50mL)中，得到的混合物室温搅拌16小时。在上述反应液中加入氰基硼氢化钠(2.75g,43.7mmol)，继续室温搅拌1小时。生成的混合物浓缩，用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯＝3/1)，得到标题化合物(5.7g,69％)，为无色油状物。LCMS(ESI)[M+H]+＝380.3.
步骤7.(R)-苄-5-(苄氧羰基氨基)-10-异丙基-13,13-二甲基-4,11-二氧代-2-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-12-氧杂-3,5,10-三氮杂十四烷-1-羧酸酯(WY-7-I).
三光气(1.1g,3.7mmol)溶于二氯甲烷(40mL)的溶液冷却至0℃，在该溶液中滴加入(R)-苄基-2-氨基-5-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)戊酸酯(3.8g,7.4mmol)溶于二氯甲烷(20mL)的溶液，反应液0℃搅拌1.5小时。然后加入苄基-2-(4-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)丁基)肼基碳酸酯(4.19g,11mmol)，反应液室温搅拌2小时。反应液中加入水(200mL)，用二氯甲烷(3×200mL)萃取。有机层合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：二氯甲烷/乙酸乙酯＝1/1)。得到标题化合物(4.76g,70％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝922.5.
步骤8.(R)-5-氨基-10-异丙基-13,13-二甲基-4,11-二氧代-2-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-12-氧杂-3,5,10-三氮杂十四烷-1-氧代羧酸(WY-7-J).
将(R)-苄基-5-(苄氧羰基氨基)-10-异丙基-13,13-二甲基-4,11-二氧代-2-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-12-氧杂-3,5,10-三氮杂十四烷-1-羧酸酯(4.5g,4.9mmol)和钯-碳(10％,1.5g)加入四氢呋喃(100mL)中，然后连接氢气发生器。该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌3小时。反应液过滤，滤液浓缩，得到标题化合物的粗品(3.4g,99％)，为白色固体，粗品不纯化，直接用于下一步。LCMS(ESI)[M+H]+＝698.4.
步骤9.(5R)-甲基-氨基-10-异丙基-13,13-二甲基-4,11-二氧代-2-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-12-氧杂-3,5,10-三氮杂十四烷-1-1-羧酸酯(WY-7-K).
0℃时，将(三乙基硅)重氮甲烷(2.0M，正己烷溶液,2.95mL,5.9mol)慢慢加至(R)-5-氨基-10-异丙基-13,13-二甲基-4,11-二氧代-2-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-12-氧杂-3,5,10-三氮杂十四烷-1-氧代羧酸(3.4g,4.9mmol)溶于二氯甲烷(40mL)和甲醇(8mL)的溶液中。反应液在0℃搅拌1小时。然后在反应液中加入乙酸(1mL)，升至室温，搅拌15分钟。得到的混合物浓缩，用反相柱层析纯化(C18柱，洗脱剂：0-75％乙腈/水，水中含有10mM碳酸氢铵)。得到标题化合物(3.3g,95％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝712.3.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.87(d,J＝8.4Hz,1H)；6.70(s,1H)；6.40(s,2H)；4.46(s,2H)；4.13-4.06(m,1H)；3.60(s,3H)；3.36-3.31(m,2H)；3.05-2.99(m,4H)；2.96(s,2H)；2.47(s,3H)；2.42(s,3H)；2.01(s,3H)；1.69-1.52(m,2H)；1.48-1.23(m,22H)；1.05(d,J＝6.0Hz,6H).
步骤10.(5S,11R)-甲基-5-(4-叔丁氧苄基)-8-(4-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)丁基)-1-(9氢-芴-9-基)-3,6,9-三氧代-11-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-羧酸酯(WY-7-L).
将(5R)-甲基-5-氨基-10-异丙基-13,13-二甲基-4,11-二氧代-2-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-12-氧杂-3,5,10-三氮杂十四烷-1-羧酸酯(3.3g,4.6mmol),Fmoc-Tyr(tBu)-OH(2.77g,6.0mmol)和吡啶(5mL)溶于二氯甲烷(60mL)的溶液冷却至0℃，在该溶液中加入三氯氧磷(1.42g,9.3mmol),反应液在0℃下搅拌1.5小时。反应液浓缩，用反相柱层析纯化(C18柱，洗脱剂：0-90％乙腈/水，水中含0.01％三氟乙酸)。得到标题化合物(4g,75％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝1153.6.
步骤11.Fmoc-Tyr(tBu)-azaLys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-OH(WY-7-M).
(5S,11R)-5-(4-叔丁氧苄基)-8-(4-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)丁基)-1-(9氢-芴-9-基)-3,6,9-三氧代-11-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-氧代羧酸
将(5S,11R)-甲基-5-(4-叔丁氧苄基)-8-(4-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)丁基)-1-(9氢-芴-9-基)-3,6,9-三氧代-11-(3-(3-(2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-基磺酰基)胍基)丙基)-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-羧酸酯(4.0g,3.5mmol)和一水合氢氧化锂(583mg,13.9mmol)加入水(50mL)和四氢呋喃(50mL)中，得到的混合物室温搅拌2小时，然后减压除去四氢呋喃。用0.5N的盐酸将反应液pH值调至4，加入1,4-二氧六环(50mL)，再加入(9氢-芴-9-基)甲基-2,5-二氧代吡咯烷-1-羧酸酯(1.4g,4.2mmol)和碳酸钠(736mg,6.9mmol)。反应液室温搅拌过夜。用0.5N盐酸将上述反应液pH值调至3-4，再用乙酸乙酯(3×300mL)萃取。有机层合并，用饱和食盐水(200mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩。得到的粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯＝1/10)，得到标题化合物(2.8g,71％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝1139.6.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.38(s,1H)；10.12(s,1H)；7.98(s,1H)；7.88(d,J＝7.6Hz,2H)；7.64(q,J＝10.8Hz,2H)；7.41(t,J＝7.4Hz,2H)；7.31(t,J＝7.4Hz,2H)；7.16(d,J＝7.6Hz,2H)；6.85(d,J＝8.0Hz,2H)；6.67(s,1H)；6.44(s,2H)；4.23-3.99(m,7H)；3.02-2.84(m,9H)；2.46(s,3H)；2.40(s,3H)；1.96(s,3H)；1.77-1.71(m,1H)；1.60-0.97(m,38H).
B.固相合成
将2.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用20mL20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH(255mg,0.5mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应40分钟。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液20ml反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-[D-Glu(OAll)]-OH 410mg,0.75mmol),HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，依次将Gly和2Nal两个氨基酸引入，得到2Nal-Gly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。在该树脂中加入Fmoc-Tyr(tBu)-azaLys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-OH(853mg,0.75mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mLDMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时；该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作；树脂用DMF洗涤，得到Tyr(tBu)-azaLys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Gly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，将Phe氨基酸引入，得到的树脂用DMF,二氯甲烷,甲醇,甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-azaLys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Gly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂，四三苯基膦钯(1.16g,1mmol),1,3-二甲基巴比妥酸(390mg,2.5mmol)加入40mL无水二氯甲烷中，该反应液在氩气的保护下室温反应3小时。反应结束后用三水二乙基二硫代氨基甲酸钠的DMF溶液(2g/400mL,50mL)，DIPEA的DMF溶液(2mL/400mL,50mL)和HOBT的DMF溶液(5.4g/400mL,50mL)依次洗涤树脂，并按相同顺序，用上述三种溶液再洗涤树脂5遍。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤后加入HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol),在室温下反应1.5小时。树脂用DMF，二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到环化后的树脂cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-azaLys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Gly-[D-Glu(OAll)]]-Lys(iPr,Boc)-Rink AmideMBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:78/22-68/32，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xtimate C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000461
柱(20mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到31.0mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:596.0
HPLC洗脱时间：12.39分钟
洗脱条件：C
柱：XBridge Peptide BEH column C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65,洗脱液A为0.01％TFA的水溶液，洗脱液B为0.01％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例6：WY-8
[cyclo side[Phe-azaTyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-Gly-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(5S,8R,11S,17R,22S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-22-苄基-8-(3-胍基丙基)-2-(4-羟基苄基)-5-(4-(异丙基氨基)丁基)-11-(萘-2-基甲基)-3,6,9,12,15,20,23-七氧代-1,2,4-,7,10,13,16,21-八氮杂环二十三烷-17-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000471
A.Fmoc-Phe-azaTyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-OH(WY-8-J)的制备
(5S,11S)-5-苄基-8-(4-叔丁氧苄基)-11-(4-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)丁基)-1-(9氢-芴-9-基)-3,6,9-三氧代-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-氧代羧酸
Figure BDA0002995301620000481
步骤1:(S)-苄基-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)-己酸酯(WY-8-B):
将(S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)己酸(5g,9.79mmol)、苄溴(2.512g,14.685mmol)溶于DMF(100mL)中，缓慢加入碳酸钠(2.075g,19.58mmol)。反应液在室温下搅拌2小时，加入水(100mL)，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。有机相合并，用水(100mL×4)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到的剩余物用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝7/3)，得标题化合物(4.6g,78.22％),为无色油状液体。LCMS(ESI)[M-100+H]+＝501.1.
步骤2:(S)-苄基-2-氨基-6-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)-己酸酯(WY-8-C)
将(S)-苄基-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)-己酸酯(4.6g,7.66mmol)溶于二氯甲烷(30mL)中,然后缓慢加入二乙胺(30mL)。反应液在室温下搅拌2小时。反应液浓缩，得到的剩余物用硅胶柱粗略纯化后(洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)继续用反相制备纯化(C18柱，洗脱剂：碳酸氢铵/乙腈/水)得标题化合物(1.7g,58.64％),为无色油状液体。LCMS(ESI)[M+H]+＝379.1.
步骤3:(S)-叔丁基-2-(2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-苯基丙酰基)肼基碳酸酯(WY-8-E)
将(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-苯丙氨酸(3.77g,9.73mmol),叔丁氧羰基肼(1.286g，9.73mmol)，HATU(4.810g，12.65mmol)和HOBt(1.972g,14.60mmol)溶于二氯甲烷(200mL)中,慢慢加入二异丙基乙胺(6.288g，48.65mmol),反应液在室温下搅拌3小时。得到的混合物旋干，加入水(100mL)，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。将有机相合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。剩余物用乙酸乙酯(30mL)和石油醚(150mL)打浆，过滤，得标题化合物(4.15g,84.94％),为白色固体。LCMS(ESI)[M+23]+＝524.0.
步骤4:(S)-(9氢-芴-9-基)甲基-1-肼基-1-氧代-3-苯丙基-2-基氨基甲酸酯(WY-8-F)
将化合物(S)-叔丁基-2-(2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-苯基丙酰基)肼基碳酸酯(4.15g,8.27mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中,慢慢加入氯化氢-1,4-二氧六环溶液(4N,50mL),反应液在室温下搅拌4小时。将反应混合物浓缩旋干，加入乙酸乙酯(20mL)和石油醚(80mL)，打浆搅拌30分钟，过滤，滤饼用60mL(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)分三次洗涤,收集滤饼并干燥，得标题化合物(3.17g,87.52％),为白色固体。LCMS(ESI)[M+H-36]+＝402.0.
步骤5:(S)-(9氢-芴-9-基)甲基-1-(2-(4-叔丁氧苄基)肼基)-1-氧代-3-苯丙基-2-基氨基甲酸酯(WY-8-G)
将(S)-(9氢-芴-9-基)甲基-1-肼基-1-氧代-3-苯丙基-2-基氨基甲酸酯的盐酸盐(3.17g,7.25mmol)和对叔丁氧基苯甲醛(1.292g，7.25mmol)溶于四氢呋喃(100mL)中，加入浓盐酸(1mL)，在室温下搅拌2小时。然后往反应液中慢慢加入氰基硼氢化钠(1.367g，21.75mmol)，反应液在室温下搅拌3小时。往反应液中加入水(20mL)，旋干，剩余物加入水(50mL)，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，有机层合并，用水(50mL×3)洗涤。将有机层旋干，用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1)，得标题化合物(2.38g,58.10％)。LCMS(ESI)[M+H]+＝564.3.
步骤6:苄基-(S)-6-((叔丁氧羰基)(异丙基)氨基)-2-异氰酰基己酸酯(WY-8-H)
将三光气(1.333g，4.49mmol)溶于无水二氯甲烷(40mL)的溶液冷却至0℃，然后将(S)-苄基-2-氨基-6-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)己酸酯(1.700g,4.49mmol)溶于无水二氯甲烷(60mL)的溶液在0℃下慢慢加入上述溶液中。反应液在室温下搅拌2小时，然后慢慢加入三乙胺(4.089g，40.41mmol)，反应液在室温下搅拌二十分钟，得到含有标题化合物的溶液(约4.49mmol)，直接用于下一步反应。LCMS(ESI)[M+23]+＝427.0。
步骤7:(5S,11S)-苄基-5-苄基-8-(4-叔丁氧苄基)-11-(4-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)丁基)-1-(9氢-芴-9-基)-3,6,9-三氧代-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-羧酸酯(WY-8-I)
在苄基-(S)-6-((叔丁氧羰基)(异丙基)氨基)-2-异氰酰基己酸酯的溶液中(约4.49mmol，即步骤6得到的WY-8-H化合物的溶液)缓慢加入(S)-(9氢-芴-9-基)甲基-1-(2-(4-叔丁氧苄基)肼基)-1-氧代-3-苯丙基-2-基氨基甲酸酯(2.38g，4.23mmol)溶于二氯甲烷(15mL)的溶液，反应液在室温下搅拌2小时后浓缩干。剩余物加入乙酸乙酯(100mL)，用水(50mL×3)洗涤，将有机层旋干，用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1/3)得标题化合物(2.2g,53.72％),为无色液体。LCMS(ESI)[M-100+H]+＝868.1。
步骤8:Fmoc-Phe-azaTyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-OH(WY-8-J)
(5S,11S)-5-苄基-8-(4-叔丁氧苄基)-11-(4-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)丁基)-1-(9H-芴-9-基)-3,6,9-三氧代-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-氧代羧酸
将(5S,11S)-苄基-5-苄基-8-(4-叔丁氧苄基)-11-(4-(叔丁氧羰基(异丙基)氨基)丁基)-1-(9氢-芴-9-基)-3,6,9-三氧代-2-氧杂-4,7,8,10-四氮杂十二烷-12-羧酸酯(2g,2.07mmol)和钯-碳(10％,100mg)加入四氢呋喃(60mL)中，再将该混合物连接氢气发生器。将该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌4小时。反应液过滤，滤液浓缩，剩余物用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(680mg,37.42％),为白色固体。LCMS(ESI)[M-100+H]+＝778.1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.38(s,1H),7.88(d,J＝7.2Hz,3H),7.64(q,J＝12Hz,2H),7.18-7.42(m,10H),7.01(d,J＝8Hz,2H),6.84(d,J＝8Hz,2H),6.26(d,J＝7.2Hz,1H),4.15-4.25(m,7H),2.84(s,5H),1.51-1.86(m,2H),1.33(s,11H),1.24(s,11H),0.98-1.05(m,6H).
B.固相合成
将2.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用20mL20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH(255mg,0.5mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应40分钟。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液20ml反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-[D-Glu(OAll)]-OH 410mg,0.75mmol),HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，依次将Gly，2Nal，D-Arg(Pbf)等氨基酸引入，得到[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Gly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
在该树脂中加入Fmoc-Phe-azaTyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-OH(650mg,0.75mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时；得到的树脂用DMF,二氯甲烷,甲醇,甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到Fmoc-Phe-azaTyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Gly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂，四三苯基膦钯(1.16g,1mmol),1,3-二甲基巴比妥酸(390mg,2.5mmol)加入40mL无水二氯甲烷中，该反应液在氩气的保护下室温反应3小时。反应结束后用三水二乙基二硫代氨基甲酸钠的DMF溶液(2g/400mL,50mL)，DIPEA的DMF溶液(2mL/400mL,50mL)和HOBT的DMF溶液(5.4g/400mL,50mL)依次洗涤树脂，并按相同顺序，用上述三种溶液再洗涤树脂5遍。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤后加入HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol),在室温下反应1.5小时。树脂用DMF，二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-azaTyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Gly-[D-Glu(OAll)]]-Lys(iPr,Boc)-RinkAmide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:78/22-73/27，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xtimate C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000511
柱(20mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到24.2mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:596.0
HPLC洗脱时间：11.50分钟
洗脱条件：C
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65,洗脱液A为0.01％TFA的水溶液，洗脱液B为0.01％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例7：WY-9
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-Pro-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(3R,8S,11S,14S,17R,20S,25AS)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-8-苄基-17-(3-胍基丙基)-11-(4-羟基苄基)-14-(4-(异丙基氨基)丁基)-20-(萘-2-基甲基)-1,6,9,12,15,18,21-七氧代二十四氢-1H吡咯并[2,1-C][1,4,7,10,13,16,19]七氮杂环二十三烷-3-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000521
将2.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH(255mg,0.5mmol),HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应40分钟。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液20ml反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-[D-Glu(OAll)]-OH(410mg,0.75mmol),HATU(570mg,1.5mmol)和HOAt(203mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol)，室温下反应1.5小时。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，依次将Pro,2Nal,D-Arg(Pbf),Lys(iPr,Boc),Tyr(tBu),Phe等氨基酸引入，得到的树脂用DMF,二氯甲烷,甲醇,甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Pro-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-RinkAmide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂，四三苯基膦钯(1.16g,1mmol),1,3-二甲基巴比妥酸(390mg,2.5mmol)加入40mL无水二氯甲烷中，该反应液在氩气的保护下室温反应3小时。反应结束后用三水二乙基二硫代氨基甲酸钠的DMF溶液(2g/400mL,50mL)，DIPEA的DMF溶液(2mL/400mL,50mL)和HOBT的DMF溶液(5.4g/400mL,50mL)依次洗涤树脂，并按相同顺序，用上述三种溶液再洗涤树脂5遍。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤后加入HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol),在室温下反应1.5小时。树脂用DMF，二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Pro-(D-Glu)]]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(15分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:77/23-69/31，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xbridge BEH peptide,C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000531
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到28.4mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:615.7
HPLC洗脱时间：13.46分钟
洗脱条件：C
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65，洗脱液A为0.01％TFA的水溶液，洗脱液B为0.01％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例8：WY-10-a
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-(R-2-AMPP acid)]]-Lys(iPr)-NH2
(4S,7R,10S,13S,16S,21R,25aS)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-16-苄基-7-(3-胍基丙基)-13-(4-羟基苄基)-10-(4-(异丙基氨基)丁基)-4-(萘-2-基甲基)-3,8,11,14,17,20,23-七氧代-((R)-1氢-吡咯[1,2-a])-1,2,4,9,12,15,18,21-八氮杂环二十三烷-5-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000532
A:(R)-2-((S)-2–(9-芴基)甲氧基)羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)-5-(烯丙氧基-5-氧代戊酸(WY-10-a-E,Fmoc-Allyl-R-2-AMPP acid)的制备：
Figure BDA0002995301620000541
步骤1.(R)-5-苄基-1-叔丁基-2-((S)-2-((叔丁氧羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)戊二酸二酯(WY-10-a-A)
将(S)-5-苄基-1-叔丁基-2-溴戊二酸二酯(4.28g,12mmol),(S)-叔丁基吡咯烷-2-甲基氨基甲酸酯(2g,10mmol)和碳酸钠(2.12g,20mmol)溶于DMF(30mL)和N-甲基吡咯烷酮(10mL)，反应液在室温下搅拌24小时。反应液用乙酸乙酯(500mL)稀释，再用水(150mL×5)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，得到的剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯＝15/1)，得到标题化合物(1.7g,36％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝477.5[M+H]+.
步骤2.(R)-5-叔丁氧基-4-((S)-2-((叔丁氧羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)-5-氧代戊酸(WY-10-a-B)
将(R)-5-苄基-1-叔丁基-2-((S)-2((叔丁氧羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)戊二酸二酯(1.7g,3.57mmol)和钯-碳(10％,500mg)加入甲醇(50mL)中，再将该混合物连接氢气发生器。将该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌2小时。反应液过滤，滤液浓缩得到粗品标题化合物(1.4g,100％)，为无色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝387.1[M+H]+.
步骤3.(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-((S)-2-((叔丁氧羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)戊二酸二酯(WY-10-a-C)
将(R)-5-叔丁氧基-4-((S)-2-((叔丁氧羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)-5-氧代戊酸(1.4g,3.6mmol)和3-溴-1-丙烯(1.32g,10.9mmol)溶于二甲基甲酰胺(40mL)中，缓慢加入碳酸钠(770mg,7.3mmol)，室温下搅拌4小时后，加入水(100mL)，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。有机相合并，用水(100mL×4)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品标题化合物(1.5g,97％)，为无色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝427.4[M+H]+.
步骤4.(R)-5-(烯丙基氧基)-2-((S)-2-(氨甲基)吡咯烷-1-基)-5-氧代戊酸三氟乙酸盐酸盐(WY-10-a-D)
将(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-((S)-2-((叔丁氧羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)戊二酸二酯(1.5g,3.5mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，然后缓慢加入三氟乙酸(20mL)，反应液在室温下搅拌6小时。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的三氟乙酸，得到粗品标题化合物(1.28g,85％)，为无色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝271.1[M+H]+.
步骤5.(R)-2-((S)-2–(((9-芴基)甲氧基)羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸(WY-10-a-E)
将(R)-5-(烯丙基氧基)-2-((S)-2-(氨甲基)吡咯烷-1-基)-5-氧代戊酸三氟乙酸盐酸盐(1.28g,3.5mmol),9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸酯(1.29g,3.8mmol)和碳酸钠(1.11g,10.5mmol)溶于水(50mL)和二氧六环(50mL)，室温下搅拌过夜。反应液用0.5mol/L的盐酸把PH调到3～4，然后用乙酸乙酯(200mL×3)萃取，饱和食盐水(200mL)洗涤。分出有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，剩余物用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(1.4g,82％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝493.5[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.08(s,1H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；7.69(d,J＝7.6Hz,2H)；7.41(t,J＝7.4Hz,2H)；7.35-7.30(m,3H)；5.96-5.86(m,1H)；5.31-5.18(m,2H)；4.54(d,J＝5.2Hz,2H)；4.36-4.19(m,3H)；3.34(t,J＝7.2Hz,1H)；3.20-3.18(m,1H)；3.04-2.99(m,1H)；2.92-2.89(m,1H)；2.80-2.72(m,2H)；2.47-2.39(m,2H)；2.03-1.83(m,2H)；1.75-1.60(m,4H).
B:固相合成
将2.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用20mL20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH(225mg,0.5mmol)，HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.26mL,1.5mmol)，室温下反应40分钟。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液20ml反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入(WY-10-a-E,Fmoc-Allyl-R-2-AMPP acid)(687mg,0.75mmol)，HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.26mL,1.5mmol)，室温下反应1.5小时。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到(R)-2-AMPP(Allyl)-Lys(iPr,Boc)-RinkAmide MBHA树脂。在该树脂中加入Fmoc-2Nal-OH(437mg,1mmo)，HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.26mL,1.5mmol)，室温下反应1.5小时；该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作；树脂用DMF洗涤，得到2Nal-[(R)-2-AMPP(Allyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，依次将D-Arg(Pdf),Lys(iPr,Boc),Tyr(tBu),Phe等氨基酸引入，得到的树脂用DMF,二氯甲烷,甲醇,甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[(R)-2-AMPP(Allyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂，四三苯基膦钯(1.16g,1mmol),1,3-二甲基巴比妥酸(390mg,2.5mmol)加入40mL无水二氯甲烷中，该反应液在氩气的保护下室温反应3小时。反应结束后用三水二乙基二硫代氨基甲酸钠的DMF溶液(2g/400mL,50mL)，DIPEA的DMF溶液(2mL/400mL,50mL)和HOBT的DMF溶液(5.4g/400mL,50mL)依次洗涤树脂，并按相同顺序，用上述三种溶液再洗涤树脂5遍。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤后加入HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.26mL,1.5mmol)，在室温下反应1.5小时。树脂用DMF，二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[(R)-2-AMPP]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:79/21-75/25，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Sunfire，C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000561
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到25.2mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:608.6
HPLC洗脱时间：10.96分钟
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65，洗脱液A为0.05％TFA的水溶液，洗脱液B为0.05％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例9：WY-10-b
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-(S-2-AMPP acid)]]-Lys(iPr)-NH2
(4S,7R,10S,13S,16S,21R,25aS)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-16-苄基-7-(3-胍基丙基)-13-(4-羟基苄基)-10-(4-(异丙基氨基)丁基)-4-(萘-2-基甲基)-3,6,9,12,15,18,20,23-七氧代-((S)-1氢-吡咯[1,2-a])-1,2,4,9,12,15,18,21-八氮杂环二十三烷-5-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000562
A:(S)-2-((S)-2–(9-芴基)甲氧基)羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸(WY-10-b-E,Fmoc-Allyl-(S)-2-AMPP acid)的制备：
Figure BDA0002995301620000571
步骤1.(S)-5-苄基-1-叔丁基-2-((S)-2((叔丁氧羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)戊二酸二酯(WY-10-b-A)
将(R)-5-苄基-1-叔丁基-2-溴戊二酸二酯(1.3g,3.6mmol)，(S)-叔丁基吡咯烷-2-甲基氨基甲酸酯(1.09g,5.5mmol)和碳酸钾(1.01g,7.63mmol)溶于乙腈(10mL)和N-甲基吡咯烷酮(10mL)。反应液在室温下搅拌24小时。反应液用乙酸乙酯(300mL)稀释，再用水(150mL×5)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，得到的剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：正己烷/乙酸乙酯＝15/1)，得到标题化合物(1.11g,64％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝477.1[M+H]+.
步骤2.(S)-5-叔丁氧基-4-((S)-2-((叔丁氧羰基氨基)甲基吡咯烷-1-基)-5-氧代戊酸(WY-10-b-B)
将(S)-5-苄基-1-叔丁基-2-((S)-2((叔丁氧羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)戊二酸二酯(1.9g,4mmol)和钯-碳(10％,600mg)加入甲醇(60mL)中，再将该混合物连接氢气发生器。将该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌2小时。反应液过滤，滤液浓缩得到粗品标题化合物(1.5g,97％)，为无色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝387.2[M+H]+.
步骤3.(S)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-((S)-2-((叔丁氧羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)戊二酸二酯(WY-10-b-C)
将(S)-5-叔丁氧基-4-((S)-2-((叔丁氧羰基氨基)甲基吡咯烷-1-基)-5-氧代戊酸(1.5g,3.9mmol)和3-溴-1-丙烯(1.41g,11.7mmol)溶于二甲基甲酰胺(40mL)中，缓慢加入碳酸钠(823mg,7.8mmol),室温下搅拌4小时后，加入水(100mL)，用乙酸乙酯(150mL×3)萃取。有机相合并，用水(100mL×4)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品标题化合物(1.5g,90％)，为无色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝427.2[M+H]+.
步骤4.(S)-5-(烯丙基氧基)-2-((S)-2-(氨甲基)吡咯烷-1-基)-5-氧代戊酸三氟乙酸盐酸盐(WY-10-b-D)
将(S)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-((S)-2-((叔丁氧羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)戊二酸二酯(1.5g,3.5mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，然后缓慢加入三氟乙酸(20mL)，反应液在室温下搅拌6小时。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的三氟乙酸，得到粗品标题化合物(1.4g,95％)，为无色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝271.0[M+H]+.
步骤5.(S)-2-((S)-2–(9-芴基)甲氧基)羰基氨基)甲基)吡咯烷-1-基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸(WY-10-b-E)
将(S)-5-(烯丙基氧基)-2-((S)-2-(氨甲基)吡咯烷-1-基)-5-氧代戊酸三氟乙酸盐酸盐(1.3g,3.5mmol),9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸酯(1.31g,3.9mmol)和碳酸钠(751mg,7.1mmol)溶于水(50mL)和二氧六环(50mL)，室温下搅拌过夜。反应液用0.5mol/L的盐酸把PH调到3～4，然后用乙酸乙酯(200mL×3)萃取，饱和食盐水(200mL)洗涤。分出有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，剩余物用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(1.1g,65％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝493.0[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.37(s,1H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；7.68(d,J＝7.6Hz,2H)；7.41(t,J＝7.6Hz,2H)；7.34-7.30(m,2H)；7.16(t,J＝5.6Hz,1H)；5.92-5.83(m,1H)；5.29-5.15(m,2H)；4.50(d,J＝5.6Hz,2H)；4.33-4.19(m,3H)；3.44-3.40(m,1H)；3.40-2.99(m,2H)；2.80-2.77(m,2H)；2.67-2.61(m,1H)；2.42-2.35(m,2H)；1.95-1.50(m,6H).
B:固相合成
从2.5g的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)出发，类似实施例9B的固相方法进行。只是用(WY-10-b-E,Fmoc-Allyl-(S)-2-AMPP acid)(687mg,0.75mmol)代替(WY-10-b-E,Fmoc-Allyl-(S)-2-AMPP acid)进行固相缩合。最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[(S)-2-AMPP(Allyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。并用9B内使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[(S)-2-AMPP(Allyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:79/21-75/25，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Sunfire，C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000581
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到25.2mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:608.6
HPLC洗脱时间：11.04分钟
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65，洗脱液A为0.05％TFA的水溶液，洗脱液B为0.05％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例10：WY-13
[cyclo side[azaPhe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-Gly-(D-Glu)]-Lys(iPr)-NH2
(5R,8S,11S,14S,20R)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-2-苄基-11-(3-胍基丙基)-5-(4-羟基苄基)-8-(4-(异丙基氨基)丁基)-14-(萘-2-基甲基)-3,6,9,12,,15,18,23-七氧代-1,2,4,7,10,13,16,19-八氮杂环二十三烷-20-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000591
A:(R)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-(2-((S)-1-(烯丙氧基)-3-(4-叔丁氧基苯基)-1-氧代丙基-2-氨基甲酰基)-2-苄肼基)-5-氧代戊酸(WY-13-I)的制备
Figure BDA0002995301620000601
步骤1.(S)-烯丙基-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-叔丁氧基苯基)丙酸酯(WY-13-A)
将Fmoc-O-叔丁基-L-酪氨酸(5g,10.89mmol)和3-溴-1-丙烯(1.8mL,20.8mmol)溶于DMF(40mL)中，缓慢加入碳酸钠(2.3g,21.7mmol)，室温下搅拌2小时后，加入水(200mL)，用乙酸乙酯(250mL×3)萃取。有机相合并，用水(100mL×4)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，所得粗产品用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝6/1)，得标题化合物(3.99g,73％)，为无色油状液体。MS(ESI):m/z＝500.2[M+H]+.
步骤2.(S)-烯丙基-2-氨基-3-(4-叔丁氧基苯基)丙酸酯(WY-13-B)
将(S)-烯丙基-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(4-叔丁氧基苯基)丙酸酯(3.99g,8mmol)加入二氯甲烷(50mL)和二乙胺(50mL)中，得到的混合物室温搅拌3小时。混合物浓缩，得到的剩余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝2/1到纯乙酸乙酯)，得到标题化合物(1.87g,84％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝278.1[M+H]+.
步骤3.(R)-5-叔丁基-1-甲-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)戊二酸二酯(WY-13-C)
在0℃，将(三甲基硅烷基)重氮甲烷(2.0M，正己烷溶液,14.1mL,28.2mol)慢慢加至N-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基)-D-谷氨酸-5-叔丁酯(10g,23.5mmol)溶于二氯甲烷(200mL)和甲醇(40mL)的溶液中。反应液在0℃搅拌1.5小时。然后在反应液中加入乙酸(2mL)，升至室温，搅拌30分钟。得到的混合物浓缩，粗品用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝4/1)，得到标题化合物(9.6g,93％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝440.2[M+H]+.
步骤4.(R)-4-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酸(WY-13-D)
将(R)-5-叔丁基-1-甲-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)戊二酸二酯(9.6g,21.9mmol)溶于二氯甲烷(100mL)，然后缓慢加入三氟乙酸(100mL)，反应液在室温下搅拌3小时。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的三氟乙酸，得到粗品标题化合物(8.4g,99％)，为棕色油状物，不用纯化直接用于下一步。m/z＝384.2[M+H]+.
步骤5.(R)-苄基-2-(4-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰基)肼基甲酸酯(WY-13-E)
将(R)-4-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酸(4.16g,25.1mmol),苄氧羰基肼(4.16g,25.1mmol)，HATU(9.52g,25.1mmol)溶于二氯甲烷(200mL)中,慢慢加入三乙胺(6.33g,62.7mmol),反应液在室温下搅拌2小时。得到的混合物旋干，剩余物用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(10.5g,95％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝532.3[M+H]+.
步骤6.(R)-甲基-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-肼基-5-氧代戊酸酯(WY-13-F)
将(R)-苄基-2-(4-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-甲氧基-5-氧代戊酰基)肼基甲酸酯(10.4g,19.6mmol)和钯-碳(10％,3g)加入甲醇(250mL)和乙酸(10mL)中，再将该混合物连接氢气发生器。将该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌1小时。反应液过滤，滤液浓缩得到粗品标题化合物(7.5g,96％)，为白色固体，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝398.2[M+H]+.
步骤7.(R)-甲基-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-(2-苄基肼基)-5-氧代戊酸酯(WY-13-G)
将(R)-甲基-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-肼基-5-氧代戊酸酯(7.4g,18.6mmol)和苯甲醛(1.98g,18.6mmol)溶于甲醇(200mL)中，加入甲酸(5mL)，在室温下搅拌2小时。将反应液浓缩之后再溶于四氢呋喃(200mL)中，加入氢氧化钯-碳(20％,2.5g)，再将该混合物连接氢气发生器。将该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌过夜。反应液过滤，滤液浓缩得到粗品，再用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(7.3g,80％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝488.2[M+H]+.
步骤8.(5R,13S)-烯丙基-10-苄基-13-(4-叔丁氧基苄基)-1-(9氢-芴-9-基)-5-(甲氧基羰基)-3,8,11-三氧代-2-氧杂-4,9,10,12-四氮杂十四烷-14-羧酸酯(WY-13-H)
将三光气(997mg,3.4mmol)溶于二氯甲烷(40mL)的溶液冷却至0℃，在该溶液中滴加入(S)-烯丙基-2-氨基-3-(4-叔丁氧基苯基)丙酸酯(1.86g,6.7mmol)溶于二氯甲烷(40mL)的溶液，反应液0℃搅拌1小时。再加入三乙胺(2.03g,20.1mmol)，反应液0℃搅拌0.5小时。然后加入(R)-甲基-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-(2-苄基肼基)-5-氧代戊酸酯(3.27g,6.7mmol)，反应液室温搅拌4小时。反应液中加入水(200mL)，用二氯甲烷(3×200mL)萃取。有机层合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/1)。得到标题化合物(4.8g,90％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝791.3[M+H]+.
步骤9.(R)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-5-(2-((S)-1-(烯丙氧基)-3-(4-叔丁氧基苯基)-1-氧代丙基-2-氨基甲酰基)-2-苄肼基)-5-氧代戊酸(WY-13-I)
将(5R,13S)-烯丙基-10-苄基-13-(4-叔丁氧基苄基)-1-(9氢-芴-9-基)-5-(甲氧基羰基)-3,8,11-三氧代-2-氧杂-4,9,10,12-四氮杂十四烷-14-羧酸酯(4.7g,5.9mmol)和碳酸钠(1.26g,11.9mmol)溶于水(100mL)和四氢呋喃(100mL)中，反应液在室温下搅拌过夜。反应液用乙酸把PH调到3～4，然后用乙酸乙酯(300mL×3)萃取，饱和食盐水(200mL)洗涤。分出有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，剩余物用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(1.9g,41％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝777.5[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.72(s,1H)；9.83(s,1H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；7.71(d,J＝7.6Hz,3H)；7.41(t,J＝7.4Hz,2H)；7.33-7.17(m,7H)；7.10(d,J＝8.4Hz,2H)；6.83(d,J＝8.0Hz,3H)；5.84-5.78(m,1H)；5.25(d,J＝17.2Hz,1H)；5.16(d,J＝10.4Hz,1H)；4.52-4.17(m,8H)；4.03-3.98(m,1H)；2.97(d,J＝7.2Hz,2H)；2.20(t,J＝7.2Hz,2H)；2.08-2.03(m,1H)；1.79-1.76(m,1H)；1.25(s,9H).
B.固相合成
将2.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用20mL20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH(255mg,0.5mmol)，HATU(568mg,1.5mmol)和HOAt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.26mL,1.2mmol)，室温下反应40分钟。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液20ml反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-[D-Glu(AzaPhe-Tyr(OtBu)(COOAllyl)]-OH(WY-13-I,410mg,0.75mmol)，HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.26mL,1.5mmol)，室温下反应1.5小时。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到[D-Glu(AzaPhe-Tyr(OtBu)(COOAllyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，依次将Gly，2Nal，D-Arg(Pbf),Lys(iPr,Boc)等氨基酸引入，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Gly-[D-Glu(AzaPhe-Tyr(OtBu)(COOAllyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂，四三苯基膦钯(1.16g,1mmol),1,3-二甲基巴比妥酸(390mg,2.5mmol)加入40mL无水二氯甲烷中，该反应液在氩气的保护下室温反应3小时。反应结束后用三水二乙基二硫代氨基甲酸钠的DMF溶液(2g/400mL,50mL)，DIPEA的DMF溶液(2mL/400mL,50mL)和HOBT的DMF溶液(5.4g/400mL,50mL)依次洗涤树脂，并按相同顺序，用上述三种溶液再洗涤树脂5遍。该树脂用20mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤后加入HBTU(568mg,1.5mmol)和HOBt(202mg,1.5mmol)的20mL DMF溶液，然后加入DIPEA(193mg,1.5mmol),在室温下反应1.5小时。树脂用DMF，二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到环化后的树脂[cyclo side[azaPhe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-Gly-(D-Glu)]-Lys(iPr,Boc)-Rink AmideMBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL)，得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:83/17-73/27，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xtimate C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000631
柱(20mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到10.8mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:596.2
HPLC洗脱时间：11.38分钟
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65，洗脱液A为0.05％TFA的水溶液，洗脱液B为0.05％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例11：WY-15
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-(4-AMIP acid)]]-Lys(iPr)-NH2
(7S,10S,13S,16R,19S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-7-苄基-16-(3-胍基丙基)-10-(4-羟基苄基)-13-(4-(异丙基氨基)丁基)-19-(萘-2-基甲基)-5,8,11,14,17,20-七氧代-1,6,9,12,15,18,21,24-八氮杂环[21,2.2]hexacosa-23(26),24-二烯-2-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000632
A.2-(4-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-基)-5-(烯丙基氧基)-5-氧代戊酸(WY-15-I)的制备：
Figure BDA0002995301620000641
步骤1.N-((1氢-咪唑-4-基)甲基)-1-苯基甲胺(WY-15-A)
将4-醛基咪唑(10g,104.2mmol)，苄胺(22.3g,208.3mmol)和乙酸(2mL)加入甲醇(100mL)和四氢呋喃(100mL)中，得到的混合物室温搅拌5小时。在上述反应液中加入氰基硼氢化钠(13.1g,208.3mmol)，继续室温搅拌过夜。加入水(200mL)，用乙酸乙酯(500mL×5)萃取。有机相合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品标题化合物(24g,62％)，为棕色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝188.1[M+H]+.
步骤2.叔丁基-4-((苄基(叔丁氧羰基)氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-甲酸酯(WY-15-B)
将N-((1氢-咪唑-4-基)甲基)-1-苯基甲胺(11.5g,61.5mmol),二叔丁基二碳酸酯(40.2g,184.5mmol)和三乙胺(23.8g,307.5mmol)溶于二氯甲烷(400mL)，反应液在室温下搅拌3小时。反应液浓缩，用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到标题化合物(17.6g,74％)，为棕色油状物。MS(ESI):m/z＝388.4[M+H]+.
步骤3.叔丁基-(1氢-咪唑-4-基)甲基(苄基)氨基甲酸酯(WY-15-C)
将叔丁基-4-((苄基(叔丁氧羰基)氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-甲酸酯(21.4g,55.3mmol)和氢氧化钠(3.32g,82.9mmol)溶于甲醇(70mL)和水(20mL)，反应液在室温下搅拌1小时。反应液浓缩，用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：碳酸氢铵/乙腈/水)纯化，得标题化合物(15.6g,98％)，为棕色油状物。MS(ESI):m/z＝288.2[M+H]+.
步骤4.5-苄基-1-叔丁基-2-(4-((苄基(叔丁氧羰基)氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-基)戊二酸二酯(WY-15-D)
将(S)-5-苄基-1-叔丁基-2-溴戊二酸二酯(7.6g,21.3mmol),叔丁基-(1氢-咪唑-4-基)甲基(苄基)氨基甲酸酯(6.1g,21.3mmol)和碳酸钾(5.9g,42.6mmol)溶于N-甲基吡咯烷酮(80mL)。反应液在室温下搅拌60小时。反应液用乙酸乙酯(800mL)稀释，再用水(150mL×5)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝5/2)，得到标题化合物(7g,58％)，为棕色油状物。MS(ESI):m/z＝564.1[M+H]+.
步骤5.5-苄基-1-叔丁基-2-(4-((苄基氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-基)戊二酸二酯盐酸盐(WY-15-E)
将5-苄基-1-叔丁基-2-(4-((苄基(叔丁氧羰基)氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-基)戊二酸二酯(5.2g,9.2mmol)溶于2mol/L盐酸乙酸乙酯溶液(150mL)，反应液在室温下搅拌50分钟。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的盐酸，得到粗品标题化合物(4.7g,95％)，为棕色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝464.4[M+H]+.
步骤6.4-(4-(氨基甲基)-1氢-咪唑-1-基)-5-叔丁氧基-5-氧代戊酸盐酸盐(WY-15-F)
将5-苄基-1-叔丁基-2-(4-((苄基氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-基)戊二酸二酯盐酸盐(4.7g,9.4mmol)和钯-碳(10％,1.8g)加入甲醇(100mL)和乙酸(6mL)中，再将该混合物连接氢气发生器。将该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌过夜。反应液过滤，滤液浓缩得到粗品标题化合物(3g,75％)，为黄色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝284.4[M+H]+.
步骤7.4-(4-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-基)-5-叔丁基-5-氧代戊酸(WY-15-G)
将4-(4-(氨基甲基)-1氢-咪唑-1-基)-5-叔丁氧基-5-氧代戊酸盐酸盐(3g,9.4mmol)，9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸酯(3.16g,9.4mmol)和碳酸钠(1.99g,18.8mmol)溶于水(30mL)和二氧六环(60mL)，室温下搅拌过夜。反应液用0.5mol/L的盐酸把PH调到3～4，然后用乙酸乙酯(300mL×3)萃取，饱和食盐水(200mL)洗涤。分出有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，剩余物用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到标题化合物(2.9g,62％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝506.1[M+H]+.
步骤8.5-烯丙基-1-叔丁基-2-(4-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-基)戊二酸二酯(WY-15-H)
将4-(4-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-基)-5-叔丁基-5-氧代戊酸(2.9g,5.8mmol)和3-溴-1-丙烯(1.4g,11.6mmol)溶于二甲基甲酰胺(50mL)中，缓慢加入碳酸钠(1.22g,11.6mmol),室温下搅过夜，加入水(100mL)，用乙酸乙酯(150mL×3)萃取。有机相合并，用水(100mL×4)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品，用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/1)，得到标题化合物(1.9g,61％)，为棕色油状物。MS(ESI):m/z＝546.2[M+H]+.
步骤9.2-(4-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-基)-5-(烯丙基氧基)-5-氧代戊酸(WY-15-I)
将5-烯丙基-1-叔丁基-2-(4-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-咪唑-1-基)戊二酸二酯(1.9g,3.5mmol)溶于二氯甲烷(60mL)，然后缓慢加入三氟乙酸(60mL)，反应液在室温下搅拌6小时。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的三氟乙酸，得到粗品,再用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(1.07g,63％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝490.0[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.47(s,1H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；7.73-7.65(m,4H)；7.41(t,J＝7.2Hz,2H)；7.32(t,J＝7.4Hz,2H)；7.01(s,1H)；5.93-5.84(m,1H)；5.29-5.18(m,2H)；4.97-4.93(m,1H)；4.52(d,J＝5.2Hz,2H)；4.30-4.20(m,3H)；4.10(d,J＝5.6Hz,2H)；2.40-2.08(m,4H).
B.固相合成
从2.5g的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)出发，类似实施例9B的固相方法进行。只是用(WY-15-I,Fmoc-Allyl-(S)-2-AMIP acid)(366mg,0.75mmol)代替(WY-10-a-E,Fmoc-Allyl-(R)-2-AMPP acid)进行固相缩合。最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[(S)-2-AMIP(Allyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。并用9B内使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[(S)-2-AMIP]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:81/19-71/29，使用：洗脱液A:0.1％TFA的水溶液，洗脱液B:0.1％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xbridge BEH peptide,10μm,
Figure BDA0002995301620000661
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到75mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:607.0
HPLC洗脱时间：11.23和11.29分钟
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65，洗脱液A为0.05％TFA的水溶液，洗脱液B为0.05％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例12：WY-16
Cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-AMPyP]-Lys(iPr)-NH2
(7S,10S,13S,16R,19S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-7-苄基-16-(3-胍基丙基)-10-(4-羟基苄基)-13-(4-(异丙基氨基)丁基)-19-(萘-2-基甲基)-5,8,11,14,17,20-七氧代-1,6,9,12,15,18,21,25-八氮杂环[21,2.1]hexacosa-23(26),24-二烯-2-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000671
A.2-(4-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-吡唑-1-基)-5-(烯丙基氧基)-5-氧代戊酸(Fmoc-(WY-16-F)的制备：
Figure BDA0002995301620000672
步骤1.N-((1氢-吡唑-4-基)甲基)-N-苄基-1-苯基甲胺(WY-16-A)
将4-醛基吡唑(6.6g,68.7mmol)，苄胺(11.03g,103.1mmol)和乙酸(10mL)加入甲醇(200mL)中，得到的混合物室温搅拌过夜。然后缓慢加入氰基硼氢化钠(8.66g,137.5mmol)，继续室温搅拌2小时。再加入苯甲醛(36.43g,343.7mmol)，室温搅拌2小时。最后再缓慢加入另一份氰基硼氢化钠(8.66g,137.5mmol)，继续室温搅拌2小时。加入水(300mL)，用乙酸乙酯(300mL×3)萃取。有机相合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品，再用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/1)，得到标题化合物(14.2g,74％)，为棕色油状物。MS(ESI):m/z＝278.2[M+H]+.
步骤2.5-苄基-1-叔丁基-2-(4-((二苄基氨基)甲基)-1氢-吡唑-1-基)戊二酸二酯(WY-16-B)
将(S)-5-苄基-1-叔丁基-2-溴戊二酸二酯(10g,28mmol)，N-((1氢-吡唑-4-基)甲基)-N-苄基-1-苯基甲胺(7.76g,28mmol)和碳酸钾(7.73g,56mmol)溶于N-甲基吡咯烷酮(100mL)。反应液在45℃度下搅拌两天。反应液用乙酸乙酯(700mL)稀释，再用饱和食盐水(200mL×5)洗涤。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩，用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝9/1)，得到标题化合物(7.4g,48％)，为黄色油状物。MS(ESI):m/z＝554.3[M+H]+.
步骤3.4-(4-(氨甲基)-1氢-吡唑-1-基)-5-叔丁基-5-氧代戊酸(WY-16-C)
将5-苄基-1-叔丁基-2-(4-((二苄基氨基)甲基)-1氢-吡唑-1-基)戊二酸二酯(7.3g,13.2mmol)和钯-碳(10％,3g)加入甲醇(200mL)和乙酸(10mL)中，再将该混合物连接氢气发生器。将该体系中的空气用氢气置换后，在45℃下搅拌5小时。反应液过滤，滤液浓缩得到粗品标题化合物(3.7g,99％)，为无色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝284.1[M+H]+.
步骤4.4-(4-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-吡唑-1-基)-5-叔丁基-5-氧代戊酸(WY-16-D)
将4-(4-(氨甲基)-1氢-吡唑-1-基)-5-叔丁基-5-氧代戊酸(3.7g,13.1mmol),9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸酯(4.41g,13.1mmol)和碳酸钠(2.77g,26.1mmol)溶于水(150mL)和二氧六环(150mL)，室温下搅拌过夜。反应液用0.5mol/L的盐酸把PH调到3～4，然后用乙酸乙酯(300mL×3)萃取，饱和食盐水(200mL)洗涤。分出有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，剩余物用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝1/3)，得到标题化合物(6.3g,95％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝506.1[M+H]+.
步骤5.5-烯丙基-1-叔丁基-2-(4-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-吡唑-1-基)戊二酸二酯(WY-16-E)
将4-(4-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-吡唑-1-基)-5-叔丁基-5-氧代戊酸(6.2g,12.3mmol)和3-溴-1-丙烯(2.23g,18.4mmol)溶于二甲基甲酰胺(120mL)中，缓慢加入碳酸钠(2.6g,24.6mmol)，室温下搅过夜，加入水(200mL)，用乙酸乙酯(200mL×3)萃取。有机相合并，用水(100mL×4)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品，用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1)，得到标题化合物(6.2g,92.5％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝546.2[M+H]+.
步骤6.2-(4-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-吡唑-1-基)-5-(烯丙基氧基)-5-氧代戊酸(WY-16-F)
将5-烯丙基-1-叔丁基-2-(4-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)甲基)-1氢-吡唑-1-基)戊二酸二酯(6.15g,11.3mmol)溶于二氯甲烷(120mL)，然后缓慢加入三氟乙酸(120mL)，反应液在室温下搅拌6小时。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的三氟乙酸，得到粗品,再用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(4.5g,82％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝490.1[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.13(s,1H)；7.89(d,J＝7.2Hz,2H)；7.70-7.64(m,4H)；7.41(t,J＝7.4Hz,2H)；7.37(s,1H)；7.32(t,J＝7.4Hz,2H)；5.93-5.84(m,1H)；5.29-5.18(m,2H)；5.03-4.99(m,1H)；4.52(d,J＝5.6Hz,2H)；4.32(d,J＝7.2Hz,2H)；4.22(t,J＝6.6Hz,1H)；4.05(d,J＝5.6Hz,2H)；2.37-2.22(m,3H)；2.16-2.10(m,1H).
B.固相合成:
从2.5g的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)出发，类似实施例9B的固相方法进行。只是用(WY-16-F,Fmoc-4-AMPyP acid)(368mg,0.75mmol)代替(WY-10-a-E,Fmoc-Allyl-(R)-2-AMPP acid)进行固相缩合。最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[4-AMPyP(Allyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。并用9B使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cycloside[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[4-AMPyP]-Lys(iPr,Boc)-RinkAmide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL)，得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:77/23-67/33，使用：洗脱液A:0.1％TFA的水溶液，洗脱液B:0.1％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xbridge BEH peptide,10μm,
Figure BDA0002995301620000691
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到87.5mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:607.1
HPLC洗脱时间：12.11和12.34分钟
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65，洗脱液A为0.05％TFA的水溶液，洗脱液B为0.05％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例13：WY-23
Cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-ψ(NHCO)Gly-Glu]-Lys(iPr)-NH2
(5S,8R,11S,14R,17S,22S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-17-苄基-8-(3-胍基丙基)-14-(4-羟基苄基)-11-(4-(异丙基氨基)丁基)-5-(萘-2-基甲基)-4,7,10,13,16,19,23-七氧代-1,3,6,9,12,15,18-八氮杂环二十三烷-22-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000701
A.(5S)-11-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙基)-1-(9氢-芴-9-基)-5-(2-萘基甲基)-3,6,10-三氧代-2-氧杂-4,7,9-三氮杂十二烷-12-酸(WY-23-H)的制备：
Figure BDA0002995301620000702
步骤1.(9氢-芴-9-基)甲基(S)-(1-((2-氨基-2-氧代乙基)胺基)-3-(2-萘基)-1-氧代丙基-2-基)氨基甲酸酯(WY-23-A)
将N-芴甲氧羰基-L-3-(2-萘基)-丙氨酸(10g,22.9mmol)，甘氨酰氨盐酸盐(2.78g,25.2mmol)，HATU(9.6g,25.2mmol)溶于二氯甲烷(400mL)中，慢慢加入三乙胺(5.8g,57.2mmol),反应液在室温下搅拌过夜。将反应液过滤，用二氯甲烷(200mL)洗固体，将固体干燥后得标题化合物(11g,97％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝494.1[M+H]+.
步骤2.(9氢-芴-9-基)甲基(S)-1-((氨基甲基)氨基)-3-(2-萘基)-1-氧代丙基-2-基)氨基甲酸酯盐酸盐(WY-23-B)
将(9氢-芴-9-基)甲基(S)-(1-((2-氨基-2-氧代乙基)胺基)-3-(2-萘基)-1-氧代丙基-2-基)氨基甲酸酯(11g,22.3mmol)溶于四氢呋喃(200mL)和水(50mL)中，慢慢加入[双(三氟乙酰氧基)碘]苯(19.2g,44.6mmol)，反应液在室温下搅拌过夜。反应液旋干得到粗品,再用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：盐酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(1.34g,12％)，为黄色固体。MS(ESI):m/z＝488.1[M+Na]+.
步骤3.2-(3-苄氧基-3-氧代丙基)-丙二酸二叔丁酯(WY-23-C)
将丙二酸二叔丁酯(20g,92.6mmol)溶于无水四氢呋喃(500mL)中，加入叔丁醇钠(10.7g,111.1mmol)，反应液在室温下搅拌1小时。然后加入3-溴丙酸苄脂(22.5g,92.6mmol)，在室温下搅拌两小时。加入水(300mL)，用乙酸乙酯(300mL×3)萃取。有机相合并，用饱和食盐水(200)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品，用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝30/1)，得到标题化合物(26.6g,76％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝401.1[M+Na]+.
步骤4.4-(叔丁氧羰基)-5-叔丁氧基-5-氧代戊酸(WY-23-D)
将2-(3-苄氧基-3-氧代丙基)-丙二酸二叔丁酯(10g,26.5mmol)和钯-碳(10％,2g)加入甲醇(100mL)中，再将该混合物连接氢气发生器。将该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌4小时。反应液过滤，滤液浓缩得到粗品标题化合物(7.4g,97％)，为无色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝311.1[M+Na]+.
步骤5.2-(3-烯丙氧基-3-氧代丙基)-丙二酸二叔丁酯(WY-23-E)
将4-(叔丁氧羰基)-5-叔丁氧基-5-氧代戊酸(7.4g,25.7mmol)，3-溴-1-丙烯(4.7g,38.5mmol)和碳酸钠(5.4g,51.4mmol)溶于二甲基甲酰胺(100mL)中，室温下搅拌4小时后，加入乙酸乙酯(700mL)稀释。用饱和食盐水(150mL×5)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品，再用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝20/1)，得到标题化合物(26.6g,76％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝351.1[M+Na]+.
步骤6.2-(叔丁氧羰基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸(WY-23-F)
将2-(3-烯丙氧基-3-氧代丙基)-丙二酸二叔丁酯(6.3g,19.2mmol)溶于4mol/L盐酸二氧六环溶液(200mL)，反应液在室温下搅拌6小时。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的盐酸，得到粗品标题化合物(4.7g,95％)，为无色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝295.0[M+H]+.
步骤7.5-烯丙基-1-叔丁基-2-(((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(2-萘基)丙酰胺基)甲基氨基甲酰基)戊二酸二酯(WY-23-G)
将2-(叔丁氧羰基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸(1.41g,5.2mmol),(9氢-芴-9-基)甲基(S)-1-((氨基甲基)氨基)-3-(2-萘基)-1-氧代丙基-2-基)氨基甲酸酯盐酸盐(1.3g,2.6mmol)，HATU(1.08g,2.9mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中，慢慢加入三乙胺(0.79g,7.8mmol),反应液在室温下搅拌6小时。得到的混合物旋干，剩余物用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1)，得到标题化合物(1.1g,59％)，为黄色固体。MS(ESI):m/z＝720.3[M+H]+.
步骤8.(5S)-11-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙基)-1-(9氢-芴-9-基)-5-(2-萘基甲基)-3,6,10-三氧代-2-氧杂-4,7,9-三氮杂十二烷-12-酸(WY-23-H)
将5-烯丙基-1-叔丁基-2-(((S)-2-(((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-(2-萘基)丙酰胺基)甲基氨基甲酰基)戊二酸二酯(1.1g,1.53mmol)溶于二氯甲烷(20mL)，然后缓慢加入三氟乙酸(20mL)，反应液在室温下搅拌4小时。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的三氟乙酸，得到粗品，再用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(780mg,78％)，为黄色固体MS(ESI):m/z＝664.3[M+H]+.
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.57(s,1H)；8.88-8.81(m,2H)；7.90-7.79(m,6H)；7.70(t,J＝8.8Hz,1H)；7.59(d,J＝7.2Hz,1H)；7.55-7.53(m,2H)；7.49-7.43(m,2H)；7.40-7.33(m,2H)；7.24(t,J＝7.2Hz,1H)；7.12(t,J＝7.4Hz,1H)；5.88-5.76(m,1H)；5.25-5.08(m,2H)；4.52-4.42(m,4H)；4.38-4.33(m,1H)；4.10-4.04(m,3H)；3.29(t,J＝7.2Hz,1H)；3.14-3.09(m,1H)；2.91(t,J＝12.2Hz,1H)；2.30(t,J＝7.8Hz,2H)；2.00-1.89(m,2H).
B.固相合成
从2.5g的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)出发，类似实施例9B的固相方法进行。只是用(WY-23-H,Fmoc-ψ(NHCO)Gly-Glu(OAllyl)-OH)(498mg,0.75mmol)代替(WY-10-a-E,Fmoc-Allyl-(R)-2-AMPyP acid)进行固相缩合。最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[ψ(NHCO)Gly-Glu(OAllyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink AmideMBHA树脂。并用9B使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[ψ(NHCO)Gly-Glu]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL)，得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:77/23-67/33，使用：洗脱液A:0.1％TFA的水溶液，洗脱液B:0.1％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xbridge BEH peptide,10μm,
Figure BDA0002995301620000721
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到10.1mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:595.7
HPLC洗脱时间：11.98分钟
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65,洗脱液A为0.05％TFA的水溶液，洗脱液B为0.05％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例14：WY-24
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-azaGly-(D-Glu)]]-Lys-NH2
(5R,10S,13S,16S,19R,22S)-N-((S)-1-氨基-2-(4-氨基丁基)-10-苄基-19-(3-胍基丙基)-13-(4-羟基苄基)-16-(4-丁基)-22-(萘-2-基甲基)-3,8,11,14,17,20,23-七氧代-1,2,4,9,12,15,18,21-八氮杂环二十三烷-5-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000731
固相合成：
将0.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.4mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用10mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH(100mg,0.2mmol)，HBTU(228mg,0.6mmol)和HOBt(81mg,0.6mmol)的10mLDMF溶液，然后加入DIPEA(0.2mL,1.2mmol)，室温下反应2小时。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液10ml反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用10mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-OH(400mg,0.6mmol)，HBTU(228mg,0.6mmol)和HOBt(81mg,0.6mmol)的10mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.2mL,1.2mmol)，室温下反应1小时。该树脂用10mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。在该树脂中加入Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(390mg,0.6mmol)，HBTU(228mg,0.6mmol)和HOBt(81mg,0.6mmol)的10mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.2mL,1.2mmol)，室温下反应2小时；该树脂用10mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作；树脂用DMF洗涤，得到[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，依次将Lys(iPr,Boc),Tyr(tBu),Phe等氨基酸引入，得到的树脂用DMF,二氯甲烷,甲醇,甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
用实施例1B内使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-(D-Glu)]]-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入10mL的TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)溶液中，该混合物搅拌2小时，过滤除去树脂，用2mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(60mL)，得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(20分钟),流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:78/22-68/32使用：洗脱液A:0.1％TFA的水溶液，洗脱液B:乙腈，在制备型的HPLC上，使用XBridge Peptide BEH C18 10μm,
Figure BDA0002995301620000741
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的组分，冻干得到10.0mg白色固体。
质谱：1148.6[M+H]+,574.8[M+2H]+/2,383.5[M+3H]+/3.
HPLC洗脱时间：14.78分钟
柱：Waters XBridge C18 4.6×250mm 5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝85/15-55/45,洗脱液A为0.1％TFA的水溶液，洗脱液B为0.05％TFA的乙腈溶液(30分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例15：WY-25
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys-(D-Arg)-2Nal-azaGly-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(5R,10S,13S,16S,19R,22S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基-10-苄基-19-(3-胍基丙基)-13-(4-羟基苄基)-16-(4-氨基丁基)-22-(萘-2-基甲基)-3,8,11,14,17,20,23-七氧代-1,2,4,9,12,15,18,21-八氮杂环二十三烷-5-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000742
固相合成:
将0.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.4mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用8mL20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH(104mg,0.2mmol),HBTU(228mg,0.6mmol)和HOBt(81mg,0.6mmol)的10mLDMF溶液，然后加入DIPEA(0.2mL,1.2mmol)，室温下反应2小时。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液10ml反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用10mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-OH(400mg,0.6mmol),HBTU(228mg,0.6mmol)和HOBt(81mg,0.6mmol)的10mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.2mL,1.2mmol)，室温下反应1小时。该树脂用10mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink AmideMBHA树脂。在该树脂中加入Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(390mg,0.6mmol),HBTU(228mg,0.6mmol)和HOBt(81mg,0.6mmol)的10mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.2mL,1.2mmol)，室温下反应2小时；该树脂用10mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作；树脂用DMF洗涤，得到[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，依次将Lys(Boc),Tyr(tBu),Phe等氨基酸引入，得到的树脂用DMF,二氯甲烷,甲醇,甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-[D-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
用实施例1B内使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-(D-Glu)]]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入20mL的TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)溶液中，该混合物搅拌2小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(100mL)，得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(20分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:77/23-67/33使用：洗脱液A:0.1％TFA的水溶液，洗脱液B:乙腈，在制备型的HPLC上，使用XBridge Peptide BEH C18 10μm,
Figure BDA0002995301620000751
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的组分，冻干，得到26.42mg白色固体。
质谱：1148.6[M+H]+,574.8[M+2H]+/2,383.6[M+3H]+/3.
HPLC洗脱时间：12.53分钟
柱：Welch Ultimate LB-C18，4.6X250mm 5um
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝80/20-50/50，洗脱液A为0.1％TFA的水溶液，洗脱液B为乙腈溶液(30分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例16：WY-26
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-azaGly-Glu]]-Lys(iPr)-NH2
(5S,10S,13S,16S,19R,22S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基-10-苄基-19-(3-胍基丙基)-13-(4-羟基苄基)-16-(4-(异丙基氨基)丁基)-22-(萘-2-基甲基)-3,8,11,14,17,20,23-七氧代-1,2-,4,9,12,15,18,21-八氮杂环二十三烷-5-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000761
固相合成：
将0.5g商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)溶胀于DMF中，该树脂用10mL20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。得到的树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-Lys(iPr,Boc)-OH(120mg,0.23mmol),HBTU(84mg,0.22mmol)和HOBt(33mg,0.23mmol)的7mL DMF溶液，然后加入DIPEA((0.26mL,1.5mmol)，室温下反应2小时。树脂用DMF洗涤，用过量的Ac2O/DIPEA/DMF＝6:10:84溶液10ml反应一小时，树脂用DMF洗涤，得到Fmoc-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。该树脂用10mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作。树脂用DMF洗涤，加入Fmoc-2Nal-azaGly-[L-Glu(OAll)]-OH(464mg,0.7mmol，合成方法与WY-2-I基本一样)，HBTU(268mg,0.7mmol)和HOBt(98mg,0.73mmol)的7mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.2mL,1.2mmol)，室温下反应1小时。该树脂用10mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作，树脂用DMF洗涤，得到2Nal-azaGly-[L-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。在该树脂中加入Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(454mg,0.7mmol)，HBTU(268mg,0.7mmol)和HOBt(98mg,0.73mmol)的7mL DMF溶液，然后加入DIPEA(0.26mL,1.5mmol)，室温下反应2小时；该树脂用10mL 20％哌啶/DMF处理20分钟以除去Fmoc，重复两遍此操作；树脂用DMF洗涤，得到[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-[L-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。以类似的方式，依次将Lys(iPr,Boc),Tyr(tBu),Phe等氨基酸引入，得到的树脂用DMF，二氯甲烷，甲醇，甲基叔丁基醚依次洗涤，然后抽干，最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-[L-Glu(OAll)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
用实施例1B内使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-azaGly-(L-Glu)]]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入10mL的TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)溶液中，该混合物搅拌2小时，过滤除去树脂，用2.5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(50mL)，得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(20分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:82/18-72/28使用：洗脱液A:0.1％TFA的水溶液，洗脱液B:乙腈，在制备型的HPLC上，使用XBridge Peptide BEH C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000771
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的组分，冻干，得到10.15mg白色固体。
质谱：1190.7[M+H]+,595.9[M+2H]+/2,397.6[M+3H]+/3
HPLC洗脱时间：12.11分钟
柱：Welch Ultimate LB-C18，4.6×250mm,5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝80/20-50/50，洗脱液A为0.1％TFA的水溶液，洗脱液B为乙腈溶液(25分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例17：WY-27
cyclo side[Phe-Tyr-Lys(cyc)-(D-Arg)-2Nal-azaGly-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(5R,10S,13S,16S,19R,22S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基-10-苄基-19-(3-胍基丙基)-13-(4-羟基苄基)-16-(4-(环己基氨基)丁基)-22-(萘-2-基甲基)-3,8,11,14,17,20,23-七氧代-1,2-,4,9,12,15,18,21-八氮杂环二十三烷-5-甲酰胺
A.Fmoc-Lys(cychexa,Boc)-OH的制备：
(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-(叔丁氧基羰基(环己基)氨基)己酸
Figure BDA0002995301620000772
步骤1.(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-(环己基氨基)己酸
将(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-氨基-己酸(2g,4.94mmol)溶于甲醇(50mL)中，在氮气的保护下加入环己酮(1.45g,14.82mmol)的甲醇(2mL)溶液，醋酸(0.1mL)以及氰基硼氢化钠(1.24g,19.76mmol)。室温下搅拌16小时后，加入水(20mL)并浓缩，再次加入水(30mL)得到悬浊液，过滤并浓缩干燥得到标题化合物粗品(1.8g,3.99mmol)，为白色固体，粗品直接用于下一步反应。
步骤2:(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-(叔丁氧基羰基(环己基)氨基)己酸
将(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-(环己基氨基)己酸(1.6g,3.55mmol)溶于二氯甲烷(40mL)中，加入Boc2O(1.16g,5.33mmol)以及三乙胺(1.08g,10.65mmol)。室温下反应16个小时。反应液直接浓缩，并加入水(40mL)中，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，干燥浓缩，并通过硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝0-10％)得到标题化合物(0.8g，收率：36.36％)，为白色固体。
B.固相合成：
从将500mg商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)出发，类似实施例14B的固相方法进行。只是用[Fmoc-Lys(cychexa,Boc)-OH](315mg,0.75mmol)代替Fmoc-Lys(Boc)-OH进行固相缩合。最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(cychexa,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[D-Glu(Allyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。并用9B内使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(cychexa,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[D-Glu(Allyl)]-Lys(iPr,Boc)-RinkAmide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入10mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用2mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(50mL)，得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(20分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:80/20-70/30使用：洗脱液A:0.1％TFA的水溶液，洗脱液B:乙腈，在制备型的HPLC上，使用XBridge Peptide BEH C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000781
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的组分，冻干，得到18.7mg白色固体。
质谱:1230.7[M+H]+,615.9[M+2H]+/2
HPLC洗脱时间：13.64分钟
柱：Welch Ultimate LB-C18，4.6×250mm,5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝80/20-50/50，洗脱液A为0.1％TFA的水溶液，洗脱液B为乙腈溶液(25分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例18：WY-28
[cycloside[Phe-Tyr-Arg(Me)-(D-Arg)-2Nal-azaGly-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(5R,10S,13S,16S,19R,22S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基-10-苄基-19-(3-胍基丙基)-13-(4-羟基苄基)-16-(3-(3-甲基胍基)丙基)-22-(萘-2-基甲基)-3,8,11,14,17,20,23-七氧代-1,2,4,9,12,15,18,21-八氮杂环二十三烷-5-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000791
固相合成：
从将500mg商购可得的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)出发，类似实施例14B的固相方法进行。只是用[Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OH](315mg,0.75mmol)代替Fmoc-Lys(Boc)-OH进行固相缩合。最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Arg(Me,Pbf)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[D-Glu(Allyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。并用9B内使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Arg(Me,Pbf)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[D-Glu(Allyl)]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入10mL的TFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)溶液中，该混合物搅拌2小时，过滤除去树脂，用2mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(50mL)，得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(20分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:81/19-71/29使用：洗脱液A:0.1％TFA的水溶液，洗脱液B:乙腈，在制备型的HPLC上，使用XBridge Peptide BEH C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000792
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的组分，冻干，得到31.2mg白色固体。
质谱:1190.7[M+H]+,595.8[M+2H]+/2,397.6[M+3H]+/3
HPLC洗脱时间：15.01分钟
柱：Waters XBridge C18，4.6×250mm,5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝85/15-55/45，洗脱液A为0.1％TFA的水溶液，洗脱液B为乙腈溶液(25分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例19：WY-30
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-ψ(CH2NBn)G-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(2S,5S,8S,11R,14S,20R)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-2,19-二苄基-11-(3-胍基丙基)-5-(4-羟基苄基)-8-(4-(羟基苄基)-14-(萘-2-基甲基)-3,6,9,12,15,23-六氧-1,4,7,10,13,16,19-七氮杂环二十三烷-20-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000801
A：(R)-2-((2-(((9-芴基)甲氧基)羰基氨基)乙基(苄基)氨基)-5-(烯丙基氧基)-5-氧代戊酸(WY-11-B)的制备
Figure BDA0002995301620000802
步骤1.(R)-5-(烯丙基氧基)-2-氨基-5-氧代戊酸三氟乙酸盐酸盐(WY-11-A)
将(R)-5-烯丙基-1-叔丁基-2-(叔丁氧羰基氨基)戊二酸二酯(4.9g,14.3mmol)溶于二氯甲烷(50mL)，然后缓慢加入三氟乙酸(50mL)，反应液在室温下搅拌6小时。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的三氟乙酸，得到粗品标题化合物(5.3g,89％)，为无色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝188.2[M+H]+。
步骤2.(R)-2-((2-(((9-芴基)甲氧基)羰基氨基)乙基(苄基)氨基)-5-(烯丙基氧基)-5-氧代戊酸(WY-11-B)
将(R)-5-(烯丙基氧基)-2-氨基-5-氧代戊酸三氟乙酸盐酸盐(5.3g,17.6mmol)，2-(((9-芴基)甲氧基)羰基氨基)乙醛(4.95g,17.6mmol)和乙酸(8mL)加入甲醇(200mL)中，得到的混合物室温搅拌过夜。然后缓慢加入氰基硼氢化钠(2.21g,35.2mmol)，继续室温搅拌2小时。再加入苯甲醛(5.6g,52.8mmol)，室温搅拌4小时。最后再缓慢加入另一份氰基硼氢化钠(2.21g,35.2mmol)，继续室温搅拌2小时。反应液用0.5mol/L的盐酸把PH调到3～4，然后用乙酸乙酯(200mL×3)萃取，饱和食盐水(200mL)洗涤。分出有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，剩余物用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(870mg,9.1％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝543.2[M+H]+。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.50(s,1H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；7.68(dd,J1＝2.0Hz,J2＝7.6Hz；2H)；7.41(t,J＝7.4Hz,2H)；7.34-7.19(m,8H)；5.87-5.78(m,1H)；5.25-5.14(m,2H)；4.41-4.39(m,2H)；4.29-4.18(m,3H)；3.84(d,J＝14.0Hz,1H)；3.60(d,J＝14.0Hz,1H)；3.18-3.15(m,1H)；3.04-2.99(m,2H)；2.76-2.68(m,1H)；2.56-2.53(m,1H)；2.37-2.32(m,2H)；1.88-1.69(m,2H).
B.固相合成：
从5g的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)出发，类似实施例9B的固相方法进行。只是用[Fmoc-ψ(CH2NBn)Gly-[D-Glu(OAlly)]](813mg,1.5mmol)代替(WY-10-b-E,Fmoc-Allyl-(S)-2-AMPP acid)进行固相缩合。最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-ψ(CH2NBn)Gly-[D-Glu(OAlly)]]]-Lys(iPr,Boc)-Rink AmideMBHA树脂。并用9B内使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-ψ(CH2NBn)Gly-(D-GluOAlly)]]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入75mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(600mL)，得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(15分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:77/23-69/32，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xbridge BEH peptide,C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000811
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到161.5mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:633.6
HPLC洗脱时间：13.61分钟
洗脱条件：C
柱：XBridge Peptide BEH C18，4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65，洗脱液A为0.01％TFA的水溶液，洗脱液B为0.01％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例20：WY-11
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-azaGly-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(2S,5S,8S,11R,14S,20R)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-2-苄基-11-(3-胍基丙基)-5-(4-羟基苄基)-8-(4-(异丙基氨基)丁基)-14-(萘-2-基甲基)-3,6,9,12,15,23-六氧代-1,4,7,10,13,16,19-7氮杂环二十三烷-20-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000821
B.固相合成：
将WY-30和钯-碳(10％,50mg)加入甲醇(50mL)中，再将该混合物连接氢气发生器。将该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌16小时。反应液过滤，滤液浓缩，然后进行线性浓度梯度洗脱(15分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:77/23-69/33，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xbridge BEHpeptide,C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000822
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到10.3mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:588.6
HPLC洗脱时间：10.91分钟
洗脱条件：C
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65，洗脱液A为0.01％TFA的水溶液，洗脱液B为0.01％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例21：WY-36
[cyclo side[Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-2Nal-ψ(CH2NBn)Gly-(D-Glu)]]-Lys(iPr)-NH2
(2S,5S,8R,11S,17R)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-16-苄基-8-(3-胍基丙基)-2-(4-羟基苄基)-5-(4-(异丙基氨基)-11-(萘-2-基甲基)-3,6,9,12,20-五氧唑-1,4,7,10,13,16-七氮杂环二十三烷-17-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000831
固相合成：
从5g的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)出发，类似制备例19B的固相方法进行,得到Fmoc-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[ψ(CH2NBn)Gly-[D-Glu(OAlly)]]]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。并用19B内使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cyclo side[Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[ψ(CH2NBn)Gly-(D-GluOAlly)]]-Lys(iPr,Boc)-RinkAmide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入75mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(600mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(15分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:77/23-69/31，使用：洗脱液A:0.05％TFA的水溶液，洗脱液B:0.05％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xbridge BEH peptide,C18,10μm,
Figure BDA0002995301620000832
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到161.5mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:560.0
HPLC洗脱时间：12.10分钟
柱：XBridge Peptide BEH C18，4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65,洗脱液A为0.01％TFA的水溶液，洗脱液B为0.01％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
实施例22：WY-37
[cyclo side[Phe-Tyr-Lys(iPr)-(D-Arg)-ψ(NHCS)Gly-Glu]]-Lys(iPr)-NH2
(5S,8R,11S,14S,17S)-N-((S)-1-氨基-6-(异丙基氨基)-1-氧代己-2-基)-17-苄基-8-(3-胍基丙基)-14-(4-羟基苄基)-11-(4-(异丙胺基丁基)-5-(萘-2-基甲基)-4,7,10,13,16,19-六氧-23-硫代-1,3,6,9,12,15,18-七氮杂环二十三烷-22-甲酰胺
Figure BDA0002995301620000841
A.(5S)-11-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙基)-1-(9氢-芴-9-基)-5-(2-萘基甲基)-3,6,-二氧代-10-硫代-2-氧杂-4,7,9-三氮杂十二烷-12-酸(WY-37-K)的制备
Figure BDA0002995301620000842
步骤1.N-苄氧羰基甘氨酰胺(WY-37-A)
将碳酸钠(9.6g,90.5mmol)和甘氨酰氨盐酸盐(10g,90.5mmol)溶于水(100mL)和二氧六环(100mL)中，在0℃下慢慢加入氯甲酸苄酯(15.43g,90.5mmol),反应液在室温下搅拌16小时。将反应液过滤，用水(400mL)洗固体，将固体干燥后得标题化合物(12g,64％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝209.1。
步骤2.N-苄氧羰基氨基甲胺盐酸盐(WY-37-B)
将N-苄氧羰基甘氨酰胺(24g,115mmol)溶于二氯甲烷(1L)和水(20mL)中,加入[双(三氟乙酰氧基)碘]苯(54.6g,127mmol)，反应液在室温下搅拌16小时。然后加入盐酸乙酸乙酯溶液(2mol/L,150mL)，将反应液过滤，用正己烷(100mL)洗固体，将固体干燥后得标题化合物(20g,80％)，为白色固体。LCMS(ESI)[M+H]+＝181.1。
步骤3.2-(3-苄氧基-3-氧代丙基)-丙二酸甲酯叔丁酯(WY-37-C)
将丙二酸甲酯叔丁酯(25g,144mmol)溶于无水四氢呋喃(500mL)中，加入叔丁醇钠(13.4g,144mmol)，反应液在室温下搅拌半小时。然后加入3-溴丙酸苄脂(34.9g,144mmol)，在室温下搅拌两小时。加入水(300mL)，用乙酸乙酯(300mL×3)萃取。有机相合并，用饱和食盐水(200)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品，用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝20/1)，得到标题化合物(33g,69％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝359.1[M+Na]+。
步骤4.4-(甲氧羰基)-5-叔丁氧基-5-氧代戊酸(WY-37-D)
将2-(3-苄氧基-3-氧代丙基)-丙二酸甲酯叔丁酯(16.5g,49.1mmol)和钯-碳(10％,5g)加入甲醇(400mL)中，再将该混合物连接氢气发生器。将该体系中的空气用氢气置换后，室温搅拌4小时。反应液过滤，滤液浓缩得到粗品标题化合物(12g,99％)，为无色油状物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝269.2[M+Na]+。
步骤5.2-(3-烯丙氧基-3-氧代丙基)-丙二酸甲酯叔丁酯(WY-37-E)
将4-(甲氧羰基)-5-叔丁氧基-5-氧代戊酸(24g,97.6mmol)，3-溴-1-丙烯(23.6g,195.1mmol)和碳酸钠(10.3g,97.6mmol)溶于二甲基甲酰胺(200mL)中，室温下搅拌5小时后，加入乙酸乙酯(700mL)稀释。用饱和食盐水(200mL×5)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品，再用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝20/1)，得到标题化合物(26g,93％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝309.2[M+Na]+。
步骤6.2-(甲氧羰基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸(WY-37-F)
将2-(3-烯丙氧基-3-氧代丙基)-丙二酸甲酯叔丁酯(20g,69.9mmol)溶于二氯甲烷(50mL)，然后缓慢加入三氟乙酸(100mL)，反应液在室温下搅拌7小时。反应液旋干并加入二氯甲烷(50mL×3)旋干三次以除去多余的三氟乙酸，得到粗品，再用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝2/1)，得到标题化合物(13.5g,84％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝231.2[M+H]+。
步骤7.5-烯丙基-1-甲基-2-(((((苄氧基)羰基)氨基)甲基)氨基甲酰基)戊二酸二酯(WY-37-G)
将2-(甲氧羰基)-5-(烯丙氧基)-5-氧代戊酸(10g,43.5mmol),N-苄氧羰基氨基甲胺盐酸盐(14.1g,65.2mmol)，HATU(19.8g,52.2mmol)溶于二氯甲烷(500mL)中,慢慢加入三乙胺(13.2g,130.4mmol)，反应液在室温下搅拌过夜。加入水(500mL)，用二氯甲烷(600mL×3)萃取。有机相合并，用饱和食盐水(400)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品，用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝2/1)，得到标题化合物(14.5g,85％)，为无色油状物。MS(ESI):m/z＝393.1[M+H]+。
步骤8.5-烯丙基-1-甲基-2-(((((苄氧基)羰基)氨基)甲基)氨基硫酰基)戊二酸二酯(WY-37-H)
将5-烯丙基-1-甲基-2-(((((苄氧基)羰基)氨基)甲基)氨基甲酰基)戊二酸二酯(14.5g,37mmol)，和劳森试剂(14.9g,37mmol)溶于甲苯(400mL)中，反应液在90℃下搅拌16小时。得到的混合物旋干，剩余物用快速色谱法分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯＝3/1)，得到标题化合物(13.5g,84％)，为黄色液体。MS(ESI):m/z＝409.2[M+H]+.
步骤9.5-烯丙基-1-甲基-2-((氨甲基)氨基硫酰基)戊二酸二酯氢溴酸盐酸盐(WY-37-I)
将5-烯丙基-1-甲基-2-(((((苄氧基)羰基)氨基)甲基)氨基硫酰基)戊二酸二酯(14g,34.3mmol)溶于33％的氢溴酸乙酸溶液(50mL)中，反应液在室温下搅拌20分钟。反应液浓缩得到粗品标题化合物(11g,92％)，为黄色物，不用纯化直接用于下一步。MS(ESI):m/z＝297.1[M+Na]+。
步骤10.5-烯丙基-1-甲基-2-((((S)-2-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(2-萘基)丙酰胺基)甲基)氨基硫酰基)戊二酸二酯(WY-37-J)
将N-芴甲氧羰基-L-3-(2-萘基)-丙氨酸(13.5g,31.1mmol),5-烯丙基-1-甲基-2-((氨甲基)氨基硫酰基)戊二酸二酯氢溴酸盐酸盐(11g,31.1mmol)，HATU(14.17g,37.3mmol)溶于二氯甲烷(500mL)中,慢慢加入三乙胺(7.85g,77.7mmol)，反应液在室温下搅拌5小时。加入水(350mL)，用二氯甲烷(500mL×3)萃取。有机相合并，用饱和食盐水(400)洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩得到粗品，再用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(4.06g,19％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝694.2[M+H]+.
步骤11.(5S)-11-(3-(烯丙氧基)-3-氧代丙基)-1-(9氢-芴-9-基)-5-(2-萘基甲基)-3,6,-二氧代-10-硫代-2-氧杂-4,7,9-三氮杂十二烷-12-酸(WY-37-K)
将5-烯丙基-1-甲基-2-((((S)-2-((((9氢-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(2-萘基)丙酰胺基)甲基)氨基硫酰基)戊二酸二酯(4g,5.8mmol)和碳酸钠(2.45g,23.1mmol)溶于水(50mL)和四氢呋喃(50mL)中,反应液在室温下搅拌三天。反应液用0.5mol/L的盐酸把PH调到3～4，然后用乙酸乙酯(300mL×3)萃取，饱和食盐水(200mL)洗涤。分出有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，剩余物用Prep-HPLC(C18柱，洗脱剂：三氟乙酸/乙腈/水)纯化，得标题化合物(0.7g,18％)，为白色固体。MS(ESI):m/z＝680.1[M+H]+.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H)；10.74(s,1H)；8.95-8.89(m,1H)；7.85-7.81(m,6H)；7.75-7.72(m,1H)；7.60-7.52(m,3H)；7.49-7.43(m,2H)；7.40-7.33(m,2H)；7.24(t,J＝7.4Hz,1H)；7.13(t,J＝7.4Hz,1H)；5.90-5.75(m,1H)；5.26-5.10(m,2H)；4.97-4.78(m,2H)；4.50-4.40(m,3H)；4.11-4.06(m,3H)；3.73(t,J＝7.2Hz,1H)；3.21-3.16(m,1H)；2.94(t,J＝12.2Hz,1H)；2.25(t,J＝7.8Hz,2H)；2.16-2.07(m,2H).
B.固相合成
从2.5g的Rink Amide MBHA树脂(0.432mmol/g)出发，类似实施例13B的固相方法进行。只是用(WY-37-K,Fmoc-ψ(NHCS)Gly-Glu(OAllyl)-OH)(498mg,0.75mmol)代替(WY-23-H,Fmoc-ψ(NHCO)Gly-Glu(OAllyl)-OH)进行固相缩合。最终得到Fmoc-Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[ψ(NHCS)Gly-Glu(OAllyl)]-Lys(iPr,Boc)-RinkAmide MBHA树脂。并用9B使用的方法脱除Ally和Fmoc保护基，并用HBTU/HOBt/DIEA关环。最终得到环化后的树脂[cyclo side[Phe-Tyr(tBu)-Lys(iPr,Boc)-[D-Arg(Pbf)]-2Nal-[ψ(NHCS)Gly-Glu]-Lys(iPr,Boc)-Rink Amide MBHA树脂。
将干燥的上述树脂加入40mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液中，该混合物搅拌2.5小时，过滤除去树脂，用5mL的TFA/TIS/H2O(95/3/2)溶液洗涤树脂。合并滤液，向滤液中加入乙醚(200mL),得到的混合物在3000转/分钟离心1分钟，除去上层液，固体用乙醚洗涤2次，并抽干。得到的沉淀用DMF溶解，然后进行线性浓度梯度洗脱(10分钟)，流速为25mL/分钟，洗脱液A/B:77/23-67/33，使用：洗脱液A:0.1％TFA的水溶液，洗脱液B:0.1％TFA的乙腈。在制备型的HPLC上，使用Xbridge BEH peptide,10μm,
Figure BDA0002995301620000871
柱(19mm×250mm)。收集含有产物的流分，冻干得到10.1mg白色固体。
质谱[M+2H]/2+:603.5
HPLC洗脱时间：13.31分钟
柱：XBridge Peptide BEH C18,4.6×150mm,3.5μm
线性浓度梯度洗脱：洗脱液A/B＝95/5-35/65，洗脱液A为0.05％TFA的水溶液，洗脱液B为0.05％TFA的乙腈溶液(20分钟)
流速：1.0mL/分钟
上述实施例制得的多肽的MS数据见表1。
效果实施例1：
A-1试验目的：
检测化合物对趋化因子受体CXCR4的拮抗活性。
测试单位：上海国家新药筛选中心
A-2.受试药物及阳性对照药物
A-2.1受试药物
性状：粉末
贮存方法：避光，冷藏保存
配药浓度：10mM、1mM、100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、水。
工作浓度：100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、100pM、水。
A-2.2阳性对照药物：
A-2.2.1 T140(CXCR4拮抗剂)
名称：T140
贮存方法：避光，-80℃密闭保存
配药浓度：1mM、100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、水。
工作浓度：10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、水。
A-2.2.2SDF-1(CXCR4激动剂)
名称：SDF-1
贮存方法：避光，-80℃密闭保存
配药浓度：1μM。
工作浓度：10nM。
A-3.试剂与仪器：
A-3.1主要试剂：F12培养基(GIBCO)；
二甲亚砜(sigma)
FLUO-4,AM PACKAGED FOR(invitrogen)
A-3.2主要仪器：Flexstation-3(Molecular Devices)
A-4.分组、剂量设置：
A-4.1剂量设置依据：
根据测试IC50的要求，设置化合物的测试浓度梯度和设置复孔。
A-4.2剂量设置与组别：
所有受试物均设8个浓度，每个浓度设3个复孔。
A-5.实验原理和方法：
实验原理：
通过建立了共转目标受体和Gα16的细胞系，使得受体被激活后能引起Gα16蛋白的活化，进而激活磷脂酶C(PLC)产生IP3和DAG，IP3可与细胞内内质网和线粒体上的IP3受体结合，从而引起胞内钙的释放。因此，测定胞内钙的变化可以作为检测目标受体活化状态的方法。Fluo-4/AM是一种钙荧光探针指示剂用来测量钙离子，作为非极性脂溶性的化合物，进入细胞后在细胞脂解酶的作用下，AM基团解离，释出Fluo-4；由于Fluo-4是极性分子，不易通过脂质双分子膜，它可使Fluo-4长时间保留在细胞内。最终可以通过测量被激发的荧光强度来反映Gα蛋白被激活的水平。如果筛选的化合物能够激动目标受体，则可以使钙流反应大大升高。反之，如果筛选的化合物能够拮抗目标受体，则可以使钙流反应大大降低。
实验步骤：
i.将稳定表达目标受体/Gα16的细胞种于96孔板，培养过夜。
ii.吸去种有细胞的孔内的培液，加入新鲜配制的染料40μl/孔，37℃培养箱内恒温孵育40分钟。
iii.用钙缓冲液将待测的药物稀释并混匀。
拮抗模式：
iv.将染料吸尽弃去，用新鲜配制的钙缓冲液洗一遍后，换上50μl溶解有待测药物的钙缓冲液。
v.用FlexStation II仪检测，第15秒开始由仪器自动加入25μl溶解有已知激动剂的钙缓冲液，最终读取525nm处荧光值。
A-6.数据处理和统计分析：
拮抗模式
通过以下公式计算得到各样品各浓度条件下的细胞反应率(％Response)。
Figure BDA0002995301620000891
LSample表示待测样品的检测信号值，LBlank表示阳性拮抗剂完全抑制的检测信号值，LAgonist表示阳性激动剂刺激DMSO组后的检测信号值。
IC50值是通过GraphPad Prism计算得到。得到相应化合物的IC50，如表1所示。
效果实施例2：
B-1试验目的：
检测化合物对细胞迁移的抑制活性。
B-2.受试药物及阳性对照药物
B-2.1受试药物
性状：粉末
贮存方法：避光，冷藏保存
配药浓度：10mM、1mM、100μM、10μM、1μM、100nM、10nM和1pM
工作浓度：100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、100pM和10pM
B-2.2阳性对照药物：
B-2.2.1 WY-1-1(CXCR4拮抗剂,LY2510924)
名称：LY2510924
贮存方法：避光，-80℃密闭保存
配药浓度：10mM、1mM、100μM、10μM、1μM、100nM、10nM和1pM
工作浓度：100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、100pM和10pM
B-3.试剂与仪器：
B-3.1主要试剂：
·CytoSelectTM 96孔细胞迁移试剂盒，(CELL BIOLABS，货号CBA-105-5)
·CytoSelectTM 96孔细胞迁移试剂盒，(CELL BIOLABS，货号CBA-106-5)
·人SDF-alpha，(PEPROTECH，货号300-28A-10)
·F12K培养基，(GE hyclone，货号SH30526.01)
·McCoys 5A Med Mod培养基，(invitrogen，货号16600082)
·胎牛血清FBS，(France origin，货号FB-1280-500)
·青链霉素双抗，(invitrogen，货号15070063)
B-3.2主要仪器：Flexstation-3(Molecular Devices)
B-4.实验方法：
实验步骤：
i.用无血清培养基(RMPI1640+0.3％BSA+10mM HEPES)将细胞制成5.0x106cells/ml细胞悬液，CXCR4拮抗剂直接加入细胞悬液中。
ii.将150μL含10ng/ml BDF-alpha的无血清培养基(RMPI1640+0.3％BSA+10mMHEPES)加入96孔细胞迁移板外室。
iii.96孔迁移板内室小心放回外室内，确保内室的膜与培养基间没有气泡形成。
iv.将细胞悬液混合均匀后，加90ul细胞悬液于内室。
v.96孔细胞培养板放入37℃，5％CO2的培养箱中培养3小时。
vi.在细胞孵育结束前，在试剂盒提供的96孔细胞收集板中加入150ul预热的细胞分离液。
vii.将培养3小时后的细胞培养板内室中的培养基吸干，将内室转移入上述含150ul细胞分离液的细胞收集板中，37℃孵育30分钟。
viii.将内室在细胞收集液中轻轻晃动数次，使内室迁移至外侧的细胞从膜上脱离。
ix.从培养外室中取75ul培养基，与75ul上述细胞收集液混合后放入一块干净的96孔板中。
x.将染色液按1:75用4x裂解液稀释配成工作液，取50ul染色工作液加入上述细胞收集混合液中。充分混合后在室温放置20分钟。
xi.取150ul上述混合液，转移至可用于荧光检测的96孔板中。
xii.在激发光480nm，发射光520nm读取数值。
B-5.实验数据处理：
-实验中设置阳性对照与阴性对照
阳性对照：迁移板外室中含10ng/ml BDF-alpha，迁移板内室中无化合物
阴性对照：迁移板外室中无10ng/ml BDF-alpha
-用读取的荧光值作为Y轴，化合物浓度作为X轴，用Graphpad Prism6作荧光值和化合物浓度相关曲线，利用软件根据曲线计算各化合物的IC50，如表1所示。
表1
Figure BDA0002995301620000911
*NA＝无活性
由表1可知，本发明化合物细胞迁移抑制表现出较好的活性，整体在125nM以下，其中，WY-2、WY-4、WY-7、WY-10-a、WY-10-b、WY-11、WY-15～16和WY-23、WY-30、WY-36的活性与对照化合物LY2510924基本相当，而化合物WY-2、WY-6、WY-13和WY-24～27的活性较对照化合物LY2510924明显更优(<25nM)，特别是WY-6和WY-24～27达到了15nM以下。

Claims (2)

1.一种如式III所示的肽类化合物、其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004054555350000011
其特征在于，所述的肽类化合物为下列化合物：
Figure FDA0004054555350000012
2.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的肽类化合物、其药学上可接受的盐，以及药用辅料。
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