CN113115709A - 一种麻竹未成熟胚离体再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种麻竹未成熟胚离体再生的方法，包括以下步骤：1)麻竹未成熟胚愈伤组织的诱导；2)麻竹胚性愈伤组织的诱导和增殖；3)麻竹胚性愈伤组织的分化；4)麻竹分化苗生根；5)麻竹再生植株炼苗移栽。本发明以未成熟胚做为外植体，解决了以往以花药为外植体存在花药发育时期不容易判断、茎尖为外植体但不容易灭菌以及两者都存在胚性愈伤组织诱导频率低的问题。其次建立了适合于麻竹未成熟胚的愈伤组织诱导培养基和不定芽分化培养基。突破了不同外植体类型的愈伤组织诱导和不定芽分化技术，提高了不定芽分化频率，拓展了外植体类型。

Description

一种麻竹未成熟胚离体再生的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种麻竹未成熟胚离体再生的方法。
背景技术
麻竹(Dendrocalamus latiflorus Munro)隶属禾本科竹亚科牡竹属麻竹亚属，原产中国，自然分布于福建、台湾、广东、广西、贵州、云南等省区，是我国华南、东南沿海地区重要的优良、速生、笋材两用大型丛生竹种之一。竹类植物品种选育主要以自然界优良无性系选育为主，遗传改良受到限制，缺乏生产上急需的优新品种。目前利用麻竹花药和带节茎段为外植体可以诱导愈伤并获得再生植株，但仍存在诱导和分化效率低、再生周期长等问题。
专利ZL201110411575.9记载了麻竹花药诱导体胚并获得再生植株的方法，主要是利用麻竹开花后的花药作为外植体进行愈伤组织诱导和不定芽分化。但是由于竹子开花周期长、不确定性较大，一方面获取新鲜花药不容易，其次胚性愈伤组织诱导率较低，不定芽分化困难、周期长。福建农林大学朱强实验室以麻竹茎尖为外植体，建立了一种麻竹茎端诱导愈伤组织并获得再生植株的方法，该方法包括外植体的选择、愈伤组织的诱导培养和增殖培养、胚状体的诱导和萌发、生根、壮苗、炼苗和移栽入土。该技术主要问题是茎尖外植体消毒灭菌较为困难，存在比较严重的外植体污染，耗时耗力。其次胚性愈伤组织诱导效率较低，不定芽分化频率较低，周期长。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明目的旨在提供一种麻竹未成熟胚离体再生的方法，以麻竹未成熟胚为外植体，诱导胚性愈伤组织并分化成完整植株。为麻竹的细胞工程、基因工程以及分子生物学的研究提供技术平台。
为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种麻竹未成熟胚离体再生的方法，包括以下步骤：
1)麻竹未成熟胚愈伤组织的诱导；
2)麻竹胚性愈伤组织的诱导和增殖；
3)麻竹胚性愈伤组织的分化；
4)麻竹分化苗生根；
5)麻竹再生植株炼苗移栽。
进一步的，步骤1)中将未成熟麻竹种子经0.1％氯化汞溶液浸泡，胚剥离盾片朝上置于愈伤诱导培养基上，25℃，暗培养21d，获得愈伤组织。
所述的诱导培养基为：MS+2,4-D 1.0-2.0mg/L+毒莠定0.1-1.0mg/L蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8。
进一步的，步骤2)中将愈伤组织转置于胚性愈伤组织诱导培养基中，25℃，暗培养，每隔21d继代一次，继代3-4次。
所述的愈伤组织诱导培养基为：MS+2,4-D 0.5-1.5mg/L+毒莠定0.1-0.5mg/L+6-BA0.1-0.3mg/L+甘露醇3.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
进一步的，步骤3)中将胚性愈伤组织转至分化培养基中，培养条件为温度25℃，每天光照16小时。
所述的分化培养基为：MS+6-BA 0.5-2.0mg/L+KT 1.0-2.0mg/L+NAA0.3-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8。
进一步的，步骤4)中选取健壮的不定芽，移入生根培养基，培养温度25℃，光照每天16小时；根系形成后将幼苗移入生长培养基，培养温度25℃，光照每天16小时。
所述的生根培养基为：1/2MS+IBA 0.5-2.0mg/L+头孢霉素300mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。
所述的生长培养基为：MS+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH 5.8。
进一步的，步骤5)中待苗长到5cm以上时，移栽至栽培基质，置于光照培养箱内培养1月，转移至遮阴大棚培养，2月后进入野外林地栽培。
所述的栽培基质为体积比1:1的泥炭土和蛭石。
本发明的有益效果为：
目前麻竹组织培养主要有建立的花药培养技术体系以及茎尖培养体系，这两种体系存在的问题主要是胚性愈伤组织诱导率较低，分化周期较长。本发明主要是解决外植体污染问题和胚性愈伤组织诱导效率问题，由于灭菌时未成熟胚尚包裹在未成熟种子里面，可以延长灭菌时间，达到彻底灭菌的目的。其次由于种子尚未完全成熟，未成熟胚的细胞全能性更高，可以显著提高胚性愈伤组织的诱导频率以及不定芽分化频率，缩短周期。
本发明以未成熟胚做为外植体，解决了花药发育时期不容易判断、茎尖不容易灭菌以及胚性愈伤组织诱导频率低的问题。其次建立了适合于麻竹未成熟胚的愈伤组织诱导培养基和不定芽分化培养基。突破了不同外植体类型的愈伤组织诱导和不定芽分化技术，提高了不定芽分化频率，拓展了外植体类型。
附图说明
图1是本发明麻竹未成熟胚愈伤组织诱导、分化及植株再生；A为麻竹未成熟种子，B为麻竹未成熟胚诱导愈伤组织，C和D为胚性愈伤组织诱导和增殖，E和F为不定芽分化，G为生根及植株再生，H为植株移栽。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，本实施例提供一种麻竹未成熟胚离体再生的方法，将未成熟麻竹种子(开花30天后)经75％酒精表面灭菌60s，无菌水冲洗2次，再浸泡于0.1％氯化汞溶液20min，无菌水冲洗3次后，将胚剥离盾片朝上置于愈伤诱导培养基上，25℃，暗培养21d，获得愈伤组织。将诱导出的愈伤组织转置于胚性愈伤组织诱导培养基中，25℃，暗培养，每隔21d继代一次，继代3-4次。将胚性愈伤组织转至分化培养基中，培养条件为温度25℃，每天光照16小时。选取健壮的不定芽，移入生根培养基。培养温度25℃，光照每天16小时。2周后根系形成，即可将幼苗移入生长培养基，培养温度25℃，光照每天16小时。待根系发达，苗长到5cm以上时进行移栽，栽培基质为泥炭土：蛭石＝1:1(v/v)，至于光照培养箱内培养1月，即可转移至遮阴大棚培养，2月后可进入野外林地栽培。
其中，诱导培养基为：MS+2,4-D 1.0-2.0mg/L+毒莠定0.1-1.0mg/L蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8。
愈伤组织诱导培养基为：MS+2,4-D 0.5-1.5mg/L+毒莠定0.1-0.5mg/L+6-BA0.1-0.3mg/L+甘露醇3.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
分化培养基为：MS+6-BA 0.5-2.0mg/L+KT 1.0-2.0mg/L+NAA0.3-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8。
生根培养基为：1/2MS+IBA 0.5-2.0mg/L+头孢霉素300mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。
生长培养基为：MS+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH 5.8。
实施例2
利用麻竹未成熟胚做为外植体，愈伤组织诱导及其胚性愈伤组织诱导可以合二为一，胚性愈伤组织诱导效率可以从17-38％提高到47.3-61.7％％，愈伤组织诱导周期从2-4个月缩短到2个月，不定芽分化频率也有显著增加，从5.81-13.78％增加到26.4-36.9％。此外由于未成熟胚尚包裹在完整的未成熟种子中，灭菌时种皮对胚具有较好的保护作用，可以彻底灭菌而不用担心胚的存活问题，可以有效降低污染。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种麻竹未成熟胚离体再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将未成熟麻竹种子经0.1％氯化汞溶液浸泡，胚剥离盾片朝上置于愈伤诱导培养基上，25℃，暗培养21d，获得愈伤组织；
2)将愈伤组织转置于胚性愈伤组织诱导培养基中，25℃，暗培养，每隔21d继代一次；
3)将胚性愈伤组织转至分化培养基中，培养条件为温度25℃，每天光照16小时；
4)选取健壮的不定芽，移入生根培养基，培养温度25℃，光照每天16小时；根系形成后将幼苗移入生长培养基，培养温度25℃，光照每天16小时；
5)待苗长到5cm以上时，移栽至栽培基质，置于光照培养箱内培养1月，转移至遮阴大棚培养，2月后进入野外林地栽培。
2.根据权利要求1所述的一种麻竹未成熟胚离体再生的方法，其特征在于，所述的诱导培养基为：MS+2,4-D 1.0-2.0mg/L+毒莠定0.1-1.0mg/L蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8。
3.根据权利要求1所述的一种麻竹未成熟胚离体再生的方法，其特征在于，所述的愈伤组织诱导培养基为：MS+2,4-D 0.5-1.5mg/L+毒莠定0.1-0.5mg/L+6-BA0.1-0.3mg/L+甘露醇3.0g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
4.根据权利要求1所述的一种麻竹未成熟胚离体再生的方法，其特征在于，所述的分化培养基为：MS+6-BA 0.5-2.0mg/L+KT1.0-2.0mg/L+NAA 0.3-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH5.8。
5.根据权利要求1所述的一种麻竹未成熟胚离体再生的方法，其特征在于，所述的生根培养基为：1/2MS+IBA 0.5-2.0mg/L+头孢霉素300mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH 5.8。
6.根据权利要求1所述的一种麻竹未成熟胚离体再生的方法，其特征在于，所述的生长培养基为：MS+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH 5.8。
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