CN113101288A

CN113101288A - 一种协同增效治疗脊索瘤的组合药物及其用途

Info

Publication number: CN113101288A
Application number: CN202110499714.1A
Authority: CN
Inventors: 冀晨辰; 费舟; 加里·加利亚; 程光; 李三中; 武秀权
Original assignee: Air Force Medical University of PLA
Current assignee: Air Force Medical University of PLA
Priority date: 2021-05-08
Filing date: 2021-05-08
Publication date: 2021-07-13

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种协同增效治疗脊索瘤的组合药物及其用途。所述组合药物为Notch阻断剂PF03084014与ELT或Notch阻断剂PF03084014与DOX。研究证明，Notch阻断剂PF0308401靶向调控脊索瘤关键转录调控因子Brachyury的转录表达，抑制肿瘤细胞增殖；并且，可明显改善脊索瘤对化疗药物DOX、ELT的耐药现象。本发明可为脊索瘤药物治疗方案提供有利的实验室研究基础，及转化研究方向。

Description

一种协同增效治疗脊索瘤的组合药物及其用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种协同增效治疗脊索瘤的组合药物及其用途。

背景技术

脊索瘤是一种来源于残存脊索组织的、罕见的、恶性骨肿瘤，好发于颅底、骶尾部等中轴骨组织。尽管脊索瘤发病进展缓慢，但患者往往预后不良；平均中位生存期约为8-9年，且患者肿瘤复发率高达50％以上，约有至少20％的患者存在肿瘤侵袭性生长。由于脊索瘤对传统化疗药物及放疗均不敏感，其治疗方式主要以手术切除为主。目前，尚无FDA批准的标准化疗药物。因此，亟待明确、完善制备脊索瘤的化学药物方案。

在脊索瘤中，转录因子Brachyury在脊索瘤肿瘤组织中普遍高表达，并且作为典型的谱系特异性癌基因在脊索瘤的发生、发展中发挥着重要的作用。因此，靶向转录因子Brachyury分子表达的治疗方案具有巨大的临床应用前景。

Notch信号通路是一类高度保守的细胞信号转导系统，并且在细胞增殖与分化、内环境稳态的维持中发挥着关键性调控作用。例如，在脊椎动物神经轴的发育过程中，激活状态下的Notch信号可以维持干、祖细胞的干性、抑制细胞的分化；与此同时，Notch信号还可以通过与其他信号通路发生交叉作用，从而调控细胞间的信号转导。Notch信号的异常表达与肿瘤的发生、进展关系密切。然而，其在脊索瘤中的具体作用尚不清楚。本研究发现，Notch阻断剂PF03084014可显著抑制脊索瘤肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡，并且靶向抑制脊索瘤标志性转录因子Brachyury分子表达。更为重要的是，我们通过体内外实验证实，Notch阻断剂PF03084014可与化疗药物阿霉素(doxorubincin，简称DOX)、厄洛替尼(erlotinib,简称ELT)产生药物叠加效应，改善DOX、ELT的化疗耐药。从而为脊索瘤的临床转化研究，提供了有利的研究方向支持。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供Notch阻断剂PF03084014与化疗药物联合用于制备抗脊索瘤药物的医药用途。

本发明的上述目的通过如下技术方案实现：

一种协同增效治疗脊索瘤的组合药物，所述的组合药物包括Notch阻断剂PF03084014与化疗药物，所述化疗药物为阿霉素或厄洛替尼。

进一步的，所述Notch阻断剂PF03084014可改善脊索瘤对化疗药物阿霉素或厄洛替尼的耐药性。

进一步的，所述组合药物中，PF03084014与厄洛替尼的质量比为2:1。

进一步的，所述组合药物中，PF03084014与阿霉素的质量比为5:2。

本发明还提供了所述组合药物的用途，它被用于制备抑制脊索瘤生长和/或转移的产品。

本发明还提供了一种体外非治疗性抑制脊索瘤细胞生长的方法，所述的方法包括步骤：将脊索瘤细胞和所述的药物组合混养。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明发现，Notch阻断剂PF03084014(简称PF)靶向调控脊索瘤关键转录调控因子Brachyury的转录表达，抑制肿瘤细胞增殖；并且，可明显改善脊索瘤对化疗药物阿霉素、厄洛替尼的耐药现象。本发明可为脊索瘤药物治疗方案提供有利的实验室研究基础，及转化研究方向。

附图说明

图1为实施例1各处理组联合作用指数分析结果。

图2为实施例1各处理组细胞克隆球形成实验拍照结果。

图3为实施例1各处理组细胞克隆球数量分析。

图4为实施例1实验终点时各处理组肿瘤拍照结果。

图5为实施例1不同处理组肿瘤生长曲线。

图6为实施例1实验终点时各组肿瘤质量比较。

图7为实施例1免疫组织化学染色检测不同处理组脊索瘤相关蛋白的表达。

图8为实施例1western blot检测不同处理组脊索瘤相关蛋白的表达。

图9为实施例2各处理组联合作用指数分析结果。

图10为实施例2各处理组细胞克隆球形成实验拍照结果。

图11为实施例2各处理组细胞克隆球数量分析。

图12为实施例2实验终点时各处理组肿瘤拍照结果。

图13为实施例2不同处理组肿瘤生长曲线。

图14为实施例2实验终点时各组肿瘤质量比较。

图15为实施例2免疫组织化学染色检测不同处理组脊索瘤相关蛋白的表达。

图16为实施例2western blot检测不同处理组脊索瘤相关蛋白的表达。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

Notch阻断剂PF03084014与ELT用于治疗脊索瘤

一、实验材料

1、脊索瘤U-CH1细胞系(上海泽叶生物)

2、脊索瘤U-CH1细胞系荷瘤小鼠模型4-8周，雌性BALB/c裸鼠(皮下接种肿瘤组织，接种1个月后开始实验)。

二、实验方法

1、体外实验

(1)CCK8细胞增殖实验

将单细胞悬液按照5×10³/孔的细胞密度均匀铺种于96孔板中，37℃细胞培养箱孵育过夜后，在药物处理组中加入不同浓度的PF(0,1.25,2.5,5μM)、ELT(0,1.25,2.5,5μM)和PF联合ELT(Combo组)，37℃细胞培养箱继续孵育72h。随后，每孔按1：9的比例直接加入CCK8反应液体。37℃培养30min后，用波长范围为450nm，酶标仪用酶标仪读取吸光度(optical density，OD)值；并且，通过运用CompuSyn分析软件(http://www.combosyn.com)，进行细胞协同抗肿瘤作用分析，记录联合作用指数(Combinationindex，CI)。其中，CI<1代表具有协同抗肿瘤作用；CI＝1代表具有叠加作用；CI>1代表具有交互作用，结果如图1所示。

(2)细胞克隆球形成能力分析：

将收集的单细胞悬液按照10³/孔的细胞密度均匀铺种于6孔板中，37℃细胞培养箱孵育过夜后，加入不同浓度的PF、ELT或PF联合ELT(Combo组)。37℃细胞培养箱孵育72h后，吸弃培养基；PBS洗涤2遍后，加入新鲜完全培养基，37℃细胞培养箱继续孵育3周。随后，吸弃培养基，加入0.05％的结晶紫兰染色液，室温摇床孵育。30min后，快速甩板，并用去离子水冲洗15min。待细胞培养板干燥后，拍照、计数培养板中克隆球数目，并做统计学分析，结果见图2-3。

2、体内实验

(1)将脊索瘤U-CH1细胞系荷瘤小鼠模型随机分组，通过口服给药途径，1次/日，药物治疗周期采用连续给药7天—停药7天—连续给药7天—停药7天(共28天)的方案分别给予如下剂量的药物:

A：空白对照组(记作Ctrl组)：不给药；

B：PF03084014组(记作PF组)：PF03084014(25mg/kg)；

C：ELT组(记作ELT组)：ELT(25mg/kg)；

D：PF联合ELT(记作Combo组)：PF03084014(25mg/kg)以及ELT(25mg/kg)。

定时用游标卡尺测量肿瘤的直径，并绘制肿瘤生长曲线，电子天平称量裸鼠的体重。最后一次给药的次日二氧化碳吸入复合脱颈椎处死小鼠，剥取肿瘤，称重并按照如下公式计算肿瘤体积：

V＝1/2(LW²)；其中，L为瘤体最长径，W为瘤体最短径；

上述实验结果见图4-6。

(2)免疫组织化学染色检测不同处理组脊索瘤相关蛋白表达量，结果见图7。

(3)western blot检测不同处理组脊索瘤相关蛋白表达量，结果见图8。

综上：本实施例体外实验发现，PF与ELT二者存在协同作用；与对照组、PF及ELT组相比，Combo组可显著抑制脊索瘤U-CH1、UCL/JHH细胞克隆球形成。进一步，体内实验发现，与对照组相比，Combo组可以抑制肿瘤细胞增殖，Combo组可以抑制肿瘤细胞增殖，下调脊索瘤肿瘤标志物Brachyury及细胞增殖标志物Ki67的蛋白表达量；PF与ELT协同作用于脊索瘤细胞后，可协同下调增殖相关蛋白PCNA、P-stat3/stat3的蛋白表达量，上调凋亡蛋白Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP蛋白表达量。

实施例2

Notch阻断剂PF03084014与DOX用于治疗脊索瘤

一、实验材料

同实施例1。

二、实验方法

1、体外实验

(1)CCK8细胞增殖实验

将收集的单细胞悬液按照5×10³/孔的细胞密度均匀铺种于96孔板中，37℃细胞培养箱孵育过夜后，在药物处理组中加入不同浓度的PF(0,1.25,2.5,5μM)、DOX(0,1.25,2.5,5μM)和PF联合DOX(Combo组)，37℃细胞培养箱继续孵育72h。随后，每孔按1：9的比例直接加入CCK8反应液体。37℃培养30min后，用波长范围为450nm，酶标仪用酶标仪读取吸光度(optical density，OD)值；并且，通过运用CompuSyn分析软件(http://www.combosyn.com)，进行细胞协同抗肿瘤作用分析，记录联合作用指数(Combinationindex，CI)。其中，CI<1代表具有协同抗肿瘤作用；CI＝1代表具有叠加作用；CI>1代表具有交互作用，结果如图9所示。

(2)细胞克隆球形成能力分析：

将收集的单细胞悬液按照10³/孔的细胞密度均匀铺种于6孔板中，37℃细胞培养箱孵育过夜后，加入不同浓度的PF、DOX或DOX联合ELT(Combo组)。37℃细胞培养箱孵育72h后，吸弃培养基；PBS洗涤2遍后，加入新鲜完全培养基，37℃细胞培养箱继续孵育3周。随后，吸弃培养基，加入0.05％的结晶紫兰染色液，室温摇床孵育。30min后，快速甩板，并用去离子水冲洗15min。待细胞培养板干燥后，拍照、计数培养板中克隆球数目，并做统计学分析，结果见图10-11。

2、体内实验

(1)将脊索瘤U-CH1细胞系荷瘤小鼠模型及UCL/JHH PDX模型随机分组，通过口服给药途径，1次/日，药物治疗周期采用连续给药7天—停药7天—连续给药7天—停药7天(共28天)的方案分别给予如下剂量的药物:

A：空白对照组(记作Ctrl组)：不给药；

B：PF03084014组(记作PF组)：PF03084014(25mg/kg)；

C：DOX组(记作DOX组)：DOX(5mg/kg)；

D：PF联合DOX(记作Combo组)：PF03084014(25mg/kg)以及ELT(5mg/kg)。

V＝1/2(LW²)；其中，L为瘤体最长径，W为瘤体最短径；

上述实验结果见图12-14。

(2)免疫组织化学染色检测不同处理组脊索瘤相关蛋白的表达，结果见图15。

(3)western blot检测不同处理组脊索瘤相关蛋白的表达，结果见图16。

综上：本实施例体外实验发现，PF与ELT二者存在协同作用；与对照组、PF及DOX组相比，Combo组可显著抑制脊索瘤U-CH1、UCL/JHH细胞克隆球形成。进一步，体内实验发现，与对照组相比，Combo组可以抑制肿瘤细胞增殖，Combo组可以抑制肿瘤细胞增殖，下调脊索瘤肿瘤标志物Brachyury及细胞增殖标志物Ki67的蛋白表达量；PF与DOX协同作用于脊索瘤细胞后，可协同下调增殖相关蛋白PCNA、、c-myc的蛋白表达量，上调凋亡蛋白Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP蛋白表达量。并且，PF与DOX还可协同抑制Notch信号通路下游蛋白Hes1的蛋白表达量，并抑制脊索瘤肿瘤标志物Brachyury的蛋白表达量。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种协同增效治疗脊索瘤的组合药物，其特征在于，所述的组合药物包括Notch阻断剂PF03084014与化疗药物，所述化疗药物为阿霉素或厄洛替尼。

2.根据权利要求1所述一种协同增效治疗脊索瘤的组合药物，其特征在于，所述Notch阻断剂PF03084014可改善脊索瘤对化疗药物阿霉素或厄洛替尼的耐药性。

3.根据权利要求1所述的组合药物，其特征在于，PF03084014与厄洛替尼的质量比为2:1。

4.根据权利要求1所述的组合药物，其特征在于，PF03084014与阿霉素的质量比为5:2。

5.权利要求1所述组合药物的用途，其特征在于，它被用于制备抑制脊索瘤生长和/或转移的产品。

6.一种利用权利要求1所述组合药物体外非治疗性抑制脊索瘤细胞生长的方法，其特征在于，所述的方法包括：将脊索瘤细胞和权利要求1所述的药物组合混养。