CN116751856A - Peli1基因在制备慢性髓系白血病诊断试剂及治疗慢性髓系白血病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及PELI1基因在制备慢性髓系白血病诊断试剂及治疗慢性髓系白血病药物中的应用。本发明第一方面提供了PELI1基因在制备慢性髓系白血病诊断试剂中的应用，第二方面提供了将PELI1基因作为作用靶标的药物在制备治疗慢性髓系白血病药物中的应用，所述PELI1基因的NCBI ID为57162。还提供了一种PELI1基因化学抑制剂——二苯硫醚类化合物BZ61及其衍生物。本发明发现CML患者的单个核细胞中PELI1基因表达水平异常上调，敲低PELI1基因表达能够显著抑制慢性髓系白血病细胞系K562细胞的增殖，可以以PELI1基因为靶标，制备治疗慢性髓系白血病药物。还发现二苯硫醚类化合物BZ61及其衍生物具备与PELI1基因靶向结合，抑制PELI1基因表达的活性，提供了新的慢性髓系白血病治疗药物。

Description

PELI1基因在制备慢性髓系白血病诊断试剂及治疗慢性髓系 白血病药物中的应用

技术领域

本发明涉及PELI1基因在制备慢性髓系白血病诊断试剂及治疗慢性髓系白血病药物中的应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是一种以髓系增生为主的骨髓造血干细胞恶性增殖血液疾病，常以外周血白细胞异常升高，中性中、晚幼粒及成熟粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞增多为特征。CML发病的标志性细胞学特征是9号染色体长臂和染色体22号染色体长臂互相易位形成费城染色体，导致ABL1癌基因与BCR基因片段融合形成BCR-ABL1融合基因。BCR-ABL1融合蛋白的异常酪氨酸激酶活性致使自身及其底物蛋白磷酸化，激活克隆性增殖信号通路，导致正常造血干细胞(HSC)的恶性转化。

针对BCR-ABL1酪氨酸激酶活性的抑制剂(TKI)，如伊马替尼，有效缓解CML负荷，甚至部分患者获得停药后无治疗长期缓解，将其转变为慢性可控疾。然而，获得性耐药和白血病干细胞(Leukemia Stem cells，LSC)残留是目前临床CML治疗中急需解决的难题。

因此，探寻潜在药物靶点，开发新的治疗策略以克服TKI耐药和根除CML-LSC，是当前临床上CML治疗的关键，具有重大的经济效益和社会价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了PELI1基因在制备慢性髓系白血病诊断试剂及治疗慢性髓系白血病药物中的应用。本发明以PELI1基因作为治疗靶点在CML治疗中的应用进行研究分析，明确了PELI1基因在CML中的作用，并发现一种二苯基硫醚类化合物通过靶向结合PELI1基因，从而抑制CML细胞增殖和清除CML-LSCs的治疗作用，为进一步提高CML治疗效果提供新思路和药物。

本发明的技术方案如下：

本发明第一方面，提供了PELI1基因在制备慢性髓系白血病诊断试剂中的应用。

根据本发明优选的，所述PELI1基因的NCBI ID为57162，该基因为人源PELI1基因。

根据本发明优选的，所述慢性髓系白血病为BCR-ABL1阳性造血干细胞克隆性增殖形成的白血病。

进一步优选的，所述慢性髓系白血病细胞系为K562细胞。

根据本发明优选的，所述诊断试剂为检测PELI1基因表达水平的RT-PCR试剂、qRT-PCR试剂、ELISA试剂、流式细胞术或免疫印迹试剂。

本发明第二方面，提供了将PELI1基因作为作用靶标的药物在制备治疗慢性髓系白血病药物中的应用。

根据本发明优选的，所述将PELI1基因作为作用靶标的药物以干扰抑制PELI1基因为基础，能够高效特异性干扰抑制慢性髓系白血病肿瘤细胞PELI1基因的表达，或者能够高效特异性降低白血病干细胞中PELI1蛋白的表达。

根据本发明优选的，所述治疗慢性髓系白血病药物包括但不限于siRNA、shRNA、microRNA或PELI1基因化学抑制剂。

本发明第三个方面，提供了PELI1基因化学抑制剂二苯硫醚类化合物BZ61及其衍生物在制备治疗慢性髓系白血病药物中的应用；

根据本发明优选的，所述二苯硫醚类化合物BZ61结构式如下式I所示：

根据本发明优选的，所述二苯硫醚类化合物BZ61衍生物结构式如下式II所示：

其中，所述n＝1/2/3/4/5/6/7/8/9/10。

进一步优选的，所述R1～R4为：

H/CH₃/CH₂(CH₃)₂/COCH₃/COOH/CO(CH₂)₂Ph/CONHCH₃/CO(CH₂)₂CH(CH₃)₂。

根据本发明优选的，所述二苯硫醚类化合物BZ61及其衍生物抑制白血病细胞和白血病干细胞的增殖，促进白血病细胞和白血病干细胞的衰老。

进一步优选的，二苯硫醚类化合物BZ61及其衍生物联合伊马替尼对慢性髓系白血病的治疗具有协同增效作用。

有益效果：

1、本发明研究发现CML患者的单个核细胞中PELI1基因表达水平异常上调，敲低PELI1基因表达能够显著抑制慢性髓系白血病细胞系K562细胞的增殖，改善CML症状，缓解CML发病进程。在此基础上，可以以PELI1基因为靶标，制备治疗慢性髓系白血病药物，在慢性髓系白血病的治疗中具有重要意义。

2、本发明首次发现二苯硫醚类化合物BZ61及其衍生物具备与PELI1基因靶向结合，并抑制PELI1基因表达的活性。体内外实验表明，二苯硫醚类化合物BZ61及其衍生物能显著抑制慢性髓系白血病细胞系K562细胞的增殖，有效缓解人源性组织异种移植CML小鼠的疾病进展。提供了新的慢性髓系白血病治疗药物，具有较好的临床应用价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中所述CML患者和健康对照者的骨髓细胞中PELI1基因的表达情况。

图2为实施例2中所述在CML细胞系K562细胞中下调PELI1基因表达后抑制其增殖；

其中，图2A为下调后PELI1基因和BCR-ABL1基因表达情况的验证，图2B为细胞增殖。

图3为实施例3中所述BCR-ABL1诱导的CML小鼠模型中证实造血系统特异性敲除PELI1的预防作用；

其中，图3A为实验流程图，图3B为外周血中CML细胞的占比，图3C为骨髓中CML细胞的占比，图3D为骨髓中CML-LSC的占比，图3E为小鼠生存曲线。

图4为实施例4中所述化合物BZ61与PELI1的相互作用；

其中，图4A为BZ61的化学结构，图4B为化合物BZ61与PELI1的分子对接，图4C为细胞热迁移实验确证BZ61与PELI1相互作用，图4D为BZ61对PELI1热稳定性的剂量效应验证。

图5为实施例5中所述K562细胞内BZ61靶向PELI1抑制其细胞增殖；

其中，图5A为BZ61下调PELI1蛋白水平的验证，图5B为BZ61对PELI1敲低细胞及对照细胞增殖的作用。

图6为实施例6中所述BZ61显著改善BCR-ABL1诱导的CML小鼠表型；

其中，图6A为实验流程图，图6B为BZ61对小鼠体重的影响，图6C为BZ61治疗后CML小鼠生存曲线图，图6D为BZ61治疗后外周血中CML细胞占比，图6E为BZ61治疗后骨髓中CML细胞占比，图6F为典型的BZ61治疗后的小鼠脾脏，图6G为BZ61治疗后脾脏中CML细胞占比。

图7为实施例6中所述BZ61抑制CML小鼠白血病干细胞的增殖；

其中，图7A为BZ61治疗骨髓中白血病干细胞的占比，图7B为BZ61治疗后，脾脏细胞中白血病干细胞的占比，图7C为BZ61治疗后，小鼠骨髓来源白血病干细胞的克隆形成能力验证。

图8为实施例7中所述BZ61抑制人源性组织异种移植CML小鼠的疾病进展；

其中，图8A为实验流程图，图8B为BZ61治疗后小鼠外周血及骨髓中人源CML细胞(CD45+)占比,图8C为BZ61治疗后小鼠骨髓中人源CD34+细胞及髓系细胞占比，图8D为BZ61治疗后小鼠髓中人CML(CD45+)细胞数目，图8E为BZ61治疗后小鼠髓中人CML-LSC细胞(CD34+)数目。

图9为实施例8中所述BZ61衍生物抑制CML细胞K562的增殖。

其中，图9A为BZ61衍生物的化学结构式，图9B为MTT法检测BZ61衍生物抑制K562细胞增殖的结果。

具体实施方式

下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

人类红白血病细胞系K562在中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库有售。

PELI1基因参与多种实体肿瘤发生、发展及侵袭转移过程。本发明研究结果表明，慢性髓系白血病患者骨髓细胞中PELI1基因(NCBI ID为57162)的表达较健康对照者明显升高，在慢性髓系白血病细胞系中下调PELI1基因的表达可明显抑制细胞增殖。该结果说明PELI1基因在慢性髓系白血病中发挥促癌基因的作用。根据本领域的一般研究思路，通过检测PELI1基因的表达，有望实现对慢性髓系白血病的诊断作用。

实施例1、PELI1基因在CML病人中高表达

1、从正常健康人和CML患者收集骨髓或外周血来源的临床样本，然后利用人类淋巴细胞分离液(SIGMA，#Histopaque-1077)从临床样本中分离得到单核细胞，实验步骤见试剂说明书。然后利用CD34⁺细胞分选试剂盒(STEMCELL，#17856)纯化CD34⁺细胞，实验步骤见试剂说明书。向取得的CD34⁺中细胞加入Trizol裂解液，使用RNA-Quick Purification Kit(上海奕杉，RN001)试剂盒提取RNA，实验步骤见试剂说明书。最后通过实时荧光定量PCR(QPCR)检测PELI1基因的表达水平，以18S mRNA表达水平为内参，使用2^-ΔΔCT方法计算PELI1基因相对表达水平，结果如图1A所示。

其中，QPCR所用引物的核苷酸序列如下：

PELI1上游引物：5’-TTGTGATGCATCCACGCAAT-3’；

PELI1下游引物：5’-ACAATGTTGCACCACAGAGG-3’。

18S上游引物：5’-GCAATTATTCCCCATGAACG-3’；

18S下游引物：5’-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3’。

2、向分离得到的单个核细胞中加入RIPA裂解液，超声破碎细胞，冰上放置30min，在12000rpm、4℃下离心20min，收集上清，加入SDS loading buffer，金属浴95℃煮沸10min蛋白变性。通过Western blot法检测PELI1蛋白表达水平，以GAPDH为内参，结果如图1B所示。

由图1A和图1B可知，与正常健康人相比，PELI1基因在CML患者的临床样本中的表达水平显著上调，说明PELI1基因可以作为CML标志物，并应用于CML的诊断。

实施例2、敲低PELI1基因抑制K562细胞增殖

1、将表达PELI1 shRNA(shRNA#1，shRNA#2)的慢病毒(pLKO.1puro-GFP)感染K562细胞，并以空载作为对照，48h后，通过Western blot法检测三组细胞中PELI1及BCR-ABL1蛋白表达水平，以GAPDH为内参，结果如图2A所示。

其中，shRNA#1和shRNA#2的序列如下：

shRNA#1：5’-CTCATTGTCTTAGGGTATAAT-3’；

shRNA#2：5’-TTACAAGATGGCTCGTTAATT-3’。

所述ABL1基因与BCR基因均为白血病常见致病基因。

2、将三组细胞以相同细胞起始数铺板，通过流式细胞仪连续三天检测细胞增殖，结果如图2B所示。

由图2A和图2B可知，与对照相比，感染表达PELI1 shRNA慢病毒后的K562细胞中，PELI1蛋白的表达水平显著降低，PELI1的敲低则显著抑制了BCR-ABL1蛋白的表达水平，PELI1和BCR-ABL1蛋白的表达水平的降低则显著抑制了K562细胞的增殖，进一步说明PELI1基因可以作为CML标志物。

实施例3、造血干细胞特异性敲除PELI1基因显著改善BCR-ABL1诱导的CML表型

骨髓造血干细胞PELI1基因特异性敲除小鼠由南京大学-南京生物医药研究院完成(鼠源PELI1基因的NCBI ID为67245)，评价骨髓造血干细胞PELI1基因特异性敲除对CML表型的预防作用具体方法如下：

以PELI1野生鼠(WT)和骨髓造血干细胞特异性敲除鼠(CKO)作为供体鼠，纯化c-Kit⁺骨髓细胞，然后将该骨髓细胞感染MSCV-IRES-BCR-ABL1逆转录病毒48h后，经尾静脉移植入550cgry辐照的小鼠体内(作为受体)，实验流程图如图3A所示，并以WT供体鼠作为对照。移植2周后，统计两组小鼠的存活，结果如图3E所示；检测两组小鼠的CML发病指标，所述发病指标包括：外周血(PBMC)中CML细胞占比、骨髓(BM)中CML细胞占比和骨髓中白血病干细胞(LSC)的占比，结果如图3B～图3D所示。

所述MSCV-IRES-BCR-ABL1逆转录病毒按照现有技术构建，其中的ABL1基因与BCR基因均为白血病常见致病基因，两者序列均为已公开的现有序列。

由图3B～图3E可知，小鼠骨髓造血干细胞特异性敲除PELI1基因后，外周血和骨髓中CML细胞占比、骨髓中白血病干细胞(LSC)的占比均明显下降。造血干细胞特异性敲除PELI1基因后，小鼠的存活率也明显升高。说明造血干细胞特异性敲除PELI1基因可以显著抑制CML细胞的增殖，改善CML症状，缓解CML发病进程。

实施例4、化合物BZ61与PELI1基因相互作用

1、使用ChemBioDraw Ultra 14.0画出二硫醚类化合物BZ61的结构(图4A)，然后用ChemBio3D Ultra 14.0使用MMFF94力场进行优化，保存得到化合物小分子BZ61的三维结构。PELI1蛋白的三维结构使用AlphaFold构建得到。PELI1蛋白和小分子均使用AutodockTools 1.5.6转化为PDBQT格式。采用Autodock vina 1.1.2蛋白和小分子对接进行分子对接研究。将化合物小分子BZ61对接至PELI1复合物的结合口袋，亲和力为-6.9kcal/mol(图4B)。

2、将化合物BZ61或DMSO分别加入至含1×10⁷个K562细胞的细胞悬液中，化合物BZ61或DMSO的终浓度均为20μM，在37℃培养箱中培养3h后，分别等量均分为7份，加入50μL的RIPA裂解液，PCR仪热处理5min，温度设37～65℃梯度。室温冷却后，在15000g、4℃下离心20min，取30μl上层上清液，加入SDS-loading，金属浴95℃煮沸10min蛋白变性，通过Western blot法检测两组PELI1蛋白水平，计算蛋白灰度值绘制可溶性蛋白含量曲线，结果如图4C所示。

由如图4C可知，与DMSO组相比，细胞热处理后化合物BZ61组中的可溶性PELI1蛋白量明显增加。

3、通过CETSA实验测试化合物BZ61对PELI1蛋白热稳定性的剂量效应，具体方法如下：

将化合物BZ61浓度梯度设置为0、0.25、0.5、2.5、12.5、25和50μM，分别与体外纯化的PELI1蛋白室温下孵育5min,然后在48℃下热处理5min，室温冷却后，在15000g、4℃下离心20min，取30μl上层上清液，加入SDS-loading，金属浴95℃煮沸10min蛋白变性，通过Western blot法检测PELI1蛋白水平。计算蛋白灰度值绘制可溶性蛋白含量曲线，结果如图4D所示。

由图4D可知，随着化合物BZ61浓度递增，可溶性PELI1蛋白量明显增加。

本实施例的结果表明，化合物BZ61在细胞内及细胞外均能够与PELI1蛋白结合。

实施例5、化合物BZ61靶向抑制PELI1蛋白表达进而抑制K562细胞增殖

1、将慢性髓系白血病细胞系K562按照5×10⁵个/孔接种至6孔板中，分为4组：对照组，药物组1，药物组2，药物组3。其中，药物组1，2和3中BZ61终浓度分别为5μM、10μM和20μM，对照组加入等量DMSO。给药9h后收集细胞，加入细胞裂解液RIPA，超声破碎细胞，在12000rpm、4℃下离心20min，收集上清，加入SDS loading buffer，金属浴95℃煮沸10min蛋白变性。通过Western blot法检测PELI1蛋白的表达水平，以GAPDH为内参，结果如图5A所示。

2、将K562细胞分两组，分别感染表达PELI1敲低慢病毒和空载的慢病毒。24h后取等量细胞，铺板，加入BZ61(2μM)，连续三天流式计数，计算增殖倍数，结果如图5B所示。

由图5A和图5B可知，敲低PELI1基因和BZ61(10μM)均显著抑制K562细胞增殖，但是BZ61对PELI1基因敲低的K562细胞增殖没有影响，说明BZ61特异性靶向PELI1发挥抑制K562细胞增殖的作用，进一步说明BZ61靶向抑制PELI1蛋白表达，进而抑制K562细胞增殖。

实施例6、BZ61显著改善BCR-ABL1诱导的CML小鼠疾病表型

纯化供体鼠C57BL/6J小鼠c-Kit⁺骨髓细胞，经MSCV-IRES-BCR-ABL1慢病毒感染48h后，尾静脉移植入550cgry辐照的C57BL/6J小鼠体内。移植2周后，取小鼠脾脏和骨髓细胞，二次移植入经550cgry辐照的C57BL/6J小鼠体内，移植后第3天开始腹腔注射给药。分组情况：对照组，伊马替尼(IM)组，BZ61组，伊马替尼+BZ61组。给药剂量：伊马替尼100mg/kg/d，BZ61 25mg/kg/qod，对照组给相同剂量的DMSO溶剂。给药方式：分早晚两次腹腔注射给药，具体过程如图6A所示。

检测评价BZ61对CML小鼠治疗作用的指标，具体如下：

1、监测小鼠体重，结果如图6B所示；

2、统计给药后四组模型小鼠生存曲线，结果如图6C所示；

3、给药两周后监测四组模型小鼠外周血中CML细胞占比和骨髓中CML细胞占比，结果如图6D和图6E所示；

4、给药两周后检测四组模型小鼠脾脏肿大情况，结果如图6F所示；

5、给药两周后检测脾脏中CML细胞的占比如图6G所示；

6、给药两周后检测骨髓和脾脏中白血病干细胞(GFP⁺LSK)占比统计，结果如图7A和图7B所示；

7、给药两周后检测四组小鼠白血病细胞的克隆形成能力。取四组模型小鼠骨髓和脾脏相同数目GFP⁺cKit⁺细胞接种到定向分化培养基(MethoCult^TMGFM3534)中，细胞铺板终浓度为1000个/ml。置于37℃，5％ CO₂，湿度>95％的培养箱中培养12天，倒置显微镜下统计GFP⁺集落数目，结果如图7C所示。

由图6B～图6G和图7A～图7C可知，相比对照组，伊马替尼组、BZ61组和伊马替尼+BZ61组小鼠体重变化不大，存活率明显升高，外周血、骨髓和肝脏中的CML细胞占比明显减小，脾脏肿大现象减轻，骨髓和脾脏中白血病干细胞占比明显减小，克隆形成能力明显下降。其中伊马替尼组，BZ61组和伊马替尼+BZ61组相互对比后可以发现，对于以上指标中，伊马替尼+BZ61组效果最好，BZ61组次之，伊马替尼组再次之。说明BZ61对CML具有显著治疗作用，且化合物BZ61联合伊马替尼对慢性髓系白血病的治疗具有协同增效作用。

实施例7、BZ61抑制人源性组织异种移植小鼠的CML进展

将临床CML病人样本用人类淋巴细胞分离液分离单核细胞，按照每只鼠2.5×10⁵个CD34⁺细胞准备细胞悬液，NXG小鼠经100cgry辐照后经尾静脉移植。喂养1个月，检测外周血中人CD45⁺细胞占比10％左右，模型建立成功，过程如图8A所示。

NXG小鼠CML模型建立后，BZ61腹腔注射给药，连续1月，给药剂量为25mg/kg/qod，对照组给相同剂量的DMSO溶剂。给药结束时，统计小鼠外周血和骨髓中人CD45⁺细胞的占比，结果如图8B所示；统计小鼠骨髓中人CD45⁺细胞来源的CD34⁺和CD11b⁺细胞的占比，结果如图8C所示；统计骨髓中人CD45⁺细胞数目，结果如图8D所示；统计骨髓中白血病干细胞数目(CD45⁺和CD34⁺)，结果如图8E所示。

由图8B～图8E可知，与对照组相比，外周血和骨髓中人CD45⁺细胞的占比明显下降，CD34+和CD11b+细胞的占比明显下降，CD45⁺细胞数目明显下降，骨髓中白血病干细胞数目也明显下降。说明BZ61能够有效抑制人源性组织异种移植CML小鼠中的白血病干细胞的增殖，进而抑制人源性组织异种移植CML小鼠的疾病进展。

实施例8、BZ61衍生物抑制CML细胞K562细胞增殖

将K562细胞种植在96孔板上(6000个细胞/孔)，分别加入10μM的BZ61和27种BZ61衍生物，具体为BZ61衍生物1～28(图9A，化合物8为BZ61)，继续培养72小时。然后采用MTT法检测其对K562细胞增殖的抑制活性，结果如图9B所示。

除了BZ61衍生物1和2之外，其他BZ61衍生物均能够有效抑制K562细胞增殖。并且与BZ61(化合物8)相比，BZ61衍生物对K562细胞增殖的抑制活性显著增强，比如BZ61衍生物6、7、10、17、21、22、27和28，说明BZ61衍生物具有抑制CML细胞增殖的活性，可以用于治疗慢性髓系白血病，具有较好的临床应用价值和广阔的应用前景。

本发明所述实施例仅为本发明优选的具体实施方案，并不用来限制本发明，凡是在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换以及改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.PELI1基因在制备慢性髓系白血病诊断试剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述慢性髓系白血病为BCR-ABL1阳性造血干细胞克隆性增殖形成的白血病；所述诊断试剂为检测PELI1基因表达水平的RT-PCR试剂、qRT-PCR试剂、ELISA试剂、流式细胞术或免疫印迹试剂。

3.将PELI1基因作为作用靶标的药物在制备治疗慢性髓系白血病药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述将PELI1基因作为作用靶标的药物以干扰抑制PELI1基因为基础，能够高效特异性干扰抑制慢性髓系白血病肿瘤细胞PELI1基因的表达，或者能够高效特异性降低白血病干细胞中PELI1蛋白的表达。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述治疗慢性髓系白血病药物为siRNA、shRNA、microRNA或PELI1基因化学抑制剂。

6.如权利要求1或权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PELI1基因的NCBI ID为57162。

7.PELI1基因化学抑制剂二苯硫醚类化合物BZ61及其衍生物在制备治疗慢性髓系白血病药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述二苯硫醚类化合物BZ61结构式如下式I所示：

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述二苯硫醚类化合物BZ61衍生物结构式如下式II所示：

其中，所述n＝1/2/3/4/5/6/7/8/9/10；所述R1～R4为：H/CH₃/CH₂(CH₃)₂/COCH₃/COOH/CO(CH₂)₂Ph/CONHCH₃/CO(CH₂)₂CH(CH₃)₂。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述二苯硫醚类化合物BZ61及其衍生物抑制白血病细胞和白血病干细胞的增殖，促进白血病细胞和白血病干细胞的衰老；所述二苯硫醚类化合物BZ61及其衍生物联合伊马替尼对慢性髓系白血病的治疗具有协同增效作用。