CN113082065A - 一种提取草珊瑚总黄酮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药材提前方法领域，具体涉及一种提取草珊瑚总黄酮的方法，包括以下步骤：步骤1、制备低共熔溶剂；所述低共熔溶剂为摩尔比为1∶4的氯化胆碱和乙二醇混合的水溶液，所述低共熔溶剂含水质量分数为20％；步骤2、将草珊瑚粉末加入制备好的低共熔溶剂，提取草珊瑚总黄酮。本发明的有益效果在于：本发明提取方法采用低共熔溶剂超声辅助提取草珊瑚总黄酮，并对其具体的工艺参数进行优化，确定最佳提取工艺。本发明提取方法得到的草珊瑚总黄酮的提取率为12.80％，与传统试剂的提取方法相比较，其提取率提高了30％左右，本发明方法操作简单，节能环保，提取效果良好，在一定程度上促进了草珊瑚的综合利用。

Description

一种提取草珊瑚总黄酮的方法
技术领域
本发明涉及中药材提前方法领域，具体涉及一种提取草珊瑚总黄酮的方法。
背景技术
草珊瑚为金栗兰科草珊瑚属草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai的干燥全草，全株都可入药，其味苦、辛，性平，归心、肝经，具有清热凉血，祛风通络的作用，可用于血热发斑发疹，风湿痹痛，跌打损伤等，也广泛应用于医药、食品以及保健品中。黄酮类化合物为草珊瑚中主要的药效成分，具有抗菌消炎和抗肿瘤等药理活性，目前主要采用水、甲醇、乙醇等溶剂提取草珊瑚中黄酮类化合物，其提取率约为5.55％-8.68％。其溶剂消耗量大，对环境造成污染，不符合绿色环保的要求，而且易挥发威胁提取人员的安全。
低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents，DESS)主要由氢键受体(HBA)和氢键供体(HBD)两者组成的一种低熔点溶剂，是一种新型的提取溶剂，与传统溶剂相比较，该溶剂具低毒性、生物降解性高、易于制备，易于储存，价格低廉等优点，而且提取能力远高于传统的提取溶剂，现已广泛应用于总黄酮类、苯丙素类、糖类和蒽醌类等化合物的提取与分离。为了充分利用草珊瑚中的有效成分以及减少对环境的污染，本研究以DESS为提取溶剂，超声辅助提取草珊瑚中总黄酮化合物，探索草珊瑚总黄酮提取工艺，以期提供一个绿色、高效、经济的提取方法，进一步促进草珊瑚药材的开发利用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种绿色、高效、经济的提取草珊瑚总黄酮的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种提取草珊瑚总黄酮的方法，包括以下步骤：
步骤1、制备低共熔溶剂；
所述低共熔溶剂为摩尔比为1∶4的氯化胆碱和乙二醇混合的水溶液，所述低共熔溶剂含水质量分数为20％；
步骤2、将草珊瑚粉末加入制备好的低共熔溶剂，离心取得上清液，即得草珊瑚总黄酮提取液。
优选的，上述的提取草珊瑚总黄酮的方法中，所述离心具体为：以3500r/min离心15min。
优选的，上述的提取草珊瑚总黄酮的方法中，所述超声条件为：提取温度为79-81度，时间为27-29min，料液比为1∶30-32。
优选的，上述的提取草珊瑚总黄酮的方法中，所述超声条件为：提取温度为80度，时间为28min，料液比为1∶31。
优选的，上述的提取草珊瑚总黄酮的方法中，所述草珊瑚粉末的制备方法为：将草珊瑚药材洗净、干燥、粉碎，过60目号筛，得草珊瑚粉末。
优选的，上述的提取草珊瑚总黄酮的方法中，制备低共熔溶剂的方法为：将氯化胆碱和乙二醇置于容器中进行于恒温磁力加热搅拌，直至形成均一透明的溶剂，即得低共熔溶剂。
优选的，上述的提取草珊瑚总黄酮的方法中，恒温磁力加热搅拌的加热温度为75-85度。
本发明的有益效果在于：本发明提供的提取草珊瑚总黄酮的方法，采用低共熔溶剂超声辅助提取草珊瑚总黄酮，并对其具体的工艺参数进行优化，确定最佳提取工艺。本发明提取方法得到的草珊瑚总黄酮的提取率为12.80％，与传统试剂的提取方法相比较，其提取率提高了30％左右，本发明方法操作简单，节能环保，提取效果良好，在一定程度上促进了草珊瑚的综合利用。
附图说明
图1为本发明具体实施方式中的实施例2的芦丁标准曲线图；
图2为本发明具体实施方式中的实施例2的不同溶剂对总黄酮提取率的影响的数据图；
图3为本发明具体实施方式中的实施例2的不同摩尔比对总黄酮提取率的影响的数据图；
图4为本发明具体实施方式中的实施例2的不同含水量对总黄酮提取率的影响的数据图；
图5为本发明具体实施方式中的实施例2的不同超声温度对总黄酮提取率的影响的数据图；
图6为本发明具体实施方式中的实施例2的不同超声时间对总黄酮提取率的影响的数据图；
图7为本发明具体实施方式中的实施例2的不同料液比对总黄酮提取率的影响的数据图；
图8为本发明具体实施方式中的实施例2的三维响应面图的AB作用图；
图9为本发明具体实施方式中的实施例2的三维响应面图的AC作用图；
图10为本发明具体实施方式中的实施例2的三维响应面图的BC作用图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
实施例1
一种提取草珊瑚总黄酮的方法，包括以下步骤：
步骤1、将氯化胆碱和乙二醇置于容器中进行于恒温磁力加热搅拌，直至形成均一透明的溶剂，得低共熔溶剂，所述恒温磁力加热搅拌的加热温度为75-85度。
所述低共熔溶剂为摩尔比为1∶4的氯化胆碱和乙二醇混合的水溶液，所述低共熔溶剂含水质量分数为20％；
步骤2、将草珊瑚药材洗净、干燥、粉碎，过60目号筛，得草珊瑚粉末，将草珊瑚粉末加入制备好的低共熔溶剂，以3500r/min离心15min，取得上清液，即得草珊瑚总黄酮提取液。所述超声条件为：提取温度为80度，时间为28min，料液比为1∶31。
实施例2
将草珊瑚药材洗净、干燥、粉碎，过60目号筛，得草珊瑚粉末，精密称量草珊瑚粉末0.5000g，加入制备好的155ml的DESs；所述低共熔溶剂(DESs)为摩尔比为1∶4的氯化胆碱和乙二醇混合的水溶液，所述低共熔溶剂含水质量分数为20％；
浸泡30min后，在80度条件下超声提取28min，以3500r/min离心15min，取得上清液。重复提取3次，合并提取液，即得草珊瑚总黄酮提取液。草珊瑚黄酮提取液，按照实施例3中2.3黄酮含量测定方法测定提取液中的总黄酮，所含总黄酮含量为12.80％。
实施例3
本发明提取草珊瑚总黄酮的方法的最优步骤参数的验证，其包括如下验证方法：
1.材料
1.1仪器
KQ-500E型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；DFY-500500g摇摆式高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；磁力加速搅拌器(巩义市英峪博研仪器设备厂)；TDL-40B型离心机(上海安亭科学仪器厂)；AR223CN电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)；UV-1600型紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)。
1.2试药
草珊瑚，购买于福建省三明市，经福建中医药大学药学院车苏容副教授鉴定为金栗兰科草珊瑚属草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai的干燥全草；芦丁对照品(批号：B20771，厂家：上海源叶生物科技有限公司)；氯化胆碱、1,4-丁二醇(批号分别为：C108896、B110394，厂家：阿拉丁试剂上海有限公司)；丙三醇、乙二醇、乳酸、氢氧化钠(批号分别为：P1648349、P1688796、P1421816、P1187856，厂家：上海泰坦有限公司)；硝酸铝、亚硝酸钠(批号分别为：20191016、20191025，厂家：国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(批号：19070502，厂家：西陇科学股份有限公司)。
2.实验方法
2.1低共熔溶剂的制备及筛选
根据文献报道，本实验选取氯化胆碱作为氢键供体(HBA)，分别选取乙二醇、丙三醇、1,4-丁二醇和乳酸作为氢键受体(HBD)，于恒温磁力加热搅拌(80℃左右)中制备，直至形成均一、透明的溶剂，室温保存备用，再进一步筛选其摩尔比(1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5)和含水量(10％，20％，30％，40％，50％)，在一定的超声条件下，根据草珊瑚总黄酮提取率筛选最合适的DESS组合。
2.2草珊瑚总黄酮提取
将草珊瑚药材片洗净、干燥、粉碎，过60目号筛，精密称量草珊瑚粉末0.5000g，加入制备好的DESs，在一定超声条件下提取草珊瑚，并与乙醇回流提取作比较，之后以3500r/min离心15min取得上清液，定容，即得草珊瑚总黄酮提取液，即测。
2.3黄酮含量测定方法
精密称取芦丁0.01050g于50mL容量瓶中，加60％无水乙醇适量，超声使其溶解，定容至刻度，摇匀即得。使得芦丁标准溶液浓度为0.21mg/mL。精密量取上述溶液0.5、1、2、3、4、5、6mL分别置于25mL的容量瓶中，分别加入5％亚硝酸钠1mL，摇匀后静置6min，再加入10％的硝酸铝1mL，摇匀后静置6min，再加入4％氢氧化钠10mL，用60％的乙醇溶液定容至25mL，摇匀，于500nm依次测定其吸光度，得到不同芦丁浓度C(mg/mL)所相对应的吸光度A值。
样品总黄酮测定方法为：取样品溶液适量于25mL容量瓶中，其后续的操作步骤按照标准曲线方法进行，总黄酮得率计算公式如下：
Figure BDA0002956244680000051
式中，W为总黄酮提取率，％；C为代入标准曲线中求得的溶液浓度，mg/mL；V反应液总体积，mL；D为稀释倍数；M为称取的样品质量，g。
2.4单因素实验
以“2.1”选取的DESS组合作为草珊瑚超声提取的溶剂，再分别对超声温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)、时间(10min、20min、30min、40min、50min)和料液比(1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50)进行初步探究，并对这三个因素选择合适的水平进行响应面实验。
2.5响应面实验
根据单因素试验结果，以超声温度、时间和料液比3个因素为自变量，从而设计3水平3因素的Box-Behnken试验优化提取条件，以总黄酮提取率为响应值，用Design Expert8.0.6进行实验数据分析，因素水平表见表1。
表1
Figure BDA0002956244680000061
2.5统计学分析
采用Design Expert 8.0.6软件对响应曲面模型的回归方程式和显著性统计进行计算和分析，方差分析中P<0.05具有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异，则表明结果具有统计学意义。
3.结果与分析
3.1方法学考察
3.1.1线性及范围
不同芦丁标准品浓度C(mg/mL)与其相对应的吸光度A的标准曲线，如图1所示，即得到回归方程为：A＝11.959C+0.0036，R2＝0.9999，表明芦丁在0.0042～0.0504mg/mL呈良好的线性关系。其中Y轴代表吸光度A的值，X轴代表芦丁标准品浓度C(mg/mL)的值。
3.1.2精密度、重复性和稳定性考察
取“2.3”配置好的芦丁样品溶液，同一样品溶液连续测定6次，总黄酮吸光值的RSD为0.25％；取同一草珊瑚药材，用超声波提取方法平行制备6份样品，总黄酮吸光值的RSD为2.94％；取同一草珊瑚药材，用超声波提取得到样品溶液，分别在0.5、1、2、4、8、16h内进行测量，总黄酮吸光值的RSD为3.00％；表明该方法可行。
3.2低共熔溶剂系统的选择
3.2.1不同类型低共熔溶剂的选择
不同类型的低共熔溶剂具有不同的理化性质，例如：熔点、密度、粘度、表面张力和溶解性等，这些因素对提取率都有一定的影响，本研究选取了4种类型的DESs，并与60％乙醇作比较，结果如图2所示，因此，选择氯化胆碱/乙二醇(DES-1)为最合适的提取溶剂。
3.2.2不同摩尔比对低共熔溶剂的影响
不同摩尔比的DESS的理化性质不尽相同，特别是对该溶剂的黏度和表面张力的影响，结果如图3所示，因此，选择1∶4为氯化胆碱/乙二醇最合适的摩尔比。
3.2.3含水量对低共熔溶剂的影响
DESS的含水量也是目标化合物提取率的重要影响因素，其主要是对溶剂极性和黏度的影响，结果如图4所示，因此，选择20％为氯化胆碱/乙二醇最合适的含水量。
3.3超声温度、时间和料液比的影响
如图5～7结果显示，超声温度、时间和料液比对其总黄酮的提取率都有一定的影响，其中温度的影响最大，其提取率随温度的升高一直升高，但时间和料液比超过一定范围之后，提取率会下降，并且超声温度影响最明显，在80℃的提取率最高，超声时间和料液比分别为30min和1∶30时，其提取率最高。因此可以选择其作为响应面设计的3个因素。
3.4BBD实验结果与分析
3.4.1统计分析与模型拟合
在单因素实验结果的基础上，采用3因素3水平的BBD实验，以提取温度、时间和料液比3个因素为独立变量，以总黄酮提取率为响应值的17个实验，如表2的BBD实验设计与结果。对实验数据进行分析，其得到的回归方程为Y＝12.07+0.95X1+0.28X2+0.42X3-0.15X1X2-0.47X1X3+5.00×10-3X2X3-4.50×10-3X12-0.39X22-0.49X32
从表3回归模型方差分析可得，整体模型的模型F值为28.08，P<0.0001，说明该模型具有统计学意义；失拟项的P值为0.0752，说明失拟项不显著，该模型对实验结果影响不显著，则模型良好；模型的R2＝0.9730，Radj2＝0.9384，表明模型的拟合度较好，可以解释该模型93.84％的响应值变化；精密度为18.125>4，则更进一步表明了该模型设计比较合理。A(温度)、B(时间)、C(料液比)、AC、B2、C2的P值均小于0.05，说明温度、提取时间、液料比对总黄酮的提取率有显著影响。
表2
Figure BDA0002956244680000081
表3
Figure BDA0002956244680000082
Figure BDA0002956244680000091
3.4.2RSM分析
三维响应面图可以显示相互自变量对响应变量的影响，可以通过观察曲面的倾斜度，从而确定两者对响应值的影响，倾斜度越大，坡度越大，说明两者的相互作用越显著。从图8的AB作用图可以看出，随着温度的升高，提取率也明显提升，可能因为随着温度的升高可以降低粘度和表面张力，而且黄酮类化合物一般提取的温度较高，并且温度的升高可以加快分子的运动，这样有利于该成分的溶出；但是随着时间的推移，提取率只有很小的改变，说明两者的交互作用对其提取率的影响不大。从图9的AC作用图可以看出，响应曲面有较好的倾斜度，则说明两者的交互作用对提取率有较大的影响；料液比随着温度的升高，提取率也显著提高，但过量的溶剂也会使其他成分溶出，导致目标化合物的含量降低。图10的BC作用图可以看出，时间和料液比两者之间的响应交互曲面比较平，则可以直观的看出两者的交互作用对其提取率的影响不大。
根据拟合方程与模型优化提取因素，得到总黄酮的优化提取条件为：提取温度为79.89℃，时间为27.70min，料液比为1∶30.73，此条件下的预测结果为12.88％。为了实验的方便进行，对三个因素进行以下修改：提取温度为80℃，时间为28min，料液比为1∶31。为了验证预测总黄酮提取率的准确性，在最佳提取条件下平行提取3次，结果为12.80％，与预测值非常接近，说明该模型优选的提取工艺可靠，可以用于草珊瑚总黄酮的提取。
综上所述，本发明提供一种新型溶剂DESS对草珊瑚总黄酮进行超声提取的工艺。其中选取氯化胆碱作为DESS的固定HBA，氯化胆碱与其它的HBA相比较更具有无毒性和适用性，并根据相关文献的研究报道，筛选乙二醇、丙三醇、1,4-丁二醇和乳酸作为HBD。实验结果表明氯化胆碱和乙二醇结合提取率最高，可能因为两者能很好地以氢键的形式结合在一起，氯化胆碱和乙二醇的摩尔比为1∶4时提取率最好，适当的摩尔比可以使两者具有更好的表面张力，并且当含水量为20％时提取率最好，可能是因为少量的水可以增加溶剂的极性和降低其粘性。
本发明对DESS的成分、摩尔比以及含水量进行筛选，确定了最适合的DESS，并且与传统乙醇比较，DESS的提取效果更好，并且该溶剂更具有无毒性，对环境污染小；对超声条件进行了单因素实验，并选取超声温度、时间和料液比作为考察因素，再通过响应面设计进一步优化得到超声辅助提取最优条件：提取温度为80℃，时间为28min，料液比为1∶31。本发明优选DESS结合超声辅助提取法提取草珊瑚总黄酮工艺，该工艺稳定、可靠，对中药草珊瑚资源的开发利用具有重要意义，也对其他中药药效成分的提取提供一定参考。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种提取草珊瑚总黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、制备低共熔溶剂；
所述低共熔溶剂为摩尔比为1∶4的氯化胆碱和乙二醇混合的水溶液，所述低共熔溶剂含水质量分数为20％；
步骤2、将草珊瑚粉末加入制备好的低共熔溶剂，离心取得上清液，即得草珊瑚总黄酮提取液。
2.根据权利要求1所述的提取草珊瑚总黄酮的方法，其特征在于，所述离心具体为：以3500r/min离心15min。
3.根据权利要求1所述的提取草珊瑚总黄酮的方法，其特征在于，所述超声条件为：提取温度为79-81度，时间为27-29min，料液比为1∶30-32。
4.根据权利要求1所述的提取草珊瑚总黄酮的方法，其特征在于，所述超声条件为：提取温度为80度，时间为28min，料液比为1∶31。
5.根据权利要求1所述的提取草珊瑚总黄酮的方法，其特征在于，所述草珊瑚粉末的制备方法为：将草珊瑚药材洗净、干燥、粉碎，过60目号筛，得草珊瑚粉末。
6.根据权利要求1所述的提取草珊瑚总黄酮的方法，其特征在于，制备低共熔溶剂的方法为：将氯化胆碱和乙二醇置于容器中进行于恒温磁力加热搅拌，直至形成均一透明的溶剂，即得低共熔溶剂。
7.根据权利要求6所述的提取草珊瑚总黄酮的方法，其特征在于，恒温磁力加热搅拌的加热温度为75-85度。
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刘珊等: "新型绿色低共熔溶剂用于金钱草总黄酮的提取研究", 《时珍国医国药》 *
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CN113599424A (zh) * 2021-08-22 2021-11-05 海南大学 一种鸡屎藤酚类物质的提取方法及其应用

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