CN113061189A - 基于cbm与纤维素特异性结合的生物传感元件 - Google Patents

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Abstract

本发明利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特性构建融合蛋白，融合蛋白包括葡萄糖氧化酶和CBM，进而以纳米纤维素膜作为融合蛋白的固定化载体，用于制备生物传感元件，所得到的生物传感元件能够表现出良好的催化特性和检测稳定性。

Description

基于CBM与纤维素特异性结合的生物传感元件
技术领域
本发明涉及氧化还原酶基因与碳水化合物结合模块(CBM)基因通过连接 肽(linker)基因连接，构建氧化还原酶-linker-CBM融合酶，并利用融合酶制 备纳米纤维素载体膜特异性结合的生物传感元件，属于生物酶基因工程和生物 传感技术领域。
背景技术
氧化还原酶是生物传感器中关键的检测敏感元件，其有效固定在载体表面 且能持久、高效地保持其活性状态，是生物传感器高稳定性和高灵敏度的重要 保证。酶分子元件在电极表面固定化通常是利用物理吸附或共价结合等方式将 酶分子随机固定在面积不到一平方厘米的载体膜上。但是，生物活性酶分子具 有空间三维结构，结合底物的活性中心具有特定取向，酶分子通过非特异性物 理吸附或共价结合与载体相互作用常隐藏掉酶分子活性中心或使其不能正确 取向，导致酶活大量损失，生物传感器稳定性较差。
近年来，利用生物亲和吸附进行酶的固定化引起越来越多的关注，其最大 优势是酶分子可与载体材料特异性结合、固定化方向可控以及酶分子构象改变 最小。碳水化合物结合模块(Carbohydrate-Binding Modules，CBM)是天然碳 水化合物活性酶分子中没有催化活性，但能在酶分子识别和定向结合底物中发 挥重要作用的功能模块，CBM数量众多，对结晶或非晶纤维素、几丁质、木 聚糖等多糖具有结合特异性，目前碳水化合物活性酶数据库 (http://www.cazy.org)收录了大约10万条CBM序列，根据氨基酸序列相似 度(>30％)归入86个家族，92个CBM结构得到解析 (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)。在天然酶分子中CBMs可以以单独 模块或者位于同一家族或不同家族的串联模块连接到催化模块N端或C端， 随着分子生物学、合成生物学、计算机辅助模拟等技术发展，目前研究者基于序列结构等生物大数据的挖掘与分析，结合动力学模拟分析蛋白质整体与局域 分子动态学行为，建立CBM与目标酶分子的精准嫁接的杂合体文库，并利用 融合DNA技术试图获得多种多样CBM与酶分子融合蛋白，以此提高酶分子 与底物亲和力、酶分子稳定性或酶活。利用CBM对纤维素的特异亲和吸附特 性构建融合酶，并以纳米纤维素膜作为融合酶分子固定化载体，提高酶电极传 感器稳定性的改造策略目前国内外几乎未见报道。
发明内容
本发明提供了一种用于生物传感元件的融合蛋白，所述融合蛋白包括葡萄 糖氧化酶和碳水化合物结合模块(CBM)。
在一个实施方式中，所述葡萄糖氧化酶(GOD)和CBM通过连接肽连接。
在一个实施方式中，所述GOD来源于Aspergillus niger An76，优选的，所 述GOD的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因序列如SEQ ID No.2 所示。
在一个实施方式中，所述CBM选自第2家族CBM，优选的，所述CBM 的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其编码基因序列如SEQ ID No.4所示。
所述连接肽选自(GGGGS)2、(EAAAK)3或选自Thermobifida fusca基因组 中内切-β-木聚糖酶(EM_PRO:Z81013.1)中连接催化结构域和CBM2结构域的 天然linker序列中的一种或任意几种；优选的，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码基因如SEQID No.6所示。
在优选的实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
另一方面，本发明还提供了上述融合蛋白的编码基因，所述融合蛋白的编 码基因序列如SEQ ID No.8所示。
另一方面，本发明还提供了上述融合蛋白的制备方法，其包括将编码基因 转化到毕赤酵母中，然后进行表达纯化的步骤。
另一方面，本发明还提供了一种基于CBM与纤维素特异性结合的生物传 感元件，所述生物传感元件包括上述用于生物传感元件的融合蛋白。
进一步的，所述生物传感元件还包括纤维素膜。
另一方面，本发明还提供了上述用于生物传感元件的融合蛋白在制备生物 传感元件中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种制备基于CBM与纤维素特异性结合的生 物传感元件的方法，所述方法包括将上述融合蛋白与纤维素膜接触制备成为融 合蛋白与纤维素膜的复合物、然后将复合物固定到电极上的步骤。
在优选的实施方式中，在所述融合蛋白与纤维素膜的复合物中，所述纤维 素膜作为融合蛋白的固定化载体。在优选的实施方式中，将上述融合蛋白溶液 添加到纤维素膜上，干燥后即得到固定了融合蛋白的纤维素膜，然后将固定了 融合蛋白的纤维素膜固定到电极上即得到上述生物传感元件。
序列信息如下：
SEQ ID No. 描述
1 GOD氨基酸序列
2 GOD核酸序列
3 CBM氨基酸序列
4 CBM核酸序列
5 连接肽氨基酸序列
6 连接肽核酸序列
7 GOD-NL-CBM2氨基酸序列
8 GOD-NL-CBM2核酸序列
附图说明
图1.SDS-PAGE检测异源表达的葡萄糖氧化酶；其中(a)预测的野生型葡 萄糖氧化酶(GOD)结构；(b)预测的融合葡萄糖氧化酶(GOD-NL-CBM2)结构； (c)条带M:蛋白标准物，50mM咪唑洗脱GOD的SDS-PAGE检测图谱；(d)20 mM咪唑洗脱GOD-NL-CBM2的SDS-PAGE检测图谱；(e)浓缩GOD和 GOD-NL-CBM2的SDS-PAGE检测图谱。
图2.GOD和GOD-NL-CBM2最适温度、最适pH测定；(a)，(b)分别为 GOD、GOD-NL-CBM2和固定化GOD-NL-CBM2最适pH、最适温度测定；(c)， (d)分别为SDS-PAGE检测不同pH、不同温度反应体系下GOD和纤维素反应 后上清中蛋白含量；(e)，(f)分别为SDS-PAGE检测不同pH、不同温度反应体 系下GOD-NL-CBM2与纤维素混合上清中蛋白含量。
图3.纤维素膜未与或与葡萄糖氧化酶反应后形貌和组成特征分析；(a1)， (a2),(a3)分别为未与葡萄糖氧化酶反应的纤维素膜SEM，EDS和FTIR检测 结果；(b1)，(b2)，(b3)分别为纤维素膜与GOD反应后的SEM，EDS和FTIR 检测结果；(c1)，(c2)，(c3)分别为纤维素膜与GOD-NL-CBM2反应后的SEM， EDS和FTIR检测结果。
图4.GOD-NL-CBM2/纤维素膜生物电极电化学行为分析；(a)利用橡胶圈 将固定化GOD-NL-CBM2的纤维素膜固定于铂电极(H2O2电极)上的模式图；(b) 裸电极、纤维素膜/电极、GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极ESI检测结果；(c) GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极在PBS和40mM葡萄糖溶液中的循环伏安图。
图5.GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极对葡萄糖的电流响应结果；(a)，(b)， (c)，(d)分别为葡萄糖浓度在1.25mM-5mM，2.5mM-10mM，5.0mM-20mM， 10mM-40mM范围内。
图6.GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极的底物选择性、抗干扰能力和重现性 分析；(a)GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极与不同种类糖反应的即时电流I-T曲 线；(b)干扰物对GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极的检测信号影响；(c)3组 GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极与依次添加不同体积的40mM葡萄糖反应的即 时电流I-T曲线；(d)3组GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极分别与依次添加不同体 积的40mM葡萄糖反应后的电流信号平均值与葡萄糖添加体积之间的相关系 数(R2)分析；(e)3组GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极与依次添加不同体积的5 mM葡萄糖反应的即时电流I-T曲线；(f)3组GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极分 别与依次添加不同体积的5mM葡萄糖反应后的电流信号平均值与葡萄糖添加 体积之间的相关系数(R2)分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较 佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员 可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离 本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或 等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、CBM与GOD的融合表达
选取CBM1、CBM2、CBM3、CBM5、CBM10家族里对纤维素具有结合 特异性的CBMs序列，利用结构生物信息学分析工具(SWISS-MODEL、ClustalX、 VMD及PyMOl软件)对不同CBMs的氨基酸频率、功能架构序列谱等信息 进行统计分析，筛选出Thermobifida fusca中的CBM2用于杂合酶构建。
基于CBM2和GOD结构特点分析，从LinkerDB数据库中选择融合酶分子 linker序列((GGGGS)2、(EAAAK)3)，同时选择Thermobifida fusca基因组中 内切-β-木聚糖酶(EM_PRO:Z81013.1)中连接催化结构域和CBM2结构域的天 然linker序列(LGGDSSGGGPGEPGGPGGPGEPGGPGGPGEPGGPGDGT)； 通过FPMOD工具模建不同linker连接或无linker连接的融合蛋白结构，并利 用Gromacs动力学模拟工具构建融合蛋白动力学模拟体系，分析融合酶波动均方根、回旋半径、氢键、蛋白质二级结构体系能量等参数，筛选出 GOD-NL-CBM2结构稳定的融合酶分子进行后续异源表达，所述 GOD-NL-CBM2中，GOD和CBM2的连接肽(linker)序列为 “LGGDSSGGGPGEPGGPGGPGEPGGPGGPGEPGGPGDGT”，预测的GOD和 GOD-NL-CBM2结构如图1a,1b所示。
以Aspergillus niger An76总cDNA为模板设计引物PCR获得编码GOD的 g9669.t1基因，以质粒pUC57-DNA为模板设计引物获得编码linker以及CBM2 的基因。按照南京诺唯赞同源重组试剂盒方法获得GOD-NL-CBM2融合酶基 因，GOD-NL-CBM2融合酶基因以pPIC9K质粒为表达载体，以Pichia pastoris GS115为表达宿主，实现GOD-NL-CBM2融合酶高效表达。
(1)Aspergillus niger An76总cDNA提取：
对Aspergillus niger An76菌株在液体培养基(NaNO3 0.595％，KCl 0.0522％，KH2PO4 0.1497％，MgSO4.7H2O 0.0493％，酵母粉0.5％，酪氨酸0.2％)中30℃ 培养36h，取20mL菌液收集菌体，按照RNA提取试剂盒方法提取总RNA， 以反转录试剂盒方法将Aspergillus niger An76 RNA反转录为cDNA；
(2)GOD-NL-CBM2融合酶基因克隆：
利用同源重组的原理和Pichia pastoris GS115克隆位点附近序列，分别根据NCBI中g9669.t1基因序列和pUC57-NL-CBM2基因序列设计引物P1，P2和 P3，P4两对引物：
P1:5’-gctgaagcttacgtagaattcctcccacactacatcaggagca-3’
P2:5’-gaggtggtggtggtggtggtgc-3’
P3:5’-accaccaccaccaccacctcggcggcgactcctcc-3’
P4:5’-aaggcgaattaattcgcggccgctcagtggtggtggtggtggt-3’
以An76基因组cDNA为模板，以P1，P2为引物，PCR扩增获得GOD基 因，以pUC57-NL-CBM2基因为模板，以P3和P4为引物，PCR扩增获得连 接肽和CBM2基因。PCR反应在50μL体系(参照
Figure BDA0002715875090000061
Max Super-Fidelity DNA Polymerase)中进行，反应条件为在95℃预变性3min开始循环，95℃变 性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环后，再于72℃延伸5min。 分别扩增得到g9669.t1基因和NL-CBM2基因PCR片段，割胶回收(产物纯化 试剂盒纯化)。然后利用南京诺唯赞
Figure BDA0002715875090000071
One Step Cloning Kit产 品将g9669.t1基因和NL-CBM2基因PCR割胶回收片段连接到pPIC9k质粒载 体上，反应体系为10μL(1μL线性化载体，2μL g9669.t1基因PCR片段，1.5 μL NL-CBM1基因PCR片段，5μL 2×ClonExpressMix，0.5μL ddH2O)，吸打 混匀后，50℃反应15min，立即置于冰上冷却，即得pPIC9k-GOD-NL-CBM2融 合酶基因重组产物。
(3)pPIC9k-GOD-NL-CBM2融合酶基因转化大肠杆菌富集质粒
将pPIC9k-GOD-NL-CBM2融合酶基因重组产物与大肠杆菌DH5α混合， 热激90s后涂布于100ug/mL氨苄抗性的LB琼脂培养平板上，37℃过夜培养。 挑取单菌落，然后提取质粒电泳检测，并在-20℃保存质粒。再利用EcoRI与 NotI酶切检测目的片段，之后送菌悬液由公司进行测序，将测序正确的质粒以 同样方法转化大肠杆菌实现质粒富集。
(4)pPIC9k-GOD-NL-CBM2转化毕赤酵母宿主菌
接种毕赤酵母GS115单菌落到含有5mL YPD液体培养基的试管中，30℃ 过夜培养。按1％接种量转接到含有50mL YPD液体培养基的三角瓶，30℃培 养过夜，直到OD600＝1.3～1.5；1500g，4℃条件下离心培养液5min，弃上清 液，利用50mL冰浴双蒸水重悬细胞；1500g，4℃条件下离心培养液5min， 弃上清液，利用25mL冰浴双蒸水重悬细胞；1500g，4℃条件下离心培养液5 min，弃上清液，用2mL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞；1500g，4℃条件下离心培养液5min，弃上清液，用100μL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细 胞，使菌悬液体积大约为150μL；将80μL处理好的感受态细胞和5～20μg 经过bglI线性化了的pPIC9k-GOD-NL-CBM2质粒加入一个1.5mL预冷离心管 中，混匀。然后把混合液转移入预先冰浴的转化杯中(0.2cm型)；冰浴装有 转化混合液的转化杯5min；按照biorad毕赤酵母电转参数设置电转化仪，并 启动电脉冲，脉冲后立即往转化杯中加入1mL冰浴的1M的山梨醇溶液，然 后把转化液转入一个新的1.5mL离心管中；30℃静置培养2h。吸取GS115转 化液100μL涂布MD平板，30℃培养，直到转化子出现。对转化的MD平板 上的单克隆进行菌落PCR验证，确保外源基因的整合。
(5)GOD-NL-CBM2融合酶基因诱导表达
接种筛选出来的毕赤酵母重组子于5mL BMGY液体培养基中，30℃，250 rpm，振荡培养过夜；取500μL过夜培养物转接于50mL BMGY液体培养基 中，30℃，250rpm，振荡培养至OD600＝2～6(对数生长期，大约16-18h)； 3000g，离心5min，弃上清，用BMMY液体培养基重悬细胞至OD600＝1.0， 甲醇终浓度为1％)置于500mL三角瓶中，用8层灭菌纱布封口，30℃，250rpm， 振荡培养；SDS-PAGE检测有无外源基因的表达。
(6)GOD-NL-CBM2融合酶分离纯化
将SDS-PAGE检测到目的蛋白表达的粗酶液与含有镍的填料混合，于4℃ 冰箱中转动结合6h。然后用浓度为5mM、10mM的咪唑溶液洗脱杂蛋白， 用20mM咪唑溶液洗脱目的蛋白，SDS-PAGE检测目的蛋白，GOD-NL-CBM2 的分子量明显大于野生型GOD的分子量(图1c-1e)，说明CBM2已成功融合 到GOD酶分子上。用3K超滤管、pH 5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液超滤20 mM咪唑洗脱下来的蛋白溶液，4900rpm，4℃，直至流下来的缓冲液的pH为 5.0，停止超滤，收集超滤获得的GOD-NL-CBM2融合酶溶液(1mg/mL,200 U/mL)，测定融合酶的最适pH(5.0)、最适温度(50℃)(图2a,2b)。利用 SDS-PAGE检测GOD-NL-CBM2中CBM2与纤维素的最适作用温度、最适作 用pH结果显示，在最适催化条件(pH 5.0，50℃)下CBM2保持最适结合活 性(图2c-2f)。
实施例3、GOD-NL-CBM2/纤维素膜形貌及组分检测
采用扫描电镜(SEM)、能谱仪(EDS)和红外光谱(FTIR)对纤维素膜(硝 酸纤维素和醋酸纤维素混合而成)未与或与葡萄糖氧化酶反应后形貌和组成特 征分析结果显示，纤维素纳米纤维形成的三维结构中存在不同的微米和纳米尺 寸的孔洞，同时，直径约为200nm的纳米纤维也呈多孔状态(图3a1)。当GOD 与纤维素膜反应后，纳米纤维的直径增大，这可能是由于缓冲液的膨胀作用， 但纳米纤维中的气孔仍然明显，尺寸没有明显变化(图3b1)。相反，当 GOD-NL-CBM2与纤维素膜相互作用后，可以观察到明显的形态变化，纳米纤 维的表面看起来更加光滑(图3c1)。
当纤维素膜未与葡萄糖氧化酶反应时，其C,N,O元素的比例为54.4％，2.5％ 和43.2％，而分别与GOD和GOD-NL-CBM2反应后，C的比例下降至47.1％， 44.3％，N的比例增加至3.6％，4.9％，O的比例增加至49.3％，50.8％。众所 周知，N在蛋白质中的比例高于碳水化合物，因此，EDS分析结果为 GOD-NL-CBM2在纤维素膜上成功固定化提供了初步证据。
FTIR检测结果显示纤维素膜具有硝基和醋酸纤维素的特征峰(828cm-1， 1279cm-1，1638cm-1，1050cm-1)(图3a3)，当纤维素膜与GOD反应后，特 征峰没有显示出明显的变化(图3b3)，然而，当GOD-NL-CBM2和纤维素反应 后，在3386cm-1处出现一个明显的酰胺-NH-峰(图3c3)，这进一步证实了 GOD-NL-CBM2固定到纤维素膜上。
实施例3、GOD-NL-CBM2融合酶传感元件性能检测
利用打孔器将纤维素膜打成“O”型片，并粘到橡胶圈上，制成酶膜圈， 将20μLGOD-NL-CBM2融合酶溶液直接滴加到酶膜圈上，室温干燥4h后， 将酶膜圈固定到电极(H2O2电极)上进行性能检测(图4a)。
通过对裸电极、纤维素膜修饰电极和GOD-NL-CBM2/纤维素膜修饰电极 在电化学探针溶液中的法拉第电荷转移电阻(Rct)检测结果显示，相比于裸 电极的Rct(605.8Ω)，纤维素膜修饰电极的Rct增大(639.6Ω)， GOD-NL-CBM2进一步与纤维素膜作用后Rct明显增大(890.6Ω)。由于纤维 素的导电能力较低，因此纤维素膜修饰电极的Rct大于裸电极。此外，酶通常 是绝缘的，酶负载后Rct的增加间接反映了GOD-NL-CBM2被成功固定在纤维素膜上(图4b)。
采用三电极体系对酶电极的电化学性质进行检测和探究，在电位范围为0-1.0V时，依次对带有酶膜的电极在pH 7.0的PBS缓冲液和1mg/mL葡萄糖 溶液中进行循环伏安法扫描检测，结果显示在PBS缓冲液中没有氧化还原峰的 出现，而当葡萄糖存在时在+0.6V处检测到一处明显的H2O2峰(图4c)，说明 融合CBM2后没有改变GOD酶分子的催化活性，仍然可以产生H2O2。进一步 通过计时电流法(IT)检测酶膜对不同浓度葡萄糖(1.25mM-5mM，2.5mM-10 mM，5.0mM-20mM，10mM-40mM)响应结果显示GOD-NL-CBM2融合酶 传感元件具有较好的电催化特性，葡萄糖线性检测范围为1.25mM-40mM(R2≥0.99)(图5a-5d)，检测限0.475mM(S/N＝3)，灵敏度466.7μA.mol-1.L.cm-2。
对GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极的底物选择性和抗干扰能力探究结果显 示，不同种类的糖(D-木糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、 D-鼠李糖、D-海藻糖、D-乳糖、D-麦芽糖)与电极反应并未检测到明显的反应 电流信号(图6a)。但在葡萄糖中添加抗坏血酸(AA,50μM)、尿酸(UA,0.2mM) 时，能引起明显的变化(23.6％、30％)，而添加尿素(2mM)则没有引起显著的变 化(1％)(图6b)，酶电极的抗干扰能力还需要进一步提高。
此外，通过连续两个月每天测定GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极电流响应 信号变化结果表明，在第2天，电流信号比初始电流信号下降了10％，而在持 续的测定中，电流信号下降缓慢，2个月后，约保留80％初始电流信号，酶膜 寿命>60天，连续测定8000次以上。进一步对三组采用相同方式制备的 GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极重现性进行检测显示，当分别添加不同体积的 40mM或5mM葡萄糖(图6c-6f),添加体积小于35μL时，三组电流信号值相近(RSD<5％),表明GOD-NL-CBM2/纤维素膜/电极具有较高的重现性。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省科学院生物研究所
<120> 基于CBM与纤维素特异性结合的生物传感元件
<130> 111
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 589
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 1
Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Pro Lys Glu Val Ala Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly
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Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro
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65 70 75 80
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<212> DNA
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gctgcccgtc tgacggagaa ccccgatatc actgtgcttg tcatcgaaag tggctcctac 180
gagtctgaca gaggtcctat cattgaggac ctgaacgctt acggtgacat ttttggcagc 240
agtgtggacc acgcctacga gactgtcgag ctcgccacca acaatcagac tgcgctgatc 300
cgctccggaa atggtctcgg tggctctacc ctcgtcaacg gtggcacctg gactcgcccc 360
cacaaggcac aagttgactc atgggagacc gtcttcggaa atgagggctg gaactgggac 420
agcgtggccg cctactccct ccaggctgag cgtgctcgcg caccaaatgc caaacagatt 480
gctgctggcc actactttaa tgcatcctgc catggtatca atggtactgt ccacgccgga 540
ccccgcgata ccggtgatga ctactccccc atcgtcaagg ctctcatgag cgctgtcgaa 600
gacaggggcg ttcccaccaa gaaggacttg ggatgcggtg acccccatgg tgtgtccatg 660
ttccccaaca ccttgcacga agaccaagtg cgctctgatg ccgctcgcga atggctcctc 720
cccaactacc agcgtcccaa cctgcaagtc ctcactggac agtatgttgg aaaggtcctg 780
ctcagccaga acgctaccac acctcgtgcc gttggcgtgg aattcggcac ccacaagggc 840
aacacccaca acgtctacgc taagcacgag gtcctcctgg ccgctggatc cgctgtctct 900
cccaccatcc tcgaatattc cggtatcgga atgaagtcca ttctagagcc tcttggaatt 960
gacaccgtcg ttgacctgcc cgttggtctc aaccttcagg accagaccac ctctaccgtc 1020
cgctcacgca ttacctccgc cggtgccgga cagggacagg ccgcttggtt cgctaccttc 1080
aacgagacct ttggcgacta cgccgaaaag gctcacgagc tgctcaacac caagctggag 1140
cagtgggccg aagaggccgt cgcccgtggc ggattccaca acaccaccgc tttgctcatc 1200
cagtacgaga actaccgcga ctggatcgtc aaggacaatg tcgcatactc ggaactcttc 1260
ctcgacacgg ccggagtggc cagtttcgat gtgtgggatc ttctgccctt cactagagga 1320
tacgtacaca tcctcgacaa ggacccctac ctccgccatt tcgcatacga ccctcagtac 1380
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<210> 3
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<212> PRT
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<220>
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Gly Asp Gly Thr Cys Ala Val Asn Tyr Thr Val Val Asn Asp Trp Gly
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Ile Asn Asn Trp Thr Leu Gln Phe Ser Phe Ser Gly Val Asn Ile Ser
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Asn Gly Trp Asn Gly Glu Trp Ser Gln Ser Gly Ser Gln Ile Thr Val
65 70 75 80
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CBM
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tcc 363
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
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Gly Gly Pro Gly Glu Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Glu Pro Gly
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35
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 6
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GOD-NL-CBM2
<400> 7
Leu Pro His Tyr Ile Arg Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr
1 5 10 15
Asp Pro Lys Glu Val Ala Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly
20 25 30
Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro
35 40 45
Asp Ile Thr Val Leu Val Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg
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Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser
65 70 75 80
Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln
85 90 95
Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val
100 105 110
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145 150 155 160
Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala Ser Cys His Gly Ile Asn Gly Thr
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Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys
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Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu
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275 280 285
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Pro Tyr Leu Arg His Phe Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu
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Gln Met Ser Ser His Val Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys
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Ile Ala Asp Ala Ile Leu Ala Asp Tyr Ala Ser Met Gln Leu Gly Gly
580 585 590
Asp Ser Ser Gly Gly Gly Pro Gly Glu Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro
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Gly Glu Pro Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Glu Pro Gly Gly Pro Gly
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Pro Ser Gln Phe Thr Leu Asn Gly Ala Thr Cys Ser
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<210> 8
<211> 2244
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GOD-NL-CBM2
<400> 8
ctcccacact acatcaggag caatggcatc gaagccagcc tcctgactga ccccaaggag 60
gttgccggcc gcactgtcga ctacatcatc gctggtggag gtctgactgg actcaccact 120
gctgcccgtc tgacggagaa ccccgatatc actgtgcttg tcatcgaaag tggctcctac 180
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ccccgcgata ccggtgatga ctactccccc atcgtcaagg ctctcatgag cgctgtcgaa 600
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ctcagccaga acgctaccac acctcgtgcc gttggcgtgg aattcggcac ccacaagggc 840
aacacccaca acgtctacgc taagcacgag gtcctcctgg ccgctggatc cgctgtctct 900
cccaccatcc tcgaatattc cggtatcgga atgaagtcca ttctagagcc tcttggaatt 960
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Claims (10)

1.一种用于生物传感元件的融合蛋白，所述融合蛋白包括葡萄糖氧化酶(GOD)和碳水化合物结合模块(CBM)，所述GOD和CBM通过连接肽连接。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述GOD来源于黑曲霉(Aspergillusniger)An76。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述CBM选自第2家族CBM。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽选自(GGGGS)2、(EAAAK)3或SEQ ID No.5所示的序列。
5.一种制备权利要求1或4任一所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括将所述融合蛋白的编码基因转化到毕赤酵母中，然后进行表达纯化的步骤。
6.一种基于CBM与纤维素特异性结合的生物传感元件，其特征在于，所述生物传感元件包括权利要求1-4任一所述的融合蛋白。
7.根据权利要求6所述的生物传感元件，其特征在于，所述生物传感元件还包括纤维素膜。
8.权利要求1-4任一所述的融合蛋白在制备生物传感元件中的应用。
9.一种制备基于CBM与纤维素特异性结合的生物传感元件的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-4任一所述的融合蛋白与纤维素膜接触制备成为融合蛋白与纤维素膜的复合物的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将复合物固定到电极上的步骤。
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