CN113057940B - 1,8-桉叶油素乳剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了1,8‑桉叶油素乳剂及其制备方法,本发明的1,8‑桉叶油素乳剂，包括以下质量配比的原料：混合油相80‑120份、乳化剂10‑15份、助乳化剂20‑30份、稳定剂5‑10份，余量为蒸馏水，所述混合油相包括1,8‑桉叶油素和其他油相，其中1,8‑桉叶油素与其他油相的质量比为1:10～10:1，1,8‑桉叶油素与混合乳化剂的质量比为1:10～10:1；其中蒸馏水的加入量为使溶液由浑浊到澄清时临界点的加入量。本发明具有扩大1,8‑桉叶油素乳剂的安全浓度范围，提高1,8‑桉叶油素药物吸收率、提高1,8‑桉叶油素的药效的特点。

Description

1,8-桉叶油素乳剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种1,8-桉叶油素的制备，特别是1,8-桉叶油素乳剂及其制备方法。
背景技术
心血管疾病发病率常年来一直位于重大疾病的前列，并呈上升态势和年轻化趋势，心血管事件引发的致死致残率极高，疾病周期长，病人对长期高频的药物治疗方案顺应性差，及高昂的护理费用等给个人、家庭和社会都带来极大的痛苦和沉重的负担。
血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)也称内皮细胞，通常指衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮，形成血管的内壁，介于血流和血管壁组织之间，具有吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，还参与集体免疫活动功能，防治血管内皮损伤是防治心血管疾病的重要措施。
现有的靶向心血管炎症因子递送系统的传统制剂，由于其与水不混溶，挥发性强，难以获得适宜的临床应用方式，极大的限制了其在临床上的应用。由于1,8-CNL通过潜在的抗炎活性机制如诱导IkBa来控制NF-κBp65的核易位，导致NF-κB活性的降低从而改善内皮细胞的功能障碍，可有效调节NF-κB活化相关炎症反应，因此本申请人前期已经研究了1,8-桉叶油素自微乳给药系统，但是该1,8-桉叶油素自微乳给药系统，其安全浓度范围较低，1,8-桉叶油素的药效不能充分发挥。
因此本申请人在1,8-桉叶油素自微乳给药系统的基础上，做了进一步的研究和实验。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种1,8-桉叶油素乳剂及其制备方法。本发明具有扩大1,8-桉叶油素乳剂的安全浓度范围，提高1,8-桉叶油素药物吸收率、提高1,8-桉叶油素的药效的特点。
本发明的技术方案：1,8-桉叶油素乳剂，包括以下质量配比的原料：混合油相80-120份、乳化剂10-15份、助乳化剂20-30份、稳定剂5-10份，余量为蒸馏水，所述混合油相包括1,8-桉叶油素和其他油相，其中1,8-桉叶油素与其他油相的质量比为1:10～10:1，1,8-桉叶油素与混合乳化剂的质量比为1:10～10:1；其中蒸馏水的加入量为使溶液由浑浊到澄清时临界点的加入量。
前述的1,8-桉叶油素乳剂中，所述其他油相包括MCT和大豆油、芝麻油、橄榄油、鱼油、菜籽油等中的至少一种，1,8-桉叶油素与其他油相的质量比为2:3～1:1；所述乳化剂包括吐温-80、HS15、大豆磷脂、泊洛沙姆188的一种或者多种混合物，其中任意两种的比例为1:2～1:4；助乳化剂包括甘油或者无水乙醇中的至少一种；所述稳定剂包括油酸和油酸钠中的至少一种。
前述的1,8-桉叶油素乳剂中，包括以下质量配比的原料：1,8-桉叶油素50份、大豆油50份、HS153份、大豆磷脂9份、甘油25份、油酸5份，余量为蒸馏水，蒸馏水的加入量为使溶液由浑浊到澄清时临界点的加入量。
前述的1,8-桉叶油素乳剂中，还包括按质量份数计的硬脂酸0.3-1份。
前述的1,8-桉叶油素乳剂中，包括以下质量配比的原料：1,8-桉叶油素40份、MCT20份、大豆油40份、HS154份、大豆磷脂8份、甘油25份、油酸3份、油酸钠3份、硬脂酸0.5份，余量为蒸馏水，蒸馏水的加入量为使溶液由浑浊到澄清时临界点的加入量。
上述的1,8-桉叶油素乳剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将水溶性的乳化剂、助乳化剂、蒸馏水加热至50-70℃混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-25℃，得水相；
步骤二、将其他油相、稳定剂和大豆磷脂，在50-70℃下混合超声至大豆磷脂融解，再加入1,8-桉叶油素混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-25℃，得油相；冰浴冷却，降低温度，避免桉叶油素挥发。
步骤三、将油相缓慢注入水相并在10000r/min的转速下高速剪切1-15min得到初乳，调节pH至5-9，以30-1000MPa压力下高压均质，制得外观为乳白色体系均一的成品。
前述的1,8-桉叶油素乳剂的制备方法中，具体包括以下步骤：
步骤一、将水溶性的乳化剂、助乳化剂和蒸馏水加热至60℃混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-15℃，得水相；
步骤二、将其他油相、稳定剂、大豆磷脂在60℃下混合超声至大豆磷脂融解，再加入1,8-桉叶油素混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-15℃，得油相；
步骤三、将油相缓慢注入水相并以10000r/min的转速下高速剪切7min得到初乳，调节pH至8，以100MPa压力下高压均质7次，制得制得外观为乳白色体系均一的1,8-CNL-LM。
前述的1,8-桉叶油素乳剂中，水溶性的乳化剂采用HS15，HS15和大豆磷脂的质量比为1:3；助乳化剂采用甘油，其他油相采用大豆油，且大豆油与1,8-桉叶油素的质量比为1:1；稳定剂采用油酸。
前述的1,8-桉叶油素乳剂的制备方法，还可以是另一种制备方案，具体包括以下步骤：
步骤一、将水溶性的乳化剂、助乳化剂和蒸馏水加热至60℃混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-10℃，得水相；
步骤二、将其他油相、稳定剂、硬脂酸和大豆磷脂在60℃下混合超声至大豆磷脂融解，再加入1,8-桉叶油素混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-10℃，得油相；
步骤三、将油相缓慢注入水相并以10000r/min的转速下高速剪切7min得到初乳，调节pH至7，以50MPa压力下高压均质7min，制得制得外观为乳白色体系均一的1,8-CNL-SRLM。
前述的1,8-桉叶油素乳剂中，水溶性的乳化剂采用HS15，HS15和大豆磷脂的质量比为1:2；所述助乳化剂采用甘油；所述其他油相采用MCT和大豆油，其中MCT∶大豆油∶1,8-桉叶油素的质量比为1∶2∶2；所述稳定剂采用质量比为1:1的油酸和油酸钠。
与现有技术相比，本发明改进了起到心血管疾病的血管内皮损伤保护作用的1,8-CNL的配方和工艺，改善了1,8-桉叶油素水溶性及稳定性，使得制得的乳剂更合适于血管内皮损伤部位的靶向和富集，药物能够更好的被吸收，提高桉叶油素的药效。
经过细胞毒性实验结果表明，1,8-CNL-LM的安全浓度范围在160μg/mL以下，1,8-CNL-SRLM的安全浓度范围在40μg/mL以下。安全性更高，药物的毒副作用明显减轻，从而达到高效低毒的效果，与现有乳剂安全浓度为5-10μg/mL相比，毒性更小。
进一步，1,8-CNL-LM的离心稳定常数值较小，稳定性更好，增加1,8-CNL的细胞摄取率；1,8-CNL-SRLM不易被细胞摄取入胞，有利于开发成滞留于内皮损伤细胞外膜靶向缓释制剂，进一步改善心血管疾病临床治疗效果，为心血管疾病的治疗剂型提供新思路。
因此，本发明具有扩大1,8-桉叶油素乳剂的安全浓度范围，提高1,8-桉叶油素药物吸收率、提高1,8-桉叶油素的药效的特点。
附图说明
图1中A是肉眼可见的1,8-CNL-LM的外观图；
图1中B是透射电子显微镜下1,8-CNL-LM的外观形态图；
图2是1,8-CNL-LM的粒径分布图；
图3是1,8-CNL-LM的zeta电位分布图；
图4中A是1,8-CNL-SRLM的外观图；
图4中B是1,8-CNL-SRLM的外观形态图；
图5是1,8-CNL-SRLM的粒径分布；
图6是1,8-CNL-SRLM的zeta电位分布图；
图7中A是1,8-CNL对HUVECs的毒性作用图；
图7中B是1,8-CNL-SMEDDS对HUVECs的毒性作用图；
图7中C是空白-LM对HUVECs的毒性作用图；
图7中D是1,8-CNL-LM对HUVECs的毒性作用图；
图7中E是空白-SRLM对HUVECs的毒性作用图；
图7中F是1,8-CNL-SRLM对HUVECs的毒性作用图；
图8中A是荧光显微镜观察1,8-CNL-SMEDDS-C6在HUVECs作用4h的摄取情况图；
图8中B是荧光显微镜观察1,8-CNL-LM-C6在HUVECs作用4h的摄取情况图；
图8中C是1,8-CNL-SRLM-C6在HUVECs作用4h的摄取情况图；
图9是流式细胞仪对1,8-CNL-SMEDDS-C6在HUVECs作用4h的细胞摄取定量分析图；
图10是流式细胞仪对1,8-CNL-LM-C6在HUVECs作用4h的细胞摄取定量分析图；
图11是流式细胞仪对1,8-CNL-SRLM-C6在HUVECs作用4h的细胞摄取定量分析图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
建立性能检测方法：
1、外观形态检测方法：
肉眼查看产品的外观。
取产品稀释数倍，滴加至铜网上，用2％的磷钨酸负染10min，自然风干后用透射电子显微镜观察其形态。
2、离心稳定性Ke检测方法：
精密吸取1,8-CNL-LM50μL于10mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容至刻度，蒸馏水作为空白，在500nm处测定吸光度，记为A。精密吸取1,8-CNL-LM3mL置于离心管中，3000r/min离心10min，离心完毕后，精密吸取靠近离心管底部的脂微球50μL于10mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容至刻度，蒸馏水作为空白，在500nm处测定吸光度，记为A0。按下列公式计算Ke:
Ke＝(A－A0)/A×100％。Ke为离心稳定性常数，Ke越小，代表乳剂越稳定。
3、粒径和zeta电位检测方法：
取三批产品稀释适宜倍数，用激光粒径测定仪和zeta电位测定仪分别测定粒径大小、分布及zeta电位。
4、载药量、含量及包封率检测方法：
4.1精密称取三份产品(W0)，置于10mL量瓶中，加乙腈适量，超声5min使溶解，定容，摇匀，按照“
Figure BDA0002990855370000061
LP-C18(4.6×150mm，5μm)流速：1.0mL/min进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长：203nm；流动相为乙腈∶水＝56∶44”的色谱条件进行测定，记录峰面积，测定药物含量(W1)。根据以下公式计算载药量：载药量＝W1/W0。
4.2精密量取三个批次的产品0.04mL加入乙腈溶解，超声处理5min，并用乙腈稀释定容至10mL，0.22μm微孔滤膜过滤，计算1,8桉叶油素含量W总及RSD值。
4.3精密量取三个批次的产品3mL，置于15mL超滤管(分子截留为10000)中3000r/min离心20min，收集滤液，0.22μm微孔滤膜过滤，按照上述的色谱条件进样测定，记录峰面积。计算100mL脂微球中游离的1,8-CNL含量W游。按下式计算包封率EE％＝(W总-W游)/W总×100％。
5、小鼠急性毒性检测方法：
5.1实验动物
SPF级昆明种小鼠，体质量(18±2)g，由贵州医科大学动物实验中心提供。普通环境饲养，温度20～25℃，湿度55％～65％，自由摄食，饮水，每天通风2～3次，控制昼夜光照，保持安静，避免过多噪声及其他干扰。适应性喂养1周。
5.2预实验
取清洁级昆明种小鼠28只，雌雄各半，平均随机分成7组，每组4只，第1组为空白对照组，2-7组为不同剂量组。参照徐叔云主编的《药理实验方法学》，取质量浓度为41.6mg/mL的1,8-CNL-LM，生理盐水分别稀释成质量浓度为41.6、27.7、20.8、10.4、5.2、1.3mg/mL的药液。给药后4h内观察小鼠的死亡情况，以及14天内小鼠死亡情况用于评估小鼠的最大0％和最小100％致死量。
5.3正式实验
根据预实验的结果，在小鼠的最大0％和最小100％致死量的区间之内，设置不同质量浓度的剂量组，按1∶0.9等比稀释的成系列浓度药液。取昆明种小鼠80只，每组10只，随机分为8组，按0.1mL/10g注射量给予小鼠尾静脉注射的脂微球质量浓度为37.4、33.7、30.3、27.3、24.6、22.1、19.8、17.9mg/mL。给药后14天内观察各组小鼠的行为活动、饮食、精神状况及死亡情况。根据下列公式计算LD50、LD50的标准误差及LD50的99％平均可信限。
Figure BDA0002990855370000081
半数致死剂量标准误差
Figure BDA0002990855370000082
LD50的99％平均可信限＝LD50±5.9×LD50×SX50
实施例1：
在制备1,8-桉叶油素脂微球递送乳剂，1,8-CNL-LM乳剂时，以平均粒径(D50)及离心稳定性常数(Ke)为考察指标进行试验优化。确定1,8-CNL-LM的最佳处方，按质量份数计为：1,8-CNL50份、大豆油50份、HS153份、大豆磷脂9份、甘油25份、油酸5份，余量为蒸馏水，蒸馏水的加入量为使溶液由浑浊到澄清时临界点的加入量。
上述1,8-CNL-LM的制备方法为：
步骤一、取上述对应比例的原料，将HS15、甘油和蒸馏水加热至60℃混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-15℃，得水相；
步骤二、将大豆油、油酸和大豆磷脂在60℃下混合超声至大豆磷脂融解，再加入1,8-桉叶油素混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-15℃，得油相；
步骤三、将油相缓慢注入水相并以10000r/min的转速下高速剪切7min得到初乳，调节pH至8，以100MPa压力下高压均质7次，制得制得外观为乳白色体系均一的1,8-CNL-LM。
1,8-CNL-LM的性能评价：
1.外观形态：
肉眼可见1,8-CNL-LM为乳白色均一液体，结果如图1中A所示；1,8-CNL-LM透射电镜下可见其外观较圆整，呈球形，无集聚；结果如图1中B所示。
2.离心稳定性Ke：
测得1,8-CNL-LM的离心稳定常数Ke值为0.11±0.04。
3.粒径和zeta电位：
采用动态光散射(DLS)测量得到1,8-CNL-LM的平均粒径为(215±0.02)nm，粒径分布范围为0.11-0.56μm，Zeta电位为(-50.5±2.50)mV。结果如图2-3所示。
4.载药量、含量及包封率：
采用高效液相色谱法测得1,8-CNL-LM中1,8-CNL的载药量为(41.65±1.49)mg/g。
采用HPLC对1,8-CNL进行含量测定，结果表明，3批1,8-CNL-LM的含量测定结果分别为82％、83％、85％，即1,8-CNL平均含量为83.3％，RSD为1.49％。
采用超速离心法进行包封率的测定，结果表明，3批1,8-CNL-LM的包封率分别为98.76％、98.81％、99.54％，1,8-CNL-LM平均包封率为99.04％，RSD为0.36％。
5.小鼠急性毒性：
5.1预实验
将一组小鼠尾静脉分别注射一次不同浓度的1,8-CNL-LM后，这一组小鼠注射后即刻出现呼吸急促、抽搐症状、走路不协调或呼吸困难10分钟内死亡。剂量为208mg/kg，无小鼠死亡。14天内无小鼠死亡。小鼠的最大0％和最小100％致死量分别为208mg/kg和416mg/kg，结果见表1，其中表中的n表示小鼠只数。
表1小鼠急性毒性试验给药剂量与小鼠死亡率(n＝4)
Tab.1 Acute toxicity test in mice dose and mouse mortality(n＝4)
Figure BDA0002990855370000101
5.2正式实验：
小鼠尾静脉注射一次给药后，1,8-CNL-LM的剂量为374、337、303、2736、246、221mg/kg的部分小鼠即刻出现呼吸急促、抽搐症状、走路不协调，继而出现安静、俯伏、垂睑等症状，之后相继有小鼠死亡，30min内小鼠死亡，给药剂量越大症状越显著，小鼠死亡无性别差异。用综合法计算小鼠半数致死剂量及LD50的99％平均可信限。
实验结果表明，经计算得半数死亡剂量的标准误差为0.0102，LD50＝239.7mg/kg及LD50的99％平均可信限为239.7±14.4251mg/kg，见表2和表3。
表2小鼠急性毒性试验给药剂量与小鼠死亡率(n＝10)
Tab.2 Acute toxicity test in mice dose and mouse mortality(n＝10)
Figure BDA0002990855370000102
Figure BDA0002990855370000111
表3 1,8-CNL-LM小鼠急性毒性实验LD50计算数据表
Tab.3 LD50 calculation data ofacute toxicity experiment of 1,8-CNL-LMin mice
Figure BDA0002990855370000112
各剂量组小鼠给药后7d，14d体质量正常增长。
实施例2：
在制备1,8-桉叶油素缓释脂微球递送乳剂，1,8-CNL-SRLM乳剂时，以平均粒径(D50)及离心稳定性常数(Ke)为考察指标进行试验优化。确定1,8-CNL-SRLM的最佳处方，按质量份数计为：1,8-桉叶油素40份、MCT20份、大豆油40份、HS154份、大豆磷脂8份、甘油25份、油酸3份、油酸钠3份、硬脂酸0.5份，余量为蒸馏水，蒸馏水的加入量为使溶液由浑浊到澄清时临界点的加入量。
上述1,8-CNL-SRLM的制备方法为：
步骤一、取上述对应比例的原料，将HS15、甘油和蒸馏水加热至60℃混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-10℃，得水相；
步骤二、将MCT、大豆油、油酸、油酸钠和大豆磷脂在60℃下混合超声至大豆磷脂融解，再加入1,8-桉叶油素混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-10℃，得油相；
步骤三、将油相缓慢注入水相并以10000r/min的转速下高速剪切7min得到初乳，调节pH至7，以50MPa压力下高压均质7min，制得制得外观为乳白色体系均一的1,8-CNL-SRLM。
1,8-CNL-SRLM的药学性能评价：
1.外观形态：
肉眼观察1,8-CNL-SRLM呈乳白色均一液体，结果如图4中A所示。透射电镜图下观察到1,8-CNL-SRLM呈类圆形，无集聚黏连，清晰可见表面有一层物质附着。如图4中B所示。
2.离心稳定性Ke：
测得1,8-CNL-SRLM的的离心稳定常数Ke值为0.25。
3.粒径及Zate电位测定：
采用动态光散射(DLS)测量得到1,8-CNL-SRLM的平均粒径为300nm，粒径范围为0.18-0.64μm，粒径较小，粒径范围较窄。1,8-CNL-SRLM的平均zeta电位为(0.36±3.87)mV。结果见图5-6所示。
4.载药量及包封率测定：
采用高效液相色谱法测定1,8-CNL-SRLM的载药量为28.50、32.38、30.14mg/g，均数为30.34mg/g，RSD为5.24％。
采用超速离心法进行包封率的测定，3批1,8-CNL-SRLM的包封率分别为95.16％、95.78％、95.16％，1,8-CNL-SRLM的平均包封率为95.37％，RSD为0.30％。
细胞毒性及细胞摄取试验：
分别对实施例1、实施例2、对照组1,8-CNL-SMEDDS和空白组1,8-CNL进行细胞毒性及细胞摄取试验；
其中对照组1,8-CNL-SMEDDS按照质量份数计，包括以下成分：1,8-CNL22.5份、LCT7.5份、HS1556份、乙醇14份。制备方法为：取原料混合，在旋涡状态下逐滴加入蒸馏水，得半透明略带蓝色乳光的1,8-CNL-SMEDDS乳剂。其平均粒径为(131.68±1.44)nm，Zeta电位为(-10.03±1.63)mV。
1方法：
1.1HUVECs的培养、复苏、传代、冻存
1.1.1HUVECs的培养
人脐静脉内皮细胞培养于含有5％FBS、1％青霉素/链霉素的ECM培养液中，培养环境含37℃，5％CO2，95％湿度的培养箱。
1.1.2HUVECs的复苏
将冻存于液氮的细胞迅速放入提前准备的37℃水中迅速解冻，解冻的内皮细胞用移液枪从冻存管中吸出，缓慢地加入到带有2mL内皮细胞培养液的培养瓶中，轻轻摇晃瓶身，使内皮细胞快速在培养液中均匀分布。最后将细胞置于CO2孵育箱中(5％CO2，95％湿度，37℃)进行培养，第二天为细胞换取新鲜培养液。
1.1.3HUVECs的传代
待细胞长到融合率为90％时，对细胞进行消化和传代。首先用PBS将细胞清洗3次，最后一次尽量吸尽PBS，防止残留的Ca2+对胰酶的活性产生影响。往细胞培养瓶中加入1mL的胰酶溶液，轻轻左右晃动培养瓶，使所有的细胞都能被胰酶溶液润湿，放入在电子显微镜下观察细胞，当大部分细胞出现收缩脱和悬浮的现象时，加入胰酶中和液，终止消化。用吸管轻轻反复吹打细胞，使细胞完全脱落，吸出细胞悬液，1500rmp离心5min，倒掉上清，加入新鲜培养液，对细胞进行重悬，最后将细胞按1∶3的比例加入培养瓶进行培养，或者按一定的密度接种于培养板中用于后续的实验。
1.1.4HUVECs的冻存
细胞的消化采用1.2.3中所述的方法，细胞在消化和离心之后，将上清吸除，加入配制好的冻存液将细胞重悬，将细胞悬液加入冻存管中(1mL/管)，做好标记。接着按照缓慢降温的原则，对细胞进行冻存，先将细胞在4℃冰箱中放置30min，接着在-20℃冰箱中放置60min，再换成-80℃冰箱中放置16～18小时，最后将细胞放入液氮中进行长期保存。
1.2细胞毒性试验(MMT法)方法：
取对数生长期的HUVECs细胞，按每孔100μL培养液含1×105个接种于96孔板中，培养在37℃、5％CO2培养箱中，待细胞贴壁后，弃去培养液，按照分组给药，分组如下：
1,8-CNL:正常对照组(培养基)，1,8-CNL40、80、160、320、640μg/mL，每组设6个复孔。
1,8-CNL-SMEDDS：正常对照组(培养基)、1,8-CNL-SMEDDS系列浓度组，相当于含1,8-CNL5、10、40、70、100μg/mL，空白-SMEDDS系列浓度组，每组设6个复孔。
1,8-CNL-LM：正常对照组(培养基)、1,8-CNL-LM系列浓度组，相当于含1,8-CNL40、80、160、320、640μg/mL，空白-LM系列浓度组，每组设6个复孔。
1,8-CNL-SRLM：正常对照组(培养基)、1,8-CNL-SRLM系列浓度组，相当于含1,8-CNL40、80、160、320、640μg/mL，空白-SRLM系列浓度组，每组设6个复孔。
1.3细胞摄取试验方法:
1.3.1定性分析
分别取正常培养的HUVECs，经过胰酶消化、细胞计数后，调整细胞密度至1×105个/mL，每孔1mL种入6孔板中，放入5％CO2培养24h贴壁后，观察细胞生长状态及密度，待细胞密度生长至60％左右，按照分组给药，分组如下：
1,8-CNL-SMEDDS：C6荧光溶液组、1,8-CNL-C6组、1,8-CNL-SMEDDS-C6组。
1,8-CNL-LM：C6荧光溶液组、1,8-CNL-C6组、1,8-CNL-LM-C6组。
1,8-CNL-SRLM：C6荧光溶液组、1,8-CNL-C6组、1,8-CNL-SRLM-C6组。
给药后，放置培养箱孵育4h，弃去培养基，用冷的PBS(pH＝7.4)清洗3次，加入0.5mL4％多聚甲醛固定液(pH＝7.4)避光固定15min，去固定液，用PBS洗2遍，每次3min，吸尽液体，洗涤时用手晃动。加入10μg/mL的DAPI染色液(避光)，染色5min。用手晃动数次，去染色液，用PBS洗2遍，每次3min，吸尽液体。洗涤时用手晃动。于荧光倒置显微镜下观察细胞摄取情况。
1.3.2定量分析
为了进一步量化细胞的摄取效率，分别取正常培养的HUVECs，经过胰酶消化、细胞计数后，调整细胞密度至1×105个/mL，每孔1mL种入6孔板中，放入5％CO2培养24h贴壁后，观察细胞生长状态及密度，待细胞密度生长至60％左右，按照分组给药，分组如下：
1,8-CNL-SMEDDS：C6荧光溶液组、1,8-CNL-C6组、1,8-CNL-SMEDDS-C6组。
1,8-CNL-LM：C6荧光溶液组、1,8-CNL-C6组、1,8-CNL-LM-C6组。
1,8-CNL-SRLM：C6荧光溶液组、1,8-CNL-C6组、1,8-CNL-SRLM-C6组。
给药后，放置培养箱孵育4h，弃去培养基，用冷的PBS(pH＝7.4)清洗3次。每孔加入0.5mL的胰酶消化，1500r/min离心5min，去上清液加入1mLPBS吹打，离心，倒掉上清，PBS重悬，离心，清洗3次后加入500μL PBS调成细胞单悬液，流式细胞仪分析细胞荧光强度。
2.结果
2.1细胞毒性
实验结果表明，1,8-CNL在40-640μg/mL范围内对HUVECs没有细胞毒性作用。1,8-CNL-SMEDDS在5-10μg/mL浓度范围内没有细胞毒性作用(存活率＞90％)。1,8-CNL-LM在40到160μg/mL浓度范围内，各组均没有显示出明显的细胞毒性(存活率＞90％)，空白-LM在88-354μg/mL浓度范围内各组均没有显示出明显的细胞毒性(存活率＞90％)。1,8-CNL-SRLM在40μg/mL以下浓度范围内，没有显示出明显的细胞毒性(存活率＞85％)，空白-SRLM在129μg/mL以下浓度范围内没有显示出明显的细胞毒性(存活率＞85％)。结果如图7所示。图中，与ctrl比较:*P<0.05，**P<0.01。
表明了1,8-CNL-LM和1,8-CNL-SRLM较1,8-CNL-SMEDDS的安全浓度范围更广。
2.2细胞摄取率:
2.2.1定性分析
采用荧光显微镜观察1,8-CNL-SMEDDS-C6、1,8-CNL-LM-C6及1,8-CNL-SRLM-C6在HUVECs细胞中的摄取情况。实验结果表明，与游离C6组和1,8-CNL-C6组，1,8-CNL-SMEDDS-C6、1,8-CNL-LM-C6及1,8-CNL-SRLM-C6荧光强度较强，表明1,8-CNL-SMEDDS-C6、1,8-CNL-LM-C6及1,8-CNL-SRLM-C6能被摄取到HUVECs细胞中，并位于细胞系的核周区域，分布在细胞质中。结果见图8。
2.2.2定量分析
实验结果表明，1,8-CNL-SMEDDS-C6组的荧光强度是1,8-CNL-C6组的13.9倍，1,8-CNL-LM-C6的荧光强度是1,8-CNL-C6的15.5倍，1,8-CNL-SRLM的荧光强度是1,8-CNL-C6的5.4倍，表明1,8-CNL-SMEDDS-C6、1,8-CNL-LM-C6及1,8-CNL-SRLM-C6均具有更高的细胞摄取效率(P<0.05)。
与1,8-CNL-SMEDDS相比，1,8-CNL-LM的摄取量最高，药效最好，1,8-CNL-SRLM的摄取量较1,8-CNL-LM和1,8-CNL-SMEDDS的低，表明其具有被开发成滞留于细胞外膜靶向缓释制剂的潜能。结果见图9-11。
图谱中上至下依次为ctrl组、C6组、1,8-CNL-C6组和实验组。与ctrl比较:*P<0.05，**P<0.01，与C6组比较，##-p<0.01。

Claims (2)

1.1,8-桉叶油素乳剂，其特征在于：按质量份数计为：1,8-桉叶油素40份、MCT20份、大豆油40份、HS15 4份、大豆磷脂8份、甘油25份、油酸3份、油酸钠3份、硬脂酸0.5份，余量为蒸馏水，蒸馏水的加入量为使溶液由浑浊到澄清时临界点的加入量。
2.根据权利要求1所述的1,8-桉叶油素乳剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、取对应比例的原料，将HS15、甘油和蒸馏水加热至60℃混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-10℃，得水相；
步骤二、将MCT、大豆油、油酸、油酸钠和大豆磷脂在60℃下混合超声至大豆磷脂融解，再加入1,8-桉叶油素混合均匀，降至室温后冰浴冷却至0-10℃，得油相；
步骤三、将油相缓慢注入水相并以10000r/min的转速下高速剪切7min得到初乳，调节pH至7，以50MPa压力下高压均质7min，制得外观为乳白色体系均一的1,8-CNL-SRLM。
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