CN113057249A

CN113057249A - 一种无毒菜籽分离蛋白及其制备方法

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Publication number: CN113057249A
Application number: CN202110488725.XA
Authority: CN
Inventors: 王志高; 何荣; 王立峰; 熊政; 富瑶瑶; 姚俊; 鞠兴荣; 张楠
Original assignee: Nanjing University of Finance and Economics
Current assignee: Nanjing University of Finance and Economics
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2021-07-02

Abstract

本发明提供一种无毒菜籽分离蛋白及其制备方法，属于植物蛋白加工领域。该无毒菜籽分离蛋白，含有植酸0~0.20%、总酚0.23%~0.32%、硫甙0μmol/g菜籽分离蛋白。本发明还提供所述无毒菜籽分离蛋白的制备方法，包括以下步骤：将菜籽粕采用植酸酶进行酶解，然后采用碱溶酸沉方法分离菜籽蛋白，最后采用乙醇水溶液洗涤，即得所述无毒菜籽分离蛋白。本发明无毒菜籽分离蛋白，制备方法简单，成本低，利于其产业化，不含有硫甙，植酸和总酚含量显著降低，无毒性，达到可食用的标准。

Description

一种无毒菜籽分离蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于植物蛋白加工领域，具体涉及一种无毒菜籽分离蛋白及其制备方法。

背景技术

我国是世界上油菜籽生产大国，总产量居世界前列。国家粮油信息中心预测2020/21年度我国菜籽粕产量将高达900多万吨，占菜籽粕组成40％左右的菜籽蛋白作为一种优质的植物蛋白，具有巨大的潜在应用价值。但菜籽粕中含有硫甙、植酸、多酚等抗营养因子，硫甙分解产物对甲状腺、肝脏、肾脏有毒害作用；植酸易与蛋白质结合生成不易溶解的复合物，使其不易消化，降低蛋白质的生物利用率；多酚类物质易导致提取的蛋白质色泽较深、味苦，严重限制了菜籽蛋白在食品工业中的应用。因此，制备菜籽蛋白时，需要去除抗营养因子，保障菜籽蛋白的食用安全性。

菜籽分离蛋白是一种高蛋白含量的菜籽蛋白制品。在制备菜籽分离蛋白过程中，目前已有多种方法，如超滤法、碱处理法、乙醇脱毒法、酶脱毒法等，被证实可以去除菜籽分离蛋白中抗营养因子，但各种方法仍然存在一定的局限性，不能全面脱除菜籽分离蛋白中的抗营养因子，从而无法保证菜籽分离蛋白达到可食用标准。

发明内容

本发明目的是提供一种无毒菜籽分离蛋白，该菜籽分离蛋白不含有硫甙，植酸和总酚含量显著降低，无毒性，达到可食用的标准。

本发明的另一目的是提供所述菜籽分离蛋白的制备方法，该方法简单，成本低，利于其产业化，得到的菜籽分离蛋白不含有硫甙，植酸和总酚含量显著降低，无毒性，达到可食用的标准。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种无毒菜籽分离蛋白，含有植酸0～0.25％、总酚0.23％～0.35％、硫甙0μmol/g菜籽分离蛋白。

本发明还提供所述无毒菜籽分离蛋白的制备方法，包括以下步骤：将菜籽粕采用植酸酶进行酶解，然后采用碱溶酸沉方法分离菜籽蛋白，最后采用乙醇水溶液洗涤，即得所述无毒菜籽分离蛋白。

在本发明中，采用如下方法进行植酸酶酶解：在脱脂后的菜籽粕中加入缓冲液，然后加入植酸酶，进行酶解。

在本发明中，缓冲液的pH为4.5-5.0，每克菜籽粕中缓冲液加入的体积为8-12mL，每克菜籽粕中植酸酶的添加量为0.8～1.2U，酶解时间为0.5～1.5h，酶解温度为50～55℃。

在本发明中，采用碱溶酸沉方法分离菜籽蛋白包括如下步骤：在每克菜籽粕的酶解产物中加入8-12mL亚硫酸钠水溶液，调节pH为10.5-11.5，在45-55℃下搅拌1-3h，离心取上清液；调节所述清液的pH为4-5，离心取沉淀。

在本发明中，采用乙醇水溶液洗涤的方法如下：在碱溶酸沉方法分离的菜籽蛋白中加入85～100％的乙醇水溶液，震荡，离心后取沉淀。

在本发明中，85～100％的乙醇水溶液与碱溶酸沉方法分离的菜籽蛋白的体积比4-8:1。

在本发明中，乙醇水溶液洗涤的次数为2-4次。

在本发明中，所述菜籽粕来源于双低油菜籽。

本发明的有益效果：(1)本发明基于双低菜籽粕，先采用植酸酶进行酶解，然后采用碱溶酸沉法分离蛋白，最后采用乙醇洗涤，得到的菜籽分离蛋白不含有硫甙，且植酸和总酚含量显著降低。(2)本发明无毒性菜籽分离蛋白，不含有硫甙，植酸含量为0-0.23％，总酚含量为0.23～0.35％，抗营养因子含量全面低于目前国内外已有报道。本发明基于急性经口毒性试验(参照国标：GB 15193.3-2014)，首次证实所得菜籽分离蛋白无毒性，且易消化，可以用于食品行业。

附图说明

图1各菜籽分离蛋白的直观图，其中脱毒菜籽分离蛋白即为无毒菜籽分离蛋白。

图2不同处理组对小鼠体重的影响，其中脱毒菜籽分离蛋白组即为无毒菜籽分离蛋白组。

具体实施方式

下面结合具体实例及附图，进一步阐述本发明，但本发明的实施方式不仅限于此。

实施例1：无毒性菜籽分离蛋白的制备及其性质

1.制备无毒性菜籽分离蛋白和未处理菜籽分离蛋白的方法

双低菜籽粕：将脱壳双低菜籽置于含有正己烷的浸出器中脱脂，将脱脂后的菜籽干燥，得双低菜籽粕。

制备无毒菜籽分离蛋白的方法，包括以下步骤：在100g双低菜籽粕中加入1000mL的浓度为0.1M、pH 4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，维持温度在50℃，加入20mg植酸酶(购自源叶生物，产品货号是9001-89-2，酶活：5U/mg)，在搅拌状态下酶解0.5h。然后，加入50mL的10％(质量百分浓度)三氯乙酸水溶液，搅拌5min，灭酶活，得到酶解后的菜籽粕。将酶解后的菜籽粕离心(10000r/min，4℃)30min，取沉淀。将该沉淀加入1000mL、0.05％(质量百分浓度)亚硫酸钠水溶液中，用2M氢氧化钠水溶液调节pH到11，维持温度在50℃，磁力高速搅拌2h，搅拌期间每隔5min调节pH至11。将上述溶液于4000r/min的条件下，离心30min，取上清液，过滤后，滴加1M盐酸调节pH至4.4，随后置冷藏柜中过夜酸沉。在10000r/min的条件下离心30min，弃上清，将沉淀采用85％乙醇水溶液洗涤两次，冷冻干燥后得脱毒菜籽分离蛋白。每次洗涤的具体方法如下：在沉淀中加入沉淀体积四倍的85％乙醇水溶液，摇床震荡5min，随后于4000r/min的条件下，离心30min，取沉淀。

未处理菜籽分离蛋白的制备方法：在100g双低菜籽粕中加入1000mL、0.05％(质量百分浓度)亚硫酸钠水溶液，用2M氢氧化钠水溶液调节pH到11，维持温度在50℃，磁力高速搅拌2h，搅拌期间每隔5min调节pH至11。将上述溶液于4000r/min的条件下离心30min，取上清液过滤，取滤液，滴加1M盐酸调节pH至4.4，随后置冷藏柜中过夜酸沉。在10000r/min的条件下离心30min，取出沉淀，直接冷冻干燥，得未处理菜籽分离蛋白。

2.无毒性菜籽分离蛋白的性质

检测本实施例标题1得到的无毒性菜籽分离蛋白和未处理菜籽分离蛋白的组分、含量和色泽变化。采用凯氏定氮法检测粗蛋白含量，采用索氏抽提法检测粗脂肪含量，灼烧重量法检测灰分含量，常压干燥法检测水分，粗纤维测定法检测粗纤维含量，氯化钯比色法检测硫甙，福林酚法检测总酚含量，过滤法测定蛋白消化率，三氯化铁比色法测定植酸。采用色度仪检测色泽。

与未处理菜籽分离蛋白相比，无毒性菜籽分离蛋白中的抗营养因子：植酸、硫甙和总酚显著下降，硫甙未检测出，蛋白质消化率得到显著提升，高达94.53％，远高于已报道的大豆分离蛋白的消化率(表1)。无毒性菜籽分离蛋白中的蛋白含量相比于未处理菜籽分离蛋白，提升近10％(表1)。此外，无毒菜籽分离蛋白的色泽得到显著改善(图1)，白度值接近于商业大豆分离蛋白(表2)。

表1菜籽分离蛋白各组分含量

	未处理菜籽分离蛋白	无毒菜籽分离蛋白<sup>a</sup>
			粗蛋白(N×6.25,干基)(％)	78.38±1.76	88.26±3.28<sup>**</sup>
粗脂肪(％)	0.44±0.05	0.29±0.04<sup>*</sup>
			灰分(％)	6.96±0.10	2.72±0.12<sup>**</sup>
水分(％)	3.42±0.18	1.89±0.19<sup>**</sup>
			粗纤维(％)	0.79±0.02	0.78±0.08
硫甙(μmol/g)	25.56±1.81	NA
			植酸(％)	2.06±0.06	0.20±0.02<sup>*</sup>
总酚(％)	0.58±0.01	0.32±0.02<sup>**</sup>
			蛋白质消化率(％)	90.02±0.17	94.53±0.35<sup>**</sup>

表1中NA：表示未检测到；^a:实例1中方法制备的无毒菜籽分离蛋白。^*：与未处理菜籽分离蛋白比较具有显著差异。^**：与未处理菜籽分离蛋白比较具有极显著差异。

表2菜籽分离蛋白色泽变化

样品	L<sup>*</sup>	a<sup>*</sup>	b<sup>*</sup>	白度
					未处理菜籽分离蛋白	53.58±1.66	3.93±0.16	14.92±0.56	51.18±2.10
无毒菜籽分离蛋白c	73.71±1.02<sup>#</sup>	1.14±0.11<sup>##</sup>	11.06±0.77<sup>#</sup>	71.43±1.22<sup>##</sup>
					大豆分离蛋白<sup>d</sup>	87.02±1.99<sup>##</sup>	1.35±0.22<sup>##</sup>	19.26±0.54<sup>##</sup>	76.10±1.99<sup>##</sup>

表2中^c:实例1中方法制备。^d:来源于秦皇岛金海食品工业有限公司。^#：与未处理菜籽分离蛋白比较具有显著差异。^##：与未处理菜籽分离蛋白比较具有极显著差异。L^*表示亮度，a^*表示红色/绿色，b^*表示黄色/蓝色。

实施例2无毒性菜籽分离蛋白的安全性分析

基于急性经口毒性试验(参照国标：GB 15193.3-2014)，采用限量法评估实施例1制备的未处理菜籽分离蛋白和无毒菜籽分离蛋白的安全性，以其中大豆分离蛋白(购自秦皇岛金海食品工业有限公司)为对照。具体如下：将C57小鼠(每只20g左右)适应性饲养1周，随后随机分成5组：空白组、无毒菜籽分离蛋白两个剂量组(蛋白给予剂量分别为10g/kg和20g/kg)、大豆分离蛋白组(蛋白给予剂量为10g/kg)和未处理菜籽分离蛋白组(蛋白给予剂量为10g/kg)，每组10只小鼠，雌雄各半。禁食12h后(不禁水)，按照各组小鼠的蛋白给予剂量，将各蛋白样品分别溶解于0.5mL生理盐水中，得到各蛋白溶液。各组灌胃对应的蛋白溶液，一次性灌胃给予每只小鼠0.5mL蛋白溶液，空白组灌胃相同体积生理盐水，正常饲养15天。从灌胃后第1天开始，每2天观察1次，至第15天结束。观察动物毒性表征(动物行为，皮肤毛色有无异常)，如有死亡，记录死亡时间。每2天记录实验小鼠体重。观察期结束，检查眼部(角膜、晶状体、球结膜、虹膜)，每组随机选取5只小鼠眼部取血，进行血液学检查。取血结束后，对主要脏器进行称重，计算脏器指数。

结果见表3和表4。15天观察期结束后，所有实验组小鼠眼部无异常，皮肤和被毛正常，观察期内小鼠无死亡。与空白组和大豆分离蛋白组相比，所有菜籽分离蛋白组对小鼠体重无明显影响(图2)。但脏器指数结果发现，未处理菜籽分离蛋白组中甲状腺指数显著低于空白组，说明甲状腺可能产生炎症性萎缩(表3和4)。小鼠血常规检测发现，未处理菜籽分离蛋白组中的白细胞数要显著高于其他组，从侧面进一步说明小鼠甲状腺产生了炎症(表5和6)。而这一结果产生的原因可能与未处理菜籽分离蛋白中的含有较多的抗营养因子有关，尤其与高含量硫甙密切相关。无毒菜籽分离蛋白即使在剂量高达20g/kg时也未对小鼠的产生任何影响，说明实施例1制备的无毒菜籽分离蛋白确实无毒性作用(根据国标15193.3-2014可得结论：实例1制备的脱毒菜籽分离蛋白实际无毒)，可用于食品行业。

表3不同处理组对小鼠脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺)指数的影响

表4不同处理组对小鼠脏器(肾脏、胸腺、甲状腺、甲状旁腺)指数的影响

表4中的^*：与空白组比较具有显著差异。

表5不同处理组对小鼠血常规指标的影响

表6不同处理组对小鼠血常规指标的影响

表6中^*：与空白组比较具有显著差异。