CN113049685A - 一种复方两面针含片的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复方两面针含片的质量检测方法，其中西青果的检测以没食子酸为质量控制指标，采用高效液相色谱法检测，其色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；检测波长：220nm；流动相：流动相A为含磷酸二氢钠20‑40 mmol/L的0.1%‑0.4%磷酸溶液，流动相B为乙腈‑无水乙醇‑3%磷酸溶液=75‑85：9‑15：6‑10，采用梯度洗脱，流动相比例均为体积百分比，洗脱程序如下：0‑3min，流动相A为94%，流动相B为6%；3‑10min，流动相A为94%→88%，流动相B为6%→12%；10‑35min，流动相A为88%→58%，流动相B为12%→42%。本发明的检测方法操作方便，检测结果准确，稳定型好，具有很高的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及一种中成药的质量检测方法领域，具体涉及一种复方两面针含片的质量检测方法。
背景技术
复方两面针含片为广西壮族自治区花红药业股份有限公司的独家产品，其处方由西青果、蝴蝶果、山豆根、薄荷素油、薄荷脑、两面针、甘草组成。具有清热解毒，疏风利咽的功效。用治疗于肺经风热引起的咽喉肿痛。
复方两面针含片因为中药本身成分复杂，并且其制剂原料中应用了较多蔗糖，这使得其检测方法建立困难，高效液相色谱及薄层色谱检测时，容易出现对检测结果的干扰，造成检测结果不稳定，限制了复方两面针含片质量控制方法的建立，不利于产品的质量监控。
发明内容
本发明的目的为了克服现有的技术的不足，提供一种复方两面针含片的质量检测方法，该方法操作方便，检测结果准确，稳定型好，具有很高的实用性。
本发明的技术方案如下：
所述的复方两面针含片中西青果的检测以没食子酸为质量控制指标，采用高效液相色谱法检测，其色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
检测波长：220nm；
流动相：流动相A为含磷酸二氢钠20-40mmol/L的0.1％-0.4％磷酸溶液，流动相B为乙腈- 无水乙醇-3％磷酸溶液＝75-85：9-15：6-10，采用梯度洗脱，流动相比例均为体积百分比，洗脱程序如下：
0-3min，流动相A为94％，流动相B为6％；
3-10min，流动相A为94％→88％，流动相B为6％→12％；
10-35min，流动相A为88％→58％，流动相B为12％→42％。
优选的，所述的流动相A为含磷酸二氢钠30mmol/L的0.2％磷酸溶液，流动相B为乙腈- 无水乙醇-3％磷酸溶液＝82：10：8，采用梯度洗脱，流动相比例均为体积百分比。
所述的没食子酸检测的对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取没食子酸对照品精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，摇匀即得；
所述的没食子酸检测的供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取去除包衣后的复方两面针含片的素片，研细，取研细后的样品0.5-1g，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入体积百分比为50％甲醇50ml，称重，经过功率320W、频率50kHz的超声处理20-40分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
复方两面针含片中薄荷脑的检测采用薄层色谱检测方法，用薄荷脑对照品参比的方法，其色谱条件为，以硅胶G为层析板，以体积比为3-5∶3-5∶1的30℃～60℃的石油醚-正己烷- 乙酸乙酯的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
复方两面针含片中薄荷脑的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取本品40片除去包衣，研细，加60℃～90℃的石油醚100ml，加热回流30分钟，滤过，滤渣备用，滤液挥至约10ml，作为供试品溶液；
对照品的制备方法包含以下步骤：另取薄荷脑对照品，加60℃～90℃的石油醚制成每1ml 含1mg的溶液，作为对照品溶液。
复方两面针含片中西青果的检测，还采用薄层色谱检测方法，用没食子酸对照品参比的方法，以体积比为3-7∶1-3∶1-3∶1的三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
复方两面针含片中西青果的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取薄荷脑的检测中的滤渣低温挥干溶剂，加丙酮80-120ml，加热回流0.5-2小时，滤过，其中过滤的滤渣备用，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；
对照品的制备方法包含以下步骤：另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
复方两面针含片中山豆根的检测以苦参碱为质量控制指标，采用薄层色谱检测方法，用苦参碱对照品参比的方法，其色谱条件为，以硅胶G为层析板，以体积比为6-10∶1-2∶0.1 的三氯甲烷-甲醇-浓氨试液的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
复方两面针含片中山豆根的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取西青果的检测中的滤渣，低温挥干溶剂，加入体积百分比为75-85％乙醇80-120ml，超声处理30分钟，放置2小时，滤过，滤液浓缩至近干，加入质量百分比0.2％的盐酸溶液30-50ml，超声处理使溶解，用浓氨试液调节pH至11～12，用三氯甲烷振摇提取2次，每次60-100ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加入体积比为8-10∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；
对照品的制备方法包含以下步骤：取苦参碱对照品，加入体积比为8-10∶2的三氯甲烷- 甲醇的混合溶液制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。
复方两面针含片中两面针的检测以氯化两面针碱为质量控制指标，采用薄层色谱检测方法，用氯化两面针碱对照品参比的方法，其色谱条件为，以硅胶G为层析板，以加入体积比为 1-3∶4-6∶1∶3-5的甲苯-正丁醇-冰醋酸-水混合液静置后的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
复方两面针含片中两面针的检测中，以复方两面针含片中山豆根的检测中的供试品为供试品；
对照品的制备方法包含以下步骤：取氯化两面针碱对照品，加入体积比6-10∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
本发明的有益效果如下：
1、本发明没食子酸采用了梯度洗脱系统，利用独特的溶剂配比，实现复方两面针含片复杂成分中干扰杂质的剥离，最终能够获得良好的没食子酸特征峰，并且实验稳定性好。并且，本发明没食子酸含量测定的供试品制备方法简单便利，在操作上也大大减少了工作量。
2、本发明薄荷脑的检测，采用了经过发明人大量实验确定的展开剂体系，具有分离好，斑点清晰，肉眼判断方便准确的特点。
3、本发明山豆根的检测，采用了滤渣进行处理，节约了实验样品，并且也减少了样品前期去除包衣等工作步骤，操作更为便利。并且，利用的展开剂体系，分离好，斑点清晰。
4、本发明两面针的检测，直接应用了山豆根检测中处理好的供试品，进一步减少了操作量，提高了工作效率。并且，本发明采用了独特的展开剂体系，克服了现有技术对于两面针薄层鉴别难以找到特征点，质量控制困难的技术问题，具有很好的质量控制效果。
附图说明
图1：没食子酸含量测定方法学研究对照品溶液和供试品溶液色谱图。
图2：没食子酸含量测定方法学研究没食子酸对照品溶液中在线紫外光谱对比图(a和b)。
图3：没食子酸含量测定方法学研究样品溶液(c)和对照品溶液中没食子酸(b)在线紫外光谱对比图。
图4：没食子酸含量测定方法学研究没食子酸标准曲线。
图5：复方两面针含片中试样品薄荷脑检测薄层色谱图。
图6：复方两面针含片中试样品西青果检测薄层色谱图。
图7：复方两面针含片中试样品山豆根检测薄层色谱图。
图8：复方两面针含片中试样品两面针检测薄层色谱图。
具体实施方式
实施例1
所述的复方两面针含片中西青果的检测以没食子酸为质量控制指标，采用高效液相色谱法检测，其色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
检测波长：220nm；
流动相：流动相A为含磷酸二氢钠20mmol/L的0.1％％磷酸溶液，流动相B为乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液＝75：9：6，采用梯度洗脱，流动相比例均为体积百分比，洗脱程序如下：
0-3min，流动相A为94％，流动相B为6％；
3-10min，流动相A为94％→88％，流动相B为6％→12％；
10-35min，流动相A为88％→58％，流动相B为12％→42％。
所述的没食子酸检测的对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取没食子酸对照品精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，摇匀即得；
所述的没食子酸检测的供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取去除包衣后的复方两面针含片的素片，研细，取研细后的样品0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入体积百分比为50％甲醇50ml，称重，经过功率320W、频率50kHz的超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例2
所述的复方两面针含片中西青果的检测以没食子酸为质量控制指标，采用高效液相色谱法检测，其色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
检测波长：220nm；
流动相：流动相A为含磷酸二氢钠40mmol/L的0.4％磷酸溶液，流动相B为乙腈-无水乙醇 -3％磷酸溶液＝85：15：10，采用梯度洗脱，流动相比例均为体积百分比，洗脱程序如下：
0-3min，流动相A为94％，流动相B为6％；
3-10min，流动相A为94％→88％，流动相B为6％→12％；
10-35min，流动相A为88％→58％，流动相B为12％→42％。
所述的没食子酸检测的对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取没食子酸对照品精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，摇匀即得；
所述的没食子酸检测的供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取去除包衣后的复方两面针含片的素片，研细，取研细后的样品1g，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入体积百分比为50％甲醇50ml，称重，经过功率320W、频率50kHz的超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例3
所述的复方两面针含片中西青果的检测以没食子酸为质量控制指标，采用高效液相色谱法检测，其色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
检测波长：220nm；
流动相：所述的流动相A为含磷酸二氢钠30mmol/L的0.2％磷酸溶液，流动相B为乙腈- 无水乙醇-3％磷酸溶液＝82：10：8，采用梯度洗脱，流动相比例均为体积百分比。洗脱程序如下：
0-3min，流动相A为94％，流动相B为6％；
3-10min，流动相A为94％→88％，流动相B为6％→12％；
10-35min，流动相A为88％→58％，流动相B为12％→42％。
所述的没食子酸检测的对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取没食子酸对照品精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，摇匀即得；
所述的没食子酸检测的供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取去除包衣后的复方两面针含片的素片，研细，取研细后的样品0.72g，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入体积百分比为50％甲醇50ml，称重，经过功率320W、频率50kHz的超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例4
所述的复方两面针含片中西青果的检测以没食子酸为质量控制指标，采用高效液相色谱法检测，其色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
检测波长：220nm；
流动相：流动相A为含磷酸二氢钠20mmol/L的0.1％％磷酸溶液，流动相B为乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液＝75：15：10，采用梯度洗脱，流动相比例均为体积百分比，洗脱程序如下：
0-3min，流动相A为94％，流动相B为6％；
3-10min，流动相A为94％→88％，流动相B为6％→12％；
10-35min，流动相A为88％→58％，流动相B为12％→42％。
所述的没食子酸检测的对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取没食子酸对照品精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，摇匀即得；
所述的没食子酸检测的供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取去除包衣后的复方两面针含片的素片，研细，取研细后的样品0.6g，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入体积百分比为50％甲醇50ml，称重，经过功率320W、频率50kHz的超声处理25分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例5
所述的复方两面针含片中西青果的检测以没食子酸为质量控制指标，采用高效液相色谱法检测，其色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
检测波长：220nm；
流动相：流动相A为含磷酸二氢钠40mmol/L的0.4％磷酸溶液，流动相B为乙腈-无水乙醇 -3％磷酸溶液＝85：9：6，采用梯度洗脱，流动相比例均为体积百分比，洗脱程序如下：
0-3min，流动相A为94％，流动相B为6％；
3-10min，流动相A为94％→88％，流动相B为6％→12％；
10-35min，流动相A为88％→58％，流动相B为12％→42％。
所述的没食子酸检测的对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取没食子酸对照品精密称定，加50％甲醇制成每1ml含50μg的溶液，摇匀即得；
所述的没食子酸检测的供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取去除包衣后的复方两面针含片的素片，研细，取研细后的样品0.9g，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入体积百分比为50％甲醇50ml，称重，经过功率320W、频率50kHz的超声处理35分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例6
1、复方两面针含片中薄荷脑的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取本品40片除去包衣，研细，加60℃～90℃的石油醚80ml，加热回流20分钟，滤过，滤渣备用，滤液挥至约10ml，作为供试品溶液；对照品的制备方法包含以下步骤：另取薄荷脑对照品，加 60℃～90℃的石油醚制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2～5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为3∶3∶1的30℃～60℃的石油醚-正己烷-乙酸乙酯的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
2、复方两面针含片中西青果的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取薄荷脑的检测中的滤渣，低温挥干溶剂，加丙酮80ml，加热回流0.5小时，滤过，其中过滤的滤渣备用，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；对照品的制备方法包含以下步骤：另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为3∶1∶1∶1的三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮- 冰醋酸的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
3、复方两面针含片中山豆根的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取西青果的检测中的滤渣，低温挥干溶剂，加入体积百分比为75％乙醇80ml，超声处理30分钟，放置2 小时，滤过，滤液浓缩至近干，加入质量百分比0.2％的盐酸溶液30ml，超声处理使溶解，用浓氨试液调节pH至11～12，用三氯甲烷振摇提取2次，每次60ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加入体积比为9∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；对照品的制备方法包含以下步骤：取苦参碱对照品，加入体积比为9∶2的三氯甲烷 -甲醇的混合溶液制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为6∶1∶0.1的三氯甲烷-甲醇-浓氨试液的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
4、复方两面针含片中两面针的检测中，以复方两面针含片中山豆根的检测中的供试品为供试品；取氯化两面针碱对照品，加入体积比6∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液制成每1ml 含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液10μl及上述对照品溶液1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以加入体积比为1∶4∶1∶3的甲苯-正丁醇-冰醋酸-水混合液静置后的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
实施例7
1、复方两面针含片中薄荷脑的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取本品40片除去包衣，研细，加60℃～90℃的石油醚120ml，加热回流40分钟，滤过，滤渣备用，滤液挥至约10ml，作为供试品溶液；对照品的制备方法包含以下步骤：另取薄荷脑对照品，加 60℃～90℃的石油醚制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2～5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5∶5∶1的30℃～60℃的石油醚-正己烷-乙酸乙酯的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
2、复方两面针含片中西青果的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取薄荷脑的检测中的滤渣，低温挥干溶剂，加丙酮120ml，加热回流2小时，滤过，其中过滤的滤渣备用，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；对照品的制备方法包含以下步骤：另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为7∶3∶3∶1的三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
3、复方两面针含片中山豆根的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取西青果的检测中的滤渣，低温挥干溶剂，加入体积百分比为85％乙醇120ml，超声处理30分钟，放置2 小时，滤过，滤液浓缩至近干，加入质量百分比0.2％的盐酸溶液30-50ml，超声处理使溶解，用浓氨试液调节pH至11～12，用三氯甲烷振摇提取2次，每次60-100ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加入体积比为10∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；对照品的制备方法包含以下步骤：取苦参碱对照品，加入体积比为10∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为10∶2∶0.1的三氯甲烷-甲醇-浓氨试液的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
4、复方两面针含片中两面针的检测中，以复方两面针含片中山豆根的检测中的供试品为供试品；取氯化两面针碱对照品，加入体积比10∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液制成每1ml 含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液10μl及上述对照品溶液1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以加入体积比为3∶6∶1∶5的甲苯-正丁醇-冰醋酸-水混合液静置后的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
实施例8
1、复方两面针含片中薄荷脑的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取本品40片除去包衣，研细，加60℃～90℃的石油醚100ml，加热回流30分钟，滤过，滤渣备用，滤液挥至约10ml，作为供试品溶液；对照品的制备方法包含以下步骤：另取薄荷脑对照品，加 60℃～90℃的石油醚制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2～5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为4∶4∶1的30℃～60℃的石油醚-正己烷-乙酸乙酯的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
2、复方两面针含片中西青果的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取薄荷脑的检测中的滤渣，低温挥干溶剂，加丙酮100ml，加热回流1小时，滤过，其中过滤的滤渣备用，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；对照品的制备方法包含以下步骤：另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为5∶2∶2∶1的三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
3、复方两面针含片中山豆根的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取西青果的检测中的滤渣，低温挥干溶剂，加入体积百分比为80％乙醇100ml，超声处理30分钟，放置2 小时，滤过，滤液浓缩至近干，加入质量百分比0.2％的盐酸溶液40ml，超声处理使溶解，用浓氨试液调节pH至11～12，用三氯甲烷振摇提取2次，每次60-100ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加入体积比为8∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液2ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；对照品的制备方法包含以下步骤：取苦参碱对照品，加入体积比为8∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8∶1∶0.1的三氯甲烷-甲醇-浓氨试液的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
4、复方两面针含片中两面针的检测中，以复方两面针含片中山豆根的检测中的供试品为供试品；取氯化两面针碱对照品，加入体积比8∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液制成每1ml 含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液10μl及上述对照品溶液1～2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以加入体积比为2∶5∶1∶4的甲苯-正丁醇-冰醋酸-水混合液静置后的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
实施例9
没食子酸含量测定方法学研究
采用HPLC法测定复方两面针含片中没食子酸的含量，同时进行方法学研究，结果表明方法可行，能达到控制本品质量的目的。标准中对样品提取方法进行了提高，色谱条件进行了改进，要比原质量标准中的含量测定方法对样品处理简单，新方法测定准确性得到显著提高。
1.1仪器和试药
Agilent 1100型液相色谱仪(配有二极管阵列检测器、四元低压梯度泵、在线脱气装置、自动进样器)，ChemStation工作站。
Sarturius-BS110S分析天平。
D&T ES-E120BⅡ分析天平
超声仪
磷酸(色谱纯)
无水乙醇(色谱纯)
无水乙醇(色谱纯)
乙腈(色谱纯)
乙腈(色谱纯)
甲醇(色谱纯)
甲醇(色谱纯)
磷酸二氢钠(分析纯)
没食子酸(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201605)
水为去离子水
复方两面针含片(广西壮族自治区花红药业股份有限公司)
1.2色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(CAPCELL PAK C18柱，250mm×4.6mm，5μm)；以0.2％磷酸溶液(含磷酸二氢钠30mmol/L)为流动相A，以乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液(82：10：8)为流动相B，按表1中梯度程序进行洗脱；检测波长为220nm；进样量5μL；柱温 (35±0.15)℃；流速1.0mL/min。
表1流动相梯度洗脱程序
根据上述色谱条件，取供试品溶液和对照品溶液各5uL，注入液相色谱仪，连续分析检测2次，以外标法计算没食子酸含量。
1.3溶液制备
1.3.1对照品溶液的制备
取没食子酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶液制成每1mL含50μg的溶液，即得。
1.3.2供试品溶液的制备
取重量差异项下的素片10片，研细；或取薄膜衣片10片，除去薄膜衣，研细。取本品约0.72g，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入50％甲醇50ml，超声处理(功率320W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.3.3系统适用性试验
取没食子酸对照品溶液和供试品溶液分别进样5μL检测，对比保留时间和在线光谱图见附图1-3，色谱峰在6.9分钟为没食子酸，将此峰作为参照物峰，以没食子酸峰计算色谱柱的理论塔板数不得低于18000。
1.4方法学考察
1.4.1专属性
由复方两面针含片处方可知，处方中的西青果和蝴蝶果中含有没食子酸，为更好的验证 HPLC色谱检测方法，根据处方中各药材和辅料量，配制了供试品阳性液和供试品阴性液，进样检测。供试品阳性液和供试品阴性液配制方法见表2。
表2供试品阳性液和供试品阴性液配制及检测结果
由表中结果可以看出，本方法可有效的检测复方两面针含片中没食子酸。
1.4.2方法耐用性试验
耐用性试验是指在测定条件有微小变动时，考察对测定结果的影响，本实验考察了不同柱温、不同流速和不同流动相起始比例对检测的影响。按照正文所规定的供试品溶液配制方法，取ZS20161203批次样品制备溶液，检测其耐用性，具体条件见表3，耐用性考察结果见表4。
本实验还考察了供试品溶液和对照品溶液的稳定性，取ZS20161203批次样品，按照正文拟定方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液5μL，分别在样品制备后0h、3h、7h、9h、13h、 16h、18h、和24h进样，计算峰面积RSD为0.99％，说明供试品溶液在24h内稳定性；精密吸取对照品溶液5μL，分别在制备后0h、5h、7h、10h、14h、16h、19h和16天进样。计算峰面积RSD为2.0％，表示对照品溶液冰箱放置在16天内稳定。
表3色谱条件微小变动参数
| 色谱参数 | 规定值 | 变动范围 |
| 柱温 | 35℃ | 30℃和40℃ |
| 流速 | 1.0ml/min | 0.8ml/min和1.2ml/min |
| 流动相起始比例 | 水相-有机相＝94-6 | 水相-有机相＝92-8和水相-有机相＝96-4 |
表4耐用性考察结果
| 条件 | 没食子酸的含量 |
| 初始条件，柱温35℃ | 3.9mg/片 |
| 柱温30℃ | 3.8mg/片 |
| 柱温40℃ | 3.9mg/片 |
| 初始条件，流速1.0mL/min | 3.9mg/片 |
| 流速1.2mL/min | 3.9mg/片 |
| 流速0.8mL/min | 3.9mg/片 |
| 初始条件，流动相初始比例94：6 | 3.9mg/片 |
| 流动相初始比例：92:8 | 3.9mg/片 |
| 流动相初始比例：96:4 | 3.9mg/片 |
在耐用性实验中，其他条件不变，分别取对照品溶液和供试品溶液在柱温30℃、40℃和35℃进样检测，，由色谱图可知没食子酸峰保留时间随着温度的升高而降低，但样品中没食子酸含量无显著差异，见表4。
其他条件不变，分别取对照品溶液和供试品溶液在流速1.0mL/min、0.8mL/min和1.2mL/min 进样检测，由色谱图可知保留时间随流速的增加而减少，但样品中没食子酸含量无显著差异，见表4。
其他条件不变，取对照品溶液和供试品溶液在有机相初始比例为6％和4％以及8％的条件下进样检测。由色谱图可知保留时间随有机相比例减少，出峰时间延长，但样品中没食子酸含量无显著变化，见表4。
1.4.3精密度试验
按照供试品溶液制备方法，取ZS20161201样品制备溶液，对同一供试品溶液，按正文拟订的色谱条件，连续测定6次。结果6次测定没食子酸的平均峰面积为2801.62，RSD为0.11％ (n＝6)，详见表5，试验表明本法的精密度很好。
表5仪器精密度试验测定结果
| 测定序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | Mean | RSD％ |
| 没食子酸峰面积 | 2796.05 | 2804.78 | 2801.17 | 2802.26 | 2802.54 | 2802.93 | 2801.62 | 0.11％ |
1.4.4方法重复性
按正文拟订的供试品溶液的制备方法，制备ZS20161201批次样品的溶液6份，每份进样两针，以没食子酸平均峰面积和样品中没食子酸含量计算RSD分别为1.1％和0.92％。详见表6，结果表明，本法的重复性很好。
表6方法重复性试验结果(含量单位：mg/0.72g)
1.4.5检测限、定量限
取没食子酸对照品溶液，稀释成不同浓度的溶液，进样检测，以信噪比S/N＝10:1为定量 限，以信噪比S/N＝3:1为检测限。确定没食子酸对照品定量限为274ng；检测限为110ng。
1.4.6线性方程
取没食子酸对照品溶液，配制成浓度为59.2μg/mL的溶液，分别进样1μl、2.5μl、5μl、10μl 和20μl，均测定二次。以平均峰面积A对没食子酸的进样质量m做线性回归方程，回归方程曲线见图附图4和-表7，回归方程为：A＝7.8363m-19.499，R2为1，表明线性关系很好。
表7没食子酸标准曲线
| 进样量(ng) | 59.2 | 148.0 | 296.0 | 592.0 | 1184.0 |
| 平均峰面积A | 450.01 | 1138.11 | 2297.02 | 4624.67 | 9265.16 |
1.4.7准确度试验
1.4.7.1对照品储备液的制备
取没食子酸对照品适量，精密称定，加50％甲醇水溶液制备成每1ml含没食子酸2.52mg 的溶液，作为对照品储备液。
1.4.7.2对照品溶液的制备
精密量取1.0ml对照品储备液置50ml量瓶中，加50％甲醇水溶液制备成浓度504μg/ml溶液，作为对照品溶液液，进样5μL，测定2次。
1.4.7.3供试品溶液的制备
取本品约0.72g(样品批号ZS20161201)，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入50％甲醇 50ml，称重，超声处理(功率320W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。进样5μL，进样测定2次。
1.4.7.4加样50％试验
取本品约0.72g(样品批号ZS20161201)，精密称定，置50ml量瓶中，加入0.50ml对照品储备液，精密加入50％甲醇49.5ml，超声处理(功率320W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。进样5μL，测定2次。以平均峰面积计算回收率结果见表8。
1.4.7.5加样100％试验
取本品约0.72g(样品批号ZS20161201)，精密称定，置50ml量瓶中，加入1.0ml对照品储备液，精密加入50％甲醇49.0ml，超声处理(功率320W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。进样5μL，测定2次。以平均峰面积计算回收率结果见表8。
1.4.7.6加样150％试验
取本品约0.72g(样品批号ZS20161201)，精密称定，置50ml量瓶中，加入对照品储备液 1.50ml，精密加入50％甲醇48.5ml，超声处理(功率320W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。进样5μL，测定2次。以平均峰面积计算回收率结果见表8。结果表明，用本法测定没食子酸的含量，回收率范围在97.0％～101.8％符合规定，平均回收率为99.10％，RSD＝1.5％。表明所建立方法的准确度合格。
表8回收试验结果
实施例10
依据本发明实施例8的检测方法条件，对广西花红药业股份有限公司生产的复方两面针含片中试样品(批号)进行了薄层色谱检测，检测情况见图5-7。
实验结论：
(1)图5复方两面针含片中试样品薄荷脑检测薄层色谱图，从图中可见，斑点清晰，与对照品位置齐平，判断准确。
(2)图6复方两面针含片中试样品西青果检测薄层色谱图，从图中可见，斑点清晰。
(3)图7复方两面针含片中试样品山豆根检测薄层色谱图，从图中可见，斑点清晰。
(4)图8复方两面针含片中试样品两面针检测薄层色谱图，从图中可见，斑点清晰。
Claims (10)
1.一种复方两面针含片的质量检测方法，其特征在于：
复方两面针含片中西青果的检测以没食子酸为质量控制指标，采用高效液相色谱法检测，其色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填料；
检测波长：220nm；
流动相：流动相A为含磷酸二氢钠20-40 mmol/L的 0.1%-0.4%磷酸溶液，流动相B为乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液=75-85：9-15：6-10，采用梯度洗脱，流动相比例均为体积百分比，洗脱程序如下：
0-3min，流动相A为94%，流动相B为6%；
3-10min，流动相A为94%→88%，流动相B为6%→12%；
10-35min，流动相A为88%→58%，流动相B为12%→42%。
2.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：
所述的流动相A为含磷酸二氢钠30 mmol/L的 0.2%磷酸溶液，流动相B为乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液=82：10：8，采用梯度洗脱，流动相比例均为体积百分比。
3.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：
所述的没食子酸检测的对照品溶液的制备方法包括如下步骤：取没食子酸对照品精密称定，加50%甲醇制成每1 ml含50μg的溶液，摇匀即得；
所述的没食子酸检测的供试品溶液的制备方法包括如下步骤：取去除包衣后的复方两面针含片的素片，研细，取研细后的样品0.5-1g，精密称定，置50 ml量瓶中，精密加入体积百分比为50%甲醇50ml，称重，经过功率320W、频率50kHz的超声处理20-40分钟，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：
复方两面针含片中薄荷脑的检测采用薄层色谱检测方法，用薄荷脑对照品参比的方法，其色谱条件为，以硅胶G为层析板，以体积比为3-5∶3-5∶1的30℃~60℃的石油醚-正己烷-乙酸乙酯的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
5.如权利要求4所述的质量检测方法，其特征在于：
复方两面针含片中薄荷脑的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取本品40片除去包衣，研细，加60℃~90℃的石油醚100 ml，加热回流30分钟，滤过，滤渣备用，滤液挥至约10 ml，作为供试品溶液；
对照品的制备方法包含以下步骤：另取薄荷脑对照品，加60℃~90℃的石油醚制成每1ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。
6.如权利要求2所述的质量检测方法，其特征在于：
复方两面针含片中西青果的检测，还采用薄层色谱检测方法，用没食子酸对照品参比的方法，以体积比为3-7∶1-3∶1-3∶1的三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求；
复方两面针含片中西青果的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取薄荷脑的检测中的滤渣低温挥干溶剂，加丙酮80-120 ml，加热回流0.5-2小时，滤过，其中过滤的滤渣备用，滤液蒸干，残渣加甲醇2 ml使溶解，作为供试品溶液；
对照品的制备方法包含以下步骤：另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。
7.如权利要求6所述的质量检测方法，其特征在于：
复方两面针含片中山豆根的检测以苦参碱为质量控制指标，采用薄层色谱检测方法，用苦参碱对照品参比的方法，其色谱条件为，以硅胶G为层析板，以体积比为6-10∶1-2∶0.1的三氯甲烷-甲醇-浓氨试液的混合液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
8.如权利要求7所述的质量检测方法，其特征在于：
复方两面针含片中山豆根的检测中，供试品的制备方法包含以下步骤：取西青果的检测中的滤渣，低温挥干溶剂，加入体积百分比为75-85%乙醇80-120 ml，超声处理30分钟，放置2小时，滤过，滤液浓缩至近干，加入质量百分比0.2%的盐酸溶液30-50 ml，超声处理使溶解，用浓氨试液调节pH至11~12，用三氯甲烷振摇提取2次，每次60-100 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加入体积比为8-10∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液2 ml使溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；
对照品的制备方法包含以下步骤：取苦参碱对照品，加入体积比为8-10∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液制成每1 ml含2 mg的溶液，作为对照品溶液。
9.如权利要求8所述的质量检测方法，其特征在于：
复方两面针含片中两面针的检测以氯化两面针碱为质量控制指标，采用薄层色谱检测方法，用氯化两面针碱对照品参比的方法，其色谱条件为，以硅胶G为层析板，以加入体积比为1-3∶4-6∶1∶3-5的甲苯-正丁醇-冰醋酸-水混合液静置后的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365 nm紫外光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，则代表符合要求，否则不符合要求。
10.如权利要求9所述的质量检测方法，其特征在于：
复方两面针含片中两面针的检测中，以复方两面针含片中山豆根的检测中的供试品为供试品；
对照品的制备方法包含以下步骤：取氯化两面针碱对照品，加入体积比6-10∶2的三氯甲烷-甲醇的混合溶液制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。
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