CN113046359B - 调控水稻雌性发育的突变型基因及其编码的蛋白、应用以及引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了调控水稻雌性发育的突变型基因，分别为OsMLH1基因上的突变型基因Osmlh1‑1和突变型基因Osmlh1‑2，以及OsMLH3基因上的突变型基因Osmlh3‑1和突变型基因Osmlh3‑2。这几种突变类型的基因编码的蛋白在控制水稻雌性器官育性方面具有明显作用，其编辑的突变体Osmlh3和Osmlh1出现相似表型，结实率都下降到10％左右，可以利用上述突变型基因通过遗传工程的手段产生水稻雌性不育恢复系，用来生产杂交种子，开展轮回选择，在农业生产上具有十分重要的应用前景。本发明还公开了上述突变型基因所编码的蛋白、在调控水稻雌性发育中的应用，以及扩增上述基因的引物对。

Description

调控水稻雌性发育的突变型基因及其编码的蛋白、应用以及 引物

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种调控水稻雌性发育的突变型基因及其编码的蛋白和应用，以及扩增上述突变型基因的引物。

背景技术

错配修复(Mismatch Repair,MMR)是影响生物遗传变异的关键机制，主要负责DNA合成、遗传重组及损伤过程基因组单个及少数碱基缺失、插入及错配的修复，对维持DNA复制保真和基因组稳定性至关重要(崔海瑞等，2014)。目前错配修复系统的功能在拟南芥中有深入研究，但是水稻的MMR系统组成及其分子机制知之甚少。

在高等植物拟南芥中有10个错配修复的基因，分别是AtMSH1、AtMSH2、AtMSH3、AtMSH6、AtMSH7、AtMSH4、AtMSH5、AtPMS1、AtMLH1、AtMLH3。其中AtMLH3与AtMLH1结合形成二聚体，除了参与错配修复外，更重要的功能是促进减数分裂中的交换，维持减数分裂进程。两个拟南芥AtMLH3基因的插入突变体在营养生长阶段与野生型没有差异，但是突变体的结实率降低50％以上，原因是雄配子形成过程中霍利迪双结(dHj)可以形成，但AtMLH1和AtMLH3形成二聚体不能正确定位，使得染色体交叉减少了60％，并引起减数分裂前期I进程延迟25h(Jackson et al.,2006)。

前期通过正向遗传学，我们利用一份雌性不育的突变体fsv1(花粉育性基本正常，约85％的胚囊败育)，定位到突变基因OsMLH3(Os09g0551900)，其为拟南AtMLH3的同源基因，已申请基因专利“调控水稻雌性器官育性的基因及其编码蛋白和应用”(申请号CN201711195274.0)。目前水稻中报道的雌性不育基因很少，可以在育种上利用的更少。因此，开发新的雌性不育基因对水稻育种领域具有十分重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种调控水稻雌性发育的新型突变型基因及其编码的蛋白和应用方法，并提供扩增上述突变型基因的引物。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种调控水稻雌性发育的OsMLH1突变型基因，具体为突变型基因Osmlh1-1或突变型基因Osmlh1-2，相比未突变的水稻OsMLH1基因全长CDS序列(其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)，所述突变型基因Osmlh1-1在水稻OsMLH1基因全长CDS序列的第334位核苷酸处存在[G/-]1个碱基的缺失，所述突变型基因Osmlh1-2在水稻OsMLH1基因全长CDS序列的第325-334位核苷酸处存在[TTCAGAGGGG/-]10个碱基的缺失。优选的，所述突变型基因Osmlh1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述突变型基因Osmlh1-2的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

一种调控水稻雌性发育的蛋白，由上述OsMLH1突变型基因编码得到，所述突变型基因Osmlh1-1编码得到的Osmlh1-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述突变型基因Osmlh1-2编码得到的Osmlh1-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

上述的OsMLH1突变型基因在调控水稻雌性发育中的应用，所述应用的方法为：利用Cas9基因编辑法将所述水稻OsMLH1基因全长CDS序列的第334位核苷酸[G/-]或第325-334位核苷酸[TTCAGAGGGG/-]敲除后，培养出新的水稻雌性不育恢复系，用于混播混收机械化制种。

上述的应用中，用于接头所述水稻OsMLH1基因的靶位点的接头引物，由具有SEQID NO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的下游引物组成；用于测序所述水稻OsMLH1基因的靶位点的测序引物，由具有SEQ ID NO.11所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的下游引物组成。

用于扩增上述OsMLH1突变型基因的引物，所述引物由具有SEQ ID NO.13所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.14所示核苷酸序列的下游引物组成。

基于一个总的发明构思，本发明还相应提供一种调控水稻雌性发育的OsMLH3突变型基因，具体为突变型基因Osmlh3-1或突变型基因Osmlh3-2，相比未突变的水稻OsMLH3基因全长CDS序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，所述突变型基因Osmlh3-1在水稻OsMLH3基因全长CDS序列的第247-248位核苷酸处存在[GT/-]2个碱基的缺失，所述突变型基因Osmlh3-2在水稻OsMLH3基因全长CDS序列的第248位核苷酸处存在[T/-]1个碱基的缺失。

一种调控水稻雌性发育的蛋白，由上述OsMLH3突变型基因编码得到。

上述的OsMLH3突变型基因在调控水稻雌性发育中的应用，所述应用的方法为：利用Cas9基因编辑法将所述水稻OsMLH3基因全长CDS序列的第247-248位核苷酸[GT/-]或第248位核苷酸[T/-]敲除后，培养出新的水稻雌性不育恢复系。

用于扩增上述OsMLH3突变型基因的引物，所述引物由具有SEQ ID NO.15所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.16所示核苷酸序列的下游引物组成。

相比拟南芥Atmlh3的表型，水稻突变株系Osmlh3的结实更低，主要影响雌性器官育性。为了深入研究错配基因与育性的关系，申请人通过同源克隆技术在水稻中获得了OsMLH1(Os01g0958900)基因。利用基因编辑技术分别在籼稻品种华占中突变OsMLH3和OsMLH1，OsMLH1突变型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。结果编辑突变体Osmlh3和Osmlh1出现相似表型，结实率都下降到10％左右，相较于fsv1的结实率有进一步降低，其他表型与fsv1相同。进一步分析Osmlh3和Osmlh1花粉育性和胚囊发育情况，发现这两个突变体表型与突变体fsv1基本一致：花粉育性基本正常，但85％左右的胚囊败育。通过体内荧光双分子(BiFC)试验，证明OsMLH3与OsMLH1存在互作，形成二聚体形式功能，任意基因功能丧失都会造成雌性不育的表型，因此OsMLH1是一个新的调控水稻雌性发育的蛋白。

申请人在系统研究水稻错配修复家族基因时，发现OsMLH1基因通过基因敲除后，也影响结实率，研究发现OsMLH1也是调控水稻雌性发育的重要蛋白，通过Cas9基因编辑技术同样可以创制水稻雌性恢复系用于杂交稻制种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的OsMLH1、OsMLH3突变型基因，分别有Osmlh1-1、Osmlh1-2和Osmlh3-1、Osmlh3-2的突变类型，这几种突变类型的基因编码的蛋白在控制水稻雌性器官育性方面具有明显作用，其编辑的突变体Osmlh3和Osmlh1出现相似表型，结实率都下降到10％左右，可以利用上述突变型基因通过遗传工程的手段产生水稻雌性不育恢复系，用来生产杂交种子，开展轮回选择，在农业生产上具有十分重要的应用前景。

2、本发明的OsMLH1或OsMLH3突变型基因在调控水稻雌性发育中的应用，利用Cas9基因编辑法将OsMLH1或OsMLH3基因的相应碱基片段敲除，可以快速培育出结实率更低的水稻雌性不育恢复系。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1中Osmlh1突变系靶位点测序分析；

图2是实施例1中突变株系Osmlh1-1与野生型华占(HZ)同时发苗的植株对比照片；

图3是实施例1中突变株系Osmlh1-1与野生型华占(HZ)同时发苗的穗部表型对比照片；

图4是实施例1中突变株系Osmlh1-1、Osmlh1-2与野生型华占(HZ)的稻穗结实率统计图；

图5是本发明中突变株系Osmlh1-1、Osmlh3-1与野生型华占(HZ)的花粉育性及胚囊发育图(A、野生型华占花粉育性；B、Osmlh1-1花粉育性；C、Osmlh3-1花粉育性；D、野生型华占成熟胚囊结构；E、Osmlh1-1成熟胚囊结构；F、Osmlh3-1成熟胚囊结构)；

图6是实施例2中Osmlh3突变系靶位点突变分析；

图7是实施例2中突变株系Osmlh3-1与野生型华占(HZ)同时发苗的植株对比照片；

图8是实施例2中突变株系Osmlh3-1与野生型华占(HZ)同时发苗的穗部表型对比照片；

图9是实施例2中突变株系Osmlh3-1、Osmlh3-2与野生型华占(HZ)的稻穗结实率统计图；

图10是实施例3中体内荧光双分子(BiFC)试验的激光共聚焦扫描显微镜图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：调控水稻雌性发育的OsMLH1突变型基因Osmlh1-1和Osmlh1-2的发现

未突变的水稻OsMLH1基因的全长CDS(2175bp)序列参见SEQ ID No.1所示，该水稻OsMLH1基因编码的未突变蛋白序列(724aa)参见SEQ ID No.2所示。

通过序列比对和靶位点规则，在OsMLH1基因第2外显子上选择了特异靶位点5’ATCGATGGGGTTCAGAGGGGAGG3’，选用刘耀光团队单子叶植物的Cas9基因编辑载体系统：CRISPR/gRNA载体为pYL-U3/U6a～c-gRNA，CRISPR/Cas9双元载体为pYLCRISPR/cas9-MT(I)，首先设计靶位点接头引物(包括上游引物gRNA-F和下游引物gRNA-R，分别如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示)：

gRNA-F：GGCATCGATGGGGTTCAGAGGGG；

gRNA-R：AAACCCCCTCTGAACCCCATCGA；

与gRNA表达盒连接、扩增，构建好的靶标gRNA表达盒序列与pYLCRISPR/cas9-MT(I)连接，用农杆菌介导法，转化籼稻华占(HZ)。

获得T0代，然后收取阳性株的种子，种植T1代，设计靶位点测序引物(包括上游引物58900F2和下游引物58900R2，分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示)：

58900F2：GCTCGAGCGAGTGAGTCCCGA；

58900R2：CGTGCAATTGGCCTTCTGTTATCGT；

提取T1代单株DNA，PCR扩增检测靶位点，与野生型华占比对，获得T1代靶点纯合突变株，进一步繁殖获得靶点突变的纯合株系Osmlh1-1和Osmlh1-2。

对Osmlh1-1和Osmlh1-2突变系测序，测序结果如图1所示。结果表明，相比未突变的水稻OsMLH1基因全长CDS序列，Osmlh1-1在靶位点有1个碱基[G/-]缺失，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；Osmlh1-2在靶位点有[TTCAGAGGGG/-]10个碱基缺失，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

突变型基因Osmlh1-1编码得到的Osmlh1-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，Osmlh1-1缺失1bp后，发生移码突变，形成新的终止密码子，翻译蛋白为116aa。突变型基因Osmlh1-2编码得到的Osmlh1-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，Osmlh1-2缺失10bp后，发生移码突变，形成新的终止密码子，翻译蛋白为114aa。

这两类突变都会引起OsMLH1蛋白发生移码突变，翻译提前终止，形成截短蛋白，使其丧失功能，明显降低稻穗结实率。由图2-图4可知，突变株系Osmlh1-1的可见表型为结实率降为13.3％，突变株系Osmlh1-1和Osmlh1-2的表型几乎一致。

对野生型华占(HZ)和基因的突变系的花粉育性、胚囊发育、结实率进行调查。如图5所示，与野生型华占(HZ)相比(图5A、D)，结果显示Osmlh1的花粉育性基本正常，大约85％左右的胚囊败育(图5B、E)。

实施例2：调控水稻雌性发育的OsMLH3突变型基因Osmlh3-1和Osmlh3-2的发现

未突变的水稻OsMLH3基因的全长CDS(3588bp)序列参见SEQ ID No.7所示，该水稻OsMLH3基因编码的未突变蛋白序列(1195aa)参见SEQ ID No.8所示。根据序列比对分析和靶位点规则，在OsMLH3基因的第5外显子选取靶位5’ATCCAAGTTTCATAATGTCATGG3’，构建Cas9基因编辑载体，通过农杆菌介导法，转化籼稻华占(HZ)，获得T0代阳性植株，收获阳性植株种子种植T1代，经过靶位点测序分析，获得T1代靶点纯合突变株，进一步繁殖获得靶点突变的纯合株系Osmlh3-1和Osmlh3-2。

对Osmlh3-1和Osmlh3-2突变系测序，测序结果如图6所示。结果表明，相比未突变的水稻OsMLH3基因全长CDS序列，Osmlh3-1在靶位点有2个碱基[GT/-]缺失，Osmlh3-2在靶位点有1个碱基[T/-]缺失。

这两类突变会引起OsMLH3蛋白发生移码突变，使其丧失功能，明显降低稻穗结实率。由图6-图9可知，突变株系Osmlh3-1的可见表型为结实率降为10.5％，突变株系Osmlh3-1和Osmlh3-2的表型几乎一致。

对野生型华占(HZ)和基因的突变系的花粉育性、胚囊发育、结实率进行调查。如图5所示，与野生型华占(HZ)相比(图5A、D)，结果显示Osmlh3的花粉育性基本正常，大约85％左右的胚囊败育(图5C、F)。

实施例3：体内荧光双分子(BiFC)试验

荧光双分子互作研究的BiFC载体为pCAMBIA1300-35S-YFPn和pCAMBIA1300-35S-YFPc，具体试验过程如下：

1、以籼稻品种G99穗提取RNA，反转录成cDNA，以此cDNA为模板，使用高保真酶(KOD)PCR扩增OsMLH1基因；使用BamHI和SalI双酶切pCAMBIA1300-35S-YFPc载体，胶回收纯化载体，与OsMLH1基因的PCR产物混匀，使用无缝克隆方法构建pCAMBIA1300-35S-OsMLH1-YFPc载体，该PCR扩增采用的上下游引物为(分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示)：

YC-MLH1-BamHI-F：TCTGATCAAGAGACAGGATCCATGGACGAGCCTTCGCCGCG；

YC-MLH1-SalI-R：CATCGGTGCACTAGTGTCGACACACCTTTCAAAAATCTTGTA；

酶切反应：BiFC载体16μL；10×FastDigest buffer 2μL；FastDigest BamHI 1μL；FastDigest SalI 1μL；37℃反应30min；

无缝克隆反应：PCR产物4μL；酶切载体4μL；Assembly Enzyme 1μL；10×AssemblyBuffer 1μL，37℃反应30min。

2、同时使用高保真酶(KOD)PCR扩增OsMLH3基因；使用BamHI和SalI双酶切pCAMBIA1300-35S-YFPn载体，胶回收纯化载体，与OsMLH3的PCR产物混匀，使用无缝克隆方法构建pCAMBIA1300-35S-OsMLH3-YFPn载体，该PCR扩增采用的上下游引物为(分别如SEQID NO.15和SEQ ID NO.16所示)：

YN-MLH3-BamHI-F：TCTGATCAAGAGACAGGATCCATGCAGACAATAAAACGGTTG；

YN-MLH3-SalI-R：CATCGGTGCACTAGTGTCGACCAGGCCACCACGTAGCTTTCT；

酶切反应：BiFC载体16μL；10×FastDigest buffer 2μL；FastDigest BamHI 1μL；FastDigest SalI 1μL；37℃反应30min；

无缝克隆反应：PCR产物4μL；酶切载体4μL；Assembly Enzyme 1μL；10×AssemblyBuffer 1μL，37℃反应30min。

3、将连接产物pCAMBIA1300-35S-OsMLH1-YFPc和pCAMBIA1300-35S-OsMLH3-YFPn转入大肠杆菌中：将连接产物加到50-100μLTop10感受态细胞中混匀，冰浴30min；42℃恒温热激90s，热激结束立即置于冰浴中放置2min；加入500μL无抗生素的LB液体培养基，37℃220rpm振荡培养60min；8000rpm离心1min，弃上清留取100μL液体悬浮细菌，均匀涂布到含50mg/L卡那霉素的LB固体琼脂培养基，37℃倒置培养12-16h。

4、挑选单克隆菌落，摇菌后提取质粒测序，挑选测序正确的克隆用于农杆菌的转化：－70℃保存的EHA105农杆菌感受态置于冰上融化后加0.5-1μg质粒混匀，冰浴30min、液氮冷冻5min、37℃水浴热激5min，冰上放置5min；加入800μL无抗生素的YEB液体培养基，28℃220rpm振摇培养4h；8000rpm离心60s后去上清，留100μL，枪头吹打重悬菌液，涂布于含25mg/L利福霉素以及50mg/L卡那霉素的YEB固体平板上，28℃培养2-3d。

5、再利用转化的农杆菌烟草瞬时转化：挑单克隆摇菌过夜生长，收集菌液，重悬于诱导培养基中4个小时后重悬于渗透培养基；

诱导培养基配方：60mM K₂HPO₄，33mM KH₂PO₄，7.6mM(NH₄)₂SO₄，2mM sodiumcitrate，1mM MgSO₄，0.2％glucose，0.4％glycerol，10mM MES，50μg/mL acetosyringone，pH 5.6；

渗透培养基配方：0.5×MS，10mM MES，150μg/mL acetosyringone，pH 5.6。

6、把含有不同载体构建的农杆菌菌液按一定体积比例混合，保证混合后菌液中两个载体的量大致相同，OD600控制在为0.8左右，混合好的菌液使用1mL注射器注射4周大小的烟草叶片，72h以后将注射过农杆菌的叶片剪下，置于载玻片上，加少量水，盖上盖玻片后在激光共聚焦扫描显微镜(Olympus FV1000)下进行观察和拍照，结果如图10所示。

如果OsMLH1和OsMLH3在体内存在真实互作，pCAMBIA1300-35S-OsMLH1-YFPc和pCAMBIA1300-35S-OsMLH3-YFPn质粒表达的融合蛋白的YFPc和YFPn就会在空间上靠近，重新形成有活性的荧光蛋白，继而被检测到荧光出现，如图10所示，在烟草细胞中检测到黄色荧光，即表明蛋白OsMLH1和OsMLH3存在互作，相反，如果这两个蛋白不能互作，则无法使得YFPc和YFPn靠近，不会形成有活性的荧光蛋白，就检测不到荧光。

序列表

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 调控水稻雌性发育的突变型基因及其编码的蛋白、应用以及引物

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2175

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 1

atggacgagc cttcgccgcg cggaggtggg tgcgccgggg agccgccccg catccggagg 60

ttggaggagt cggtggtgaa ccgcatcgcg gcgggggagg tgatccagcg gccgtcgtcg 120

gcggtgaagg agctcatcga gaacagcctc gacgctggcg cctccagcgt ctccgttgcg 180

gtgaaggacg gtggcctcaa gctcatccag gtctccgatg acggccatgg catcaggttt 240

gaggatttgg caatattgtg cgaaaggcat actacctcaa agttatctgc atacgaggat 300

ctgcagacca taaaatcgat ggggttcaga ggggaggctt tggctagtat gacttatgtt 360

ggccatgtta ccgtgacaac gataacagaa ggccaattgc acggctacag ggtttcttac 420

agagatggtg taatggagaa tgagcctaag ccttgcgctg cggtgaaagg aactcaagtc 480

atggttgaaa atctatttta caacatggta gcccgcaaga aaacattgca gaactccaat 540

gatgactacc ccaagatcgt agacttcatc agtcggtttg cagtccatca catcaacgtt 600

accttctctt gcagaaagca tggagccaat agagcagatg ttcatagtgc aagtacatcc 660

tcaaggttag atgctatcag gagtgtctat ggggcttctg tcgttcgtga tctcatagaa 720

ataaaggttt catatgagga tgctgcagat tcaatcttca agatggatgg ttacatctca 780

aatgcaaatt atgtggcaaa gaagattaca atgattcttt tcataaatga taggcttgta 840

gactgtactg ctttgaaaag agctattgaa tttgtgtact ctgcaacatt gcctcaagca 900

tccaaacctt tcatatacat gtccatacat cttccatcag aacacgtgga tgttaatata 960

cacccaacca agaaagaggt tagccttttg aatcaagagc gtattattga aacaataaga 1020

aatgctattg aggaaaaact gatgaattct aatacaacca ggatattcca aactcaggca 1080

ttaaacttat cagggattgc tcaagctaac ccacaaaagg ataaggtttc tgaggccagt 1140

atgggttctg gaacaaaatc tcaaaaaatt cctgtgagcc aaatggtcag aacagatcca 1200

cgcaatccat ctggaagatt gcacacctac tggcacgggc aatcttcaaa tcttgaaaag 1260

aaatttgatc ttgtatctgt aagaaatgtt gtaagatcaa ggagaaacca aaaagatgct 1320

ggtgatttgt caagccgtca tgagctcctt gtggaaatag attctagctt ccatcctggc 1380

cttttggaca ttgtcaagaa ctgcacatat gttggacttg ccgatgaagc ctttgctttg 1440

atacaacaca atacccgctt ataccttgta aatgtggtaa atattagtaa agaacttatg 1500

taccagcaag ctttgtgccg ttttgggaac ttcaatgcta ttcagctcag tgaaccagct 1560

ccacttcagg agttgctggt gatggcactg aaagacgatg aattgatgag tgatgaaaag 1620

gatgatgaga aactggagat tgcagaagta aacactgaga tactaaaaga aaatgctgag 1680

atgattaatg agtacttttc tattcacatt gatcaagatg gcaaattgac aagacttcct 1740

gttgtactgg accagtacac ccctgatatg gaccgtcttc cagaatttgt gttggcttta 1800

ggaaatgatg ttacttggga tgacgagaaa gagtgcttca gaacagtagc ttctgctgta 1860

ggaaacttct atgcacttca tcccccaatc cttccaaatc catctgggaa tggcattcat 1920

ttatacaaga aaaatagaga ttcaatggct gatgaacatg ctgagaatga tctaatatca 1980

gatgaaaatg acgttgatca agaacttctt gcggaagcag aagcagcatg ggcccaacgt 2040

gagtggacca ttcagcatgt cttgtttcca tccatgcgac ttttcctcaa gcccccgaag 2100

tcaatggcaa cagatggaac gtttgtgcag gttgcttcct tggagaaact ctacaagatt 2160

tttgaaaggt gttag 2175

<210> 2

<211> 724

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 2

Met Asp Glu Pro Ser Pro Arg Gly Gly Gly Cys Ala Gly Glu Pro Pro

1 5 10 15

Arg Ile Arg Arg Leu Glu Glu Ser Val Val Asn Arg Ile Ala Ala Gly

20 25 30

Glu Val Ile Gln Arg Pro Ser Ser Ala Val Lys Glu Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Ser Leu Asp Ala Gly Ala Ser Ser Val Ser Val Ala Val Lys Asp Gly

50 55 60

Gly Leu Lys Leu Ile Gln Val Ser Asp Asp Gly His Gly Ile Arg Phe

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Ile Leu Cys Glu Arg His Thr Thr Ser Lys Leu Ser

85 90 95

Ala Tyr Glu Asp Leu Gln Thr Ile Lys Ser Met Gly Phe Arg Gly Glu

100 105 110

Ala Leu Ala Ser Met Thr Tyr Val Gly His Val Thr Val Thr Thr Ile

115 120 125

Thr Glu Gly Gln Leu His Gly Tyr Arg Val Ser Tyr Arg Asp Gly Val

130 135 140

Met Glu Asn Glu Pro Lys Pro Cys Ala Ala Val Lys Gly Thr Gln Val

145 150 155 160

Met Val Glu Asn Leu Phe Tyr Asn Met Val Ala Arg Lys Lys Thr Leu

165 170 175

Gln Asn Ser Asn Asp Asp Tyr Pro Lys Ile Val Asp Phe Ile Ser Arg

180 185 190

Phe Ala Val His His Ile Asn Val Thr Phe Ser Cys Arg Lys His Gly

195 200 205

Ala Asn Arg Ala Asp Val His Ser Ala Ser Thr Ser Ser Arg Leu Asp

210 215 220

Ala Ile Arg Ser Val Tyr Gly Ala Ser Val Val Arg Asp Leu Ile Glu

225 230 235 240

Ile Lys Val Ser Tyr Glu Asp Ala Ala Asp Ser Ile Phe Lys Met Asp

245 250 255

Gly Tyr Ile Ser Asn Ala Asn Tyr Val Ala Lys Lys Ile Thr Met Ile

260 265 270

Leu Phe Ile Asn Asp Arg Leu Val Asp Cys Thr Ala Leu Lys Arg Ala

275 280 285

Ile Glu Phe Val Tyr Ser Ala Thr Leu Pro Gln Ala Ser Lys Pro Phe

290 295 300

Ile Tyr Met Ser Ile His Leu Pro Ser Glu His Val Asp Val Asn Ile

305 310 315 320

His Pro Thr Lys Lys Glu Val Ser Leu Leu Asn Gln Glu Arg Ile Ile

325 330 335

Glu Thr Ile Arg Asn Ala Ile Glu Glu Lys Leu Met Asn Ser Asn Thr

340 345 350

Thr Arg Ile Phe Gln Thr Gln Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ile Ala Gln

355 360 365

Ala Asn Pro Gln Lys Asp Lys Val Ser Glu Ala Ser Met Gly Ser Gly

370 375 380

Thr Lys Ser Gln Lys Ile Pro Val Ser Gln Met Val Arg Thr Asp Pro

385 390 395 400

Arg Asn Pro Ser Gly Arg Leu His Thr Tyr Trp His Gly Gln Ser Ser

405 410 415

Asn Leu Glu Lys Lys Phe Asp Leu Val Ser Val Arg Asn Val Val Arg

420 425 430

Ser Arg Arg Asn Gln Lys Asp Ala Gly Asp Leu Ser Ser Arg His Glu

435 440 445

Leu Leu Val Glu Ile Asp Ser Ser Phe His Pro Gly Leu Leu Asp Ile

450 455 460

Val Lys Asn Cys Thr Tyr Val Gly Leu Ala Asp Glu Ala Phe Ala Leu

465 470 475 480

Ile Gln His Asn Thr Arg Leu Tyr Leu Val Asn Val Val Asn Ile Ser

485 490 495

Lys Glu Leu Met Tyr Gln Gln Ala Leu Cys Arg Phe Gly Asn Phe Asn

500 505 510

Ala Ile Gln Leu Ser Glu Pro Ala Pro Leu Gln Glu Leu Leu Val Met

515 520 525

Ala Leu Lys Asp Asp Glu Leu Met Ser Asp Glu Lys Asp Asp Glu Lys

530 535 540

Leu Glu Ile Ala Glu Val Asn Thr Glu Ile Leu Lys Glu Asn Ala Glu

545 550 555 560

Met Ile Asn Glu Tyr Phe Ser Ile His Ile Asp Gln Asp Gly Lys Leu

565 570 575

Thr Arg Leu Pro Val Val Leu Asp Gln Tyr Thr Pro Asp Met Asp Arg

580 585 590

Leu Pro Glu Phe Val Leu Ala Leu Gly Asn Asp Val Thr Trp Asp Asp

595 600 605

Glu Lys Glu Cys Phe Arg Thr Val Ala Ser Ala Val Gly Asn Phe Tyr

610 615 620

Ala Leu His Pro Pro Ile Leu Pro Asn Pro Ser Gly Asn Gly Ile His

625 630 635 640

Leu Tyr Lys Lys Asn Arg Asp Ser Met Ala Asp Glu His Ala Glu Asn

645 650 655

Asp Leu Ile Ser Asp Glu Asn Asp Val Asp Gln Glu Leu Leu Ala Glu

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Ala Glu Ala Ala Trp Ala Gln Arg Glu Trp Thr Ile Gln His Val Leu

675 680 685

Phe Pro Ser Met Arg Leu Phe Leu Lys Pro Pro Lys Ser Met Ala Thr

690 695 700

Asp Gly Thr Phe Val Gln Val Ala Ser Leu Glu Lys Leu Tyr Lys Ile

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<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

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<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

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<213> 水稻(Oryza sativa L.)

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115

<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 6

Met Asp Glu Pro Ser Pro Arg Gly Gly Gly Cys Ala Gly Glu Pro Pro

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Arg Ile Arg Arg Leu Glu Glu Ser Val Val Asn Arg Ile Ala Ala Gly

20 25 30

Glu Val Ile Gln Arg Pro Ser Ser Ala Val Lys Glu Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Ser Leu Asp Ala Gly Ala Ser Ser Val Ser Val Ala Val Lys Asp Gly

50 55 60

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Val

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<213> 水稻(Oryza sativa L.)

<400> 7

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<213> 水稻(Oryza sativa L.)

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Lys Asn Thr Val Arg Asp Met Asn Phe Asp Thr Ala Ala Pro Ala Glu

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Pro Lys Asp Asn Tyr Leu Ser Leu Asp Met Glu Pro Ser Thr Trp Arg

420 425 430

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Asp Leu Ser Ser Ala Asn Pro Thr Ile Cys Lys Met Gln Lys Thr Glu

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Asp Ile Phe His Gly His Ala Tyr Ser Gly Lys Phe Gly Leu Leu Gln

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530 535 540

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Leu Ser Asp Asp Gly Arg Gly Ile Thr Tyr Leu Asp Ser Glu Glu Asp

995 1000 1005

Leu Val Leu Pro Glu Thr Gly Phe Gln Leu Phe Gln Lys Tyr Met Gln

1010 1015 1020

Gln Ile Gln Ser Trp Gly Trp Ile Ile Asn Ser Thr Asn Ser Cys Glu

1025 1030 1035 1040

Ser Phe Lys Lys Asn Met Asn Val Leu Arg Arg Gln Ser Arg Arg Leu

1045 1050 1055

Thr Leu Ala Ala Val Pro Cys Ile Leu Gly Val Thr Leu Thr Gly Lys

1060 1065 1070

Asp Leu Met Asp Phe Ile Gln Gln Leu Asp Asp Thr Asp Gly Ser Ser

1075 1080 1085

Ala Ile Pro Pro Ala Val Ile Arg Ile Leu Asn Phe Lys Ala Cys Arg

1090 1095 1100

Gly Ala Ile Met Phe Gly Asp Pro Leu Leu Pro Ser Glu Cys Ser Leu

1105 1110 1115 1120

Ile Ile Glu Glu Leu Lys Ala Thr Ser Leu Cys Phe Gln Cys Ala His

1125 1130 1135

Gly Arg Pro Thr Thr Val Pro Ile Val Asn Val Ala Ser Leu Arg Gly

1140 1145 1150

Glu Leu Ala Arg Leu Gly Ala Val Asn Gly Arg Gln Glu Glu Thr Trp

1155 1160 1165

His Gly Leu Ser His His Gly Pro Ser Leu Glu Arg Ala Arg Thr Arg

1170 1175 1180

Leu Arg Glu Leu Arg Lys Leu Arg Gly Gly Leu

1185 1190 1195

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggcatcgatg gggttcagag ggg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaccccctc tgaaccccat cga 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctcgagcga gtgagtcccg a 21

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgtgcaattg gccttctgtt atcgt 25

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tctgatcaag agacaggatc catggacgag ccttcgccgc g 41

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catcggtgca ctagtgtcga cacacctttc aaaaatcttg ta 42

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tctgatcaag agacaggatc catgcagaca ataaaacggt tg 42

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

catcggtgca ctagtgtcga ccaggccacc acgtagcttt ct 42

Claims (5)

1.一种调控水稻雌性发育的OsMLH1突变型基因，具体为突变型基因Osmlh1-1或突变型基因Osmlh1-2，其特征在于，所述突变型基因Osmlh1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述突变型基因Osmlh1-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种调控水稻雌性发育的蛋白，其特征在于，由权利要求1所述OsMLH1突变型基因编码得到，所述突变型基因Osmlh1-1编码得到的Osmlh1-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述突变型基因Osmlh1-2编码得到的Osmlh1-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.一种如权利要求1所述的OsMLH1突变型基因在调控水稻雌性发育中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：利用Cas9基因编辑法将所述水稻OsMLH1基因全长CDS序列的第334位核苷酸[G/-]或第325-334位核苷酸[TTCAGAGGGG/-]敲除后，培养出新的水稻雌性不育恢复系，用于混播混收机械化制种。

5.一种用于扩增权利要求1所述OsMLH1突变型基因的引物，其特征在于，所述引物由具有SEQ ID NO. 13所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO. 14所示核苷酸序列的下游引物组成。

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