CN113018359A - 石壁茶提取物及石壁茶活性成分山茶苷a在制备治疗肝损伤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及石壁茶提取物及石壁茶活性成分山茶苷A在制备治疗肝损伤的药物中的用途，本发明研究了石壁茶水提物及其主要成分山茶苷A对四氯化碳肝损伤小鼠的治疗作用，发现石壁茶提取物及山茶苷A可通过抗氧化、抗炎及抗细胞凋亡作用发挥保护肝组织细胞的作用，促进肝损伤的修复，且对安全、无毒。本发明不仅发掘了石壁茶提取物及山茶苷A的新应用方向，而且为化学性肝损伤提供了新的治疗方案。

Description

石壁茶提取物及石壁茶活性成分山茶苷A在制备治疗肝损伤 的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及石壁茶提取物及石壁茶活性成分山茶苷A在制备治疗肝损伤的药物中的用途。

背景技术

肝脏是腹腔内最大的实质性器官，担负着人体的重要生理功能。肝病会严重危害人们的身体健康和生活质量，肝损伤是各种肝脏疾病共有的一种病理状态，其持续恶化会导致肝硬化、肝纤维化、肝癌等严重疾病，危及患者生命。肝损伤因诱因不同可分为很多种，主要有病毒性、酒精性、物理性、化学性、环境性及代谢性等肝损伤。

四氯化碳(CCl₄)是一种典型的肝脏毒性物质，是工业生产中常用的溶剂，也用作干洗剂、灭火剂及薰蒸剂，是化学工业迅速发展过程中产生的有毒的污染环境及损害人体健康的化学物质，尤其对肝、肾有严重的损害作用，吸入高浓度的四氯化碳可迅速出现昏迷、抽搐，甚至造成室颤和呼吸中枢麻痹而猝死。在科学研究过程中，四氯化碳诱导的肝损伤模型一直以来广泛用于肝损伤、肝坏死及肝硬化的病因学、组织学和肝功能变化的研究以及对保肝药物、药用植物提取物的评价。四氯化碳引发的肝损伤作用机制复杂，主要是与氧化应激、炎症以及细胞凋亡有关。当四氯化碳进入肝细胞后，经过细胞色素P450酶代谢激活，产生三氯甲基自由基(CCl₃·)和过氧化三氯甲基自由基(OOCCl₃·)，这些自由基会与肝细胞膜、内质网和线粒体上的磷脂分子发生共价结合，引发脂质过氧化反应损害膜的结构和功能，并通过抑制细胞膜及线粒体膜上钙泵的活性，使得大量Ca²⁺内流，导致肝细胞损伤，从而影响细胞正常的物质能量代谢。另外，四氯化碳代谢产物还可以刺激肝脏Kupffer细胞，释放促炎性细胞因子，引起局部或全身免疫反应，还可激活细胞内促凋亡蛋白，最终诱导细胞凋亡，进一步加重肝脏的损伤。

肝损伤尤其是四氯化碳诱发的肝损伤通常伴随严重的肝肾衰竭，现代医学并无治疗肝损伤的特异性药物，目前多采用休息、调节饮食、补充维生素等方法进行治疗，严重者需被迫终止其他疾病治疗的用药，以免加重肝损伤。迄今临床仍缺乏高效、无明显毒副作用的西药用于治疗肝损伤疾病，而天然药物治疗肝损伤相关疾病的实验和临床研究成果展示了广阔的应用前景。近些年随着天然药物提取、分离和检测方法的不断进步，极大地促进了天然药物中具有保肝作用的有效成分(包括黄酮、生物碱、多糖和萜类等)及保肝作用机制的研究。天然药物作为我国的传统医药，具有保肝疗效稳定，毒副作用较小，多成分、多靶点起效、历史悠久、资源丰富等特点而日渐备受青睐。中医古籍以及中医药现代研究中的单味药材和复方主要通过以下途径发挥肝脏保护作用：①清热解毒利湿，如复方柳菊片、茵栀黄注射液、复方夏枯草、茵陈蒿汤、龙胆泻肝汤等；②疏肝理气，如柴胡疏肝散、芍药甘草汤、逍遥散等；③补肾健脾益气养血，如复方五仁醇胶囊、养阴软肝颗粒等；④活血化瘀，如血府逐瘀汤、活络舒肝胶囊、赤芍、丹参、桃仁、地龙等。而关于石壁茶及其组分山茶苷A在肝损伤保护中的作用尚未报道。

石壁茶本是一种野生植物，又叫石崖茶、石山茶，因生长在悬崖上而得名，其学名为亮叶杨桐(Adinandra nitida)，为亮叶杨桐属黄瑞木茶科，它常作为一种保健茶和传统的中草药被长期食用。研究表明，石壁茶中含有丰富的黄酮类化合物，如山茶苷A、山茶苷B和芹菜素，其中以山茶苷A为主，约占15％-30％左右。石壁茶在减脂、抗癌、降血压等方面具有多种疗效；中医多有记载石壁茶在消炎镇痛方面的用处，民间常用它来防治各种炎症、无名肿痛及外伤等疾病，有明显的效果且无任何副作用。目前尚无石壁茶及其成分在肝损伤保护中的应用的报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了石壁茶提取物及石壁茶活性成分山茶苷A在制备治疗肝损伤的药物中的用途，石壁茶提取物及山茶苷A可通过抗氧化、抗炎及抗细胞凋亡作用以达到保护肝组织细胞的目的，进而促进肝损伤的修复作用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供了石壁茶提取物或/和石壁茶活性成分山茶苷A在制备治疗肝损伤的药物中的应用。

优选地，所述石壁茶提取物包括但不限于石壁茶水提物。

之前由于石壁茶是野生茶，生长在峭壁上，采摘困难，资源有限，功效研究受到一定的影响。近年来由于栽培技术的提升，石壁茶逐渐得到人工栽培且大幅度推广，人工栽培的品质经检测并不输野生茶，且其主要功效成分山茶苷A的含量比野生茶更丰富。

本发明选用的石壁茶主要是人工栽培的石壁茶，当然也可以是野生茶，石壁茶提取物和山茶苷A可从茶叶中直接提取分离，也可直接从公司购买，材料来源广、制备简单、容易获得。

其中，山茶苷A的结构如式(I)所示：

优选地，所述肝损伤为化学性肝损伤。

进一步地，所述肝损伤包括但不限于四氯化碳诱导的肝损伤。

优选地，所述治疗包括抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡。

如图1所示，本发明研究了石壁茶水提物及其主要成分山茶苷A对四氯化碳肝损伤小鼠的治疗作用，发现：(1)石壁茶水提物与山茶苷A对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤具有良好的治疗作用，降低了肝组织损伤指数，减少了炎性浸润，降低了病变中过高的谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平，保护肝功能；(2)石壁茶提取物与山茶苷A能够减少肝损伤中活性氧ROS和脂质过氧化反应产物MDA的含量，刺激了抗氧化酶SOD，CAT的活性，通过抗氧化作用治疗肝损伤；(3)石壁茶提取物与山茶苷A能够减少肝损伤中高表达的促炎因子TNF-α和IL-1β，通过抗炎作用治疗肝损伤；(4)石壁茶提取物与山茶苷A能够减少肝损伤中促凋亡因子Bax的表达水平并增加抑制凋亡因子Bcl2的表达水平，通过抗凋亡作用治疗肝损伤。

说明石壁茶水提物及山茶苷A对四氯化碳诱导的肝损伤均具有较好的疗效，其可通过抗氧化调节氧化应激，下调炎症因子TNF-α、IL-1β及减少促凋亡因子Bax和增加抑制凋亡因子Bcl2(即抗氧化、抗炎及抗细胞凋亡作用)，从而有效减轻肝脏的损伤程度，达到保护肝组织细胞的目的，促进肝损伤的修复，有望应用于肝损伤保护中。

本发明还提供了一种用于治疗化学性肝损伤的药物，该药物以石壁茶提取物或/和石壁茶活性成分山茶苷A为主要活性成分。

优选地，还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

进一步地，所述赋形剂是指可用于药学领域的稀释剂、黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稳定剂以及其他一些药用基质。

进一步地，所述载体是药物领域中可接受的功能性药用辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(PLGA)、透明质酸等。

优选地，所述药物的剂型包括但不限于注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、口服液制剂。

进一步地，所述药物可以经口服或胃肠外方式(例如静脉、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其制备成肠衣片剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了石壁茶提取物及石壁茶活性成分山茶苷A在制备治疗肝损伤的药物中的用途，石壁茶提取物及山茶苷A可通过抗氧化、抗炎及抗细胞凋亡作用发挥保护肝组织细胞的作用，促进肝损伤的修复，且对安全、无毒。本发明不仅发掘了石壁茶提取物及山茶苷A的新应用方向，而且为化学性肝损伤提供了新的治疗方案。

附图说明

图1为石壁茶水提物及山茶苷A保护肝脏的原理图；

图2为石壁茶水提物及山茶苷A对四氯化碳肝损伤小鼠的缓解作用(A为肝脏组织HE染色；B为肝损伤指数的评估)；

图2中，Normal：正常对照组，Model：模型对照组，Positive：水飞蓟(100mg/kg)，L-CA：低浓度山茶苷A(30mg/kg b.w.)，H-CA：高浓度山茶苷A(100mg/kg b.w.)，L-Tea：低浓度石壁茶冻干粉(200mg/kg b.w.)，H-Tea：高浓度石壁茶冻干粉(700mg/kg b.w.)，所有数值均表示为平均值±SD,与Control相比，##P<0.01；与Model相比，**P<0.01，*P<0.05。

图3为石壁茶水提物及山茶苷A对四氯化碳肝损伤小鼠肝脏组织和血清中AST和ALT含量的影响(A为血清中AST的酶活；B为血清中ALT的酶活；C为肝脏组织匀浆液中AST的酶活；D为肝脏组织匀浆液中ALT的酶活)；

图3中，Normal：正常对照组，Model：模型对照组，Positive：水飞蓟(100mg/kg)，L-CA：低浓度山茶苷A(30mg/kg b.w.)，H-CA：高浓度山茶苷A(100mg/kg b.w.)，L-Tea：低浓度石壁茶冻干粉(200mg/kg b.w.)，H-Tea：高浓度石壁茶冻干粉(700mg/kg b.w.)，所有数值均表示为平均值±SD,与Control相比，##P<0.01；与Model相比，*P<0.05，**P<0.01。

图4为石壁茶水提物及山茶苷A对四氯化碳肝损伤小鼠的抗氧化作用(A为肝脏组织匀浆液中MDA的含量；B为肝脏组织匀浆液中ROS的含量；C为肝脏组织匀浆液中SOD的酶活；D为肝脏组织匀浆液中CAT的酶活)；

图4中，Normal：正常对照组，Model：模型对照组，Positive：水飞蓟(100mg/kg)，L-CA：低浓度山茶苷A(30mg/kg b.w.)，H-CA：高浓度山茶苷A(100mg/kg b.w.)，L-Tea：低浓度石壁茶冻干粉(200mg/kg b.w.)，H-Tea：高浓度石壁茶冻干粉(700mg/kg b.w.)，所有数值均表示为平均值±SD,与Control相比，##P<0.01；与Model相比，*P<0.05，**P<0.01。

图5为石壁茶水提物及山茶苷A对四氯化碳肝损伤小鼠的抗炎作用(A为TNF-α和IL-1β的免疫组化结果；B为TNF-α和IL-1β免疫组化结果的定量分析)；

图5中，Normal：正常对照组，Model：模型对照组，Positive：水飞蓟(100mg/kg)，L-CA：低浓度山茶苷A(30mg/kg b.w.)，H-CA：高浓度山茶苷A(100mg/kg b.w.)，L-Tea：低浓度石壁茶冻干粉(200mg/kg b.w.)，H-Tea：高浓度石壁茶冻干粉(700mg/kg b.w.)，所有数值均表示为平均值±SD,与Control相比，##P<0.01；与Model相比，*P<0.05，**P<0.01。

图6为石壁茶水提物及山茶苷A对四氯化碳肝损伤小鼠的抗凋亡作用(A为Bax和Bcl2的western blot结果；B为Bax和Bcl2 western blot结果的定量分析)。

图6中，Normal/Nor：正常对照组，Model/Mod：模型对照组，Positive/Pos：水飞蓟(100mg/kg)，L-CA：低浓度山茶苷A(30mg/kg b.w.)，H-CA：高浓度山茶苷A(100mg/kgb.w.)，L-Tea：低浓度石壁茶冻干粉(200mg/kg b.w.)，H-Tea：高浓度石壁茶冻干粉(700mg/kg b.w.)，所有数值均表示为平均值±SD,与Control相比，##P<0.01；与Model相比，*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。

实施例1石壁茶水提物及其主要成分山茶苷A对四氯化碳肝损伤小鼠的治疗作用研究

一、实验方法

1、石壁茶水提物及山茶苷A的制备

石壁茶水提物的制备：石壁茶干茶叶用粉碎机粉碎，将茶粉在沸水中提取(茶/水的比例为1:20)3次，每次30分钟，过滤并合并所得提取液，将提取液在60℃下旋蒸浓缩，然后冷冻干燥成石壁茶冻干粉即得石壁茶水提物。

山茶苷A的制备方法如下：用1500mL沸水提取100g石壁茶叶60min，过滤所得残渣再用1200mL沸水提取60min并过滤，将两次滤液混合，在2℃下保存24小时，然后过滤收集沉淀物，沉淀物在60℃下干燥5h，得到粗品。粗品用20％乙醇重结晶纯化5次，得到结晶体，结晶体经60℃干燥3h，得到纯度超过98％的淡黄色山茶苷A单体。

2、构建小鼠肝损伤模型

购买7周龄C57雄性小鼠，适应性饲养一周后，随机分组：(1)正常对照组；(2)模型对照组；(3)阳性药对照组；(4)低剂量山茶苷A组；(5)高剂量山茶苷A组；(6)低剂量石壁茶水提物组；(7)高剂量石壁茶水提物组，每组各7只动物。

实验前一天，禁食12h后，除正常组外小鼠腹腔注射1mg/kg CCl₄诱导小鼠急性肝损伤(CCl₄溶于玉米油)，正常组小鼠注射等量玉米油；造模给药2h后，各组按照表1所示的给药剂量进行灌胃给药(水飞蓟、山茶苷A、石壁茶冻干粉溶于0.5％CMCNa溶液)，每天1次，连续3天，末次灌胃2h后处死小鼠，采集血液和肝脏样本进行进一步分析。

表1动物实验设计分组及注射剂量

3、肝脏组织切片的制备

(1)处死动物后马上留取组织块，用锋利刀片分割需包埋和切片的组织；

(2)将组织用4％多聚甲醛浸泡24-48h，若样品需保存1-2月，用4％多聚甲醛固定24h后需更换70％乙醇保存，若隔天脱水包埋直接进行以下步骤；

(3)用锋利刀片将固定好的组织切成2-3mm厚度的组织块，置于标记好的包埋盒中，投入70％乙醇固定液，准备脱水；

(4)组织脱水：用全自动组织脱水机进行组织脱水，检查每个罐的脱水试剂，补充体积至300-500mL，按照如下程序设定脱水步骤：70％、80％、90％、95％乙醇依次脱水，每次30min；100％乙醇脱水3次，每次20min；二甲苯浸泡3次，每次20min；液态石蜡(65℃恒温)透蜡2次，第一次40min，第二次60min；

(5)用夹子取下脱水篮，夹出包埋盒，放入预先设定开机的组织包埋机的液蜡槽中，逐个进行包埋，并置于旁边冰面上凝固，取出包埋组织蜡块，-20℃冻存暂时不用的蜡块；

(6)设定切片厚度(4-5μm)，装好刀片，将蜡块取出擦去表面水珠，并固定于切片机上，开始切片；

(7)将切好的片子于42℃水面上展片，用载玻片捞片，37℃烘片过夜或40℃烘片2h，进行后续实验。

4、肝脏组织HE染色

组织切片40℃烘片2h后，可进行HE染色。步骤如下：

(1)二甲苯1脱蜡10min；(2)二甲苯2脱蜡10min；(3)无水乙醇1复水5min；(4)无水乙醇2复水5min；(5)95％乙醇复水2min；(6)80％乙醇复水2min；(7)70％乙醇复水2min；(8)蒸馏水洗5s；(9)苏木素染色10min；(10)95％乙醇浸泡5s；(11)自来水流水冲洗10min；(12)纯水冲洗5s；(13)伊红染色40s；(14)蒸馏水洗10s；(15)95％乙醇脱水2min；(16)无水乙醇脱水2min；(17)二甲苯1透明5min；(18)二甲苯2透明5min；(19)中性树胶封片。

封片结束后置于常温自然烘干24h,采用光学显微镜进行观察分析。

5、肝脏组织免疫组化分析

组织切片40℃烘片2h后，可进行免疫组化实验。具体步骤如下：

(1)切片脱蜡复水：二甲苯1脱蜡10min，二甲苯2脱蜡10min，无水乙醇1复水5min，无水乙醇2复水5min，95％乙醇复水2min，80％乙醇复水2min，70％乙醇复水2min；

(2)清洗：纯水浸泡2min，TBS浸泡5min；

(3)室温浸泡3％H₂O₂15min，灭活内源性过氧化物酶；

(4)纯水冲洗1次，TBS浸泡5min；

(5)修复抗原：1×EDTA修复液700mL，采用微波炉加热修复(EDTA修复液沸腾10-15min：微波炉先高火煮8-10min，沸腾后转中低火10min)，室温自然冷却30min；

(6)用TBS浸泡清洗3次，每次5min；

(7)用油笔圈标出切片中的组织区域；

(8)将封闭液(含5％血清的1×TBST溶液)滴于切片画好的油圈中，室温封闭40min；

(9)吸水纸吸去封闭液，加入一抗(用封闭液稀释)于4℃湿盒内孵育过夜；

(10)待切片恢复室温后，回收一抗，用TBS洗3次，每次5min；

(11)采用生物素标记二抗室温孵育60min，TBS浸泡清洗3次，每次5min；

(12)采用SABC试剂(HRP)室温反应30min，TBS浸泡3次，每次5min

(13)DAB室温显色，每组时间不超过5min；

(14)流水冲洗5min后用纯水泡1min；

(15)苏木精复染1min；

(16)流水冲洗10min，95％乙醇脱2min，100％乙醇脱水2min，二甲苯透明两次，每次各5min；

(17)中性树胶封片。

封片结束后置于常温自然烘干24h，采用光学显微镜进行观察拍照。采用ImageJ软件进行免疫组化定量分析。

6、肝脏组织Westernblotting检测蛋白水平表达

(1)蛋白样品制备：取各组肝组织约40mg，放入事先预冷的含有2-3颗珠子与400μLRIPA裂解液的匀浆管中，按照1:10的比例，补齐RIPA裂解液，即1mg组织加10μL裂解液，设定匀浆机参数(转速6bar，时间10s)，将匀浆管对称置于匀浆机上充分匀浆，10s结束后，迅速将匀浆管插入冰中静止1min，重复间歇匀浆2-3次，将匀浆管插入冰中静止1h，收集匀浆液于1.5mL EP管，于4℃、13200rpm离心20min，取中层清澈提取液(单独取5μL出来用于蛋白含量测定)，其余分装并于-80℃保存。

(2)定量蛋白：1)BCA工作液的配制：根据测定需要量将A液和B液按50:1的比例混合均匀；2)蛋白标准液的配制：配制0mg/mL、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL的蛋白标准品；3)取96孔板，在预定的孔中每孔加入稀释25倍后(5μL样品+120μL水)的25μL样品或标准品25μL，再每孔加入200μLBCA工作液，轻敲混匀；4)37℃孵育箱孵育30min，在562nm波长下酶标仪测OD值，根据标准曲线求各样本的蛋白浓度。

(3)制备SDS-PAGE凝胶，电泳：将电泳缓冲液倒入电泳槽至合适液面，插入电泳槽。轻轻拔去梳子，将玻璃夹板“凹”面贴紧电泳槽，两侧用夹子很好的固定在电泳槽上。吸出变性蛋白液，贴紧加样孔上方，将样品轻轻加至凝胶孔中；将电泳仪设置成稳压状态，接通电源，将电压调至80V使样品通过浓缩胶。当染料进入分离胶后，将电压调高到120V，继续电泳使染料至分离胶适当位置；

(4)待蛋白分离完全后，停止电泳，小心取出凝胶，去除浓缩胶部分，提前准备好适当大小的PVDF膜并在甲醇中浸泡5min左右，转膜装置从下到上依次是阳极板、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵、阴极板。确保各层间均接触良好，将每一层滤纸接触面的气泡排出。

(5)将准备好的转膜夹子插入转膜槽中，在其中加入预先4℃预冷的转膜液，正确连接电源，保证电荷由负极向正极流动。置于装有冰的盒子中，接通电源，恒流275mA运行60-90min；

(6)转膜结束后小心取出转移膜，在膜的右上角做标记，在1×TBST液中漂洗一下，放入含有5％脱脂奶粉的封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动封闭1-2h。

(7)根据蛋白分子量大小将PVDF膜剪开，加入用封闭液按照一定比例稀释的一抗，室温孵育2h或4℃过夜；

(9)回收一抗，用1×TBST漂洗3次，每次5分钟，之后加入用1×TBST按照一定比例稀释的二抗，孵育50min之后回收二抗，1×TBST洗膜3次，每次5min。

(10)按1：1(v/v)混合ECL试剂盒中的两种液体，将上述混合液均匀铺在PVDF膜表面，室温作用2分钟，将膜置于Canon凝胶成像系统中显影。

7、SOD、MDA、ROS、CAT、ALT、AST指标检测

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)、过氧化氢酶(CAT)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)指标的检测，分别按照试剂盒的操作说明进行检测：MDA(南京建成A003-1)；ROS(酶免MM-43700M1)；CAT(南京建成A007-1-1)；SOD(南京建成A001-3)；AST(南京建成C010-2-1)；ALT(南京建成C009-2-1)。

8、统计方法

所有数据均以至少三个独立实验的平均值±标准差(Mean±SD)表示。使用GraphPad Prism 7.0软件(GraphPad software Inc.，San Diego,CA,USA)进行单向方差分析和Tukey’s检验。计算值p<0.05(*)和p<0.01(**)差异为有统计学意义。

二、实验结果

(1)HE染色结果

肝损伤严重程度的评分从1到5取决于细胞坏死、凝固物、中央区域和周围炎性浸润的程度。病变程度根据严重程度由1-5级分级:0分表示正常，1分表示极低(1％)，2分表示轻度(1-25％)，3分表示中度(26％-50％)，4分表示中度/重度(51-75％)，5分表示重度/高度(76-100％)。

从图2可以看出，模型组中肝脏细胞排列紊乱，发生了炎症细胞的浸润，肝细胞浆凝聚，显示造模方法较好。石壁茶水提物和山茶苷A明显改善了肝组织病理状态，其中高浓度处理结果更为显著。

(2)肝脏组织和血清AST、ALT的含量检测结果

ALT和AST升高程度与肝细胞受损程度相一致，是目前最常用的肝功能检测指标。ALT与AST主要分布在肝细胞内，一小部分存在于肌肉细胞内。如果肝脏受损或损坏，肝细胞中的转氨酶便进入血液，血液中ALT和AST水平升高，提示肝脏疾病信号。

从图3可以看出，模型组中不管是肝脏组织还是血液中，ALT和AST水平显著增加，说明肝损伤模型构建成功。阳药组以及石壁茶水提物和山茶苷A处理组，ALT和AST水平趋于正常水平，说明石壁茶水提物和山茶苷A具有显著的降低转氨酶的活性作用，具有降酶保肝的作用

(3)抗氧化指标的测定结果

氧化损伤是四氯化碳诱发肝损伤的主要作用机制，氧化损伤指标丙二醛(MDA)为脂质过氧化反应形成的脂质过氧化物之一，可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映细胞损伤的程度。ROS自由基激增，不仅直接对肝细胞造成氧化损伤，还可导致脂质过氧化，进一步诱发炎症反应和细胞凋亡。SOD和CAT是人体最常见的抗氧化酶，可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。

从图4可以看出，MDA、ROS的激增和SOD、CAT的骤减，说明四氯化碳诱发的肝损伤引起了氧化应激，而石壁茶水提物及山茶苷A可显著降低了活性氧ROS和MDA的含量，并激发了SOD和CAT抗氧化酶的活性(具浓度依赖性)，说明石壁茶水提物和山茶苷A通过抗氧化活性缓解了肝损伤。

(4)炎症反应指标的检测结果

炎症反应是肝损伤发生的重要机制，受损组织中的中性粒细胞浸润会诱发多种炎症因子的释放，并增强肝细胞的炎症反应。其中，TNF-α和IL1β主要由巨噬细胞产生，以引发炎症反应，调节免疫细胞的功能。

从图5可以看出，模型组中TNF-α和IL1β的表达水平显著升高，说明四氯化碳肝损伤促发了炎症反应。而石壁茶水提物及山茶苷A可显著降低这两个炎症因子的表达水平，说明石壁茶水提物及山茶苷A可发挥抗炎作用缓解肝损伤。

(5)促凋亡蛋白的表达检测

细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，多数研究显示，在各种肝疾病中，肝细胞损伤的结果可导致肝细胞凋亡，抑制细胞凋亡可达到保护肝细胞损伤的目的。

从图6可以看出，四氯化碳肝损伤模型中促凋亡蛋白Bax表达显著升高，抑制凋亡因子Bcl2明显降低，说明细胞凋亡的发生(β-Actin为内参)。而石壁茶水提物及山茶苷A显著抑制了促凋亡蛋白的表达，增加了抑制凋亡因子的表达，从而抑制了细胞凋亡，说明石壁茶水提物及山茶苷A发挥抗凋亡作用缓解肝损伤。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.石壁茶提取物或/和石壁茶活性成分山茶苷A在制备治疗肝损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述石壁茶提取物包括但不限于石壁茶水提物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝损伤为化学性肝损伤。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肝损伤包括但不限于四氯化碳诱导的肝损伤。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述治疗包括抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡。

6.一种用于治疗化学性肝损伤的药物，其特征在于，以石壁茶提取物或/和石壁茶活性成分山茶苷A为主要活性成分。

7.根据权利要求6所述的一种用于治疗化学性肝损伤的药物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。

8.根据权利要求6所述的一种用于治疗化学性肝损伤的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括但不限于注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、口服液制剂。

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