CN106995479B - 化合物人参皂苷Rk1的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物化学领域，具体公开了一种高纯度化合物人参皂苷Rk1（ginsenoside Rk1，C42H70O12）的制备方法与应用，制备方法包括用冰乙酸水溶液溶解人参二醇组皂苷，之后利用水浴反应制备ginsenoside Rk1。所采用的方法操作简单，成本低，适宜工业化生产。所述应用包括在制备保护对乙酰基氨基酚（Acetaminophen,APAP）致肝损伤药物及保健品中的应用。
Description
技术领域
本发明属于化合物制备领域，提供了天然化合物—人参皂苷Rk1（ginsenosideRk1）的制备方法与应用。
背景技术
人参皂苷Rk1（ginsenoside Rk1）是一种稀有人参皂苷，在人参中含量极少，在红参或黑参热加工过程中大量产生（Jin, Y., J. Piao, and S.M. Lee., Evaluating thevalidity of the Braden scale using longitudinal electronic medical records.JRes Nurs Health, 2015, 38, 152-61;）。目前，利用高压酸水解可以高效制备人参皂苷Rk1。
在人参加工过程中，二醇类皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd 等受热或在微酸环境中，部分水解可生成人参皂苷20( S，R) -Rg3，人参皂苷20( S，R) -Rg3在20位碳上的-OH和22位碳上的-H进一步脱水而在20位和22位碳之间形成双键，最终生成人参皂苷Rk1。
“药物性肝病”是指由药物或其代谢产物引起的肝损害。大约75%的肝脏血来自胃肠道和脾脏，经门静脉进入肝脏。这些血液带来了大量经胃肠道吸收的药物和外源性毒物。肝脏在解毒这些物质的同时，产生的毒性物质造成肝损害（毛颖婕，等. 肝损伤的中药治疗研究进展，江西中医学院学报，2011年）
对乙酰基氨基酚（Acetaminophen, APAP），又称“扑热息痛”，在临床应用中常作为止痛和退烧的药物。APAP在治疗剂量时是安全的，但是急性或蓄积性的过量则会导致严重的肝损伤，并有可能进一步发展成肝衰竭。在美国和英国，APAP过量是肝损伤最常见的原因。APAP致急性肝损伤不同于常规化学物质致肝损伤，其病因较为复杂和特殊。APAP在代谢过程中会产生自由基而引起肝细胞膜脂质过氧化，并且通过钙稳态而产生细胞毒素，导致严重的肝细胞损伤，通过肝脏病理切片可以看到严重的炎性浸润和大面积的细胞坏死（顾兴丽，等. 扑热息痛肝损伤机制研究进展，中国临床药理学与治疗学，2009年）。
目前，对于APAP肝损伤的治疗药物研究最透彻是N-乙酰半胱氨酸，在美国,该药为口服，而在大多数国家(尤其是欧洲)则喜欢静脉用药，疗效比较显著，患者死亡率低。但长期应用容易产生副作用，如可引起咳呛、支气管痉挛、恶心、呕吐、胃炎等不良反应。近年来，从天然药中发现许多天然化合物具有良好的抗APAP肝损伤作用，如中药菟丝子的乙醇提取物和甘草素被用来治疗APAP肝损害（Yen FL, Wu TH , Lin LT, et. al.,Hepatoprotective and antioxidant effects of Cuscuta Chinensis againstacetaminophen- induced hepatotoxicity in rats. J Ethnopharmacol, 2007, 111,123 -128; Kim YW, Ki SH, Lee JR, et al .Liquiritigenin, an aglycone ofliquiritin in Glycyrrhizae radix, prevent acute liver in rats induced byacetaminophen with or without buthionine sulfoximine. Chem Biol Interact,2006, 161, 125-138）。不难看出，天然药安全，可靠，廉价易得，从天然药物中寻找预防和治疗APAP诱导肝损伤具有广阔的前景。
研究发现：人参皂苷Rk1具有多种药理活性，如抗癌，提高免疫力及益智等功能（关大鹏，等. 高温热裂解人参皂苷Rk1和Rg5的制备工艺优化，上海中医药杂志，2015年）。到目前为止，未见有关人参皂苷Rk1（ginsenoside Rk1）对“对乙酰基氨基酚”所致急性肝损伤保护作用的报道，本发明创造性的提出并证明了该成分可以预防和治疗急性肝损伤。
人参皂苷Rk1可以通过化学处理廉价易得的人参茎叶皂苷生产二醇型皂苷，进而水解产生而获得，是一种非常有前途和开发价值的肝损伤保护剂。
发明内容
本发明提供了人参皂苷Rk1（以下简称“Rk1”）在制备预防对乙酰基氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤药物中的应用。
本发明所述的人参皂苷Rk1在用于上述用途时，其口服或胃肠外给药，均是安全的，在口服情况下，其可以以任何常规的形式给药，如片剂，胶囊剂，粉针剂，注射剂，丸剂，软胶囊，颗粒剂和贴剂等。
本发明制备保护急性肝损伤药物是由有效单体或有效成分与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体的赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个例子，散剂是内服的粉末剂，它的赋形剂有乳糖，淀粉，糊精，碳酸钙，合成或天然硫酸铝，氧化镁，硬脂酸镁，碳酸氢钠，干燥酵母等；溶液剂的赋形剂有水，甘油，1，2-丙二醇，单糖浆，乙醇，乙二醇，聚乙二醇，山梨糖醇等；软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木蜡、液体石蜡等组合成的疏水剂或亲水剂。本发明的药物组合物可以按现有技术中已知的方法如混合、制粒、压片来制备。本发明药物组合物还可以包括各种药学使用的任何组分，如香味剂、着色剂、甜味剂等。
本发明的有益效果在于，人参皂苷Rk1可以利用富含人参皂苷的提取物进行酸水解而得到，其容易获得，工业化前景好，同时具有疗效显著和毒副作用小等优点。
本发明可以通过下面的实验例进一步说明。
实验例. 人参皂苷Rk1的制备方法
1、选用比例为10%的冰醋酸水溶液1.0L作为反应液，保持冰乙酸水溶液处于0~4℃，之后添加100g人参二醇组皂苷，二醇组皂苷经HPLC分析主要含有人参皂苷Rb1,Rb2,Rc和Rd等，总含量约为92%，边加边搅动。将反应液置于80~90℃水浴反应2小时，静置取沉淀即得两种构型的人参皂苷Rg3粗品59.5g，再经80℃含0.1%吡啶的热乙醇溶解、冷却及重结晶即得50.2g的人参皂苷Rk1，得率>50%。
2、选用比例为20%的冰醋酸水溶液1.0L作为反应液，保持冰乙酸水溶液处于0~4℃，之后添加100g人参二醇组皂苷，二醇组皂苷经HPLC分析主要含有人参皂苷Rb1,Rb2,Rc和Rd等，总含量约为92%，边加边搅动。将反应液置于80~90℃水浴反应2小时，静置取沉淀即得两种构型的人参皂苷Rg3粗品62.5g，再经80℃含0.3%吡啶的热乙醇溶解、冷却及重结晶即得52.5g的人参皂苷Rk1，得率>50%。
3、选用比例为30%的冰醋酸水溶液1.0L作为反应液，保持冰乙酸水溶液处于0~4℃，之后添加100g人参二醇组皂苷，二醇组皂苷经HPLC分析主要含有人参皂苷Rb1,Rb2,Rc和Rd等，总含量约为92%，边加边搅动。将反应液置于80~90℃水浴反应2小时，静置取沉淀即得两种构型的人参皂苷Rk1粗品65.2g，再经80℃含0.5%吡啶的热乙醇溶解、冷却及重结晶即得56.1g的人参皂苷Rk1，得率>50%。
上述制备方法优选含0.1-0.5的吡啶溶剂，经HPLC分析，不加吡啶处理，其Rk1得率在37-42%，明显少于加吡啶溶剂的热乙醇。
实验例. 人参皂苷Rk1对APAP诱导的急性肝损伤的保护作用
1 材料和方法
1.1 材料、试剂及仪器
人参皂苷Rk1，ginsenoside Rk1， 纯度>98.5%(HPLC)；对乙酰基氨基酚(APAP, 纯度>99%)。
谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)试剂盒等均购自南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)试剂盒均购自美国R&D公司。
BP211D电子天平，德国Sartorius公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；HC-2517高速离心机，安徽中科中佳公司；Epoch超微量微孔板分光光度计，美国伯腾仪器有限公司；FSH-2A可调高速匀浆机，金坛市华城海龙实验仪器厂。
1.2 实验动物：
雄性ICR小鼠32只，体重（25±2g）购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。所有小鼠允许自由进食水和维持饲料，25±2℃的温度，50±10%的相对湿度下昼夜交替循环。所有实验必须按照中华人民共和国国家科技委员会实验动物管理条例进行。
1.3 动物分组与给药：
给药组按剂量每天灌胃给药一次，连续7天，正常对照组和模型组灌胃等体积纯净水。末次给药后开始断粮，1h后对模型组和给药组小鼠一次性腹腔注射250 mg/kg的APAP生理盐水溶液，造模24h后依次对各组小鼠进行眼球取血，3000r/min离心10min分离血清，4℃保存备用；迅速解剖取肝脏及脾脏。经4℃生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重，取部分肝脏于10%的甲醛溶液中固定，待切片，剩余肝脏-80℃低温冰箱中保存。
1.4 血清中生化指标的测定：
采集小鼠血液分离血清，按照试剂盒方法测定，谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，肿瘤坏死因子(TNF-α)，白细胞介素-1β(IL-1β)。
1.5 肝脏中生化指标的测定：
取部分肝脏称重，加入9倍体积的冰生理盐水，用组织匀浆机制得10%的肝组织匀浆，离心取上清液。按照试剂盒方法点板，在450nm处测定OD值，根据公式计算肝脏中MDA的含量和GSH的活性。
1.6 肝组织病理学观察
取部分肝脏组织置于10%的中性甲醛溶液中固定，低浓度到高浓度酒精脱水，二甲苯中透明，常规石蜡包埋，切片，脱蜡后用H&E染色，于光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化。
1.7 数据处理
实验数据均用均数±标准差(±s)表示，用SPSS22.0统计软件进行分析，组间采用单因素方差分析比较差异。P<0.05位明显差异。
结果：
2.1人参皂苷Rk1对小鼠一般状态、体重及肝指数的影响
与正常对照组小鼠相比，APAP模型组小鼠摄食量和饮水量均减少，肝脾指数显著升高( p<0.01 )，肝脏有损伤现象，代谢器官受损严重；Rk1给药组，小鼠状态明显好转，可以明显改善APAP所致的肝指数下降( P<0.01, P<0.05 )，结果如表1所示。
表1 人参皂苷Rk1对APAP致肝损伤小鼠体重、脏器指数的影响(n=8)
注：与空白组相比** P<0.01；与模型组相比## P<0.01,# P<0.05
2.2 人参皂苷Rk1有效减少APAP致血清ALT和AST的水平
从实验的结果可以看出，APAP会导致血清中的ALT和AST活性明显升高(P<0.01)，Rk1给药组与模型组比ALT和AST活性均有显著的降低(P<0.01)。结果如表2所示。
表2. 人参皂苷Rk1对APAP诱导的肝损伤小鼠ALT和AST的影响
注：与空白组相比** P<0.01；与模型组相比## P<0.01
2.3 人参皂苷Rk1有效减少APAP致血清TNF-α和IL-1β水平
TNF-α是细胞信号因子，可以促进急性反应的发生，IL-1β被认为是细胞免疫应答过程中的关键调节因子，正常细胞中升高会导致炎症反应的发生。APAP使血清中TNF-α和IL-1β的浓度明显升高(P<0.01,P<0.05)。给予Rk1治疗后TNF-α和IL-1β与模型组比明显的下降（P<0.01,P<0.05），降低了炎症反应。结果如表3.
表3. 人参皂苷Rg3对APAP导致急性肝损伤小鼠TNF-α和IL-1β的影响
注：与空白组相比** P<0.01, * P<0.05；与模型组相比## P<0.01, # P<0.05
2.4 人参皂苷Rk1有效减少APAP致肝组织氧化应激损伤
与空白组相比，模型组小鼠肝组织匀浆中MDA含量明显的上升，GSH水平显著下降(P<0.01)，使小鼠体内脂质过氧化产物累积，抗氧化代谢水平降低；与模型组相比，人参皂苷Rk1给药组MDA含量明显的下降(P<0.01, P<0.05)，GSH水平均显著升高(P<0.05)，表明人参皂苷Rk1可以在一定程度上缓解APAP引起的脂质过氧化，调节体内抗氧化代谢水平，结果如表4 所示。
表4. 人参皂苷Rk1对APAP肝损伤小鼠肝组织脂质过氧化影响
注：与空白组相比** P<0.01；与模型组相比## P<0.01, # P<0.05
2.5 人参皂苷Rk1有效减少APAP致肝组织坏死和炎性浸润
通过对肝脏组织病理学的观察，空白组具有完整的肝小叶和圆润而饱满的肝细胞。模型组的细胞发生了结构的变化，主要的特征是细胞水肿和变性，出现大面积的炎性浸润和细胞坏死，Rk1的给药组有效的减轻了APAP的损伤，炎性浸润明显降低，细胞坏死的区域明显减少，也使肝细胞数量明显增加，图略。
人参皂苷Rk1有效减少APAP致肝细胞凋亡
为了确定Rk1对APAP导致的小鼠肝组织肝毒性的保护作用，进行了肝组织的Hoechst染色。结果表明：对照组小鼠肝组织中细胞生长旺盛，经Hoechst染色后未见细胞皱缩及凋亡发生；而经APAP处理的模型组，可以明显看见细胞核皱缩，可见部分碎片，呈致密浓染，推测APAP会诱导小鼠肾组织细胞凋亡。与比模型组比较，Rk1给药组明显改善，图略。
人参皂苷Rk1显著减少APAP所致的硝基化
通过免疫组织化学染色分析，空白组3-NT(3-硝基酪氨酸)表达几乎不可见，而模型组肝组织中3-NT(3-硝基酪氨酸)表达明显增加。经过Rk1预给药治疗后，Rk1两个剂量组的肝组织中3-硝基酪氨酸表达明显减弱，表明Rk1能够有效减少APAP所致的硝基化。
结论
人参皂苷Rk1在10和20 mg/kg剂量范围内，可以显著改善对乙酰基氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤，主要通过改善急性氧化应激水平、降低炎症因子及抗凋亡等，是一种很有前景的药物肝损伤保护剂。
实施例 药物的实施例
制备药剂的实施例一
胶囊剂的制备 200g人参皂苷Rk1，药用淀粉适量，两者充分混匀，装胶囊，制成1000粒胶囊，每粒重0.25g，每粒含人参皂苷Rk1 200mg。口服，每次4粒，每日三次。
制备药剂的实施例二
片剂的制备 200g人参皂苷Rk1，药用淀粉适量，两者充分混匀，用乙醇做粘合剂制湿颗粒，干燥，过120目筛整粒，装胶囊，每粒200 mg，每次口服1-2粒，每日2次。
制备药剂的实施例三
滴丸剂的制备 聚乙二醇4000 300g，在水浴上熔化，加入人参皂苷Rk1原料200g，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80-90℃下滴入冷却过的液体石蜡中（温度±4℃），滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，再加入少量滑石粉，混匀，得人参皂苷Rk1滴丸1000粒。口服，一次4粒，每日三次，饭后服用。
以上根据上述实施方式对本发明的人参皂苷Rk1在制备预防急性肝损伤药物的应用进行了说明，但本发明并不限于上述实施方式，在不脱离其要旨的范围内，可在各种方式中实施本发明。除了上述实施方式之外，其它等同技术方案也应当在其保护范围之内，在此不再一一叙述。
Claims (2)
1.人参皂苷Rk1在制备预防对乙酰基氨基酚（Acetaminophen, APAP）致急性肝损伤药物中的应用，具体明显改善APAP产生的氧化应激、炎症反应、细胞凋亡及硝化应激，Rk1能够有效减少APAP所致的硝基化。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将人参皂苷Rk1作为唯一活性成份与制药中可以接受的辅助和/或添加成份混合后，按常规的制药方法和工艺要求，制成用于治疗或预防急性肝损伤的制药中可接受的剂型，选自片剂，胶囊剂，粉针剂，注射剂，丸剂，软胶囊，颗粒剂和贴剂。
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