CN113016714A - 一种泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法及评价泄泻食滞胃肠证动物模型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法及评价泄泻食滞胃肠证动物模型的方法，该制备方法包括以下步骤：向动物投喂高蛋白高热量的饲料，并辅以植物油灌胃，具体为：向所述动物投喂高蛋白高热量的饲料后，第4天开始辅以植物油灌胃。本发明的制备方法以向动物投喂高蛋白高热量饲料联合灌胃植物油的方式模拟饮食不节病因，成功制成符合泄泻食滞胃肠证症状的动物模型，该制备方法可有效制备泄泻食滞胃肠证动物模型，所制成的动物模型是成功的、可行的，可用于泄泻食滞胃肠证的后续研究。

Description

一种泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法及评价泄泻食滞胃 肠证动物模型的方法

技术领域

本发明涉及动物模型制备技术领域，更具体地，涉及一种泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法及评价泄泻食滞胃肠证动物模型的方法。

背景技术

实验动物模型是药物的药效、药理及毒理研究的重要工具。动物模型所反映的疾病是否符合临床是影响药物评价的关键因素。目前，以西医病名为主的动物模型研究较多，而中医的特色为辨证论治，目前对各种“证”的病因病机和生理生化变化等本质尚未完全阐明，故复制与临床“证”相符的动物模型是现代中医药研究领域中的难点。根据症候相关的理化指标判定与药物反证是目前检验模拟中医“证”的动物模型是否可靠的主要方法。

泄泻是以排便次数增多，粪质溏薄或完谷不化，甚至泻出如水样为主症的常见脾胃肠疾病，感受外邪、饮食所伤、情志失调、病后体虚、禀赋不足等是泄泻的主要病因。食滞胃肠证是泄泻临床分型的常证，亦称食积证、伤食证。食滞胃肠泄泻的病因病机在于饮食过量、嗜食肥甘生冷或误食不洁而伤于脾胃，使脾胃运化功能失调，肠道分清泌浊、传导功能失司。泄泻食滞胃肠证的中医诊断和辩证要点为泄下大便臭如败卵，或伴不消化食物，脘腹痞满，纳呆等，临床上以消食导滞，和中止泄为治法，代表方为保和丸。

目前关于泄泻的动物模型研究较多，食滞胃肠证的动物模型研究较少，而泄泻食滞胃肠证动物模型的研究几乎是空白。现有针对食滞动物模型的研究多从过量饮食、嗜食肥甘生冷等饮食角度着手，用饥饱失常、给予高脂高热量饲料、灌胃白酒、食醋或熟地黄等方法创建模型，虽取得一定的效果，但亦存在以下问题：

(1)食滞动物模型既可出现泄泻，也可出现便秘症状。食滞化热，津伤肠燥，则肠失温润、运化无力而引发便秘。以往食滞模型的研究发现大多小鼠出现粪便干结、量少、肛温升高等食积化热症状，与泄泻相距甚远。

(2)动物摄食量难以控制。饮食过量，食物消化不正常而积滞于胃肠是食滞胃肠证的主要诱因，以往食滞模型的研究大多用特制饲料喂养，小鼠自由取食，食量难以控制，因此较难判断饮食是否过量，加上特制饲料口感差、易变质，容易使小鼠厌食，更难达到食滞的目的。

(3)未结合食滞胃肠证的发病人群考虑模型动物的周龄。食滞胃肠证在婴幼儿中常见,因为婴幼儿的脾胃脏腑尚未发育完全，本就脾胃虚弱，如饮食不当，极易引起食滞胃肠。因此创建泄泻食滞胃肠证动物模型时应尽量选周龄较小的动物。

(4)模型评价指标较单一。以往研究对食滞胃肠模型多从动物的一般行为、粪便特征、病理解剖形态、体重及摄食量、胃残存率、小肠推进率等较粗略的指标进行评价，不够客观全面，亟需建立客观科学、全面综合的模型评价体系。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法，以泄泻食滞胃肠证的病因为导向，以自食高蛋白高热量饲料联合灌胃植物油的方式模拟饮食不节制备泄泻食滞胃肠证动物模型，所制备的动物模型符合泄泻食滞胃肠证的症状体征，可用于泄泻食滞胃肠证的后续研究。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法，包括以下步骤：

向动物投喂高蛋白高热量的饲料，并辅以植物油灌胃，具体为：向所述动物投喂高蛋白高热量的饲料后，第4天开始辅以植物油灌胃。

在一些实施方式中，造模时间为5～10天。

在一些实施方式中，所述饲料由面粉、奶粉、肉松和豆粉制成。

在一些实施方式中，所述饲料由面粉、奶粉、肉松和豆粉按质量比为1:1:1:2的配比制成。

在一些实施方式中，所述饲料由以下方法制备：将面粉、奶粉、肉松和豆粉按比例混合均匀后，加适量蒸馏水和成糊状，塑形成棒状，干燥；具体地，利用模具塑形成棒状，每块长约5cm，直径约1cm，用电热恒温鼓风干燥箱干燥，置于干燥处保存。

在一些实施方式中，所述植物油包括但不限于大豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、稻米油、芝麻油、花生油、胡麻油中的至少一种；优选的，所述植物油为金龙鱼1:1:1食用植物调和油。

在一些实施方式中，向所述动物投喂所述饲料后，第4天开始辅以植物油灌胃，所述植物油用量为：每日2次，每次0.2～1.0mL。

在一些实施方式中，所述动物为小鼠。

本发明的目的之二在于提供一种泄泻食滞胃肠证动物模型，所述动物模型由上述任一实施方式的制备方法制备而成。

本发明的目的之三在于提供一种评价泄泻食滞胃肠证动物模型的方法，该方法从宏观表征和微观指标对所述动物模型进行评价，并基于方证相应理论以泄泻食滞胃肠证的代表方——保和丸反证；所述宏观表征包括动物模型的粪便性状、摄食量、体重增长表征；所述微观指标包括动物模型的粪便含水率、肠道消化酶活性、胃泌素、胆囊收缩素指标。

相较于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明的制备方法中，向动物投喂高蛋白高热量的饲料后灌胃植物油，以动物自食高蛋白高热量饲料联合灌胃植物油的方式模拟饮食不节病因，其中，植物油作用在于提供高脂及延缓胃排空、加快小肠推进，成功诱导实验小鼠出现便溏、粪便臭如败卵、伴不消化食物、纳差等符合泄泻食滞胃肠证的症状体征，且出现摄食量减少、体重增长缓慢、粪便含水率升高，肠内蛋白酶、淀粉酶、乳糖酶等多种消化酶活性下降，血清脂肪酶、胃泌素、胆囊收缩素水平降低等系列生理生化指标的改变。通过本发明的方法可有效制备符合泄泻食滞胃肠证症状的动物模型。

本发明评价泄泻食滞胃肠证动物模型的方法，是结合中医食滞胃肠证的临床症状及西医生理生化指标对泄泻食滞胃肠证的动物模型进行评价，并通过治疗泄泻食滞胃肠证的代表方--保和丸对动物模型的治疗效果进一步反证动物模型的创建是否成功，该评价方法可有效证明本发明创建的泄泻食滞胃肠证动物模型是成功的、可行的，可用于泄泻食滞胃肠证的后续研究。

附图说明

图1为具体实施例实验组和对照组实验小鼠粪便含水量变化图；

图2为具体实施例实验组和对照组实验小鼠摄食量变化图；

图3为具体实施例实验组和对照组实验小鼠饮水量变化图；

图4为具体实施例实验组和对照组实验小鼠体重增长变化图；

图5为具体实施例保和丸干预对实验小鼠模型的粪便含水量的影响；

图6为具体实施例保和丸干预对实验小鼠模型摄食量的影响；

图7为具体实施例保和丸干预对实验小鼠模型饮水量的影响；

图8为具体实施例保和丸干预对实验小鼠模型体重增长的影响。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

一、小鼠模型制备

1、实验动物

SPF级雄性昆明小鼠75只，3周龄，体重(20±2)g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司(许可证：SCXK(湘)2019-0004)，质量合格证编号NO.110727201100782721。适应性喂养2天，将75只实验小鼠随机分成正常组(N＝30)和模型组(N＝45)，每笼5只。

2、常规饲料和特制饲料制备

常规饲料：为大小鼠繁殖饲料(湖南嘉泰实验动物有限公司生产(许可证：SCXK(湘)2015-0010，生产批号：M01-20200712)，由实验动物中心提供。

特制高蛋白高热量饲料：由面粉(惠宜低筋小麦粉)、奶粉(雀巢怡运全家营养奶粉)、肉松(烘培肉粉松，制造商：安徽力正食品股份有限公司)、豆粉(惠宜豆浆粉(速溶豆粉))，按1:1:1:2的比例配制而成。将原材料充分混匀后加适量蒸馏水和成糊状，利用模具塑形成棒状，每块长约5cm，直径约1cm，用电热恒温鼓风干燥箱烘干，置于干燥处保存。

3、植物油

金龙鱼1:1:1食用调和油，市购。

4、造模

用特制高蛋白高热量饲料喂养联合植物油灌胃的方法模拟饮食不节制备泄泻食滞胃肠证小鼠模型。模型组小鼠投喂高蛋白高热量的特制饲料，并从第4天开始辅以植物油灌胃，一日2次，每次0.5mL；正常组投喂常规饲料，同期给予等体积无菌水灌胃。造模时间共6天。

二、模型小鼠治疗

1、保和丸的制备

保和丸全方由山楂18g，神曲6g，半夏9g，茯苓9g，陈皮3g，连翘3g，莱菔子3g组成，中药饮片均购于湖南中医药大学第一附属医院。按全方用药比例称取各味中药，加水300mL浸泡半小时，武火煮沸后转文火煎煮半小时，用纱布滤出药液，药渣再加水200mL，同法煎煮取滤液。将两次药液混合，文火浓缩制成含生药0.28g/mL的保和丸汤剂。

2、给药治疗

造模结束后，取部分正常组(N＝15)及模型组(N＝15)小鼠取材后检测相关指标。同时将模型组剩余30只实验小鼠随机分成自然恢复组(N＝15)和中药干预组(N＝15)。中药干预组给予保和丸汤剂灌胃，按体表面积折算临床等效剂量为6.63g/Kg/d，连续给药3天，正常组和自然恢复组给予等体积无菌水灌胃。

3、检测指标

试验期间每日上午8时对实验动物的外观表征、粪便情况、体重、摄食量、饮水量等指标进行观察及记录，并收集各组小鼠的新鲜粪便烘干称重，计算粪便含水率。

粪便含水率(％)＝(湿便重量-干便重量)/湿便重量×100％

4、生化指标

(1)胃泌素、胆囊收缩素含量测定

小鼠采血前禁食不禁水，摘眼球取血法采集全血标本。血样在室温下静置2h后3000rpm，4℃离心10min，取血清用于胃泌素、胆囊收缩素含量测定。采用酶联免疫吸附测定法测定血清样本胃泌素、胆囊收缩素水平。

(2)脂肪酶含量检测

按上述(1)的方法采集全血标本，血样送至湖南中医药大学第一附属医院医学检验中心检验血清中脂肪酶含量。

(3)肠道消化酶活性测定

小鼠颈椎脱臼处死后在无菌环境下收集小肠段内容物，同组小鼠的内容物样本混匀后装入灭菌离心管中，加入20mL无菌水，震荡5min后3000r/min离心10min，取上清液测定蛋白酶、淀粉酶、乳糖酶、纤维素酶和木聚糖酶的活性。利用福林酚法测定蛋白酶活性；3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定淀粉酶、纤维素酶和木聚糖酶活性；邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)法测定乳糖酶活性。

三、泄泻食滞胃肠证小鼠模型的评价

(一)以与临床诊断标准等效对应法评价

造模结束后，根据泄泻食滞胃肠证的临床诊断标准及生化指标对小鼠模型进行评价。本申请利用自食高蛋白高热量的特制饲料联合灌胃植物油的方式模拟饮食不节、嗜食肥甘厚腻的病因来复制泄泻模型，饮食物成分及量的“太过”，超出机体正常所需量和脾胃的运化腐熟能力，符合中医饮食不节之说。本发明建立的模型小鼠表现出软糊便、溏便，伴明显酸臭，粪便见明显透纸水渍迹，摄食量减少，体重增长缓慢等宏观表征，以及粪便含水量升高，肠内消化酶活性降低，血清脂肪酶、胆囊收缩素、胃泌素水平降低等微观病理生理特征，与腹泻的诊断要点和食滞胃肠证的辩证要点相符，与泄泻食滞胃肠证的病理相符。

相应病理生理特征具体表现如下：

(1)粪便特征

造模第2天，模型组实验小鼠大便质地变软，按压易扁，气味酸臭。造模第5天，模型组实验小鼠粪便基本呈条形，用镊子夹取易变形、沾镊，过半数呈稠糊状，气味臭秽，将粪便置于滤纸上按压易糊开、有明显透纸水渍迹，部分实验小鼠的肛周及尾部可见粪便粘附污染或被毛湿润，粪便镜检见淀粉颗粒和脂肪球。正常组实验小鼠的大便色黑呈麦粒状，软硬适中，将粪粒置于滤纸上按压不易变形、无明显透纸水渍迹，酸臭味不明显，肛周及尾部干净、不潮湿，粪便镜检淀粉颗粒和脂肪球阴性。造模期间实验小鼠粪便的含水率具体如图1所示，由图1可知，在造模1天后，模型组实验小鼠的粪便含水率开始显著高于正常组(p＜0.05)。模型组实验小鼠的上述表现结合饮食史与泄泻食滞胃肠证的诊断和辩证要点中有明确伤食史，泻下大便臭如败卵，或伴消化不良食物等均相符合。

(2)摄食量、饮水量和体重增长量

图2-4分别为模型组和正常组实验小鼠摄食量、饮水量和体重增长的变化图，其中，图2为摄食量变化图；图3为饮水量变化图，图4为体重增长变化图。由图2-4可知，在造模期间，模型组实验小鼠的摄食量虽随日龄的增加表现出增长趋势，但仍显著低于正常组的摄食量(p＜0.05)；与正常组相比，模型组的饮水量显著增加(p＜0.05)；模型组的体重增长缓慢且显著低于正常组实验小鼠(p＜0.05)，且在造模后期，随着摄食量的增加，体重增长反而呈下降趋势，甚至出现负增长。

(3)脂肪酶、胃泌素和胆囊收缩素

由表1可知，在造模因素影响下，模型组实验小鼠的血清脂肪酶水平以及血清胃泌素、胆囊收缩素水平显著低于正常组(p＜0.01)。

表1实验小鼠血清脂肪酶、胆囊收缩素(CCK)、胃泌素(Gas)的变化(N＝5)

与正常组比较，**表示p<0.01。

(4)肠道消化酶活性

由表2可知，造模使实验小鼠肠道内容物中的木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和乳糖酶的活性下降，其中，纤维素酶、淀粉酶、乳糖酶的活性显著低于正常组(p＜0.05)。

表2实验小鼠肠道消化酶活性变化(N＝5)

与正常组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01

(二)药物反证法评价

造模结束后，一部分模型组小鼠自然恢复，一部分模型组小鼠给予泄泻食滞胃肠证的代表方——保和丸进行干预，以保和丸的治疗效果对泄泻食滞胃肠证小鼠模型进行评价。本发明中保和丸对小鼠模型有改善作用，能改善小鼠粪便性状，有益摄食、体重增长等表征恢复，可调节胃泌素、胆囊收缩素分泌，调节肠道消化酶活性等促进消化机能恢复，一方面证明了保和丸对食滞胃肠泄泻的疗效，另一方面也有效的反证了泄泻食滞胃肠证小鼠模型的可靠性。保和丸干预后，实验小鼠的病理生理特征表现如下：

(1)粪便特征

用保和丸对中药干预组实验小鼠进行1天干预后，该组实验小鼠粪便由不成形的稠糊状溏便或条形软糊便逐渐变为麦粒形，质地由软烂转正常，酸臭气味减轻，同期，自然恢复组实验小鼠的粪便性状也有类似的好转，但仍有个别存在便溏、软便等症状。干预第3天，中药干预组、自然恢复组的粪便性状与正常组的基本无异，均成麦粒形，软硬适中，将粪粒置于滤纸上按压不易变形、无明显透纸水渍迹，无明显酸臭味，肛周及尾部干净、不潮湿。由图5可知，治疗期间三组实验小鼠的粪便含水量无明显差异(p＞0.05)。

(2)摄食量、饮水量和体重增长量

由图6-8可知，在治疗期间，恢复至常规饮食的第1天，中药干预组和自然恢复组的摄食量出现较明显的反弹，由造模期间显著低于正常组转变成略高于正常组，但自然恢复组的摄食量在这之后转而下降，至第3天显著低于正常组(p＜0.05)，与之相比，中药干预组的摄食量变化幅度较平缓，摄食量日渐接近正常组基线。恢复正常饮食后，中药干预组和自然恢复组的饮水量恢复至正常组基线，三组之间差异不显著。

正常组、自然恢复组和中药干预组的日均体重增长量分别为0.78±0.17g/只、0.93±0.95g/只和1.39±0.85g/只，其中，中药干预组的日均体重增长显著高于正常组(p＜0.05)。治疗期间，中药干预组实验小鼠的体重增长量一直高于自然恢复组，在治疗第2天尤为突出(p＜0.05)。

(3)脂肪酶、胆囊收缩素和胃泌素

由表3可知，中药干预组与自然恢复组的血清脂肪酶水平差异不大，均显著低于正常组(p＜0.05)。三组之间的胆囊收缩素水平，以自然恢复组最低，中药干预组次之，正常组最高。三组实验小鼠之间的胃泌素水平，表现为自然恢复组最低、且显著低于正常组(p＜0.05)，中药干预组次之、且显著高于自然恢复组(p＜0.05)而接近正常组。说明保和丸对模型小鼠的血清胆囊收缩素和胃泌素水平具有一定的上调作用，使其向正常基线水平恢复。

表3保和丸干预对实验小鼠血清脂肪酶、胆囊收缩素(CCK)、胃泌素(Gas)的影响(N＝5)

与正常组比较，*表示p<0.05；与自然恢复组比较，#表示p<0.05。

(4)肠道消化酶活性

由表4可知，三组实验小鼠的木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和乳糖酶等酶活性均以自然恢复组最高；除纤维素酶差异不显著外，中药干预组的其他4种酶活性均显著低于自然恢复组(p＜0.05)；与正常组对比，中药干预组的蛋白酶和淀粉酶显著降低(p＜0.05)、乳糖酶显著升高(p＜0.05)，木聚糖酶和纤维素酶的活性与正常组差异不显著；而自然恢复组的酶活性均显著高于正常组(p＜0.05)。

表4保和丸干预对实验小鼠肠道酶活性的影响(N＝5)

与正常组比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01；与自然恢复组比较，#表示p<0.05，##表示p<0.01

综上，本发明以自食高蛋白高热量饲料联合灌胃植物油的方式模拟饮食不节病因，成功诱导实验小鼠出现便溏、粪便臭如败卵、伴不消化食物、纳差等符合泄泻食滞胃肠证的症状体征，且出现摄食量少、体重增长缓慢、粪便含水率升高，肠内蛋白酶、淀粉酶、乳糖酶等多种消化酶活性下降，血清脂肪酶、胃泌素、胆囊收缩素水平降低等系列生理生化指标的改变，经保和丸干预后模型小鼠的相关症状体征和生理生化指标有明显改善，表明本发明创建的泄泻食滞胃肠证模型是成功的、可行的，可用于泄泻食滞胃肠证的后续研究。

本申请中，泄泻食滞胃肠证动物模型，是指泄泻、而且是食滞胃肠证的动物模型。

需要说明的是，本发明的制备方法，除了上述具体实施例中的小鼠模型，还可制备其他的泄泻食滞胃肠证动物模型，包括但不限于大鼠、兔子等动物模型。本发明的评价方法，同样适用于评价其他的泄泻食滞胃肠证动物模型，包括但不限于大鼠、兔子等动物模型。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

向动物投喂高蛋白高热量的饲料，并辅以植物油灌胃，具体为：向所述动物投喂高蛋白高热量的饲料后，第4天开始辅以植物油灌胃。

2.根据权利要求1所述的泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法，其特征在于，造模时间为5～10天。

3.根据权利要求1所述的泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法，其特征在于，所述饲料由面粉、奶粉、肉松和豆粉制成。

4.根据权利要求3所述的泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法，其特征在于，所述饲料由面粉、奶粉、肉松和豆粉按质量比为1:1:1:2的配比制成。

5.根据权利要求4所述的泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法，其特征在于，所述饲料由以下方法制备：

将所述面粉、奶粉、肉松和豆粉按比例混合均匀后，加适量蒸馏水和成糊状，塑形成棒状，干燥。

6.根据权利要求1所述的泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法，其特征在于，所述植物油包括大豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、稻米油、芝麻油、花生油和胡麻油中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法，其特征在于，向所述动物投喂所述饲料后，第4天开始辅以植物油灌胃，所述植物油用量为：每日2次，每次0.2～1.0mL。

8.根据权利要求1-7任一项所述的泄泻食滞胃肠证动物模型的制备方法，其特征在于，所述动物为小鼠。

9.一种泄泻食滞胃肠证动物模型，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的制备方法制备而成。

10.一种评价泄泻食滞胃肠证动物模型的方法，其特征在于，从宏观表征和微观指标进行评价，并基于方证相应理论以泄泻食滞胃肠证的代表方保和丸反证；所述宏观表征包括动物模型的粪便性状、摄食量、体重增长表征；所述微观指标包括动物模型的粪便含水率、肠道消化酶活性、胃泌素、胆囊收缩素指标。

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