CN112946139B - 一种胡黄连的药物制剂的指纹图谱、及其建立方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，以胡黄连的药物制剂为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，共获得了21个特征峰，并通过液质联用确认了共有特征峰峰2为云杉苷、峰3为草夹竹桃苷、峰5为香草酸、峰8为香草乙酮、峰9为胡黄连苷Ⅳ、峰10为胡黄连苷Ⅲ、峰13为胡黄连苷Ⅱ、峰17(S)为胡黄连苷Ⅰ、峰18为6‑阿魏酰梓醇，选择13号峰胡黄连苷Ⅰ作为内参考峰，确定了胡黄连的药物制剂的共有特征峰的相对保留时间，且结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品特征图谱与对照特征图谱经Mark峰相似度计算，相似度不得低于0.90。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种胡黄连的药物制剂的指纹图谱、及其建立方法和应用。
背景技术
胡黄连的药物制剂是通过对中药胡黄连进行提取、浓缩、制粒所得。胡黄连为玄参科植物胡黄连Picrorhiza scrophulariiflora Pennell的干燥根茎，胡黄连中的化学成分主要包括环烯醚萜类、葫芦素类及酚苷类，还包括少许苯乙醇苷类、芳香酸和D-甘露醇等成分。为我国传统中药的清虚热要药，苦、寒；归肝、胃、大肠经。具有清湿、凉血、燥湿、消疳功效，适用于治疗骨蒸潮热，小儿疳热，湿热泻痢，黄疸尿赤，痔疮肿痛等症。现代药理学研究表明，胡黄连具有保肝利胆，抗菌消炎，抗哮喘，神经保护，免疫活性和降血糖等多种药理作用，具有广泛的药理活性。
《中国药典》2020年版对胡黄连的质量控制包括原植物品种、药材性状、理化鉴别、含量测定等项目，文献也对胡黄连中化学成分进行阐述，包括环烯醚萜类、葫芦素类及酚苷类，还包括少许苯乙醇苷类、芳香酸和D-甘露醇等成分。然而，一方面，通过上述单一成分的含量测定或鉴别胡黄连的药物制剂，不能从整体上检测和控制其质量；另一方面，通过单一成分的含量测定联合其他成分的鉴别胡黄连的药物制剂，费时、费力，难以广泛地应用于生产实践。
而现有技术中，对胡黄连的药物制剂质量控制都是针对胡黄连饮片，并非是针对胡黄连的药物制剂，现有技术中针对胡黄连饮片的检测方法并不能适用于胡黄连的药物制剂。
因此，建立一种能够全面地、快速地检测胡黄连的药物制剂的方法，对于其全面质量检测和整体质量控制具有重要意义。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的胡黄连的质量控制都是针对胡黄原料药缺陷，从而提供一种胡黄连的药物制剂的指纹图谱、及其建立方法和应用。
一种建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，该方法包括如下步骤：
1)取胡黄连的药物制剂制备为供试溶液；
2)取供试溶液进行高效液相色谱检测；得供试品溶液的液相色谱；
色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以体积百分比0.5％醋酸溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0～6min，A与B的体积比由8％：92％变为10％：90％；6～10min，A与B的体积比由10％：90％变为11％：89％；10～25min，A与B的体积比由11％：89％变为13％：87％；25-50min，A与B的体积比由13％：87％变为15％：85％；50～65min，A与B的体积比为15％：85％；65-72min，A与B的体积比由15％：85％变为18％：82％；72～92min，A与B的体积比由18％：82％变为23％：77％；92～102min，A与B的体积比为23％：77％；102～105min，A与B的体积比由23％：77％变为8％：92％；105～110min，A与B的体积比为8％：92％；上述百分比为体积百分比。
可选的，步骤2)中，以Intersustain C18为色谱柱，色谱柱的规格为：4.6mm×250mm、5μm；检测波长为275nm；柱温为35℃，流速为1ml/min；进样量为5μ-20μL。
可选的，供试溶液的制备方法包括如下步骤：采用溶剂对胡黄连的药物制剂进行提取、过滤，取滤液的步骤；
可选的，采用的溶剂为体积分数为95％～100％甲醇水溶液；更可选的，采用的溶剂为甲醇；
可选的，提取的方式为加热回流提取、振摇提取或超声提取；更可选的，提取的方式为超声提取；
可选的，超声功率200W-300W；更可选的，超声功率为250W；
可选的，超声时间为20-40分；
可选的，胡黄连的药物制剂与溶剂比为(0.05-0.15):(20-30)，比例关系为g/mL；更可选的，胡黄连的药物制剂与溶剂比为0.1:25，比例关系为g/mL；
可选的，上述方法还包括对照品溶液的制备、对照药材溶液的制备和将步骤2)中的供试溶液替换为对照品溶液或对照药材溶液进行实验的步骤：
精密称取胡黄连苷Ⅰ对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品A溶液，每1体积份对照品A溶液含0.0002-0.0004重量份的胡黄连苷Ⅰ；
精密称取胡黄连苷Ⅱ对照品，加95～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品B溶液，每1体积份对照品B溶液含0.0006-0.0008重量份的胡黄连苷Ⅱ；
精密称取胡黄连苷III对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品C溶液，每1体积份对照品C溶液含0.0002-0.0004重量份的胡黄连苷III；
精密称取胡黄连苷IV对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品D溶液，每1体积份对照品D溶液含0.0002-0.0004重量份的胡黄连苷IV；
精密称取草夹竹桃苷对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品E溶液，每1体积份对照品E溶液含0.0002-0.0004重量份的草夹竹桃苷；
精密称取6-阿魏酰梓醇对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品F溶液，每1体积份对照品F溶液含0.0002-0.0004重量份的6-阿魏酰梓醇；
精密称取香草酸对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品G溶液，每1体积份对照品G溶液含0.0002-0.0004重量份的香草酸；
精密称取香草乙酮对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品H溶液，每1体积份对照品H溶液含0.0002-0.0004重量份的香草乙酮；
精密称取云杉苷对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品I溶液，每1体积份对照品I溶液含0.0002-0.0004重量份的云杉苷；
精密称取米内苷对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品J溶液，每1体积份对照品J溶液含0.0002-0.0004重量份的米内苷。
对照药材溶液的制备包括如下步骤：采用溶剂对胡黄连对照药材进行提取、过滤，取滤液的步骤；
对照药材与取胡黄连对照药材粉末0.20-0.30重量份，加水50-60体积份，加热回流或超声提取40-50分钟，滤过，滤液蒸干；加入95％-100％甲醇溶液20-30体积份，超声处理25-30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；
所述重量份与所述体积份的关系为g/ml。
可选的，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
可选的，所述胡黄连的药物制剂的制备方法包括如下步骤：
取胡黄连，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少10min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.26～1.30，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂；所述辅料为药学上可接受的辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、PEG4000、虫蜡等。
可选的，所述胡黄连的药物制剂的制备方法包括如下步骤：
取胡黄连，加热回流提取1～5次，每次加入8～25重量倍量的水提取10min～1h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.26～1.30，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂；
更可选的，取胡黄连，加热回流提取2次，第1次加入9重量倍量的水提取1h，第2次加入7重量倍量的水提取0.5h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.26～1.30，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
可选的，所述胡黄连的药物制剂的指纹图谱中，共获得了21个特征峰，依次为峰1-21；并通过液质联用技术确认了共峰2为云杉苷、峰3为草夹竹桃苷、峰5为香草酸、峰8为香草乙酮、峰9为胡黄连苷Ⅳ、峰10为胡黄连苷Ⅲ、峰13为胡黄连苷Ⅱ、峰17为胡黄连苷Ⅰ、峰18为6-阿魏酰梓醇。
可选的，所述胡黄连的药物制剂的指纹图谱中，以17号峰胡黄连苷Ⅰ为内参考峰；峰1-峰21的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为依次为：0.09、0.13、0.17、0.21、0.23、0.33、0.39、0.42、0.49、0.55、0.58、0.60、0.64、0.69、0.79、0.82、1.00、1.06、1.09、1.25、1.27。上述的方法在胡黄连的药物制剂的质量检测和/或质量控制中的应用。
如下任一所述方法：
(I)一种胡黄连的药物制剂的有效成分及含量测定方法，包括使用待测胡黄连的药物制剂按照所述的方法建立待测胡黄连的药物制剂的指纹图谱的步骤；
(II)一种胡黄连的药物制剂的质量检测方法，包括使用待测胡黄连的药物制剂按照所述的方法建立待测胡黄连的药物制剂的指纹图谱的步骤。
可选的，胡黄连的药物制剂的有效成分选自胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ和胡黄连苷Ⅳ中的一种或几种；
本发明技术方案，具有如下优点：
(1)本发明所述建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，以胡黄连的药物制剂为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了共有特征峰峰2为云杉苷、峰3为草夹竹桃苷、峰5为香草酸、峰8为香草乙酮、峰9为胡黄连苷Ⅳ、峰10为胡黄连苷Ⅲ、峰13为胡黄连苷Ⅱ、峰17(S)为胡黄连苷Ⅰ、峰18为6-阿魏酰梓醇，选择17号峰胡黄连苷Ⅰ作为指纹图谱中的内参考峰，确定了胡黄连的药物制剂的共有特征峰的相对保留时间，且结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、快速地检测胡黄连的药物制剂的质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。
(2)本发明提供一种胡黄连的药物制剂的有效成分及含量测定方法，测定方法分离度好，可以同时测定胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷Ⅲ和胡黄连苷Ⅳ的含量，而且该检测方法的精密度较高、稳定性和重复性较好，因此，能够全面地、快速地检测胡黄连的药物制剂中有效成分及其含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1～3实施例5梯度1～3胡黄连的药物制剂色谱图；图1为实施例5梯度1胡黄连的药物制剂色谱图；图2为实施例5梯度2胡黄连的药物制剂色谱图；图3为实施例5梯度3胡黄连的药物制剂色谱图；
图4～10为实施例5不同流动相系统胡黄连的药物制剂色谱图；图4为实施例5中0.5％乙酸水溶液-乙腈流动相系统胡黄连的药物制剂色谱图；图2为实施例5水-乙腈流动相系统胡黄连的药物制剂色谱图；图6为实施例5中0.5％磷酸水-乙腈流动相系统胡黄连的药物制剂色谱图；图7为实施例5中0.5％甲酸水溶液-乙腈流动相系统胡黄连的药物制剂色谱图；图8为实施例5中0.5％乙酸水-乙腈流动相系统胡黄连的药物制剂色谱图；图9为实施例5中0.25％乙酸水-乙腈流动相系统胡黄连的药物制剂色谱图；图10为实施例5中0.1％乙酸水-乙腈流动相系统胡黄连的药物制剂色谱图；
图11～14为实施例5不同色谱柱的胡黄连的药物制剂色谱图；图11为Inertsustain C18胡黄连的药物制剂色谱图；图12为ZORBAX SB-C18胡黄连的药物制剂色谱图；图13为Waters XBridge○R C18胡黄连的药物制剂色谱图；图14为Kromasil C18胡黄连的药物制剂色谱图；
图15～17为实施例5不同流速胡黄连的药物制剂色谱图；图15为0.8ml/min胡黄连的药物制剂色谱图；图16为1.0ml/min胡黄连的药物制剂色谱图；图17为1.2ml/min胡黄连的药物制剂色谱图；
图18为实施例7的17批胡黄连的药物制剂色谱图；
图19为实施例7的胡黄连的药物制剂对照特征图谱；
图20为实施例8仪器精密度试验色谱图；S1：对照图谱；S2～S7：精密度试验样1～6；
图21为实施例8重复性色谱图；S1：对照图谱，S2～S7：重复性试验样1～6；
图22为实施例8专属性实验阴性对照色谱图；
图23为实施例8稳定性色谱。
具体实施方式
仪器包括：高效液相色谱仪；天平；超声波发生器；超纯水系统；
试药包括：乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
实施例1
以下实施例和实验例中，胡黄连的药物制剂的制备方法为：取胡黄连，加热回流提取2次，第1次加入9重量倍量的水提取1h，第2次加入7重量倍量的水提取0.5h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.26～1.30，加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。
实施例2
本实施例建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测胡黄连的药物制剂0.1g，精密称定，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，取甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取胡黄连苷Ⅰ对照品，加甲醇制成每1mL含0.0003g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取胡黄连苷Ⅱ对照品，加甲醇制成每1mL含0.0007g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
取胡黄连对照药材粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，加热回流45分钟，滤过，滤液蒸干；精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率250W，频率53kHz)，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mm×250mm、5μm的Intersustain C18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.5％(v/v)醋酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0～6min，A与B的体积比由8％：92％变为10％：90％；6～10min，A与B的体积比由10％：90％变为11％：89％；10～25min，A与B的体积比由11％：89％变为13％：87％；25-50min，A与B的体积比由13％：87％变为15％：85％；50～65min，A与B的体积比为15％：85％；65-72min，A与B的体积比由15％：85％变为18％：82％；72～92min，A与B的体积比由18％：82％变为23％：87％；92～102min，A与B的体积比为23％：77％；102～105min，A与B的体积比由23％：77％变为8％：92％；105～110min，A与B的体积比为8％：92％；检测波长为275nm；柱温为35℃，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液、对照药材参照物溶液0.015mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液、对照药材参照物溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液、对照药材参照物溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实施例3
本实施例建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测胡黄连的药物制剂0.15g，精密称定，精密加入甲醇30mL，称定重量，超声提取40分钟，放冷，再称定重量，取甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取胡黄连苷Ⅰ对照品，加甲醇制成每1mL含0.0004g的溶液，摇匀，作为对照品A溶液；
精密称取胡黄连苷Ⅱ对照品，加甲醇制成每1mL含0.0008g的溶液，摇匀，作为对照品B溶液；
精密称取胡黄连对照药材粉末0.30g，置具塞锥形瓶中，加水60mL，加热回流提取50分钟，放冷，再称定重量，滤过，滤液蒸干；精密加入甲醇30mL，密塞，称定重量，超声提取35分钟(功率250W，频率53kHz)，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mm×250mm、5μm的Intersustain C18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.5％(v/v)醋酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0～6min，A与B的体积比由8％：92％变为10％：90％；6～10min，A与B的体积比由10％：90％变为11％：89％；10～25min，A与B的体积比由11％：89％变为13％：87％；25-50min，A与B的体积比由13％：87％变为15％：85％；50～65min，A与B的体积比由15％：85％；65-72min，A与B的体积比由15％：85％变为18％：82％；72～92min，A与B的体积比由18％：82％变为23％：87％；92～102min，A与B的体积比为23％：77％；102～105min，A与B的体积比由23％：77％变为8％：92％；105～110min，A与B的体积比为8％：92％；检测波长为275nm；柱温为35℃，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液、对照药材参照物溶液0.015mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液、对照药材参照物溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实施例4
本实施例建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测胡黄连的药物制剂0.05g，精密称定，精密加入90％(v/v)甲醇水溶液20mL，称定重量，加热回流提取或超声提取20分钟，放冷，再称定重量，取90％(v/v)甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)精密称取胡黄连苷Ⅰ对照品，加90％(v/v)甲醇水溶液，摇匀，制成对照品A溶液，每1mL对照品A溶液含0.00002g胡黄连苷Ⅰ；
精密称取胡黄连苷Ⅱ对照品，加90％(v/v)甲醇水溶液，摇匀，制成对照品B溶液，每1mL对照品B溶液含0.00006g胡黄连苷Ⅱ；
精密称取胡黄连对照药材粉末0.20g，置具塞锥形瓶中，加水40mL，超声提取40分钟，放冷，再称定重量，滤过，滤液蒸干；精密加入95％甲醇水溶液20mL，密塞，称定重量，加热回流提取或超声提取25分钟(功率250W，频率53kHz)，取出，放冷，再称定重量，用95％甲醇水补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。
(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以4.6mm×250mm、5μm的Intersustain C18为色谱柱，以乙腈为流动相A、以0.5％(v/v)醋酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0～6min，A与B的体积比由8％：92％变为10％：90％；6～10min，A与B的体积比由10％：90％变为11％：89％；10～25min，A与B的体积比由11％：89％变为13％：87％；25-50min，A与B的体积比由13％：87％变为15％：85％；50～65min，A与B的体积比为15％：85％；65-72min，A与B的体积比由15％：85％变为18％：82％；72～92min，A与B的体积比由18％：82％变为23％：87％；92～102min，A与B的体积比为23％：77％；102～105min，A与B的体积比由23％：77％变为8％：92％；105～110min，A与B的体积比为8％：92％；检测波长为275nm；柱温为35℃，流速为1mL/min；
(4)分别精密吸取供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液、对照药材参照物溶液0.005mL，注入高效液相色谱仪，测定，分别得供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液、对照药材参照物溶液的液相色谱；
(5)利用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统，对供试品溶液、对照品A溶液、对照品B溶液、对照药材参照物溶液的液相色谱分别经过数据导入，多点校正和数据匹配，即得指纹图谱。
实施例5色谱分析条件的确定
(1)检测波长的选择
除检测波长不同外，其他条件与实施例2相同，以检测波长作为变量，分析不同吸收波长230nm、260nm、264nm、266nm、275nm、290nm、295nm和350nm下的色谱图，以色谱峰数量和峰高作为指标，确定275nm作为检测波长。
(2)梯度的选择
除梯度洗脱程序外，其他条件与实施例2相同，以梯度洗脱程序作为变量，不同的梯度洗脱程序如表1～3所示，不同梯度洗脱程序的色谱图如图1～3所示。由图1～3可知，梯度3洗脱呈现的图谱，色谱信息较丰富，主要色谱峰分离度高，基线较平稳且分析时间较为合理，故确定了流动相梯度为梯度3做后续的条件筛选，以期达到更好地分离效果。
表1流动相梯度1
表2流动相梯度2
表3流动相梯度3
(3)流动相成分的选择
除流动相外，其他条件与实施例2相同，以流动相作为变量，选择流动相分别为0.5％(v/v)乙酸溶液-乙腈、水-乙腈、0.5％(v/v)磷酸溶液-乙腈、0.5％(v/v)甲酸溶液-乙腈、0.5％乙酸溶液-乙腈、0.25％乙酸溶液-乙腈、0.1％乙酸溶液-乙腈的胡黄连的药物制剂分离效果，各流动相的色谱图如图4～10所示。由图4～10可知，与其他流动相比，0.5％(v/v)乙酸溶液-乙腈更适合于胡黄连的药物制剂所有成分的分离。
(4)不同色谱柱的考察
除色谱柱外，其他条件与实施例2相同，以色谱柱作为变量。取同一份胡黄连的药物制剂样品的供试品溶液，考察了实验室中现有的色谱柱：(1)Inertsustain C18柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm；(2)ZORBAX SB-C18柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm；(3)Waters
C18柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm LN:0294353071；(4)Kromasil C18柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm。按1.0mL/min的流速进行梯度洗脱分析，不同色谱柱的色谱图如图11～14所示。由图11～14可知，Inertsustain C18对胡黄连的药物制剂的分离效果较好。
(5)不同流速的考察
除流速外，其他条件与实施例2相同，以流速作为变量，分别以0.8mL/min、1.0mL/min，1.2mL/min流速测定，不同流速的色谱图如图15～17所示。由图15～17可知，流速为1.0mL/min流速的色谱效果较好。
(6)不同柱温的选择
除柱温外，其他条件与实施例2相同，以柱温作为变量，取同一份胡黄连的药物制剂样品的供试品溶液，考察不同柱温25℃、30℃、32℃、35℃、40℃对本品的分离效果，系统适应性参数如表4所示。由表4可知，柱温为35℃，其各成分分离效果较好，故选择柱温为35℃。
表4不同柱温考察结果
(7)不同进样量的选择
除进样量外，其他条件与实施例2相同，以进样量作为变量，进样量为5μL、10μL、15μL、20μL，系统适应性参数如表5所示。由表5可知，进样量为15μL的色谱图的效果较好。
表5不同进样体积的考察
(8)最终色谱条件
色谱柱：Inertsustain C18色谱柱(250mm，4.6mm，5μm)；以乙腈-0.5％(v/v)醋酸溶液为流动相，梯度洗脱如表6所示；流速：1.0mL/min；柱温为35℃；检测波长为275nm；理论板数按胡黄连苷Ⅰ峰计算应不低于5000，进样量：15μL。
表6梯度洗脱程序
实施例6供试品溶液的制备
(1)提取溶剂的选择
提取溶剂为水、乙醇、甲醇、10％(v/v)甲醇、30％(v/v)甲醇溶液、50％(v/v)甲醇溶液、70％(v/v)甲醇溶液，主要特征峰的系统适应性参数如表7-8所示。由表7-8可知，提取溶剂为甲醇时，所得色谱图的峰型较好，系统适应性参数相对较优。
表7提取溶剂的考察
表8不同浓度甲醇溶液考察
(2)不同提取方式的考察
除提取方式外，其他条件与实施例2相同，以提取方式作为变量，考察振摇和超声两种提取方式对胡黄连的药物制剂提取效果，结果表明，两种处理方式下胡黄连的药物制剂提取效果变化不大，考虑实验操作的简易性，故本实验选择超声处理。系统适应性参数如表9所示。
表9不同提取方式的考察
(3)不同超声功率的考察
除超声功率外，其他条件与实施例2相同，以超声功率作为变量，考察不同超声功率200W、250W、300W对胡黄连的药物制剂的提取效果，结果表明，功率为250W时，胡黄连的药物制剂色谱峰的峰形和系统适应性参数相对较优，故本实验选择功率250W进行后续考察。结果见表10。
表10不同超声功率的考察
(4)不同提取溶剂量
除提取溶剂量外，其他条件与实施例2相同，以提取溶剂量作为变量，考察不同提取溶剂量10ml、25ml、50ml对胡黄连的药物制剂的提取效果，结果表明，提取溶剂量为25ml时，胡黄连的药物制剂色谱峰的峰形和系统适应性参数相对较优，故本实验选择25ml进行后续考察。结果见表11。
表11不同提取溶剂量的考察
(5)最终提取方案
供试品溶液的制备方法为：取本品粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例7胡黄连的药物制剂特征指纹图谱的建立
参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南(试行)》，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”软件，通过对所得指纹图谱的进行相似度比较(以平均数建立参照特征指纹图谱)，并进行方法学考察。
根据实施例5和6，确定胡黄连的药物制剂HPLC特征指纹图谱按如下方法建立：
(1)供试品溶液的制备：取胡黄连的药物制剂粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率35kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
参照物溶液的制备：取胡黄连苷Ⅰ、胡黄连苷Ⅱ、胡黄连苷III、胡黄连苷IV、草夹竹桃苷、6-阿魏酰梓醇、香草酸、香草乙酮、云杉苷、米内苷对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL分别含胡黄连苷Ⅰ0.30mg、胡黄连苷Ⅱ0.75mg、胡黄连苷III 0.20mg、胡黄连苷IV0.25mg、草夹竹桃苷0.30mg、6-阿魏酰梓醇0.15mg、香草酸0.40mg、香草乙酮0.30mg、云杉苷0.20mg、米内苷0.20mg的对照品溶液，即得。
另取胡黄连对照药材粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水50mL，加热回流45分钟，滤过，滤液蒸干；精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率250W，频率53kHz)，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。
(2)高效液相HPLC色谱分析条件：色谱柱：Intersustain C18色谱柱(250mm，4.6mm，5μm)；以乙腈-0.5％(v/v)醋酸溶液为流动相，梯度洗脱如表3所示；流速：1.0mL/min；柱温为35℃；检测波长为275nm；理论板数按胡黄连苷Ⅰ峰计算应不低于5000，进样量：10μL。
(3)HPLC-PDA-MSN联用系统：高效液相系统为Agilent 1290，包括在线脱气机、四元泵、自动进样器和PDA检测器；MS和MSn实验使用6540B MS Q ToF质谱仪，包括ESI离子源和离子阱系统。LC-MS条件流动相为乙腈(A)-0.5％(v/v)甲酸溶液(B)，梯度洗脱如表3所示；柱后分流，分流比为1∶50；进样量10μL；柱温30℃；ESI源；源电压-3.2kV；雾化室压力(psig)35kPa，干燥气温度350℃，干燥气流速11L/min，质谱扫描质量范围m/z 100～800。
按上述方法进行胡黄连的药物制剂特征指纹图谱的共有模式的建立。
取17个批次的胡黄连的药物制剂(序号1-17，由华润三九医药股份有限公司提供，按照实施例1的制备方法制备而成)样品作为供试品溶液，通过高效液相色谱得到胡黄连的药物制剂特征指纹图谱，图18为17批胡黄连的药物制剂的特征指纹图谱(S1～S17，R为对照特征图谱)，图19为胡黄连的药物制剂对照特征指纹图谱。
采用药典委员会编制的指纹图谱相似度评价软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”，生成对照特征指纹图谱，对配方颗粒特征图的检测结果进行分析、比较。由图18～19可知，胡黄连的药物制剂HPLC特征指纹图谱共有色谱峰21个，其中9个峰(峰2、3、5、8、9、10、13、17、18)为已知成分峰；选取17号峰胡黄连苷Ⅰ为内参考峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.09(峰1)、0.13(云杉苷)、0.17(草夹竹桃苷)、0.21(峰4)、0.23(香草酸)、0.33(峰6)、0.39(峰7)、0.42(香草乙酮)、0.49(胡黄连苷IV)、0.55(胡黄连苷III)、0.58(峰11)、0.60(峰12)、0.64(胡黄连苷Ⅱ)、0.69(峰14)、0.79(峰15)、0.82(峰16)、1.00(S峰，胡黄连苷Ⅰ)、1.06(6-阿魏酰梓醇)、1.09(峰19)、1.25(峰20)、1.27(峰21)。所得结果如表12～14所示。
表12胡黄连的药物制剂对照特征图谱相对保留时间
表13 17批胡黄连的药物制剂特征图谱(13-1为峰1-峰10，13-2为峰11-峰21)测定相对保留时间结果
表13-1
表13-2
表14 17批胡黄连的药物制剂特征图谱相似度结果
实施例8胡黄连的药物制剂特征图谱的方法学验证
8.1精密度
8.1.1精密度实验
取同一份供试品溶液，按实施例7色谱条件，重复进样6次，测定21个共有峰的相对保留时间，结果如表15～16所示，精密度实验的色谱图如图20所示。由表15～16和图20可知，各特征峰与参照物S峰(17号峰)的相对保留时间的RSD均小于2％，与胡黄连的药物制剂对照特征图谱的相似度分别大于1.0，这表明精密度较好。
表15仪器精密度相对保留时间试验结果
表15-1
表15-2
表16仪器精密度相似度试验结果
注：R为对照图谱。
8.1.2重复性实验
取同一批号供试品6份，按实施例7的方法分别测定21个共有峰的相对保留时间，结果如表17～18所示，重复性实验的色谱图如图21所示。由表17～18和图21可知，结果各特征峰与内参考峰(17号峰)的相对保留时间的RSD均小于2％，与胡黄连的药物制剂对照特征图谱的相似度分别大于1.0，表明本方法重复性较好。
表17重复性实验结果(n＝6)表17-1峰1-峰10的重复性实验结果
表17-2峰11-峰21的重复性实验结果
表18重复性实验的相似度结果(n＝6)
4.2专属性实验
供试品采用提取溶剂为甲醇，精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液(甲醇+麦芽糊精)各10μL，分别注入高效液相色谱仪，按实施例7的方法，结果如图22所示。由图22可知，空白溶剂在相应保留时间处无色谱峰，无干扰，符合要求。
4.3稳定性实验
取同一批号供试品，按实验例3方法操作，分别在0、2、4、8、10、12、24小时进样，测定21个共有峰的相对保留时间，结果如表19～20所示，稳定性实验的色谱图如图23(S1为对照特征图谱，S2-S8为0-24进样)所示。由表19～20和图23所示，各特征峰与参照物S峰(17号峰)的相对保留时间的RSD分别小于2％，与胡黄连的药物制剂对照特征图谱的相似度分别大于1.0；这表明供试品溶液在24小时内稳定，符合测定要求。
表19稳定性相对保留时间试验结果(表19-1为峰1-峰10，表19-2为峰11-峰21)
表19-1
表19-2
表20稳定性相似度试验结果
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (27)
1.一种建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，
该方法包括如下步骤：
1)取胡黄连的药物制剂制备为供试溶液；供试溶液的制备方法包括如下步骤：采用溶剂对胡黄连的药物制剂进行提取、过滤，取滤液的步骤；采用的溶剂为体积分数为95％～100％甲醇水溶液；所述胡黄连的药物制剂通过采用胡黄连进行提取、浓缩、制粒所得；
2)取供试溶液进行高效液相色谱检测；得供试品溶液的液相色谱；
色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以体积百分比0.5％醋酸溶液为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0～6min，A与B的体积比由8％：92％变为10％：90％；6～10min，A与B的体积比由10％：90％变为11％：89％；10～25min，A与B的体积比由11％：89％变为13％：87％；25-50min，A与B的体积比由13％：87％变为15％：85％；50～65min，A与B的体积比为15％：85％；65-72min，A与B的体积比由15％：85％变为18％：82％；72～92min，A与B的体积比由18％：82％变为23％：77％；92～102min，A与B的体积比为23％：77％；102～105min，A与B的体积比由23％：77％变为8％：92％；105～110min，A与B的体积比为8％：92％；上述百分比为体积百分比；
还包括对照品溶液的制备、对照药材溶液的制备和将步骤2)中的供试溶液替换为对照品溶液或对照药材溶液进行实验的步骤；
对照品溶液为；
精密称取胡黄连苷Ⅰ对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品A溶液，每1体积份对照品A溶液含0.0002-0.0004重量份的胡黄连苷Ⅰ；
精密称取胡黄连苷Ⅱ对照品，加95～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品B溶液，每1体积份对照品B溶液含0.0006-0.0008重量份的胡黄连苷Ⅱ；
精密称取胡黄连苷III对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品C溶液，每1体积份对照品C溶液含0.0002-0.0004重量份的胡黄连苷III；
精密称取胡黄连苷IV对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品D溶液，每1体积份对照品D溶液含0.0002-0.0004重量份的胡黄连苷IV；
精密称取草夹竹桃苷对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品E溶液，每1体积份对照品E溶液含0.0002-0.0004重量份的草夹竹桃苷；
精密称取6-阿魏酰梓醇对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品F溶液，每1体积份对照品F溶液含0.0002-0.0004重量份的6-阿魏酰梓醇；
精密称取香草酸对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品G溶液，每1体积份对照品G溶液含0.0002-0.0004重量份的香草酸；
精密称取香草乙酮对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品H溶液，每1体积份对照品H溶液含0.0002-0.0004重量份的香草乙酮；
精密称取云杉苷对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品I溶液，每1体积份对照品I溶液含0.0002-0.0004重量份的云杉苷；
精密称取米内苷对照品，加95％～100％甲醇水溶液，摇匀，制成对照品J溶液，每1体积份对照品J溶液含0.0002-0.0004重量份的米内苷；
对照药材溶液的制备包括如下步骤：采用溶剂对胡黄连对照药材进行提取、过滤，取滤液的步骤；
所述重量份与所述体积份的关系为g/ml。
2.根据权利要求1所述建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，步骤2)中，以Intersustain C18为色谱柱，色谱柱的规格为：4.6mm×250mm、5μm；检测波长为275nm。
3.根据权利要求1或2所述建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，供试溶液的制备方法中，采用的溶剂为甲醇。
4.根据权利要求1或2所述建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，提取的方式为加热回流提取、振摇提取或超声提取。
5.根据权利要求1或2所述建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，提取的方式为超声提取。
6.根据权利要求5所述建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，超声功率200W-300W。
7.根据权利要求5所述建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，超声功率为250W。
8.根据权利要求5所述建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，超声时间为20-40分。
9.根据权利要求5所述建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，超声时间为30分。
10.根据权利要求1或2所述建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，胡黄连的药物制剂与溶剂比为0.1:(20-30)，比例关系为g/mL。
11.根据权利要求1或2所述建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，胡黄连的药物制剂与溶剂比为0.1:25，比例关系为g/mL。
12.根据权利要求1或2所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液体制剂或注射制剂。
13.根据权利要求12所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述药物制剂包括蜜炼丸剂。
14.根据权利要求12所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述药物制剂包括缓释制剂、速释制剂或控释制剂。
15.根据权利要求1或2所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述胡黄连的药物制剂的制备方法包括如下步骤：
取胡黄连，加热回流提取至少1次，每次加入至少2重量倍量的水提取至少10min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.26～1.30，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液体制剂或注射制剂。
16.根据权利要求15所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，制备成临床上可接受的蜜炼丸剂。
17.根据权利要求15所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，制备成临床上可接受的缓释制剂、速释制剂或控释制剂。
18.根据权利要求1或2所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述胡黄连的药物制剂的制备方法包括如下步骤：
取胡黄连，加热回流提取1～5次，每次加入8～25重量倍量的水提取10min～1h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.26～1.30，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液体制剂或注射制剂。
19.根据权利要求18所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，制成临床上可接受的蜜炼丸剂。
20.根据权利要求18所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，制成临床上可接受的缓释制剂、速释制剂或控释制剂。
21.根据权利要求1或2所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，取胡黄连，加热回流提取2次，第1次加入9重量倍量的水提取1h，第2次加入7重量倍量的水提取0.5h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.26～1.30，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液体制剂或注射制剂。
22.根据权利要求21所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，制成临床上可接受的蜜炼丸剂。
23.根据权利要求21所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，制成临床上可接受的缓释制剂、速释制剂或控释制剂。
24.根据权利要求1-2任一项所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述胡黄连的药物制剂的指纹图谱中，共获得了21个特征峰，依次为峰1-21；峰2为云杉苷、峰3为草夹竹桃苷、峰5为香草酸、峰8为香草乙酮、峰9为胡黄连苷Ⅳ、峰10为胡黄连苷Ⅲ、峰13为胡黄连苷Ⅱ、峰17为胡黄连苷Ⅰ、峰18为6-阿魏酰梓醇。
25.根据权利要求24所述的建立胡黄连的药物制剂的指纹图谱的方法，其特征在于，所述胡黄连的药物制剂的指纹图谱中，以17号峰胡黄连苷Ⅰ为内参考峰；峰1-峰21的相对保留时间在规定值的±10％范围之内，规定值为依次为：0.09、0.13、0.17、0.21、0.23、0.33、0.39、0.42、0.49、0.55、0.58、0.60、0.64、0.69、0.79、0.82、1.00、1.06、1.09、1.25、1.27。
26.权利要求1-25任一项所述的方法在胡黄连的药物制剂的质量检测和/或质量控制中的应用。
27.一种胡黄连的药物制剂的有效成分的含量测定方法，包括使用待测胡黄连的药物制剂按照权利要求1-25任一所述的方法建立待测胡黄连的药物制剂的指纹图谱的步骤。
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