CN1128811C - 一种直接从粗蛇毒中富集神经生长因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从粗蛇毒中富集神经生长因子的方法，依据神经生长因子等电点，选择合适酸碱度的溶样液，使其在溶液中以阴或阳离子蛋白质的形式存在，然后选择介质，用扩张柱床吸附的方法先从下向上上样使它们结合，再以从下向上的方式进行漂洗，静置，再从上向下用一定的淋洗液淋洗，收集样品即为含NGF的粗品，可以在一小时内直接从粗蛇毒原液中富集95%以上的神经生长因子，所用时间为传统方法的1/100，可线性地从中试放大到规模生产。
Description
本发明涉及一种用扩张柱床吸附技术直接从未经任何处理的粗蛇毒中富集神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)的方法。
NGF是一个能够促进神经细胞生长的生长因子，是交感神经元和某些感觉神经元生长发育所必需的一种蛋白质，它能够维持交感神经和感觉神经细胞生存、促进周围神经细胞的生长和分化、决定轴突的生长方向，对保证大脑的正常发育，维持大脑的正常机能及对内分泌和免疫系统都发挥着重要作用。在临床上，它能有效地治疗神经损伤类疾病，如脑损伤、Alzheimer型老年性痴呆、原发性癫痫、神经衰弱和血管神经性头痛、脑膜炎后遗症、农药中毒性脑病后遗症、帕金森氏综合症、格林巴利综合症、脑萎缩、神经性耳聋、肌肉侧索硬化症等，具有广泛的市场前景。如能将其开发成国家一类新药，不仅会挽救无数人的生命和解除他们的痛苦，带来巨大的社会效益，而且它的研究开发和产业化，也会带来巨大的经济效益。
神经生长因子主要存在于胎脑、小鼠颌下腺和一些蛇毒中，用基因工程的方法重组的NGF无论是在E.coli或啤酒酵母中表达，不但其表达量非常低(以融合蛋白形式表达，目前可达5-7mg蛋白/升发酵液)，而且其NGF生物活性也很低，只有生物提取的200-1000分之一，使其失去了作为一种药物应用开发的价值；从胎脑中提取人NGF，尽管工艺上可行，并且一些医院也实际上在临床使用，但这种方法不仅存在原材料来源问题，而且更重要的是，它是以堕胎胎脑为原料，受世界人权公约和有关国际组织压力，这种方法实际上不可能作为一种药物开发方法而得到国家药品监督管理局(SDA)的批准；目前从小鼠颌下腺提取的NGF在美国已上II期临床，而在国内也已经上I期临床，但从小鼠颌下腺中提取NGF同样也存在原材料来源问题，这种方法不仅要饲养大量的小鼠，花费大量的人力、物力和空间，而且需要专门人员从小鼠中剥离和提取颌下腺，若购买半成品颌下腺，则成本要比从蛇毒中提取高近3倍；而蛇毒在中国存在着广泛的资源，其中广东、浙江、云南、广西、海南等省和自治区具有蛇毒采集和加工的传统，在这些地方，目前，蛇毒大量的以粉状原料出口到国外，而这些原材料的出口，其价格是非常低的，若能对其进行深加工，采用现代生物技术提取其有用成分，并且对蛇毒进行综合利用和综合加工，不仅会造福于人类，而且也会带来高额的附加值。如从蛇毒中提取的神经生长因子，其产值将会是每克蛇毒原材料价值的600多倍，再者，从蛇毒中提取的NGF的生物活性几乎要比从小鼠颌下腺中提取的NGF活性高出一倍，这也更有利于降低生产成本。
目前，尽管在文献上还有其它一些从蛇毒中提取NGF的方法报导，但是，从分离介质的化学稳定性和商品可获得性，以及从纯化工艺的可靠性和稳定性方面考虑，真正具有实际用途的从蛇毒中提取NGF的方法则是比较经典的、且目前在文献上大量使用的凝胶过滤+离子交换+凝胶过滤模式[文献1：Hogue-Angeleui，R.A.，et al.，Biochemistry，15(1976)，26；文献2：刘一平等，中华生化药物杂志，1994：15(1)]，但这种方法存在以下两个致命弱点：
(1)在第一步的凝胶排阻过程中一般至少需要100多个小时，不但操作时间太长，而且蛋白与介质的长时间接触，使得所需的目标蛋白的活性有可能降低。
(2)在第一步采用凝胶排组方法，由于凝胶介质吸附容量较小，使得样品处理量很小，因此，只能用于实验室少量样品的制备，很难放大到中试和规模生产上。
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提出一种用扩张柱床吸附技术从蛇毒中富集NGF的方法，可以一步直接从未经任何处理的粗蛇毒中富集几乎95％以上的NGF。
图1是实现本发明所需的装置。
图2是本发明的操作顺序图。
如图1所示，该装置包括两个并联的输液泵1，输液泵1的出口和混合器2的一端相连通，混合器的另一端与层析柱3相连通，层析柱3后配置一台紫外检测仪4和一台记录仪5。
依据NGF的等电点pI在约7.0左右，可以选择在它的等电点附近酸碱度的溶样液，使NGF在溶样液中以阳离子或阴离子蛋白质的形式存在，然后选择一种可以与这种带电蛋白质特异结合的离子交换介质，用扩张柱床吸附的方法先从反方向上样使它们结合，再以反方向的方式进行漂洗，静置，再从正方向用一定的淋洗液淋洗，收集样品即为含NGF的粗品。
具体实施方法如下：
1、溶样液的选择
所选择的溶样液既要使样品中的NGF能完全溶解，又不破坏NGF的活性。如pH在4.0-7.0或7.0-10.0的缓冲溶液(如20-50mmol/L的HAC-NaAc缓冲液或Na2HPO4～Na H2PO4缓冲液，亦可将Na盐换成K盐)。
2、漂洗液的选择
所选择的漂洗液一方面要不使NGF活性受到损害，并且要维持它的活性，另一方面也要使溶液本身的酸碱度合适，使NGF以带电离子的形式存在，此外，溶液中的盐浓度也要合适，以使其他杂蛋白洗脱出去，而NGF吸附到介质上。如pH在4.0-7.0或7.0-10.0的低浓度盐溶液(如0.05-0.3mol/L的含Nacl溶液，缓冲液可用HAC-NaAc和Na2HPO4～NaH2PO4体系)。
3、介质的选择
所选择的介质一方面不能与NGF产生不可逆吸附，另一方面也必须与带电NGF特异结合，以使NGF得到富集，更重要的是，所选择的介质必须密度分布均匀，以使NGF在扩张床内按密度均匀分布。如以琼脂糖为基质的；用化学方法键合上磺酸基或二乙胺二乙酸基等集团的介质(如Pharmacia公司的STREA-MLINE SP或STREAMLINE DEAE介质)。
4、淋洗液的选择
与漂洗液一样，所选择的淋洗液一方面要不使NGF活性受到损害，并且要维持它的活性，另一方面也要使溶液本身的酸碱度合适，使NGF以带电离子的形式存在，此外，溶液中的盐浓度也要合适，以使NGF能从柱上洗脱下来，而又不损害介质。如pH在4.0-7.0或7.0-10.0的高浓度盐溶液(如0.5-2.0mol/L的Nacl溶液，缓冲液可用HAC-NaAc和NaH2PO4～Na2HPO4)。
5、操作方法
操作可在图1所示的装置内进行，按图2所示顺序操作。图2-A是静态柱，图2-B中用溶样液反向扩张柱床，待UV记录仪基线平稳后，再以图2-C的方式反向上样，上样完成后，再以图2-D方式反向用漂洗液漂洗，直至UV记录基线达到溶样液基线附近平稳。此时掉转方向，以图2-E的方式，从上到下用洗脱液冲洗，同时收集UV记录的峰处样品，即为含NGF的样品，在图2-F中，再用溶样液从上到下平衡柱，以备下次再用。
操作实例1：
取30.0～50.0克粗粉状蛇毒，溶于120ml，PH＝5.0的10mmHAC-NaAc缓冲液中，用Pharmacia公司的STREA-MLINE SP介质100ml在1.6×50cm的分离柱中进行富集，上样流速为240cm/h(8ml/h)，洗脱流速为120cm/h(4ml/h)，在280nm检测，按图2-7的方式直接上扩张柱床进行富集。其中所用的漂洗液为0.3MNacl(含10mmHAC-NaAc，PH＝5.0)，洗脱液为0.3MNacl(含10mmHAC-NaAc，PH＝5.0)。
用此方法所得的NGF经SDS-PAGE电泳测定，其NGF的纯度约为52％，用NGF刺激鸡胚背根神经节的生长法测活性，发现在20ug/ml时仍具生物活性。
操作实例2：
取30.0～50克粗粉状蛇毒，溶于120ml～150ml，PH＝8.5的10mM的NaH2PO4～Na2HPO4缓冲液中，用Pharmacia公司的STREAMLINE DEAE介质120ml在1.6×50cm的分离柱中进行富集，上样流速为240cm/h(8ml/h)，洗脱流速为120cm/h(4ml/h)，在280nm检测，按图2的方式直接上扩张柱床进行富集。其中所用的漂洗液为0.35MNacl(含10mmPBS，PH＝8.5)，洗脱液为0.75MNacl(含10mmPBS，PH＝8.5)。
用此方法所得的NGF经SDS-PAGE电泳测定，其NGF的纯度约为25％，用NGF刺激鸡胚背根神经节的生长法测活性，发现在20ug/ml时仍具生物活性。
由此可见，本发明工艺具有以下特色和创新之处是：(1)工艺简单：用扩张柱床吸附技术提取NGF，不需对样品进行前处理，一步可直接从未经任何处理的粗蛇毒原液中提取NGF；(2)效率高：用扩张柱床吸附技术从蛇毒提取NGF，将使提取时间大为缩短，所需时间仅为原来的1/100；(3)提高了NGF质量回收率：利用传统的提取方法，目标产品的损失率较大，一般仅有70％左右的NGF得到回收，而用扩张柱床吸附技术，其第一步回收率至少可达90％以上；(4)提高了NGF的生物活性：由于使用扩张柱床吸附技术，使NGF与介质的接触时间大为缩短，这样使其活性损失较小；用这种方法提取的NGF的最适活性为10ng/ml，比用传统方法提取的NGF活性(20ng/ml)要低；(5)能几乎在线放大到工业化生产：目前所有的有关纯化NGF的工艺一般只能在实验室规模上进行，处理量较小，不能进行产业化。我们使用的扩张床吸附技术可以方便的几乎线性的放大到生产规模，可以提供满足工业化生产和药检纯度及活性的稳定生产工艺。
使用本发明方法从蛇毒中提取NGF，将大大简化目标蛋白质的纯化处理工艺，提高其质量和活性回收率及纯化效率，降低生产成本。这项技术的开发和应用，将对蛇毒的综合利用和其产业化起到巨大的推动作用，并会产生良好的社会效益和经济效益。
Claims (8)
1、一种直接从粗蛇毒中富集神经生长因子的方法，其特征在于，选择在NGF的等电点附近酸碱度的溶样液，使NGF在溶样液中以阳离子或阴离子蛋白质的形式存在，然后选择一种可以与这种带电蛋白质特异结合的介质，用扩张柱床吸附的方法先从反方向上样使它们结合，再以反方向的方式进行漂洗，静置，再从正方向用一定的淋洗液淋洗，收集样品即为含NGF的粗品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，首先用溶样液反向扩张柱床，待平衡后，反向上样，上样完成后，以反向用漂洗液漂洗，等洗到基线时，掉转方向，从上到下用洗脱液冲洗，同时收集样品，即为含NGF的样品。
3、根据权利要求1、2所述的方法，其特征在于，所说的溶样液为PH在4.0-7.0或7.0-10.0的缓冲溶液。
4、根据权利要求1、2所述的方法，其特征在于，所说的漂洗液为PH在4.0-7.0或7.0-10.0的低浓度盐溶液。
5、根据权利要求1、2所述的方法，其特征在于，所说的介质为琼脂糖或纤维素为基质的用化学方法键合上羧甲基、磺酸基、磷酸基、季胺基、或二乙胺二乙酸基集团。
6、根据权利要求1、2所述的方法，其特征在于，所说的淋洗液为PH在4.0-7.0或7.0-10.0高浓度盐溶液。
7、根据权利要求1、2所述的方法，其特征在于，取30.0～50克粗粉状蛇毒，溶于120ml～150ml 10mM的含醋酸-醋酸盐的pH＝5.0的缓冲液中，用含磺酸基的介质100ml在1.6×50cm的分离柱中进行富集，上样流速为240cm/h(8ml/h)，洗脱流速为120cm/h(4ml/h)，在280nm检测，直接上扩张柱床进行富集。
8、根据权利要求1、2所述的方法，其特征在于，取30.0～50克粗粉状蛇毒，溶于120ml～150ml 10mM的含磷酸盐的pH＝8.5的缓冲液中，用含二乙胺二乙酸基的介质120ml在1.6×50cm的分离柱中进行富集，上样流速为240cm/h(8ml/h)，洗脱流速为120cm/h(4ml/h)，在280nm检测，直接上扩张柱床进行富集。
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| WO2007068168A1 (fr) * | 2005-12-12 | 2007-06-21 | Beijing Sannuo Jiayi Biological Technology Co., Ltd. | Procede pour la determination de contenu de facteur de croissance neuronal |
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1999
- 1999-11-09 CN CN 99115899 patent/CN1128811C/zh not_active Expired - Fee Related
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