CN112843150B - 含枸杞提取物的组合物及其制备方法和应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天然产物治疗领域，具体涉及枸杞提取物组合物及制备方法和应用方法，该组合物包含枸杞提取物，所述枸杞提取物包含多糖、枸杞黄酮、类胡萝卜素、多酚和枸杞色素。所述组合物能增加骨骼肌的重量，增加骨骼肌氧化型肌纤维的比例或含量，增加骨骼肌的有氧代谢水平，减少糖酵解水平，增加肌红蛋白含量，提高有氧耐力，抵抗运动疲劳。

Description

含枸杞提取物的组合物及其制备方法和应用方法
优先权和交叉引用
本申请要求于2020年1月8日递交的美国临时申请62/958,503的优先权，该申请的全部内容明确地通过引用合并于此。
技术领域
本发明涉及天然产物治疗领域，具体涉及含枸杞提取物的组合物及制备方法和应用方法。
背景技术
骨骼肌是哺乳动物体内最丰富的组织，约占体重的40-50％。除了支撑和运动的主要功能外，骨骼肌也是维持正常的机体能量平衡的极为重要的新陈代谢器官。
骨骼肌由肌球蛋白重链(MyHC)亚型和代谢活动定义的不同肌纤维亚型组成。不同的肌纤维亚型差异性影响肌肉的代谢和功能。在哺乳动物中，骨骼肌纤维分为I型(慢速氧化型肌纤维)，IIa型(快速氧化型肌纤维)，IIx/d型(中间肌纤维)和IIb型(快速糖酵解肌纤维)。I型和IIa型富含线粒体和肌红蛋白，具有较高的有氧代谢能力和运动耐力。相反，IIb型具有较低的耐力和较少的线粒体，并且主要通过糖酵解产生ATP。肌纤维的类型和组成直接影响骨骼肌的健康和人体的能量代谢。许多疾病，例如肌肉萎缩、糖尿病、肥胖症、肝脏代谢紊乱和衰老，与肌纤维类型和能量代谢密切相关。
运动能有效地改善肌肉耐力和功能。它可以显著增加慢速氧化纤维的比例，并增强线粒体的生物合成。尽管尚不清楚运动如何促进肌肉健康，但许多研究发现该过程涉及一些信号分子。运动能够增加AMP和NAD+的水平以激活代谢传感器AMPK(AMP激活的蛋白激酶)和SIRT1(Sirtuin 1)，然后通过翻译后修饰激活PGC1。PGC1a/β作为核受体PPARδ(过氧化物酶体增殖物激活的受体δ)和ERRα/γ(与雌激素有关的受体a/γ)的转录共激活物发挥作用，它们已被确定有助于运动诱导的肌纤维类型转换和耐力。
考虑到运动对骨骼肌健康的有益作用，一些针对肌肉的“锻炼模拟”药物已开始开发。这些化合物通过激活参与骨骼肌代谢重塑的一些关键调节因子来模拟锻炼，例如AMPK激活剂、Sirt1激活剂或PPAR配体。尽管合成的锻炼模拟物具有提高肌肉健康和耐力的潜力，但必须考虑药物的安全性和健康性。
发明内容
本发明提供了一种枸杞提取物，包含这种枸杞提取物的组合物，其制备方法和应用方法。
本发明证明了包含枸杞提取物的组合物，增加骨骼肌的重量，增加骨骼肌氧化型肌纤维的比例或含量，增加骨骼肌的有氧代谢水平，减少糖酵解水平，增加肌红蛋白含量，提高有氧耐力，并提供对运动疲劳的抵抗力。
通过一系列实验，本发明的发明人发现长期服用枸杞水提取物会显著增加小鼠的肌肉重量，增加氧化型肌纤维的比例，增加有氧代谢的能力，提高运动能力。通过用枸杞水提取物处理C2C12成肌细胞的体外实验，发现枸杞水提取物能够增加与氧化型肌纤维相关基因的表达，增加有氧代谢水平，并降低糖酵解水平。进一步的研究发现，ERRγ途径的激活与介导枸杞水提取物促进肌纤维转化的重要作用有关。
因此，本发明的目的是通过增加氧化型肌纤维的比例和通过激活ERRγ途径来增加骨骼肌的有氧代谢来提供枸杞水提取物的重要作用。枸杞水提取物和相关组合物至少在以下六个方面具有潜在应用价值：1.该提取物和相关组合物在增强有氧耐力运动的功能食品或锻炼模拟的功能食品中具有枸杞水提取物的潜在应用价值。2.枸杞水提取物对宇航员的肌肉组织萎缩具有潜在的预防和保护作用。3.枸杞水提取物对慢性卧床病人的肌肉萎缩具有潜在的预防和保护作用。4.枸杞水提取物对老年人的肌肉萎缩有潜在的预防和保护作用。5.枸杞水提取物对改善肥胖人群的代谢异常具有潜在的治疗作用。6.枸杞水提取物在提高运动员骨骼肌的有氧代谢水平，改善有氧耐力，和抵抗运动疲劳方面具有潜在的应用价值。
根据一些实施方式，本发明提供了用于促进骨骼肌氧化型肌纤维生成的组合物。所述组合物包含枸杞、枸杞水提取物或其组合。在一些实施方式中，所述组合物还进一步包括一种或多种药学上能接受的赋形剂，所述赋形剂选自溶剂、助溶剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、蛋白质粉末或其组合组成的组。
在一些实施方式中，所述组合物包含枸杞水提取物，并且枸杞水提取物包含多糖、枸杞黄酮、类胡萝卜素、多酚和枸杞色素。这些组分中的每一种可具有一个或两个或多个相同类型。例如，该组合物可以包括两种或更多种类型的多糖，两种或更多种类型的枸杞黄酮，两种或更多种类型的类胡萝卜素，两种或更多种类型的多酚，和/或两种或更多种类型的枸杞色素。
在一些实施方式中，在枸杞提取物中，基于提取物的总干重，多糖的含量在约10.0重量％至约70.0重量％的范围内(例如，约50重量％至约70重量％)，枸杞黄酮的含量在约0.1重量％至约5.0重量％的范围内，类胡萝卜素的含量在约0.1重量％至3.0重量％的范围内，多酚的含量在约0.1重量％至8.0重量％的范围内，以及枸杞色素的含量在约0.1重量％至约8.0重量％的范围内。干重是相当于干粉(无水)提取物的当量重量。提取物可包含非常少量的其他残留物。干粉形式的提取物能与水混合以提供具有本发明所述的选定浓度的水溶液形式的提取物。
在一些实施方式中，所述枸杞提取物为粉末形式。在一些实施方式中，所述枸杞提取物为浓度为例如0.1g/mL至5g/mL的水溶液形式。在一些实施方式中，所述组合物是包括有效量的用于促进骨骼肌氧化型肌纤维生成组分的药物组合物，功能组合物，一种食物，或膳食补充剂。所述组合物可以是任何合适的形式，例如，片剂、饮料(例如运动饮料)、糖果或小吃。
在另一方面，本发明提供了一种制备如上所述的组合物的方法。这样的方法包括通过在水中提取枸杞浆果来制备枸杞的水性提取物。所述方法包括制备枸杞提取物的步骤。在一些实施方式中，制备枸杞提取物的步骤包括本文所述的步骤。例如，制备枸杞提取物的步骤包括：将干的枸杞浆果浸泡在水中，将枸杞浆果压碎以提供浸泡的浆果粉料，在沸水中将浸泡的浆果粉料进行煎煮(如两次)以得到汤剂，在真空下蒸馏过滤后的汤剂以得到浓缩物，然后冻干浓缩物以得到干粉末，作为枸杞提取物。所述方法可以进一步包括向枸杞的含水或干燥的粉末提取物中添加一种或多种组分来配制所述组合物。所述方法可以进一步包括将枸杞提取物溶于水中以得到水溶液。本发明还涉及由上述方法制得的枸杞提取物。
在另一方面，本发明提供了一种应用如上所述的组合物的方法。这样的方法包括将适当量的组合物施用或服用于人类受试者。在一些实施方式中，所述组合物用于增加骨骼肌的重量，和/或增加骨骼肌氧化型肌纤维的比例。在一些实施方式中，所述组合物还可用于提高有氧代谢的水平，和/或降低糖酵解水平。在一些实施方式中，所述组合物还可用于增加肌红蛋白的含量，提高运动耐力，和/或抵抗运动疲劳，和/或用于锻炼模拟。在一些实施方式中，所述组合物用于激活ERRγ通路，和/或通过激活ERRγ通路调节肌纤维类型。在一些实施方式中，所述组合物或枸杞提取物用于制备增加骨骼肌的重量的药物和/或用于制备增加骨骼肌氧化型肌纤维比例的药物。在一些实施方式中，所述组合物或枸杞提取物用于制备提高有氧代谢水平的药物和/或用于制备降低糖酵解水平的药物。在一些实施方式中，所述组合物或枸杞提取物在用于制备增加肌红蛋白的含量的药物。在一些实施方式中，所述组合物或枸杞提取物用于制备提高运动耐力的药物，和/或用于制备抵抗运动疲劳的药物，和/或用于制备锻炼模拟的药物。在一些实施方式中，所述的组合物或枸杞提取物用于制备激活ERRγ通路的药物，和/或制备通过激活ERRγ通路调节肌纤维类型的药物。
附图说明
当结合附图阅读时，根据以下详细描述可以最好地理解本发明。要强调的是，根据惯例，附图的各种特征不一定按比例绘制。相反，为了清楚起见，各种特征的尺寸被任意扩大或缩小。在整个说明书和附图中，相同的附图标记表示相同的特征。
图1表示对照组小鼠和施用了枸杞(LB)水提取物的实验组小鼠的体重、胫骨前肌和腓肠肌的重量；其中，图1A表示对照组小鼠和施用了枸杞(LB)水提取物的实验组小鼠的体重；图1B-1C表示对照组和具有枸杞水提取物的实验组的胫骨前肌和腓肠肌的重量。
图2表示对照组小鼠和使用枸杞水提取物的实验组小鼠的力竭跑步距离。
图3表示对照组小鼠和使用含枸杞水提取物的实验组小鼠的血清中的乳酸含量。
图4表示对照组小鼠和使用枸杞水提取物的实验组小鼠的胫骨前肌和比目鱼肌中不同类型肌纤维的免疫荧光染色和统计结果。I型(绿色)，IIa型(蓝色)和IIb型(红色)。
图5表示对照组小鼠和使用枸杞水提取物的实验组小鼠的胫骨前肌中肌球蛋白重链各亚型的表达水平。
图6表示对照组小鼠和使用枸杞水提取物的实验组小鼠的胫骨前肌中的肌红蛋白的表达水平。
图7表示在对照组小鼠和使用枸杞水提取物的实验组小鼠的胫骨前肌中线粒体DNA拷贝数。
图8表示用枸杞水提取物处理的肌管和对照组肌管中与肌纤维相关的基因的表达水平。
图9表示对照组小鼠和使用枸杞水提取物的实验组小鼠的最大耗氧量、二氧化碳呼出量、呼吸熵和能量交换率。
图10表示用枸杞水提取物处理的胫骨前肌和对照组的胫骨前肌中的有氧代谢水平和相关基因表达水平的变化。
图11表示用枸杞水提取物处理的成肌细胞和对照组的成肌细胞中细胞有氧呼吸水平和相关基因的表达水平的变化。
图12表示用枸杞水提取物处理的成肌细胞和对照组的成肌细胞中细胞糖酵解水平和相关基因的表达水平的变化。
图13表示用枸杞水提取物处理的实验组小鼠和对照组小鼠的胫骨前肌中ERRγ的表达水平。
图14表示用枸杞水提取物处理的肌管和对照组的肌管中ERRγ的表达水平。
图15表示Esrrg基因受到干扰后的，用枸杞水提取物处理的肌管和对照组的肌管中Esrrg的表达水平，骨骼肌纤维相关基因的表达水平，和作为ATP关键基因的Atp5b的表达水平。
图16表示用不同浓度(1.0、2.0、4.0和8.0mg/mL)的LB提取物处理过的C2C12肌管的形态和用不同剂量的LB提取物处理并通过qPCR测定的C2C12肌管中的Esrrg、Mef2a和Myh2的RNA水平。
具体实施方式
为了在下文中描述的目的，应当理解以下描述的实施例可以采取替代变型和实施例。还应理解，本文所述的具体制品，组合物，和/或过程是示例性的不应视为限制性的。
在本发明中，单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数引用，并且除非上下文另有明确指示，否则对特定数值的引用至少包括该特定值。因此，例如，对“纳米结构”或成分的引用是对本领域技术人员已知的一种或多种这样的结构及其等同形式的引用，等等。当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解的是，特定值形成另一实施方式。如本文所用，“约X”(其中X是数值)优选是指包括所列举值的±10％，包括端值在内。例如，短语“约8”优选是指包括7.2至8.8的值，包括端值；作为另一个示例，短语“约8％”优选(但不总是)是指包括7.2％至8.8％的值，包括端值在内。在存在的情况下，所有范围都是包括性的和可组合的。例如，当列举范围“1-5”时，所列举的范围应解释为包括范围“1-4”，“1-3”，“1-2”，“1-2和4-5”，“1-3和5”，“2-5”等。另外，当肯定地提供替代项目时，这种项目可以解释为意味着可以例如通过权利要求中的否定限制来排除任何替代。例如，当列举“1-5”的范围时，所列举的范围可以被解释为包括其中1、2、3、4或5中的任何一个被否定排除的情况；因此，列举“1-5”可以解释为“1和3-5，但不包括2”，或者简单地解释为“其中不包括2”。意图是，在本文中肯定列举的任何组件、元素、属性或步骤都可以在权利要求中明确排除，无论这些组件、元素、属性或步骤是否作为替代物列出还是将其单独列出。
如上所述，合成的锻炼模拟物具有提高肌肉健康和耐力的潜力，但是合成的锻炼模拟物可能具有需要考虑安全性和健康性问题。
因此，发现具有模拟锻炼效果的天然药物食用植物具有重要的意义。
本发明提供了与枸杞(LB)提取物在促进骨骼肌氧化型肌纤维生成的应用有关的组合物和方法，属于天然产物治疗领域。
本发明提供了一种组合物和枸杞提取物在促进骨骼肌氧化型肌纤维生成中的应用的方法。在本发明中，枸杞的水提取物用于对小鼠施用。与对照组相比，给药组小鼠的胫骨前肌和腓肠肌的重量显著增加，氧化型肌纤维比例增加，肌红蛋白含量增加，有氧代谢能力增加，运动耐力和平均力竭跑步距离增加约40％。在体外实验中，C2C12成肌细胞用枸杞的水提取物处理。与对照组相比，枸杞水提取物能增加与氧化型肌纤维相关基因的表达，增加有氧代谢水平，并降低糖酵解水平。此外，通过干扰ERRγ(与雌激素受体相关的受体-γ)基因的表达，证明了枸杞水提取物通过激活ERRγ通路而促进了氧化型肌纤维的生成。本发明证明枸杞具有促进骨骼肌氧化型肌纤维生成的作用，并且枸杞具有应用于运动食品或锻炼模拟食品中以增强有氧耐力的潜力。
用枸杞浆果进行提取。在本发明中，枸杞(或枸杞)提取物可以作为一种饮食上的天然“锻炼模拟”制剂，用于缺乏或无法进行充足体育锻炼的人们。枸杞提取物对骨骼肌纤维类型的转换和体内外能量代谢具有作用。
除非另有明确说明，否则本文中提到的“组合物”应理解为包括任何合适形式的组合物，包括但不限于固体、液体和糊剂。除非另有明确说明，否则“水提取物”或“提取物”应理解为包括任何合适形式的枸杞提取物，包括但不限于固体形式，例如干粉、糊剂和液体形式。例如，如本文所述，枸杞的干浆果可以使用本文所述的方法使用沸水提取以得到水性提取物，将其干燥以提供干粉形式的提取物。术语“水提取物”可以指粉末形式的提取物。然后将干粉溶于水以制备合适浓度的水性提取物。提取物中各组分的重量百分比为干粉形式提取物中各组分的含量。除非另有明确说明，否则水性提取物的浓度由提取物干重的质量(干粉形式的提取物的当量重量)和水性提取物的体积来定义。本文的术语“重量”和“质量”可互换使用。
在本发明的一个实施方式中，枸杞水提取物中的成分主要包括水溶性组分，如多糖、枸杞黄酮、类胡萝卜素、多酚和枸杞色素。枸杞多糖在约10.0重量％至约70.0重量％的范围内，分子量范围为4.50×103D-6.05×105D。例如，多糖可在约20.0重量％至约70.0重量％、约30.0重量％至约70.0重量％、或约40.0重量％至约70.0重量％的范围内。在一些实施方式中，多糖更优选约50.0重量％至约70.0重量％。在一些实施方式中，阿拉伯糖、半乳糖醛酸和半乳糖在糖组合物中的含量不低于60％。在一些实施方式中，多糖的含量为54％，并且分子量为6.50×103D至5.05×105D。
除了多糖之外，每种其它组分可以在合适的范围内。例如，在一些实施方式中，枸杞黄酮的含量在约0.1重量％至约5.0重量％的范围内(例如，0.5-5％、1-5％、2-5％或3-5％)，类胡萝卜素的含量在约0.1重量％至约3.0重量％的范围内(例如，0.2-3％、0.5-3％或1-3％)，多酚的含量在约0.1重量％至约8.0重量％的范围内(例如，0.5-8％、1-8％、2-8％、4-8％、5-8％或任何其他合适的范围)，枸杞色素的含量在约0.1重量％至约8.0重量％的范围内(例如，0.1-7％、0.1-6％、0.1-5％、0.1-4％，或任何其他合适的范围)。这些重量百分比是相对于干粉形式的提取物的总重量。
在本发明的一个具体实施方式中，枸杞的水性提取物通过灌胃(gavage)或口服施用，但并不限于此。使组合物进入胃的任何施用形式都是合适的。
在本发明的一些实施方式中，枸杞水提取物的剂量是2.5g/kg(示例性提取物的干重/动物如小鼠的体重)。参考徐叔云教授主编的“药理学实验方法”中人与动物之间的当量剂量比，计算出该剂量在人体中相当于19.39g/70kg。小鼠的剂量(D1)与人的剂量(D2)的比例基于以下公式计算：D1＝D2*9.023。施用剂量不以任何方式限制本发明的范围。例如，剂量可以在约10.0g/70kg至约40.0g/70kg的范围内。在这些剂量中，以克计的质量是指相应提取物的当量干重，以kg计的质量是指人类受试者的体重。
本发明提供的枸杞水提取物药食同源，能作为健康食品。食品或保健食品的剂型没有特别限制。例如，可以制成片剂、饮料、糖果等。每种食品制剂除了枸杞水提取物外，还可以包括本领域所用的其他组分。其它组分可由本领域技术人员考虑所用的具体配方或目的来选择。
在一些实施方式中，所述组合物是食品或保健品，包括运动饮料、蛋白质粉等。
通过制备实施例和测试实施例解释本发明的特征和效果。然而，以下制备实施例和测试实施例仅用于说明，而不限制本发明的范围。
实施例
除非另有说明，否则本文所用的水是双蒸馏水(pH＝7)。
使用小鼠的所有动物实验均在C57BL/6上进行。动物的护理和处理根据动物伦理委员会的指导进行。
1、枸杞提取物的制备
枸杞提取物是通过以下步骤制备的：枸杞浆果在中国宁夏银川市中宁县种植并获得。将干的浆果洗涤5次后，在室温下在双蒸馏水(pH＝7)中浸泡2小时，然后压碎。将浸泡过的浆果粉料加入8倍的中性水，均匀混合，并在沸腾温度下煎煮两次，煎煮时长分别为2.0小时和1.5小时。合并的浓缩汤剂通过中空纤维膜过滤。将以上滤液合并，并在真空下于45℃蒸发以除去水得到浓缩物。将所得浓缩物冻干成粉末，并储存在干燥器中，并以适当的浓度用于后续实验。
在实验中，使用了示例性的所得枸杞提取物(实施例1)。这样的示例性提取物是提取物水溶液，并且具有1g/mL的浓度(干粉的当量重量或提取物的干重/提取物的体积)。此浓度仅用于说明。可以将水性提取物调节至任意适当的浓度，例如，在约0.1g/mL至5g/mL的范围内(示例性提取物的干重/提取物的体积)。在一些实施方式中，可以将这样的水提取物稀释用于施用。水提取物可进一步稀释用于细胞实验。
本发明中提供的枸杞提取物主要包括水溶性的枸杞多糖、枸杞黄酮、类胡萝卜素、多酚和色素。在所使用的示例性提取物中，基于干粉形式的提取物的总当量重量，多糖的含量为约50.0重量％至约70.0重量％(例如，约54％-56％或54％)，枸杞黄酮为约0.1重量％至约5.0重量％。类胡萝卜素为约0.1重量％至约3.0重量％，多酚为约0.1重量％至约8.0重量％，以及枸杞色素为约0.1重量％至约8.0重量％。
2.细胞培养与处理：
在37℃下在5％CO2气氛中，将小鼠C2C12细胞在生长培养基中培养，该生长培养基由添加了4.5g/L葡萄糖，10体积％胎牛血清(FBS)，1体积％抗生素/抗真菌药和1体积％庆大霉素的Dulbecco改良的Eagle's培养基(DMEM；Gibco)组成。
3.耐力测试
跑步实验用于测试枸杞提取物是否可以提高小鼠的运动能力。将小鼠跑动仪设置成传送带转动，即设置小鼠的跑步速度和电刺激的强度。小鼠的跑步平台的倾斜度设置为15度。将小鼠置于跑步通道中，首先以10m/min的速度平衡3分钟，然后在10分钟内以2m/min的加速度加速至30m/min，然后以这个速度均速移动。小鼠连续在电击区域活动或连接到电击区域的跑步平台的后半部分活动，作为小鼠初始疲劳的标准。如果小鼠在2.5mA电流刺激下仍停留在电击区域中，则小鼠完全疲劳。在完全疲劳时记录小鼠跑步的总距离，并将其视为小鼠的疲劳运动能力。
4.乳酸含量的测量：
采用商业化试剂盒(南京建成)测量小鼠血清中乳酸含量。
5.冷冻切片的免疫荧光染色：
在免疫荧光染色之前，将肌肉的冷冻切片在冷丙酮中固定20分钟，用PBS洗涤3次，并用0.2体积％TritonX-100/PBS(PBST)透化10分钟。用PBS洗涤后，通过在室温下与5体积％的BSA孵育2小时来封闭细胞。通过与一抗在4℃下孵育过夜，对细胞进行免疫染色。洗涤后，与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗兔IgG抗体(中山金桥公司)孵育后，可以看到免疫反应蛋白。细胞核用Hoechst(Santa Cruz)染色。然后使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM750)(Carl Zeiss)观察细胞。
6.实时qPCR：
根据制造商的(Invitrogen)方案，使用TRIzol试剂提取总RNA。然后使用M-MuLV逆转录酶逆转录RNA样品，并通过在7500实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行RT-qPCR来测量mRNA水平。将样品加热到95℃停留2分钟，并进行40个扩增循环(94℃，1分钟；58℃，1分钟；和72℃，1分钟)，然后在72℃最后延伸10分钟。
7.蛋白质印迹：
在放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液(150mM的NaCl，1体积％NP-40、0.5体积％DOC，0.1体积％SDS，50mM的Tris，pH7.4、5mM的EDTA和1体积％蛋白酶抑制剂混合物溶液(Roche))中裂解细胞，并通过离心对裂解物进行清理。对于每个样品，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离40mg蛋白质并将其转移到PVDF膜上。将膜在含5体积％脱脂奶粉的TBST(0.1％Tween-20)中封闭1小时，并与以下第一抗体在4℃下孵育过夜；抗-iNOS(1：500，Santa Cruz)；抗-p-ERK，抗-ERK，抗-p-AKT，抗-AKT，抗-p-AMPKα/β，和抗-AMPKα/β(1：1000，细胞信号)；抗-HIF-1α(1：200，圣克鲁斯)；抗-Nrf2(1：200，圣克鲁斯)；抗-HSP60，抗-HSP70和抗-HSP90(1：500，圣克鲁斯)；抗-LC3(1：1000，MBL)或抗肌动蛋白(1：2000，Sungene Biotech)。在TBST中洗涤后，将膜与1：2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)(稀释液为TBST)标记的第二抗体(中山金桥公司)在室温下孵育1小时，然后用TBST洗涤3次。将每个膜放入ECL溶液(Thermo)中，随后使用Molecular Imager ChemiDoc XRS+(BioRad)检测信号，并使用Image Lab 4.0.1进行分析。
8.代谢测量：
通过使用Oxymax实验室动物监测系统(Columbus Instruments，Columbus，OH)获得代谢测量。针对标准气体混合物对系统进行校准，以测量消耗的氧气(VO2，ml/kg/h)和产生的CO2(VCO2，ml/kg/h)。这些测量是对施用了2个月枸杞的动物进行的。前12小时是动物适应的一段时间，然后评估24小时的代谢率(VO2)和食物摄入量。能量消耗(或热量产生)计算为氧气的热值(3.815_1.232_呼吸熵)和消耗的氧气体积的乘积。
9、XF24耗氧量测定法及耗氧率：
使用来自Seahorse Bioscience的XF24细胞外通量分析仪测量耗氧量。为此，在分析前2小时，将对照的，在24孔XF24 V28细胞培养微孔板(Seahorse Bioscience)上过表达的C2C12成肌细胞用化合物C预处理。实验前一小时，洗涤细胞，并在37℃的非CO2培养箱中于630ml非缓冲(无碳酸钠)DMEM(4.5g/L葡萄糖)pH7.4中孵育。实验中每种细胞类型重复五次，将四个均匀分布在板中的孔用于校正温度变化。在实验的整个过程中，在2分钟内以6分钟为间隔测量氧气浓度，其中包括2分钟的混合时间和4分钟的等待时间。使用固定增量法计算2分钟测量周期内的OCR，以确定斜率。
10、ATP产物测定
使用商品化试剂盒(碧云天)测定细胞中ATP的含量。测定原理为：当萤火虫萤光素酶催化底物产生荧光时，需要ATP提供能量。当荧光素酶和荧光素都过量时，荧光的产生在一定浓度范围内与ATP的浓度成正比。
11、统计分析
结果表示为至少3个独立实验的平均值±平均值的标准误差(SEM)。使用Student's t-test计算两个平均值之间差异的统计显着性，并通过进行2-way ANOVA分析来计算对照组和处理组之间的差异。对于所有分析，p<0.05被认为具有统计学意义，并且显着性水平表示如下：***，p<0.001；**，p<0.01；*，p＜0.05。
实施例2:枸杞提取物(LB)增加了骨骼肌的重量并增强了运动能力。
从维通利华公司购买的约8周龄的雄性C57BL/6小鼠被随机分为对照组和枸杞处理组。在枸杞组(“LB”)中，每天通过灌胃枸杞提取物2.5g/kg，并且生理盐水用作为对照组(“Ctrl”)。对小鼠施用枸杞4个月。胃中服用枸杞提取物后，分别对对照组和枸杞组的小鼠称重。用乙醚麻醉小鼠，抽血，然后颈部处死，解剖并称重小鼠腿的胫骨前肌和腓肠肌。
如图1A-1C所示，枸杞水提取物对小鼠体重没有明显影响(图1A)，但是它可以显着增加小鼠胫骨前肌和腓肠肌的重量(图1B-1C)。
如图2所示，在运动实验中，枸杞水提取物能使小鼠的跑步距离显著增加约40％左右，提高了小鼠的运动能力。枸杞提取物缓解了肌肉疲劳并增强了耐力。
在雄性C57BL/6J小鼠中评估了枸杞提取物(LB)对骨骼肌的作用，这些小鼠通过灌胃4个月以2.5g/kg/天的剂量服用LB(生理盐水作为对照)。与对照组相比，LB组小鼠的体重没有变化(图1A)，但是它们的肌肉质量表现出明显的变化(图1B-1C)。LB显著增加了胫骨前肌(TA)和腓肠肌(GAS)的重量(图1B-1C)。
为了研究LB对改善肌肉功能的作用，测试了小鼠的运动能力。LB组小鼠的力竭跑步距离比对照组长得多(图2)。这些发现表明LB增加了基于氧化型纤维类型的耐力。同时，血清中乳酸水平的降低也支持了LB缓解了肌肉疲劳(图3)。因此，长期用LB喂食小鼠可缓解肌肉疲劳并增强耐力，并且此功能可能与肌纤维类型的改变有关。
实施例3：LB(枸杞提取物)在体内和体外促进了肌肉糖酵解至氧化纤维类型的转换。
为了进一步验证LB喂食后肌纤维类型的变化，在肌肉的冷冻切片上通过IF对I型(氧化型)、IIa型(氧化型)和IIb型(糖酵解)纤维进行染色(图4)。在胫骨前肌(TA肌肉)中，几乎没有I型纤维，IIa型纤维的比例显著增加，而IIb型的比例相应降低(图4A)，这表明LB促进了在体内糖酵解至氧化纤维类型的转换。
同时，使用qPCR确定IIa型和IIb型纤维的特征性mRNA的表达。它揭示了IIa型纤维的标志物Myh2的mRNA的增加(图5B)，而I型纤维的标志物Myh7和IIb型纤维的标志物Myh4的转录水平没有改变(分别为图5A和图5C)。由于氧化纤维富含线粒体和肌红蛋白，LB处理后胫骨前肌中肌红蛋白表达和mtDNA含量增加也证实了LB通过促进糖酵解至氧化纤维类型的转换增强耐力(图6-7)。然而，在比目鱼肌中，由于IIb型纤维的数量极少，三种类型的肌纤维的比例没有显著变化(图4B)。
在分化的肌管中，也评估了IIa型和IIb型纤维标志物在体外的表达。与体内结果一致，LB以剂量依赖性方式诱导氧化型纤维标记物(Myh7、Myh2和Myh1)的mRNA水平，并且Myh4的水平没有变化(图8)。因此，LB在体内和体外促进了肌肉糖酵解至氧化纤维类型的转换。
实施例4：LB增强了机体有氧代谢能力。
不同的肌纤维亚型与代谢活性密切相关，I型和IIA型富含线粒体和肌红蛋白，并具有较高的有氧代谢能力。
为了进一步验证来自LB组的小鼠具有较强的有氧代谢能力，本发明的发明人通过呼吸代谢检测系统分析测量了对照组和LB组小鼠体内的耗氧和二氧化碳的产生。LB组小鼠的O2消耗(图9A)和能量消耗(EE)(图9B)总体上显著增加，这表明LB增加了在正常生理条件下小鼠的能量消耗。但是，对照组和LB组之间的CO2产生量没有显著差异(图9C)，相应地LB组的呼吸熵(RQ)降低(图9D)。这些数据表明LB组小鼠的氧化呼吸增加，并且更可能利用脂肪产生能量。这些结果与增加的氧化纤维类型相关。
接下来，检测关于骨骼肌中能量产生的关键基因的水平。LB降低了胫骨前肌中糖酵解关键酶Pfk1的表达，对Hk2的表达没有明显影响(图10A)。同时，LB上调了胫骨前肌中与有氧代谢相关的基因Atp5b和与脂肪酸氧化相关的基因Cpt1的水平(图10C-10D)。同时，LB上调了与有氧代谢相关的基因Cox5b、Cox7a(细胞色素c氧化酶亚基)和Cytc(细胞色素C)的水平，表明LB诱导了有氧代谢(图10B-10C)。增加的Atp5b(ATP合成酶5b)水平表明LB诱导ATP水平(图10C)。本发明的发明人发现，LB处理没有改变丙酮酸脱氢酶激酶4(Pdk4)的表达，表明ATP合成的增加不能通过葡萄糖和蛋白质分解的增加实现(图10D)。LB在胫骨前肌中显著诱导了与脂肪酸氧化相关的基因Cpt1，表明LB通过促进脂肪酸代谢而增加了ATP(图10D)。这些数据也支持了LB组小鼠的TA肌肉比对照组具有更高的有氧代谢能力。
实施例5：LB促进C2C12成肌细胞中的有氧呼吸
为了进一步评估LB提取物对C2C12成肌细胞中线粒体功能的影响，使用SeahorseXF24分析仪分析了细胞生物能谱。如图11A所示，2mg/mL的LB处理的成肌细胞的耗氧速率(OCR)增加。基础呼吸的增加是由于质子漏(proton leak)和线粒体ATP产生的提高引起的(图11A)，表明LB促进了热量的产生和ATP的产生。
此外，在图11A中，寡霉素为ATP合成酶抑制剂，在寡霉素(oligomycin)加入之前，细胞耗氧率(OCR)代表细胞的基础呼吸水平；细胞培养基中加入寡霉素后，ATP合成酶活性受到抑制，此时的细胞耗氧率(OCR)代表细胞质子漏水平，同时下降的细胞耗氧率(OCR)代表细胞ATP的水平；羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)为解偶联剂，其作用可以消除线粒体基质与胞质之间的质子梯度，此时的细胞耗氧率(OCR)代表细胞的最大呼吸水平；抗霉素A(Antimycin A)为线粒体电子传递链复合物三的抑制剂，鱼藤酮(Rotenone)为线粒体电子传递链复合物一的抑制剂，抗霉素A和鱼藤酮的加入可以彻底抑制线粒体电子传递链的活性，此时的细胞耗氧率(OCR)代表细胞的非线粒体呼吸水平。分别在细胞培养基中于不同时间添加寡霉素、羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙、以及抗霉素A和鱼藤酮，在添加解偶联剂羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP)之后，2mg/mL的LB处理的成肌细胞显示出更高的最大呼吸和备用呼吸能力(图11A)，显示出更强的呼吸潜力。与C2C12细胞中ATP生成的增加一致，使用试剂盒检测到的总ATP水平也增加了2倍以上(图11A)。同时，测量了线粒体中电子传输链的主要成分的转录水平。LB剂量依赖性地增加了细胞色素c(Cytc)、细胞色素c氧化酶亚基(Cox2和Cox5b)和ATP合酶(Atp5b)的表达(图11B-11E)，进一步支持了ATP生成的增加。此外，在图12A中，葡萄糖(Glucose)为糖酵解过程中己糖激酶的底物，葡萄糖的加入起始了细胞的糖酵解过程，此时的细胞外酸化率代表糖酵解能力；寡霉素(oligomycin)为ATP合成酶抑制剂，细胞培养基中加入寡霉素后，ATP合成酶活性受到抑制，此时的细胞线粒体ATP产生受到抑制，此时的细胞外酸化率代表细胞最大糖酵解能力；2-脱氧葡萄糖(2-DG)是己糖激酶的抑制剂，细胞培养基中加入2-脱氧葡萄糖后，细胞糖酵解受到抑制，此时的细胞外酸化率代表细胞非糖酵解酸化率。分别在细胞培养基中于不同时间添加葡萄糖、寡霉素和2-脱氧葡萄糖，如由Seahorse XF24分析仪测量的，LB处理的成肌细胞表现出较低的细胞外酸化率(ECAR)，表明糖酵解通量降低和糖酵解能力减弱(图12A)。与糖酵解通量降低一致，LB处理的成肌细胞显示出更低的己糖激酶2(Hk2)的mRNA水平，己糖激酶2(Hk2)是葡萄糖代谢途径第一步的关键酶，磷酸果糖激酶1(Pfk1)的水平没有变化(图12B、12C)。因此，LB促进了C2C12成肌细胞中的有氧呼吸并抑制了糖酵解过程。
实施例6：LB通过ERRγ调节肌纤维类型转变
接下来，本发明的发明人研究了LB如何调节肌纤维类型转换的分子机制。本发明的发明人首先评估了涉及骨骼肌代谢重塑的已知关键调节子的表达，包括AMPK、PGC-1、Sirt1和PPAR。本发明的发明人发现在体外和体内LB均增加了Esrrg的转录水平(图13-14)。为了证实LB通过调节ERR通路来调节肌纤维类型和代谢类型的转换，使用siRNA敲低了C2C12肌管中Esrrg的表达。ERRγ的缺乏抑制了LB诱导的氧化纤维(Myh7、Myh2和Myh1)和ATP合酶(Atp5b)的标志物的mRNA水平(图15)，表明LB通过调控ERRγ增加了氧化纤维类型的比例，增强了有氧呼吸。
为了测试LB的药物兴奋效应，本发明的发明人使用高剂量的LB提取物处理C2C12肌管细胞，发现当LB的浓度达到8mg/mL时，许多细胞死亡。尽管4mg/mL浓度的LB也增加了基因(Esrrg和Mef2a)表达的水平，但是这种上调程度明显低于2mg/mL提取物诱导的上调程度(图16)。因此，LB对C2C12细胞的有益作用仅在一定浓度范围内(约0-2mg/mL，例如0.1-2mg/mL或0.5-2mg/mL)是剂量依赖性的。
如前所述，运动被认为是提高肌肉质量和功能的有效方法。耐力锻炼增加肌肉质量，减少脂肪质量，促进了纤维类型向慢肌的转化，刺激线粒体的生物合成和脂肪酸氧化，促进了O2的利用，CO2和热量的产生，促进了有氧呼吸，提高肌肉耐力。因此，运动触发了骨骼肌的代谢和结构重塑，从而提高骨骼肌性能。据报道，近年来被定义为“锻炼模拟物”的某些天然化合物，其代谢作用类似于运动引起的代谢作用。枸杞提取物能增加肌肉质量，减少脂肪质量，促进肌纤维类型转换，刺激线粒体的生物合成和脂肪酸氧化，促进O2的利用、ATP和热量的产生，从而提高有氧呼吸能力和肌肉的耐力。因此，它作为“锻炼模拟物”非常有用。
作为中草药和功能性食品，具有“锻炼模拟”效果的枸杞提取物可应用于许多领域。例如，对于耐力运动员来说，枸杞可能有益于增加氧化型肌纤维的比例。对于缺乏或无法进行充足体育锻炼的人们，枸杞提取物可能能够在一定程度上预防肌肉流失并促进肌肉新陈代谢。此外，骨骼肌质量的流失是人类衰老中最普遍和最有害的过程之一，其降低了生活质量。在本发明中，本发明的发明人发现了枸杞能增加IIa型纤维和肌肉质量。同时，线粒体在骨骼肌稳态中起着关键作用，并且线粒体能量代谢中衰老相关的缺陷与衰老的肌肉萎缩有关，而通过枸杞治疗可提高有氧呼吸和能量产生。因此，枸杞提取物通过上调线粒体的新陈代谢和肌纤维类型的转化，有助于缓解衰老的肌肉萎缩。
尽管已经根据示例性实施方式描述了本发明，但是本发明不限于此。相反，所附权利要求应被广义地解释为包括本领域技术人员可以做出的其他变型和实施方式。

Claims (11)

1.枸杞提取物在制备用于促进骨骼肌氧化型肌纤维生成的组合物中的应用，其特征在于，该组合物的活性成分为枸杞提取物，所述枸杞提取物包含多糖、枸杞黄酮、类胡萝卜素、多酚和枸杞色素；
其中，在所述枸杞提取物中，基于干粉形式的提取物的总干重，多糖的含量在10.0重量%至70.0重量%的范围内；枸杞黄酮的含量在0.1重量%至5.0重量%的范围内，类胡萝卜素的含量在0.1重量%至3.0重量%的范围内，多酚的含量在0.1重量%至8.0重量%的范围内，且枸杞色素的含量在0.1重量%至8.0重量%的范围内。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物还包括一种或多种药学上能接受的赋形剂，所述赋形剂选自溶剂、助溶剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、蛋白质粉末和其组合组成的组。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在所述枸杞提取物中，基于干粉形式的提取物的总干重，多糖的含量在50.0重量%至70.0重量%的范围内。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物包含两种或更多种类型的多糖，两种或更多种类型的枸杞黄酮，两种或更多种类型的类胡萝卜素，两种或更多种多酚，或两种或更多种类型的枸杞色素。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物是药物组合物。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的应用，其特征在于，所述组合物的制备方法包括制备枸杞提取物的步骤，所述制备枸杞提取物的步骤包括以下步骤：
将干的枸杞浆果浸泡在水中；
将枸杞浆果压碎以提供浸泡的浆果粉料；
在沸水中将浸泡的浆果粉料进行煎煮两次以得到汤剂；
在真空下蒸馏过滤后的汤剂以得到浓缩物；以及
冻干浓缩物以得到干粉末作为枸杞提取物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述方法还包括将所述枸杞提取物溶于水中以得到水溶液。
8.枸杞提取物在制备用于增加骨骼肌的重量和/或增加骨骼肌氧化型肌纤维比例的组合物中的应用，其特征在于，所述组合物为权利要求1-7任意一项中所述的组合物。
9.枸杞提取物在制备用于提高有氧代谢水平和/或降低糖酵解水平的组合物中的应用，其特征在于，所述组合物为权利要求1-7任意一项中所述的组合物。
10.枸杞提取物在制备用于增加肌红蛋白的含量的组合物中的应用，其特征在于，所述组合物为权利要求1-7任意一项中所述的组合物。
11.枸杞提取物在制备用于锻炼模拟的组合物中的应用，其特征在于，所述组合物为权利要求1-7中任意一项所述的组合物。
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