BR112018073483B1

BR112018073483B1 - Suplementos e composições dietéticas para a melhoria do desempenho físico e dos níveis de energia

Info

Publication number: BR112018073483B1
Application number: BR112018073483-7A
Authority: BR
Inventors: Alluri Venkata Krishna Raju; Bhupathiraju Kiran; Gokaraju Ganga Raju; Gokaraju Rama Raju; Gokaraju Venkata Kanaka Ranga Raju; Golakoti Trimurtulu; Sengupta Krishanu
Original assignee: Laila Impex
Priority date: 2016-05-21
Filing date: 2017-05-20
Publication date: 2022-08-23
Also published as: CN109475167A; MY190273A; WO2017203540A1; BR112018073483A2; US20190191752A1; CA3023426A1; US11122829B2

Abstract

SUPLEMENTOS E COMPOSIÇÕES DIETÉTICAS PARA A MELHORIA DO DESEMPENHO FÍSICO E DOS NÍVEIS DE ENERGIA A invenção divulga novos suplementos dietéticos ou produtos fitoterápicos compreendendo pelo menos um ingrediente selecionado dentre os extratos ou frações derivadas de frutos de Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, casca de caule de Mangifera indica, caule de Woodfordia fructiosa e frutos de Acácia nilótica ou suas composições em combinação com pelo menos um composto selecionado de ativos biológicos, extratos de ervas, minerais, aminoácidos, proteínas, vitaminas, excipiente, diluente ou transportador como um realçador de energia natural para fornecer um início e manutenção constante de energia e para melhorar a força muscular, massa muscular e alerta mental, para tratar Sarcopenia e atrofia muscular em um animal de sangue quente ou mamífero que necessite.

Description

ÁREA TÉCNICA DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a novos suplementos dietéticos de ervas selecionadas dos extratos e frações derivados da Bauhinia racemosa, Mangifera indica, Woodfordia fruticosa, Cassia auriculata e Acacia nilotic, isoladamente e suas composições como intensificador de energia natural para melhorar o desempenho físico, massa muscular, força muscular, níveis de energia e para tratar a Sarcopenia e a atrofia muscular em um mamífero.

[002] A presente invenção refere-se também sobre formulações de ingredientes alimentares como bebidas, formulação de ingredientes dietéticos, lanches e bebidas energéticas contendo o dito ingrediente herbóreo ou suas composições para início e manutenção constante de energia, força muscular e alerta mental e para aumentar a força muscular, atividade física, aptidão física, agilidade mental, níveis de energia, níveis de resistência, saúde circulatória, saúde dos vasos sanguíneos ou para obtenção de melhor saúde física e mental.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[003] A descrição comum de energia é a capacidade de um sistema em executar o trabalho. Todas as atividades da vida humana requerem a presença de energia. A energia é necessária para sustentar a vida e todos os aspectos da existência, tais como pensar, sentir, andar, comer, beber, sonhar, respirar, etc. A energia é sentida e experimentada em seu gasto das reservas de energia do corpo, não através de sua acumulação. Idade, fadiga e estresse fazem com que as pessoas se sintam com deficiência de energia. Este peso na energia compromete muitas vezes o estado de alerta mental do corpo. A eficiência no local de trabalho e o gerenciamento pessoal podem ser aprimorados ao abordar adequadamente as demandas de energia do corpo. Além da energia, a força muscular e a resistência muscular são fatores importantes para melhorar a agilidade física de uma pessoa. A força muscular é uma medida de quanta força os músculos de uma pessoa podem exercer, enquanto a resistência é a medida de quantas vezes os músculos podem repetir um esforço específico de força.

[004] A Sarcopenia é a perda de massa muscular esquelética e força associada ao processo de envelhecimento (Cruz-Jentoft et al 2010; Fielding et al 2011). Ela afeta o equilíbrio, o caminhar e a capacidade geral de realizar tarefas rotineiras diárias. As causas da Sarcopenia são multifatoriais, incluindo estilo de vida sedentário, funções endócrinas alteradas, doenças crônicas, inflamação, resistência à insulina e deficiências nutricionais. As opções terapêuticas para a Sarcopenia não são claras e estão em constante evolução. A abordagem mais racional para retardar a progressão e tratar a Sarcopenia é baseada na combinação de nutrição adequada, associada ao uso de suplementos dietéticos e um programa regular de exercícios.

[005] Os suplementos dietéticos são usados para aumentar o desempenho físico, a aptidão física, melhorar a saúde ou reduzir as consequências potencialmente negativas da atividade física, como lesões e fadiga crônica, ou a função imunitária suprimida.

[006] Muitas bebidas energéticas, suplementos e formulações de ingredientes alimentares contendo proteínas, aminoácidos e vitaminas, além de vários outros agentes, estão atualmente disponíveis no mercado, mas são altamente ricos em carboidratos complexos. Assim, essas formulações agem rápido demais para fornecer energia instantânea, mas não sustentam os níveis ao longo do tempo. Muitas dessas formulações tendem a aumentar acentuadamente os níveis de glicose no sangue e isso é seguido por sua rápida depleção, que às vezes pode levar a complicações. As desvantagens, além do alto teor de açúcar, incluem alto teor de cafeína, teor alcoólico e uso de outros ingredientes, como aminoácidos, taurina, guaraná e ginseng, em quantidades muito pequenas, sem efeitos benéficos à saúde. Outras desvantagens das bebidas energéticas são as limitações diárias recomendadas, para limitar o consumo diário.

[007] À luz do exposto, permanece a necessidade na invenção, de fornecer suplementos naturais, que melhorem a sensação de energia, agilidade geral, resistência e alerta mental sem ter quaisquer complicações de saúde.

[008] Portanto, a presente invenção aborda a necessidade existente na técnica, fornecendo extratos e composições para aumentar a energia, resistência, força muscular, resistência muscular e/ou alerta mental. Assim, a presente invenção proporciona extratos naturais, frações e/ou composição(ões) capazes de aumentar os níveis de energia durante um período de tempo prolongado num mamífero para aumentar os níveis de energia, potência muscular, resistência muscular e estado mental e assim resolver estas necessidades.

[009] A Bauhinia racemosa pertence à família Caesal piniaceae. Na aiurvédica Tradicional, a casca da Bauhinia racemosa é usada no tratamento da malária, disenteria e diarreia, asma e doenças da pele como erupções cutâneas, espinhas, acne, abscessos e úlceras e as folhas são usadas como forragem para o gado.

[010] Mangifera indica, vulgarmente conhecida como manga, pertence ao gênero Mangifera da família Anacardiaceae. Ele tem sido usado na aiurvédica por mais de 4000 anos e é o fruto nacional da Índia, Paquistão e Filipinas. A maioria das partes da mangueira é útil para tratar várias condições médicas, como insolação, cicatrização de feridas, doenças degenerativas, diabetes, diarreia, disenteria, anemia, asma, bronquite, tosse, hipertensão, insônia, reumatismo, dor de dente, leucorréia, hemorragia e hemorroidas etc. A fruta é comestível. Cascas, folhas, caules, talos tenros e sementes são amplamente utilizados por seus potenciais medicinais.

[011] A Woodfordia fruticosa comumente conhecida como Dhataki é encontrada no Sri Lanka, Konkan Sul e norte da Índia. A Woodfordia fruticosa pertence à família Lythraceae. É usada como um agente de fermentação para a preparação de Asava e Arishta em aiurvédica. Também é conhecida por tratar problemas intestinais, hemorragias, menorragia e fraqueza seminal, febre, dor de cabeça, herpes.

[012] A Acacia nilotica pertence ao gênero Acacia da família Leguminosae/Fabaceae- Mimosodeae. Foi amplamente utilizada na medicina egípcia tradicional para tratar várias condições médicas que incluem dor de estômago e escorbuto, como um antisséptico, expectorante, tuberculose, lepra, varíola, disenteria, tosse, oftalmia, dor de dente, câncer de pele, como adstringente, antiespasmódico e afrodisíaco. Folhas, casca, frutos e sementes são comumente usados por seus benefícios para a saúde.

RESUMO DA INVENÇÃO

[013] A presente invenção fornece novos extratos de erva e frações derivadas de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa para aumentar os níveis de energia, aumentando a resistência por um período prolongado de tempo, melhorando o desenvolvimento muscular, alerta mental e tratando Sarcopenia e atrofia muscular.

[014] A presente invenção proporciona novos extratos herbais e suas composições de suplementos dietéticos compreendendo pelo menos dois ingredientes/componentes selecionados a partir dos extratos ou frações derivados de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa, que são capazes de aumentar os níveis de energia por um longo período de tempo, melhorando o desenvolvimento muscular e o poder e agilidade mental.

[015] Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona novas composições de suplemento dietético compreendendo pelo menos um ingrediente selecionado dos extratos e frações derivados da Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa, em combinação com pelo menos um ingrediente selecionado a partir de compostos ativos, extratos, fitoquímicos, derivados de planta(s), animal(is) ou microorganismos com benefícios comprovados de saúde terapêutica; diluentes, excipientes e hospedeiros; vitaminas, aminoácidos e minerais, úteis para aumentar os níveis de energia, resistência por um período prolongado de tempo, melhorando o desenvolvimento muscular, a potência muscular, o estado de alerta mental e para tratar a Sarcopenia e a atrofia muscular.

[016] Noutro aspecto, a invenção proporciona suplementos dietéticos, formulações de ingredientes alimentares tais como bebidas, lanches e bebidas energéticas contendo o(s) referido(s) ingrediente(s) acima ou a(s) sua(s) composição(ões) para o início e manutenção constante de energia e alerta mental. A formulação é útil para melhorar a potência muscular, atividade física, aptidão física, alerta mental, massa muscular, níveis de energia, níveis de resistência, saúde circulatória, saúde dos vasos sanguíneos ou para melhorar a saúde física e mental e tratar a Sarcopenia e a atrofia muscular em mamíferos.

[017] Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona novos extratos ou frações derivados da Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cássia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa, e as suas composições para o início e a manutenção constante de energia; força muscular, alerta mental e para aumentar a força muscular, massa muscular, atividade física, condicionamento físico, agilidade mental, níveis de energia, níveis de resistência, saúde circulatória, saúde dos vasos sanguíneos ou para melhor saúde mental em animais de sangue quente que o necessitem.

[018] Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um método para aumentar a energia, a massa muscular e a resistência para proporcionar um início e uma manutenção constante da energia, força muscular, resistência muscular e estado de alerta mental; e para o tratamento da Sarcopenia e atrofia muscular num mamífero, em que o modo compreende a suplementação ou tratamento do referido mamífero com pelo menos um ingrediente selecionado dos extratos ou frações derivadas da Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa e suas composições.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[019] Figura 1: Imagens de transferência western representam LN16002 (painel A), LN16008 (painel B), LN16011 (painel C), LN17090 (painel D), Composição 3 (Painel E & F) hiperfosforila a proteína mTOR e aumenta-se a produção de fatores de transcrição específicos do músculo tais como mTOR, PGC 1 α, miostatina, MyoD e Myogenin em mioblastos esqueléticos de ratos L6. A expressão da proteína GAPDH representa o controle de carregamento.

[020] Figura 2: Diagramas representativos de barras mostram a modulação do Citocromo C oxidase 1 (COX1) por extratos de frutos de Bauhinia racemosa (LN16002; A), caule de Woodfordia fruticosa (LN16008; B), frutos da Acacia nilotica (LN16011; C), extrato alcoólico das folhas da Cassia auriculata (LN17090; D) e composição-3 (E). A Figura 2F é um diagrama de barras que representa a inibição do proteassoma 20S pelo extrato LN17090 e a composição- 3.

[021] Figura 3: As imagens de contraste de fase representam a formação de miotubos em células de mioblastos L6 de rato induzidas por: LN16002 (painel A), LN16008 (painel B), LN16011 (painel C), LN17090 (painel D) e Composição-3 (painel F) em diferentes concentrações de tratamento conforme indicado. As culturas tratadas com controle de veículo receberam 0,1% de DMSO.

[022] Figura 4: Diagramas de barra representando melhora da força de presa (A), resistência muscular (B), diâmetro da fibra do músculo gastrocnêmico (C) e diâmetro da fibra do músculo soleo (D) no modelo Sarcopenia de ratos SD para os grupos de tratamento suplementados com 200 mg de LN17090 (G3 ), 400 mg de LN17090 (G4), 200 mg de LN16011 (G5) e 350 mg de HMB (G6) em comparação aos grupos de controle do veículo (G1) e da doença (G2). (Os valores são representados como média ± SEM; n = 6 animais por grupo. ###P<0.001, ##P<0.01 comparado ao controle do veículo (G1), *** P <0,001 **P <0,01 e *P <0,05 em comparação com o grupo controle da doença (G2) usando ANOVA two-way seguido pelo pós-teste de bonferroni.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[023] A invenção será agora descrita em detalhe em relação a certas formas de realização preferidas e opcionais, de modo que vários aspectos da mesma possam ser mais completamente compreendidos e apreciados. No entanto, qualquer pessoa especializada apreciará até que ponto tais formas de realização poderão ser extrapoladas na prática.

Fonte dos materiais da Planta:

[024] As plantas utilizadas na presente invenção, nomeadamente, a Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Mangifera indica e a Woodfordia fruticosa foram recolhidas na Índia. Os extratos derivados da fruta seca da Acacia nilotica; Frutas secas da Bauhinia racemosa, partes externas da Cassia auriculata, casca de caule da Mangifera indica, matéria-prima de parte do caule da Woodfordia fruticosa e algumas outras partes de plantas destas plantas que foram usadas para demonstrar a invenção. Outras partes de plantas e frações de extrato também podem ser usadas da mesma maneira.

Justificativa da realização de ensaio de NO, ensaio de ATP e outros ensaios

[025] A presença e o sustento da energia são os requisitos básicos e as condições por trás de todas as atividades da vida humana. O suprimento adequado de nutrientes e oxigênio através da circulação sanguínea aumentada para os músculos em funcionamento é essencial, especialmente durante a atividade física e o exercício. O óxido nítrico (NO) produzido pelas células endoteliais vasculares é conhecido como um potente vasodilatador, que faz com que os vasos sanguíneos se expandam, fornecendo assim mais oxigênio e nutrientes às células musculares durante os treinos. Assim, os extratos vegetais e compostos com propriedades promotoras de NO podem ajudar a prolongar a resistência durante o exercício e as atividades físicas. Como o NO possui níveis curtos de vida, os níveis de nitrito foram avaliados nos estudos atuais.

[026] A adenosina trifosfato ou ATP é a segunda molécula complexa mais importante no corpo humano após o DNA. A ATP é responsável pelo fornecimento de energia química para numerosas funções celulares, incluindo transporte celular, produção de moléculas biológicas e funcionamento de macromoléculas, que são essenciais para a existência e sobrevivência da célula. Ela fornece energia ao músculo cardíaco (para circulação sanguínea) e músculo esquelético (para as contrações musculares necessárias para o movimento corporal bruto). Nos primeiros 5 ou 6 segundos de ação física intensa, como corrida, a atividade muscular depende da posição da ATP que já está presente nas células musculares. Além desse tempo, a nova ATP é produzida principalmente por meio do processo anaeróbio (glicólise) e do metabolismo aeróbico (respiração celular pela glicólise, ciclo do ácido cítrico e transporte de elétrons/fosforilação oxidante). Em geral, a ATP permite a ativação de contrações musculares necessárias para suportar atividades físicas mais longas e mais vigorosas. Portanto, é essencial aumentar a fonte de energia intracelular ou o conteúdo da ATP durante o exercício de resistência ou por um período mais longo e intenso de atividades físicas.

[027] A proteína é o principal bloco de construção dos músculos, ossos e cartilagem; e é essencial para o crescimento e reparo muscular. Proteínas são sintetizadas nas células através do processo de tradução de mRNA utilizando aminoácidos. Portanto, a estimulação da síntese proteica muscular é um fator importante para o aumento da massa muscular. O mTOR (alvo de rapamicina em mamíferos), uma serina/treonina- proteína quinase, é um regulador central da síntese proteica. O mTOR ativado aumenta a síntese de proteínas pela fosforilação de reguladores chave na transformação do mRNA e da síntese do ribossomo. Além disso, a ativação do mTOR aumenta a produção de fatores de transcrição específicos do músculo, como MyoD e Miogenina. Assim, extratos de plantas ou suplementos dietéticos, que ativam a sinalização mTOR, podem ter o potencial de melhorar o desenvolvimento e a resistência muscular.

[028] As mitocôndrias são o local de produção de energia oxidante nas células e fornecem a maior parte do ATP total necessário para manter a função celular normal e a homeostase. A ATP também desempenha um papel fundamental na função do músculo esquelético como gerador de força para a locomoção. A biogênese mitocondrial é o processo pelo qual novas mitocôndrias são formadas na célula através da proliferação de mitocôndrias pré-existentes. A biogênese mitocondrial é acompanhada não só pelo aumento do número, mas também em tamanho e massa. A biogênese mitocondrial é influenciada por muitos estresses ambientais, incluindo exercícios e outras atividades físicas. O PGC-1α *PPAR (receptor ativado por proliferador de peroxissoma) -y coativador-1α+ é um importante regulador da biogênese mitocondrial.

[029] Além disso, o Citocromo C oxidase 1 (COX1) é uma subunidade chave da Enzima Citocromo c Oxidase (Complexo IV), uma proteína mitocondrial localizada na membrana mitocondrial interna e uma enzima chave na cadeia de transporte de elétrons. A expressão/atividade dessa enzima respiratória é uma abordagem direta para investigar a saúde mitocondrial ou a biogênese mitocondrial. A razão do nível do Complexo IV, ou citocromo e oxidase (COX-1) para o complexo II, ou succinato desidrogenase (SDH-A) determinará a saúde e o número de mitocôndrias ativas presentes na célula. O aumento da razão COX- 1/SDH-A indica, assim, que as mitocôndrias são saudáveis e também é uma medida indireta da biogênese mitocondrial.

[030] Assim, os extratos de plantas que podem induzir a biogênese mitocondrial (proliferação, tamanho e massa) através da ativação de PGC-1α e COX1 podem ter o potencial de aumentar a energia, a resistência e a construção muscular.

[031] A principal função do músculo esquelético é apoiar movimentos corporais voluntários e involuntários. Portanto, uma massa muscular decente é um fator importante para a atividade física prolongada ou para o exercício. O novo tecido muscular é gerado a partir de mioblastos através de um processo chamado miogênese. Os mioblastos são tipos de células progenitoras embrionárias que proliferam e se diferenciam através de um processo de fusão para formar fibras multinucleadas chamadas miotubos. Este processo de diferenciação é regulado por fatores reguladores miogênicos, que incluem MyoD e myogenin. A miogenina é um fator de transcrição específico do músculo envolvido na coordenação do desenvolvimento do músculo esquelético ou miogênese e reparo. A miogenina é necessária para a fusão de células precursoras miogênicas em fibras novas ou previamente existentes durante o processo de diferenciação. MyoD é outro importante fator proteico regulador que desempenha um papel importante na regulação da diferenciação muscular e no desenvolvimento muscular. A ativação da miogênese é boa para o desenvolvimento e a resistência muscular.

[032] Com base nas informações acima, hipotetizamos que os extratos herbais, frações ou suas composições/formulações que podem aumentar a síntese de óxido nítrico nas células endoteliais; aumentar o teor de ATP; ativar a síntese proteica/sinalização mTOR, biogênese mitocondrial e miogênese (formação de miotubos); e ativar a sinalização MyoD e miogenina em células musculares esqueléticas seriam idealmente promissoras para aumentar o nível de energia e resistência, massa muscular em atletas, como fisiculturistas, atletas etc. Portanto, uma triagem completa foi realizada sobre os extratos herbais, fração e suas composições em estudos baseados em células para avaliar sua capacidade de aumentar a síntese de nitrito em células endoteliais e ATP intracelular e proteína em células do músculo esquelético.

[033] Durante o atual estudo de seleção, verificou-se surpreendentemente que os extratos hidroalcoólicos derivados da casca de Mangifera indica (LN16005), caule da Woodfordia fruticosa (LN16008), Acacia nilotica (LN16011) e extrato alcoólico derivado de partes externas da Cassia auriculata (LI17090) aumentaram potencialmente a produção de nitrito em células endoteliais humanas EA.hy926 como resumido na tabela 1 . Estes extratos também aumentaram a produção de ATP nas células do músculo esquelético L6 do rato, conforme resumido na Tabela 5. Os dados de óxido nítrico e ATP obtidos para extratos derivados de outras partes da planta e os derivados usando outros meios de solventes para extração também são resumidos na tabela 1 e 5, respectivamente. O extrato hidroalcoólico de Bauhinia racemosa (LN16002) e alguns outros extratos de solventes das ervas acima também aumentaram os níveis de ATP. De modo semelhante, os mioblastos esqueléticos de músculo de rato L6 expostos aos compostos de teste acima aumentaram a expressão de PGC-1α *PPAR (coativador ativado por proliferador de peroxissomo)-Y coativador-1α+ conforme ilustrado na Figura 1, sugerindo que estes compostos podem regular positivamente a mitocôndria biogênese. Os compostos acima também mostraram eficácia na ativação do complexo IV da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC), como indicado pela superexpressão de Cyt. C Oxidase 1 (COX1) em mioblastos esqueléticos de músculo de rato L6, como representado na Figura 2. O regulador principal que exprime PGC1α e a ativação do complexo IV são conhecidos por contribuir para o aumento da biogênese mitocondrial. Em sintonia com essas observações, os extratos de frutos da Bauhinia racemosa (LN16002), partes externas da Cassia auriculata (LI17090), casca de Mangifera indica (LN16005), caule de Woodfordia fruticosa (LN16008) e fruta de Acacia nilotica (LN16011) apresentaram maior biogênese mitocondrial em mioblastos esqueléticos de ratos. Os dados para expressão de PGC1α e a ativação de COX1 são mostrados nas figuras 1 e 2, respectivamente, e os dados para biogênese mitocondrial são resumidos na tabela 12. No geral, observa-se que os extratos podem fornecer uma fonte de energia celular adicional para maior energia e resistência, além de aumentar a massa muscular, a força muscular, a proteção contra o envelhecimento, a Sarcopenia e a atrofia muscular.

[034] Além disso, cada um dos extratos de frutos de Bauhinia racemosa (LN16002), partes externas de Cassia auriculata (LI17090), caule de Woodfordia fruticosa (LN16008) e frutas de Acacia nilotica (LN16011) ativaram a mTOR por hiperfosforilação e aumentaram a expressão/produção de fatores de transcrição específicos do músculo, tais como MyoD e Myogenin em mioblastos esqueléticos de ratos L6. Isso indica aumento do desenvolvimento da massa muscular via ativação do mecanismo de síntese proteica ribossômica e potencialização de fatores de crescimento miogênicos específicos musculares essenciais. A modulação dos referidos marcadores específicos do músculo pelos extratos anteriores está representada na figura 1. Outros estudos também indicaram que o tratamento de mioblastos esqueléticos de ratos L6 com os extratos de fruto de Bauhinia racemosa (LN16002), partes externas de Cassia auriculata (LN17090), caule de Woodfordia fruticosa (LN16008) e Acacia nilotica (LN16011) aumentam a formação de miotubos através da miogênese aumentada, como mostrado na figura 3. Estes estudos indicam que os referidos extratos têm o potencial de aumentar a massa de tecido muscular e aumentar os níveis de resistência. Potencial de membrana mitocondrial:

[035] As mitocôndrias são a principal fonte de produção de ATP. O gradiente de tensão através da membrana mitocondrial interna, que é chamado potencial de membrana mitocondrial (ΔΦM), é um indicador importante de saúde celular e lesão/morte. Sob as condições do estresse oxidativo, a diferença de potencial de membrana é reduzida a partir de seu nível de estado estacionário, o que é chamado de despolarização mitocondrial. A despolarização mitocondrial resulta em ruptura mitocondrial e subsequente morte celular. A eficácia de alguns dos extratos e composições da presente invenção para inibir a despolarização mitocondrial ou recuperar as células/mitocôndrias do estado despolarizado de volta ao estado polarizado foram avaliadas usando o analisador FACS (Classificação de Células Ativadas por Fluorescência) e a sonda analisadora de fluorescência JC-1 (5,5‘, 6,6‘-tetracloro- 1,1‘, 3,3‘- iodeto de tetraetilbenzimidazolilcarbocianina)] em Citômetro de Fluxo. Por exemplo, extratos hidroalcoólicos derivados da casca de Mangifera indica (LN16005), caule de Woodfordia fruticosa (LN16008) e frutas de Acacia nilotica (LN16011), e extrato alcoólico derivado de partes externas de Cassia Auriculata (LI17090) apresentaram recuperação significativa da despolarização a membrana pelo peróxido de hidrogênio que induziu estresse oxidativo em mioblastos esqueléticos de ratos L6, como resumido na Tabela 14.

Ensaio 20S de proteassoma:

[036] A Via de Proteassoma da Ubiquitina (UPP) é o principal mecanismo para o catabolismo proteico no citosol e no núcleo dos mamíferos. O complexo citosólico 26S proteassoma contendo 20S (proteossoma catabólica) e 19S (proteassoma regulatória) subunidades de proteína que afetam uma ampla variedade de processos celulares e defeitos no sistema pode resultar na patogênese de várias doenças humanas importantes, que incluem degeneração muscular. A proteassoma 20S é um dos importantes caminhos de degradação para a degradação proteica. O extrato de Cassia auriculata (LN17090) apresentou potencial para inibir a via da proteassoma 20S em mioblastos L6 de rato, conforme resumido na Figura 2F, sugerindo seu uso para reduzir a perda de massa muscular através da inibição da via da proteossoma ubiquitina.

[037] Em uma extensão do estudo, os extratos foram convertidos em composições em pó de fluxo livre pela combinação com excipientes, portadores e diluentes. As referidas composições (Composições-6 a 10) também mostram atividades biológicas semelhantes. Da mesma forma, para explorar a viabilidade de obter novas composições com eficácia melhorada pelo menos dois ingredientes selecionados a partir dos extratos ou frações derivadas da fruta da Acacia nilotica, fruta da Bauhinia racemosa, partes externas da Cassia auriculata, casca da Mangifera indica, folhas da Mangifera indica e caule macio da Woodfordia; e algumas outras partes de plantas das mesmas plantas foram combinadas para obter novas composições (Composições-11 a 25 e 33 a 37), que também foram testadas para o aumento do teor de óxido nítrico/nitrito, ATP e síntese de proteínas. Adicionalmente, para obter ainda um produto com atividade melhorada, pelo menos um ingrediente selecionado a partir dos extratos ou frações derivados de plantas acima foram combinados com pelo menos um ingrediente opcional selecionado entre os extratos ou frações derivadas de Sphaeranthus indicus, Rubia cordifolia e Punica granatum em diferentes proporções e as composições assim obtidas (Composições-2 a 5 e Composições-26 a 32) foram testadas para a modulação de óxido nítrico e ATP.

[038] Inesperadamente, estas composições (Composições-2 a 5 e Composições-11 a 37) mostraram melhor eficácia no aumento do óxido nítrico, ATP e síntese proteica, quando comparadas com os seus ingredientes individuais correspondentes sugerindo a tendência dos extratos em mostrarem sinergismo quando combinados com outros ingredientes. Por exemplo, as células musculares esqueléticas L6 de rato tratadas com extrato hidroalcoólico do extrato de Mangifera indica (LN16005) na concentração de 2,5 ng/mL e extrato de Sphaeranthus indicus (LN16015) a 7,5 ng/mL apresentaram aumento de 3,52% e 6,28% nos níveis de ATP respectivamente. As células tratadas com a composição 2 contendo estes dois extratos na proporção de 1:3 mostraram um aumento de 22,2% no nível de ATP a 10 ng/mL, o que é significativamente melhor do que o efeito aditivo (9,78%) derivado para a mesma concentração. Similarmente, as células musculares esqueléticas L6 de rato tratadas com a composição 3 contendo os mesmos ingredientes em 1:2 mostraram um aumento de 60,25% na produção de nitrito em 1 μ concentração de g/mL, quando comparado com o aumento de 5,71% e 4,83% demonstrado pelo extrato hidroalcoólico do extrato de Mangifera indica (LN16005) e extrato de Sphaeranthus indicus (LN16015) a 0,33 μ g/mL e 0,66 μ g/mL, respectivamente. Assim, o aumento observado na produção de nitrito induzida pela composição-3 em 1 μ g/mL a concentração é muito maior (60,25%) em comparação com o efeito aditivo correspondente mostrado pelos ingredientes individuais (10,74%). Os dados para elevação dos níveis de nitrito e ATP para as composições-2 a 5 e os dois ingredientes individuais correspondentes estão resumidos nas tabelas 2 e 6. Os dados sugerem que as composições contendo os extratos derivados de Mangifera indica e Sphaeranthus indicus exibem eficácia sinérgica no aumento dos níveis de ATP e nitrito. Além disso, a dose da composição 3 aumenta de forma dependente a atividade da NADPH oxidase com um valor de IC50 de 216 ng/mL. Também aumenta de forma dependente o teor proteico melhorado em células de mioblastos esqueléticos de ratos L6. A composição 3 aumenta a miogênese (formação de miotubos) através da formação de miotubos em mioblastos mesenquimais C2C12 (Figura 3F), apoiando seu potencial na construção de fibras musculares esqueléticas. Isso ativa a síntese de proteínas através da ativação da sinalização mTOR nas células do músculo esquelético e regulação positiva dos Fatores de Transcrição Musculares Específicos (Myf6, MyoD e Miogenina) nas células musculares esqueléticas L6, conforme a figura 1 (E e F). A Composição-3 melhora ainda mais a função mitocondrial através da biogênese mitocondrial (Tabela 12) e regulando positivamente a proteína enzimática chave, Cyt C oxidase-1 (COX1), da via de Fosforilação Oxidante mitocondrial (OX-PHOS) como resumido na figura 2F. Além disso, a composição 3 exibiu potencial para inibir a via do proteassoma 20S em mioblastos L6 de rato, conforme resumido na Figura 2F, sugerindo o seu potencial para proteger a perda de massa muscular. É importante ressaltar que a composição 3 também mostrou recuperação significativa da despolarização causada à membrana pelo estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio nos mioblastos esqueléticos de ratos L6, conforme resumido na tabela 14.

[039] Os dados para a eficácia sinérgica de outras composições (Composição-11 a Composição-25) para elevar os níveis de nitrito estão resumidos nas tabelas 3 e 4; e a eficácia sinérgica para aumentar os níveis de ATP está resumida nas tabelas 7 a 11. Similarmente, a eficácia sinérgica das composições 26 a 31 para aumentar a biogênese mitocondrial está resumida nas tabelas 12, 13 e 13A.

[040] A eficácia dos extratos derivados de frutos de Bauhinia racemosa, casca de Mangifera indica, frutas de Woodfordia fruticosa e Acacia nilotica ou suas composições para aumentar a energia e resistência foi avaliada em um estudo com animais. Para ilustração, ratos suíços albinos foram tratados oralmente com veículo ou 200 mg de LN16011 ou a composição-1 [contendo 80% de extrato metanólico de casca de Mangifera indica (LN16014) e extrato de Sphaeranthus indicus (LN16015)] por 21 dias. No dia 21, uma hora após o tratamento, os ratos foram submetidos ao teste de natação forçada e a atividade monitorada pelo sistema de rastreamento de vídeo SMART (Panlab SLU). Os animais tratados com o extrato LN16011 ou composição 1 apresentaram tempo de repouso reduzido e tempo de movimento lento, tempo de movimento rápido, tempo total de movimento, comprimento do percurso de natação e velocidade média em comparação com os animais tratados de controle, conforme resumido na tabela 15.

[041] Do mesmo modo, após 21 dias de tratamento, a força de aderência dos ratos foi medida usando o medidor de força de aderência (UgoBasile, Itália). Os animais suplementados com as composições LN16011 e composição-1 apresentaram resistência melhorada em comparação com os animais tratados com o controle, como resumido na Tabela 16.

[042] Numa experiência semelhante, a eficácia da composição-33 a 37 contendo dois ingredientes selecionados dos extratos das partes da planta de Mangifera indica, Acacia nilotica e Cassia auriculata foram avaliados para aumentar a energia e a resistência num modelo semelhante. A suplementação oral destes produtos teste ou referência por 21 dias mostrou clara melhora nos parâmetros de natação e força de aderência em ratos. Suplementação da Composição-33, Composição-34, Composição- 35, Composição-36, Composição-37 e L-carnitina resultou em aumento notável na distância de natação, aumento notável no tempo de natação e diminuição clara no tempo de descanso. Além disso, os ratos suplementados com Composição-33, Composição-34, Composição-36, Composição-37 e L-carnitina também mostraram aumento estatisticamente significativo (P <0,05) na força de aderência sobre o grupo de controle do veículo. A composição 35 também mostrou melhora significativa na força de aderência. Os resultados são resumidos nas tabelas 17 e 18. Estes dados suportam o potencial das novas composições da presente invenção para aumentar a energia e a força muscular.

[043] Estudou-se a eficácia do extrato etanólico de parte aérea de Cassia auriculata (LN17090) e Acacia nilotica (LN16011) na melhoria da força de aderência, resistência muscular e diâmetro da fibra muscular no modelo de Sarcopenia induzido por Dexametasona de ratos Sprague Dawly (SD). Os animais do Grupo Sarcopenia suplementado com dexametasona (G2) apresentaram redução significativa na força de aderência, resistência muscular e diâmetro da fibra muscular quando comparados àqueles do grupo de controle normal (G1), como mostrado na Figura 4A para DIV, sugerindo o sucesso da indução da Sarcopenia. Os grupos de tratamento suplementados com 200 mg de LN17090 (G3) e 400 mg de LN17090 (G4) mostraram melhora dependente da dose e estatisticamente significativa na força de preensão em comparação com o grupo de controle da doença (G2). Animais suplementados com LN16011 (G5) e HMB (G6) também mostraram melhora significativa na força de aderência como resumido na Figura 4. Da mesma forma, ratos suplementados com LN17090 (G3 e G4) mostraram melhora significativa na resistência muscular em relação ao grupo de controle da doença (G2). Melhora clara na resistência muscular também foi observada em ratos suplementados com LN16011 (G5). Finalmente, quando comparado ao grupo de controle de doença (G2), ratos suplementados com LN17090 (G3 e G4) apresentaram melhora dependente da dose e estatisticamente significativa tanto no diâmetro do gastrocnêmio quanto no diâmetro da fibra do músculo sóleo. Animais suplementados com LN16011 e HMB (G4 e G5) também apresentaram melhora significativa no diâmetro da fibra muscular. Os dados estão resumidos na Figura 4. No geral, os dados sugerem que os extratos de folhas da Cassia auriculata (LN17090) e da Acacia nilotica (LN16011) podem fornecer suplementos eficazes para o tratamento da Sarcopenia.

[044] O precedente demonstra que extratos ou frações derivadas de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa e suas composições podem ser potentes suplementos naturais para fornecer um início, de manutenção constante de energia, aumentando os níveis de energia, crescimento muscular, força de músculo, resistência física e alerta mental, tratamento de sarcopenia e atrofia muscular em humanos e animais.

[045] Consequentemente, numa forma de realização preferida, a presente invenção divulga extratos e frações derivadas de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangiferaindica e Woodfordia fruticosa, quer isoladamente ou com as suas composições úteis para aumentar os níveis de energia, resistência, massa muscular, força muscular e estado mental para o tratamento eficaz da Sarcopenia e atrofia muscular.

[046] Noutra forma de realização, a invenção divulga extratos e frações derivadas de Accia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangiferaindica e Woodfordia fruticosa e suas composições para o início e manutenção constante de energia, força muscular e alerta mental, em que os extratos ou frações e as seus composições são úteis para aumentar a força muscular, atividade física, aptidão física, alerta mental, níveis de energia, níveis de resistência, saúde circulatória, saúde dos vasos sanguíneos ou para obtenção de melhor saúde física e mental em um mamífero.

[047] Noutra concretização, a invenção divulga composições compreendendo extratos e frações derivadas de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa em combinação com pelo menos um ingrediente biologicamente ativo selecionado de extratos de plantas, frações ou fitoquímicos puros, minerais, vitaminas como um intensificador de energia natural para proporcionar um início e uma manutenção constante de energia, força muscular e alerta mental num animal de sangue quente ou mamífero que o necessite.

[048] Em outra modalidade, a invenção divulga composições compreendendo extratos e frações derivadas de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa em combinação com pelo menos um ingrediente biologicamente ativo selecionado a partir de extratos, fração ou fitoquímicos puros, derivados de pelo menos uma espécie de planta selecionada: Sphaeranthus indicus, Rubia cordifolia, Punica granatum, Coleus aromaticus, Cissus quadrangularis, Curcuma longa, Garcinia mangostana, Citrulus lanatus, Oscimun sanctum, Cinnamomum tamala, Ocimum basilicum , Zingiber officinalis, Tribulus terrestris, Trachyspermum ammi, Mentha arvensis e Foeniculumvulgare para aumentar os níveis de energia, resistência, massa muscular, alerta mental da força muscular e para o tratamento de sarcopenia e atrofia muscular.

[049] Noutra concretização, a invenção divulga composições compreendendo extratos e frações derivadas de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa em combinação com pelo menos um ingrediente biologicamente ativo, selecionado dos extratos, fração ou fitoquímicos puros, derivados de pelo menos uma parte da planta de Sphaeranthus indicus para aumentar os níveis de energia, resistência, massa muscular, força muscular e agilidade mental.

[050] Ainda noutra forma de realização, a invenção divulga composições compreendendo extratos e frações derivadas de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa em combinação com pelo menos um ingrediente selecionado de excipientes, transportadores, diluentes, edulcorantes, aromatizantes corantes, vitaminas, proteínas ou aminoácidos, como um intensificador de energia natural para melhorar o desempenho físico ou mental, início e manutenção constante de atividade física, aptidão física, alerta mental, níveis de energia, níveis de resistência, saúde circulatória, saúde dos vasos sanguíneos ou para melhor mental saúde em um mamífero.

[051] Em outra modalidade, a invenção divulga extratos e frações derivadas de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa ou suas composições para melhorar o desempenho físico, que incluem maior resistência e melhor velocidade, força, potência, resistência, flexibilidade, agilidade, equilíbrio, coordenação de foco, tempo de reação, recuperação de fadiga e também aumento da resistência sexual. Exemplos de melhoria do desempenho mental incluem melhora da nitidez, atenção, alerta mental, funções cognitivas, elevação do humor e recuperação ou redução da fadiga mental (por exemplo, após um exercício físico de alta intensidade) para tratamento de perda de massa muscular (Sarcopenia) e disfunção mitocondrial.

[052] Noutra forma de realização, as composições inventivas incluem suplementos dietéticos, formulações de ingredientes alimentares, tais como bebidas, lanches e bebidas energéticas contendo o(s) referido(s) ingrediente(s) acima ou sua(s) composição(ões) para aumento, para resistência muscular, atividade física, condição física, níveis de energia, níveis de resistência, saúde circulatória, saúde dos vasos sanguíneos ou para melhor saúde mental em animais de sangue quente que necessitem.

[053] Noutra forma de realização, a invenção proporciona um modo para aumentar a energia natural para proporcionar um início e manutenção constante de energia, alerta mental, força muscular e aumento da massa muscular num mamífero, em que o modo compreende suplementar ou tratar o referido mamífero com pelo menos um ingrediente selecionado a partir dos extratos e frações derivadas de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa ou suas composições.

[054] Ainda noutra concretização, a invenção proporciona composições compreendendo pelo menos dois ingredientes selecionados dos extratos de erva ou frações derivadas de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangiferaindica e Woodfordia fruticosa como intensificadores naturais de energia, massa muscular, potência muscular e desempenho físico em animais de sangue quente que precisam disso.

[055] Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona composições compreendendo os referidos ingredientes biologicamente ativos, como descrito de acordo com a presente invenção, em combinação com um ou mais componentes selecionados de extrato(s), fraco(s), composto(s) ativo(s), fitoquímico(s).; pó(s) derivado(s) da(s) planta(s), animal(is) ou microorganismos com benefícios terapêuticos comprovados para a saúde; agentes farmacêuticos ou dieteticamente aceitáveis, ingredientes ativos, vitaminas, aminoácidos ou minerais.

[056] Numa outra forma de realização exemplificativa, a composição da presente invenção pode ainda conter opcionalmente um ou mais dos componentes não limitantes tais como vitaminas selecionadas de vitaminas B, incluindo tiamina, riboflavina, niacina, ácido pantotênico, piridoxina, biotina, cianocobalamina, colina e/ou ácido fólico, incluindo as formas reduzidas de ácido fólico, tais como, mas não limitadas a, ácido folínico, folinato de cálcio e metiltetrahidrofolato. As vitaminas do complexo B também são vitaminas solúveis em água que auxiliam na decomposição dos carboidratos em glicose para fornecer energia ao corpo, a quebra de gorduras e proteínas para ajudar o funcionamento normal do sistema nervoso e o tônus muscular no estômago e no trato intestinal. Formas particulares de vitaminas B na composição podem incluir pantotenato de d-Cálcio, niacinamida, cloridrato de piridoxina e mononitrato de tiamina; ou aminoácidos.

[057] Noutra forma de realização, os referidos extratos ou frações herbicidas ou as suas composições podem ser tomadas, por exemplo, por atletas de desempenho, engajados em desportos de resistência e multidisciplinares, idosos e doentes para aumentar o estado de alerta mental, níveis de resistência, força muscular, aptidão física e para manter o início e manutenção constante de energia, força muscular. Os presentes ingredientes e composições podem ser formulados como um “suplemento de aptidão” ou “bebida de aptidão" que pode ser tomado com café da manhã ou na forma de um concentrado do qual tal bebida pode ser usada regularmente.

[058] A composição em que a concentração dos ingredientes derivados da Acacia nilotica, da Bauhinia racemosa, da Cassia auriculata, da Mangifera indica e da Woodfordia fruticosa na composição, individualmente ou em conjunto, varia entre 0,01% e 99,99%.

[059] Noutra forma de realização, a invenção proporciona um modo para melhorar os biomarcadores selecionados de ATP, Óxido nítrico, eNOS, mTOR, MyoD e miogenina e método para melhorar os processos biológicos selecionados da biogênese mitocondrial, miogênese, proliferação de células musculares em que o método compreende administrar a um sujeito ou mamífero ou animal de sangue quente uma quantidade terapeuticamente eficaz dos extratos e frações derivados de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cássia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa ou as suas composições que contêm opcionalmente pelo menos um ingrediente biologicamente ativo selecionado a partir dos extratos ou frações vegetais.

[060] Noutra forma de realização da invenção, os vários solventes adequados que podem ser utilizados para preparar os extratos e frações, extrair ou fracionar as ervas Acica nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa incluem, mas não se limitam a álcoois C1-C5, como etanol, metanol; água e misturas dos mesmos; Hidrocarbonetos C1-C7, tais como hexano; esteres como acetato de etilo e similares e suas misturas.

[061] Noutra forma de realização da invenção, as partes da planta para preparar os extratos podem ser selecionadas de folhas, caules, caules moles, partes aéreas, frutos, casca de frutos, sementes, cabeças de flores, raízes, casca ou plantas inteiras ou suas misturas.

[062] Noutra forma de realização, os extratos ou frações ou composição(ões) da presente invenção podem ser formuladas de forma seca, líquida, produto alimentício, Suplemento dietético ou qualquer forma adequada tal como comprimido, uma cápsula ou uma mastigação macia.

[063] Noutra forma de realização, os extratos ou frações ou composição(ões) podem ser entregues na forma de comprimidos de libertação controlada, utilizando revestimentos base de polímero de libertação controlada pelas técnicas incluindo nanotecnologia, microencapsulação, sistemas transportadores coloidais e outros sistemas de distribuição de fármacos.

[064] Noutra forma de realização, a invenção fornece os extratos ou frações ou composição(ões) como suplementos nutricionais/dietéticos que podem ser contemplados/feitos na forma de dosagem de alimentos saudáveis, ou alimentos para usos específicos de saúde, como alimentos sólidos como barras de chocolate ou nutricionais, alimentos semissólidos como creme ou geleia, ou gel e também bebidas e afins, tais como bebidas refrescantes, bebida de bactérias do ácido láctico, gota, doces, gomas de mascar, doces gomosos, iogurte, sorvete, pudim, geleia de feijão adzuki mole, geleia, biscoito, chá, refrigerante, suco, leite, café, cereais, lanchonete e similares.

[065] Noutra forma de realização, os extratos ou frações ou composição(ões) desta invenção são úteis no tratamento de deficiências mitocondriais em humanos e animais. Ele também pode ser usado para melhorar ou manter o desempenho físico ou mental, reduzindo a infecção em atletas fisicamente estressados ou não- atletas que fazem exercícios físicos intensos.

[066] Noutra forma de realização exemplificativa, os extratos e frações inventivos derivados de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa ou suas composições podem adicionalmente ser combinados opcionalmente com um ou mais excipientes, veículos e diluentes farmacêuticos ou dieteticamente aceitáveis, que incluem mas não limitado a glicose, frutose, sacarose, maltose, dextrina amarela, dextrina branca, aerosil, celulose microcristalina, estearato de cálcio, estearato de magnésio, sorbitol, esteviosídeo, xarope de milho, lactose, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido succínico, ácido láctico, ácido L- ascórbico, dl-alfa-tocoferol, glicerina, propilenoglicol, éster gordo de glicerina, éster gordo de poliglicerina, éster gordo de sacarose, éster gordo de sorbitano, éster gordo de propilenoglicol, acácia, carragenina, caseína, gelatina, pectina, agar, grupo da vitamina B, nicotinamida, pantotenato de cálcio, aminoácidos, proteínas, sais de cálcio, pigmentos, temperos, conservantes, água, solução salina, solução aquosa de glucose, álcool, propilenoglicol e polietilenoglicol, vários óleos animais e vegetais, parafina mole branca, parafina, aromatizantes, corantes e cera.

[067] Noutra forma de realização, a invenção apresenta um modo de melhorar o desempenho físico ou mental, manutenção constante de energia, resistência física, massa muscular, força muscular e alerta mental em humanos e animais, em que o modo compreende administrar a um indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de um extrato e fração derivada de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Cassia auriculata, Mangifera indica e Woodfordia fruticosa ou suas composições, em que exemplos de melhor desempenho físico incluem maior resistência e melhor velocidade, força, potência, resistência, flexibilidade, agilidade, equilíbrio, coordenação de foco, tempo de reação, recuperação de fadiga e aumento da resistência sexual. Exemplos de melhor desempenho mental incluem melhor nitidez, atenção, alerta mental, funções cognitivas, elevação do humor e recuperação ou redução da fadiga mental (por exemplo, após um exercício físico de alta intensidade).

[068] Os peritos na arte apreciarão que podem ser feitas alterações às formas de realização descritas acima sem se afastarem do conceito inventivo geral da mesma. Entende-se, portanto, que esta invenção não está limitada às formas de realização ou exemplos particulares divulgados, mas destina-se a abranger modificações dentro dos objetivos e âmbito da presente invenção, tal como definido na especificação. Os exemplos apresentados ilustram a invenção, mas não devem ser considerados para limitar o âmbito da invenção de qualquer forma.

EXEMPLOS: Exemplo 1:

[069] Preparação de extratos aquosos de matérias-primas secas de frutos de Bauhinia racemosa, partes externas de Cassia auriculata, casca de caule de Mangifera indica, caule de Woodfordia fruticosa e frutas de Acacia nilotica:

[070] As matérias-primas de 100g de frutos de Bauhinia racemosa, caule de Mangifera indica, caule de Woodfordia fruticosa e Acacia nilotica foram pulverizadas e os pós extraídos individualmente com água (600 mL) por percolação contínua à temperatura ambiente por 1,5 h em soxhlet. O extrato foi removido do soxhlet e a matéria prima usada foi novamente extraída duas vezes com água (2 x 300 mL) sob condições semelhantes. O extrato combinado de cada matéria-prima foi filtrado e concentrado em evaporador rotativo e o concentrado foi submetido à secagem final em secador por congelamento para obtenção dos extratos aquosos de frutos de Bauhinia racemosa (LN16001; 5,15g), partes aéreas de Cassia auriculata (LN17088; 10,5g), casca de caule Mangiferaindica (LN16004; 9,9g), caule de Woodfordiafruticosa (LN16007; 3,85g) e frutos de Acacia nilotica (LN16010; 38,6g).

Exemplo 2:

[071] Preparação de hidroalcool (etanol aquoso) extratos de matérias-primas secas de frutas da Bauhinia racemosa, partes externas da Cassia auriculata, casca do caula da Mangifera indica, folhas Mangifera indica, partes da Woodfordia Fruticosa e frutas da acácia nilotica:

[072] As matérias-primas de 100 g de frutos de Bauhinia racemosa, partes aéreas de Cassia auriculata, casca de caule de Mangiferaindica, Mangifera indica, caule de Woodfordia fruticosa e Acacia nilotica foram pulverizadas e os pós extraídos individualmente com etanol a 50% (600 mL) percolação à temperatura ambiente por 1,5 h em aparelho soxhlet. O extrato foi removido de soxhlet e a matéria prima usada foi novamente extraída duas vezes com etanol a 50% (2 x 300 mL) sob condições semelhantes. O extrato combinado de cada matéria-prima foi filtrado e concentrado em um evaporador rotativo e o concentrado foi submetido à secagem final em secador por congelamento para obtenção dos extratos hidroalcoólicos de frutos de Bauhinia racemosa (LN16002; 6,70 g), partes externas de Cassia auriculata (LN17089; 11,6 g), casca do caule de Mangifera indica (LN16005; 17,3 g), folhas de Mangifera indica (LN17093; 14,9 g), caules de Woodfordia fruticosa (LN16008; 6,0 g) e Acacia nilotica (LN16011; 44,0 g).

Exemplo 3:

[073] Preparação de extratos etanólicos de matérias-primas secas de frutos de Bauhinia racemosa, partes externas de Cassia auriculata, casca de caule de Mangifera indica, caule de Woodfordia fruticosa e frutos de Acacia nilotica:

[074] As matérias-primas de 100 g de frutos de Bauhinia racemosa, partes aéreas de Cassia auriculata, casca de caule de Mangifera indica, caule de Woodfordia fruticosa e Acacia nilotica foram pulverizadas e os pós extraídos individualmente com etanol (600 mL) por percolação contínua à temperatura ambiente 1,5 h em aparelho soxhlet. O extrato foi removido de soxhlet e a matéria-prima usada foi novamente extraída duas vezes com etanol (2 x 300 mL) sob condições semelhantes. O extrato combinado de cada matéria-prima foi filtrado e concentrado em evaporador rotativo para obter os extratos etanólicos de frutos de Bauhinia racemosa (LN16003; 2,67 g), partes externas de Cassia auriculata (LN17090; 8,4 g), casca do caule de Mangifera indica (LN16006; 9,55 g), caules de Woodfordia fruticosa (LN16009; 6,3 g) e frutos de Acacia nilotica (LN16012; 24,9 g).

Exemplo 4: Preparação do extrato metanólico a 80% da casca de Mangifera indica:

[075] A Casca de Mangifera indica (100 g) foi pulverizada e o pó foi carregado em um extrator de laboratório e extraído com 80% de metanol (500 mL) à temperatura de refluxo por 2 h. O extrato foi filtrado e a matéria prima usada foi novamente extraída duas vezes com 80% de metanol (2 x 400 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado com precisão e concentrado sob vácuo para se obter um resíduo (LN16014; 12,5 g).

Preparação de 80% de extrato metanólico da folha de Mangifera indica:

[076] Folha de Mangifera indica (100 g) foi pulverizada e o pó foi carregado em um extrator de laboratório e extraído com 80% de metanol (500 mL) à temperatura de refluxo por 2 h. O extrato foi filtrado e a matéria prima usada foi novamente extraída duas vezes com 80% de metanol (2 x 400 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado com precisão e concentrado sob vácuo para se obter um resíduo (LN17091); 12,5 g).

[077] Preparação de 80% de extrato metanólico (LN17094) da fruta Acacia nilotica: O extrato de metanol a 80% da fruta Acacia nilotica foi preparado usando o mesmo procedimento descrito acima.

[078] d) Preparação dos extratos representativos de outras partes de plantas e outros meios de extração de solventes: O extrato hidroalcoólico da Acacia nilotica (LN17095), Acacia nilotica (LN17096), Acacia nilotica (LN17097), Bahuinia racemosa (LN17109), Extrato hidroalcoólico de Bauhinia racemosa (LN17098), extrato aquoso foliar de Cassia auriculata (LN17099), extrato hidroalcoólico foliar de Cassia auriculata (LN17100), extrato de acetona de folha Cassia auriculata (LN17101), extrato etanólico de caule Cassia auriculata (LN17106), extrato etanólico de folha de Woodfordia fruticosa (LN17102), extrato de acetona foliar de Woodfordia fruticosa (LN17103), Extrato hidroalcoólico de folha de Mangifera indica (LN17093), extrato de metanol de folha de Mangifera indica (LN17094), extrato de acetona de casca de Mangifera indica (LN17095) foram preparados usando os procedimentos de extração descritos acima.

Exemplo 5: Preparação de metanol, álcool aquoso (60% metanol) e extratos aquosos de casca de frutas secas Punica granatum:

[079] A casca da fruta Punica granatum (100 g) foi pulverizada e o pó foi carregado em um extrator de laboratório e extraído com metanol (400 mL) a 80 oC. Temperatura oC por 2 h. O extrato foi filtrado e a matéria prima usada foi novamente extraída duas vezes com metanol (2 x 300 mL) sob condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado com precisão e concentrado sob vácuo para obter um resíduo de extrato metanólico (LN16048; 25,6 g). O extrato aquoso de metanol (LN16047) e o extrato aquoso (LN16046; 28,6 g) foram obtidos por meio de procedimento similar, utilizando 60% de metanol e água como solventes de extração, respectivamente.

Exemplo 6

[080] Extrato aquoso de Rubia cordifolia: Raízes secas da Rubia cordifolia, (100 g) foram pulverizadas até o pó grosso, extraídas com 500 mL de água a 70-80 °C durante 1 h. O processo de extração foi repetido duas vezes usando 300 mL de água. Todos os extratos foram combinados, o extrato aquoso combinado foi finamente filtrado, e o extrato transparente foi evaporado até à secura num evaporador de filme ascendente a 50-60 °C para se obter um resíduo (10 g)

Exemplo 7 Preparação do extrato da Sphaeranthus indicus.

[081] As cabeças de flor da Sphaeranthus indicus (100 g) de matéria prima (RM) foram pulverizadas e o pó foi extraído com etanol (700 mL) à temperatura ambiente utilizando técnicas de percolação. O processo de extração foi repetido mais duas vezes com 500 ml de etanol de cada vez. Os extratos foram combinados, o extrato combinado foi filtrado e concentrado a 45-50°C sob vácuo. O resíduo foi repartido entre água e acetato de etilo e as camadas foram concentradas separadamente para obter a fração de acetato de etilo e a fração de água. A fração de acetato de etila e a fração aquosa assim obtidas foram combinadas na relação 3:1 para obtenção do extrato de Sphaeranthus indicus (LN16015). No entanto, qualquer extrato de solvente orgânico/fração ou mistura contendo os extratos/frações em qualquer outra razão também pode ser utilizado.

[082] Os procedimentos de extração acima são apenas para fins ilustrativos. Outras partes da planta também podem ser extraídas usando procedimentos semelhantes. As técnicas de extração e outros solventes de extração também podem ser usados. Os parâmetros de extração, tais como temperatura, pressão e razões de solventes também podem ser variados.

Exemplo 8:

[083] Preparação de composições selecionadas compreendendo extratos de Acacia nilotica, Bauhinia racemosa, Mangifera indica, Woodfordia fruticosa e Sphaeranthus indicus.

[084] Composição-1: A composição 1 foi preparada combinando 22 g de extrato alcoólico a 80% de Mangifera indica (LN16014) e 44 g de extrato de Sphaeranthus indicus (LN16015), 28 g de pó de celulose microcristalina (MCCP) e 2 g de Syloid.

[085] Composição-2: A composição-3 foi preparada pela combinação do extrato hidroalcoólico da Mangifera indica (LN16005) e extrato de Sphaeranthus indicus (LN16015) na proporção de 1:3.

[086] Composição-3: A composição 2 foi preparada combinando o extrato hidroalcoólico da casca da Mangifera indica (LN16005) e o extrato de cabeça de flor da Sphaeranthus indicus (LN16015) na proporção de 1: 2.

[087] Composição-4: A composição-4 foi preparada pela combinação do extrato hidroalcoólico de Mangifera indica (LN16005) e extrato de Sphaeranthus indicus (LN16015) na proporção de 1:1.

[088] Composição-5: A composição-5 foi preparada pela combinação do extrato hidroalcoólico da Mangifera indica (LN16005) e extrato de Sphaeranthus indicus (LN16015) na proporção de 2:1.

[089] Composição-6: A composição-6 foi preparada combinando o extrato hidroalcoólico da casca de Mangifera indica (LN16005) e o pó de celulose microcristalina numa proporção de 3:1.

[090] Composição-7: A composição 7 foi preparada combinando o extrato de metanol a 80% das folhas de Mangifera indica (LN17091) e o pó de celulose microcristalina numa proporção de 3:1.

[091] Composição-8: A composição-8 foi preparada combinando o extrato hidroalcoólico da fruta Acacia nilotica (LI16011) e o pó de celulose microcristalina numa proporção de 3:1.

[092] Composição-9: A composição 9 foi preparada combinando o extrato hidroalcoólico do caule macio de Woodfordia fruticosa (LI16008) e o pó de celulose microcristalina na proporção de 3:1.

[093] Composição-10: A composição-10 foi preparada combinando o extrato alcoólico de Cassia auriculata (LN17090) e pó de celulose microcristalina numa proporção de 3:1.

[094] Composições-11, 12 e 13 contendo extrato hidroalcoólico de casca de Mangifera indica (LN16005) e extrato hidroalcoólico de frutos de Acacia nilotica (LI16011). As Composições-11, 12 e 13 foram preparadas combinando o extrato hidroalcoólico de Mangifera indica (LN16005) e extrato hidroalcoólico de Acacia nilotica (LI16011) nas proporções 1:2, 1:1 e 2:1, respectivamente.

[095] Composições-14, 15 e 16 contendo 80% de extrato metanólico de folhas de Mangifera indica (LN17091) e extrato hidroalcoólico da fruta de Acacia nilotica (LI16011). As composições-14, 15 e 16 foram preparadas combinando-se o extrato metanólico a 80% das folhas de Mangifera indica (LN17091) e o extrato hidroalcoólico da Acacia nilotica (LI16011) nas proporções 1:2, 1:1 e 2:1, respectivamente.

[096] Composições-17, 18 e 19 contendo extrato hidroalcoólico de casca de Mangifera indica (LN16005) e extrato alcoólico de Cassia auriculata (LN17090). As composições-17, 18 e 19 foram preparadas pela combinação do extrato hidroalcoólico de Mangifera indica (LN16005) e extrato alcoólico de Cassia auriculata (LN17090) nas proporções 1:2, 1:1 e 2:1, respectivamente.

[097] Composições-20, 21 e 22 contendo 80% de extrato metanólico de folhas de Mangifera indica (LN17091) e extrato alcoólico de Cassia auriculata (LN17090). As Composições-20, 21 e 22 foram preparadas pela combinação do extrato metanólico a 80% das folhas de Mangifera indica (LN17091) e extrato alcoólico de Cassia auriculata (LN17090) nas proporções 2:1, 1:1 e 1:2, respectivamente.

[098] Composições-23, 24 e 25 contendo extrato alcoólico de Cassia auriculata (LN17090) e extrato hidroalcoólico de fruta de Acacia nilotica (LI16011). As composições-23, 24 e 25 foram preparadas combinando o extrato alcoólico da Cassia auriculata (LN17090) e extrato hidroalcooleiro da fruta da Acacia nilotica (LI16011) nas proporções 2:1, 1:1 e 1:2, respectivamente.

[099] Composições-26, 27, 28 e 29 contendo extrato alcoólico de Cassia auriculata (LN17090) e extrato metanólico de fruta de Punica granatum (LN16048). As composições-26, 27, 28 e 29 foram preparadas pela combinação do extrato alcoólico de Cassia auriculata (LN17090) e extrato metanólico do fruto de Punica granatum (LN16048) nas proporções 2:1, 1:1, 1:2 e 1:3 respectivamente.

[100] Composições-30, 31 e 32 contendo extrato alcoólico de Cassia auriculata (LN17090) e extrato aquoso da raiz de Rubia cordifolia (LN17092). As composições-30, 31 e 32 foram preparadas pela combinação do extrato alcoólico de Cassia auriculata (LN17090) e extrato aquoso da raiz de Rubia cordifolia (LN17092) nas proporções de 3:1, 1:1 e 1:2, respectivamente.

[101] Composições-33: A composição 33 foi preparada combinando o extrato metanólico a 80% da casca de Mangifera indica (LN16014) e o extrato hidroalcoólico de Acacia nilotica (LN16011) na proporção de 1:1.

[102] Composições-34: A Composição-34 foi preparada combinando o extrato etanólico a 50% das folhas de Mangifera indica (LN17093) e o extrato metanólico a 80% de Acacia nilotica (LN17094) na proporção de 1:1.

[103] Composições-35: A Composição-35 foi preparada combinando o extrato etanólico a 50% das folhas de Mangifera indica (LN17093) e o extrato etanólico a 50% de Cassia auriculata (LN17089) na proporção de 1:2.

[104] Composições-36: A composição 36 foi preparada combinando o extrato de metanol a 80% da casca de Mangifera indica (LN16014) e o extrato etanólico a 50% de Cassia auriculata (LN17089) na proporção de 1:2.

[105] Composição-37: As composições-37 foram preparadas combinando o extrato hidroalcoólico de Cassia auriculata (LN17089) e o extrato hidroalcoólico da fruta Acacia nilotica (LI16011) na proporção de 1:1.

Exemplo 9

[106] Avaliação de extratos de frutos de Bauhinia racemosa (LN16002), casca de caule de Mangifera indica (LN16005 e LN16014), caule de Woodfordia fruticosa (LN16008), Acacia nilotica (LN16011 e LN16012) e Sphaeranthusindicus (LN16015) para indução de Nitrito: Para avaliar se a amostra de teste pode induzir a geração de óxido nítrico em células endoteliais humanas, testamos a concentração de nitrito nos sobrenadantes das culturas celulares de células endoteliais humanas EA.hy926 (ATCC, Manassas, VA). Resumidamente, o número igual de células endoteliais humanas EA.hy926 (1,5 x 105) foi plaqueado em placa de cultura de 35 mm. Após fixação das células, as placas de cultura foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e as células lavadas foram tratadas com diferentes concentrações das amostras de teste LN16002, LN16005, LN16008, LN16011, 16012, LN16014 e LN16015 durante 4h. As culturas de controle do veículo receberam 0,2% de DMSO. Recolheram-se os sobrenadantes das culturas isentas de células e estimou-se o teor em nitrito utilizando o teste Griess. Misturaram-se cinquenta microlitros de sobrenadantes de cultura com igual volume de reagente de Griess (uma mistura contendo 1:1 de diaminedidrocloreto de naftileno a 0,2% e 2% de sulfanilamida em ácido fosfórico a 5%) em cada poço de uma placa de microtitulação e incubou-se durante 10 min em temperatura ambiente. O desenvolvimento de cor foi medido a 550 nm num leitor de microplacas (Spectra MaxM5, Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA). Curvas padrão foram construídas com concentrações conhecidas de nitrito de sódio. O aumento percentual na concentração de nitrito foi calculado e os dados são resumidos na tabela 1. Os dados de nitrito obtidos para extratos derivados de outras partes de plantas e os derivados usando outros meios solventes para extração são também resumidos na tabela-1, respectivamente.Tabela 1

Exemplo 10

[107] Avaliação das Composições-2 a 32 para indução de Nitrito em Células endoteliais humanas de EA.hy926: O estudo foi realizado usando o procedimento descrito acima no Exemplo 9. O aumento percentual na concentração de nitrito para diferentes composições foi calculado e os dados estão resumidos nas tabelas 2 a 4. Tabela - 2 Ensaio de Nitrito (1μ/ml)

Tabela 3 Ensaio de nitrito (5 μg/ml)

Tabela 4 Ensaio de Nitrito (2,5 μg/ml)

Exemplo 11

[108] Ensaio ATP: Avaliação da eficácia de potencialização do ATP dos extratos hidroalcoólicos de frutos da Bauhinia racemosa (LN16002), Mangifera indica (LN16005 e LN16014), caule da Woodfordia fruticosa (LN16008), Acácia nilotica (LN16011) e cabeça de flor da Sphaeranthus indicus (LN16015).

[109] O nível de ATP intracelular foi medido por luminescência baseado no sistema de ensaio de detecção de ATP, ATPlite (PerkinElmer Inc., Waltham, MA). Resumidamente, células de músculo esquelético de rato L6 foram cultivadas em uma placa de 96 poços em RPMI, suplementado com 10% de FBS e 50 μg/ml de penicilina- estreptomicina a 37 °C com 5% de CO2. Após 16 h, o meio foi substituído por meio fresco contendo independentemente diferentes concentrações das amostras de teste LN16002, LN16005, LN16008, LN16011, 16012, LN16014

[110] e LN16015 e incubado durante 4 horas. As culturas de controle do veículo receberam apenas 0,2% de DMSO (V/V). Finalmente, adicionou-se 50 de solução de substrato a cada poço e incubou-se a temperatura ambiente durante 5 min num agitador de placas. Após 10 minutos de adaptação ao escuro, a luminescência foi lida num luminímetro (Modulus Multimode Reader, Turner Biosystems Inc., Sunnyvale, CA). A diluição em série de uma solução padrão de ATP que varia de 1x10-5 M para branco foi aplicada à placa de ensaio. O nível de ATP intracelular foi estimado quantitativamente a partir de uma curva padrão traçada com unidades de luminescência vs. concentrações conhecidas de ATP. O índice de ATP celular nas culturas tratadas foi calculado comparando o teor de ATP nas amostras tratadas com o teor de ATP nas culturas de controle de veículo. O conteúdo de ATP nas culturas de controle de veículos foi considerado como 100%. Todas as concentrações de tratamento para cada amostra foram tratadas em poços quadruplicados. Os extratos hidroalcoólicos de frutos da Bauhinia racemosa (LN16002), casca de caule da Mangifera indica (LN16005), caule da Woodfordia fruticosa (LN16008) e frutas da Acacia nilotica (LN16011) aumentaram significativamente a concentração de ATP intracelular. Os dados do índice ATP intracelular (%) estão resumidos na Tabela 5. Da mesma forma, a casca do caule de Mangifera indica 80% do extrato metanólico (LN16014) e apresentou 29,2%, 38,7% e 44,3% de aumento na concentração de ATP nas doses de 5, 25 e 125 ng/mL, respectivamente, sobre as células de controle não tratadas. Os dados de ATP obtidos para extratos derivados de outras partes de plantas e os derivados usando outros meios solventes para extração também são resumidos na tabela-5, respectivamente.Tabela 5

Exemplo 12

[111] Avaliação da eficácia de aumento de ATP das Composições-1 a 5 e Composições- 11 a 32: A eficácia das novas composições Composições-1 a 5 e composições-11 a 32 para aumentar os níveis de ATP em células de músculo esquelético de rato L6 foram avaliadas utilizando o procedimento de teste descrito acima para o Exemplo 11. Os dados estão resumidos nas tabelas 6 a 11 Tabela 6 Ensaio de ATP (10 ng/ml)

Tabela 7 Ensaio de ATP (1 ng/ml)

Tabela 8 Ensaio de ATP (5ng/ml)

Tabela 9 Ensaio de ATP (5 ng/ml)

Tabela 10 Ensaio de ATP (25ng/ml)

Tabela 11 Ensaio ATP (1 ng/ml)

Exemplo 13

[112] Ensaio de imunotransferência: Avaliação da eficácia dos extratos hidroalcoólicos de frutos da Bauhinia racemosa (LN16002), casca de caule da Mangifera indica (LN16005), caule da Woodfordia fruticosa (LN16008) e Acacia nilotica (LN16011), extrato alcoólico foliar da Cassia auriculata (LN17090) e composição-3 na modulação dos marcadores musculares das proteínas Phospho mTOR (Ser2448), m- TOR, PGC-1α, Miogenina e MyoD. Os efeitos das amostras de teste no marcador de proteínas específicas do músculo em células de músculo esquelético de ratos L6 foram analisados usando o ensaio de imunotransferência. Resumidamente, as células L6 foram tratadas com as amostras de teste (LN16002, LN16005, LN16008 e LN16011) durante um período de tempo diferente como indicado. Depois disso, as células foram lavadas três vezes com PBS gelado e os lisados celulares foram preparados num tampão de lise (10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de Triton X-100) contendo um cocktail de inibidores de protease. Os lisados celulares foram clarificados a 14.000g durante 20 min a 4 °C. As concentrações proteicas foram estimadas pelo reagente de Bradford.

[113] Uma quantidade igual de proteínas foi resolvida em SDS-PAGE. Após SDS- PAGE, as membranas de nitrocelulose com eletrosferose reagiram durante a noite a 4oC com vários anticorpos (específicos para PhosphomTOR (Ser2448), m-TOR, PGC-1α, Myogenin, MyoD). A mesma membrana foi reincubada com anticorpo anti-GAPDH. Sinais específicos foram detectados com quimiluminescência melhorada (Thermo Scientific, EUA) e as intensidades de sinal foram captadas pelo Sistema de Imagiologia Gel Doc ™ XR + e analisadas usando o Software Image Lab ® 2.0 (BioRad, Hercules, CA). Os compostos de teste LN16002, LN16005, LN16008, LN16011, LN17090 e a composição-3 potenciaram as proteínas marcadas específicas de músculo FosfomTOR (Ser2448), m-TOR, PGC-1α, Miogenina, MyoD, Myf6 como resumido na figura 1.

Exemplo 14

[114] Ensaio de Biogênese Mitocondrial: Avaliação do potencial de aumento da biogênese Mitocondrial de extratos hidroalcoólicos de frutos da Bauhinia racemosa (LN16002), caule da Woodfordia fruticosa (LN16008), frutos da Acacia nilotica (LN16011), extrato alcoólico foliar da Cassia auriculata (LN17090), composição 3 e composições 26-31. A biogênese mitocondrial foi medida utilizando o Kit ELISA In-Cell MitoBiogenesis® (Abcam, Cambridge, UK). Este ensaio baseia-se na medição das razões entre a subunidade I do complexo IV’ (COX-I), uma proteína endodontia do DNA mitocondrial (mtDNA) e a ‘subunidade do complexo succinato desidrogenase A’ (SDH- A), uma proteína codificada de DNA nuclear (nDNA). Resumidamente, igual número de L6 de rato mioblastos esqueléticas foram semeadas em cada poço-96 de uma placa poli-revestida com L-lisina e incubada durante a noite a 37 °C numa incubadora de CO2. As células foram tratadas com LN16002, LN16008 ou LN16011 em diferentesconcentrações durante três dias consecutivos. Os poços de culturas de veículos que receberam 0,2% de DMSO foram considerados como o veículo de controle. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 20 min à temperatura ambiente. Depois as células lavadas foram incubadas com ácido acético a 0,5% durante 5 min para bloquear a atividade de fosfatase alcalina endógena. Posteriormente, as células foram permeabilizadas com tampão de permeabilização e incubadas com solução de anticorpos primários durante a noite a 4°C. As células lavadas foram ainda incubadas com Solução de Anticorpos Secundária marcada com AP/HRP. Finalmente, as reações de fosfatase alcalina e peroxidase de rábano foram desenvolvidas para detecção de SDH-A e COX-1, respectivamente, conforme protocolo. As reações de cor desenvolvidas para SDH- A e COX-1 foram lidas a 405 e 600 nm, respectivamente num leitor de microplacas (Spectra MaxM5, Dispositivos moleculares, Sunnyvale, CA). O aumento percentual na biogênese mitocondrial, quando comparado ao controle, foi calculado e os dados estão resumidos na Tabela 12, 13 e 13A abaixo. A modulação do Citocromo C oxidase 1 (COX1) por extratos hidroalcoólicos de frutos da Bauhinia racemosa (LN16002), caule da Woodfordia fruticosa (LN16008), frutas da Acacia nilotica (LN16011), extrato alcoólico foliar da Cassia auriculata (LN17090) e composição-3 é resumida na Figura 2 Tabela 12

Tabela 13 - % de aumento da biogênese mitocondrial sobre o controle de veículos

Tabela 13A- % de aumento da biogênese mitocondrial sobre o controle de veículos

Exemplo 15

[115] Ensaio Miotubo: Avaliação da eficácia da formação de miotubo (fibra muscular) dos extratos hidroalcoólicos de frutos da Bauhinia racemosa (LN16002), caule da Woodfordia fruticosa (LN16008), Acacia nilotica (LN16011) e Cassia auriculata (LN17090) e composição-3. O mesmo número de células de mioblasto de rato C2C12 foi semeado numa placa de cultura celular de 24 poços e incubou-se a 37°C em uma incubadora de CO2 durante a noite. No dia seguinte, as células foram tratadas com múltiplas concentrações de amostras de teste LN16002, LN16005, LN16008, LN16011 e 16012 (preparadas em DMEM suplementado com 10% de FBS). Os poços de cultura de controle de veículo receberam meio de cultura de células contendo apenas 0,1% de DMSO. O meio de cultura de células juntamente com os tratamentos foi renovado a cada 48 horas e a placa foi monitorizada todos os dias para uma diferenciação ótima. Após quatro dias de tratamento, os miotubos foram formados e a cultura foi finalizada. Posteriormente, as células foram fixadas com formaldeído a 2% e os miotubos formados foram observados sob ampliação de 20X em campo claro e as imagens de contraste de fase foram capturadas sob um microscópio (observador Axio Z1, Carl Zeiss). As células tratadas com extrato hidroalcoólico de frutos da Bauhinia racemosa (LN16002), caule da Woodfordia fruticosa (LN16008), Acacia nilotica (LN16011), folhas da Cassia auriculata (LN17090) e composição-3 apresentaram melhora da dose-dependente na formação de miotubos quando em comparação com as células tratadas com controle. Os dados estão descritos na Figura 3.

Exemplo 16

[116] Avaliação 20S Atividade de inibição de proteassoma do extrato alcoólico de folhas da Cassia auriculata (LN17090) e composição-3 em mioblastos esqueléticos de ratos L6: O ensaio de atividade de proteassoma foi realizado utilizando o kit de ensaio 20S Proteassoma de Cayman (Ann Arbor, MI, No. cat. 10008041) de acordo com o protocolo do fabricante. Emprega um substrato 20S específico, SUC-LLVY-AMC que, após clivagem pela enzima ativa, gera um produto altamente fluorescente com um comprimento de onda de emissão a 480nm. Para o ensaio, aproximadamente 1 x 105 a 1 x 106 células L6 (ATCC, Manassas, VA; Cat # CRL-1458) foram semeadas num frasco de T-75 e incubadas a 37 °C em uma incubadora de CO2. Após dois dias, as células foram lavadas com 1XPBS, três vezes e 3mL de tampão de ensaio foram adicionados ao balão. O tampão de ensaio foi removido e foram adicionados 2 mL de tampão de lise (fornecido pelo kit). As células foram desmanteladas e o lisado resultante continha proteína. O teor de proteína no lisado foi estimado utilizando o kit de ensaio de proteína Pierce BCA (Thermo Scientific, Waltham, MA; Cat No. 23225). Dez microlitros de amostra na concentração desejada e aproximadamente 0,4 mg/mL de proteína foram adicionados a cada poço. Dez microlitros de substrato foram adicionados e incubados a 37 °C durante uma hora. Após o período de incubação, a intensidade de fluorescência de cada poço foi medida com Ex: 360nm/Em: 480 nm num leitor multimodo Spectramax 5e (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). A intensidade do composto de teste foi comparada com a do poço de controle para obter a percentagem de inibição da atividade da proteassoma 20S. Os dados para LN17090 e Composição-3 estão resumidos na Figura 2.

Exemplo 17

[117] Eficácia do LN17090 e da Composição-3 para se recuperar do potencial de membrana mitocondrial despolarizado em mioblastos esqueléticos de rato L6 induzidos por H2O2, Ensaio de potencial de membrana mitocondrial: O potencial da membrana mitocondrial (ΔΦM) foi medido utilizando um corante catiônico lipofílico citofluorimétrico, 5,5',6,6'-Tetracloro-1,1',3,3'-iodeto de tetraetilbenzimidazolilcarbo- cianina (JC-1, Thermofisher Scientific; Cat No. T3168). Resumidamente, L-6 (ATCC, Manassaas, VA; Cat No. CRL-1458) mioblastos esqueléticos de ratos foram colhidos dos frascos de cultura e 0,1x106 células/mL em 1XPBS foram recolhidos em tubos FACS. As amostras nas concentrações necessárias foram preparadas em 1XPBS, adicionadas aos respectivos tubos e incubadas por 30 minutos a 37 °C em uma incubadora de CO2. H2O2 (concentração final de 5mM) foi adicionado a todos os tubos, exceto para o controle e para os tubos de JC-1 e incubaram-se durante 15 minutos a 37 °C em uma incubadora de CO2. JC-1 (0,5μg/mL) foi adicionado a todos os tubos, exceto o controle e incubado por 30 minutos a 37 °C em uma incubadora de CO2. Todos os tubos foram centrifugados a 1300 rpm por cinco minutos. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em 1 mL de 1XPBS quente, centrifugadas à 1300 rpm durante 5 minutos. As células foram ressuspensas em 200μL de 1XPBS e adquiridas num fluxo BD FACS Verso, citômetro e analisados por FACS de software Suite para obter a percentagem de células despolarizadas para o controle, H2O2 a célula e as células tratadas com os compostos de ensaio tratados. Os dados estão resumidos na Tabela 14.Tabela 14

Exemplo 18

[118] Avaliação da energia, resistência e potencial de aumento da força muscular do extrato hidroalcoólico da Acacia nilotica (LN16011) e composição 1 contendo 80% do extrato metanólico de casca da Mangifera indica (LN16014) e extrato e excipientes da Sphaeranthus indicus (LN16015). Ratos albinos suíços foram aclimatados por 5 dias antes do início do estudo. Ratos albinos suíços saudáveis foram selecionados e divididos aleatoriamente (n = 6) em diferentes grupos de tratamento. Os grupos G1 a G3 de ratos albinos suíços foram administrados por via oral com veículo, composição-1 (150 mg/kg) e LN16011 (200 mg/kg) respectivamente, por 21 dias para avaliar a resistência energética e o potencial de força muscular desses compostos.

[119] No dia 21, uma hora após o tratamento, os ratos foram forçados a nadar com uma carga constante (10% do seu peso corporal ligado à cauda) num cilindro de acrílico cheio de água. Este teste foi monitorado por 10 minutos usando o sistema de rastreamento de vídeo SMART (Panlab SLU). Vários parâmetros de natação foram registrados e analisados por software inteligente. Os parâmetros de natação medidos incluem tempo de descanso, tempo de movimento lento, tempo de movimento rápido, tempo total de movimento, comprimento do percurso do nado e velocidade média. Os resultados foram expressos como média ± SEM e comparados com o grupo de controle para medir a eficácia e os resultados estão resumidos na Tabela 15.Tabela 15

[120] Os valores são expressos como média ± SEM; n = 6 animais/grupo

[121] Os grupos de animais suplementados com os itens de teste Composição-1 e LN16011 mostraram uma redução no tempo de repouso (seg) e aumento na distância percorrida (mm), tempo de natação lento (seg), natação rápida (seg) no 21° dia do estudo. As observações acima indicam que os animais tratados com a composição 1 e LN16011 foram mais ativos e energéticos durante 10 minutos do período de natação forçada e poderiam tender a nadar lentamente ou rapidamente a maior parte do tempo em vez de descansar em comparação ao grupo de controle. O aumento na velocidade de natação rápida e natação no grupo no dia 21 revela que os animais tratados tendem a nadar rapidamente e percorrem longas distâncias no menor período de tempo após a administração oral da composição-1 e LN16011 em comparação ao grupo de controle. Assim, os animais tratados com estas composições composição-1 e extrato LN16011 são mais energéticos. Além disso, uma energia melhorada, o aumento da distância percorrida e o tempo de repouso reduzido indicam que a composição 1 e o extrato LN16011 têm maior resistência sobre o controle.

[122] Após 21 dias de tratamento, mediu-se a força de aderência dos ratos utilizando o medidor de força de aderência (UgoBasile, Itália). Os animais foram treinados e habituados ao ambiente e as condições experimentais por 5 dias antes da medida da força de aderência. Cada rato foi autorizado a agarrar a barra de agarrar e foi puxado para trás suavemente em um plano horizontal pela cauda com força gradualmente crescente até que a força de tração superasse a força de aderência do animal. A força aplicada no momento em que os ratos deixam de aderir na barra de agarrar foi registrada como força de aderência em gramas. Três ensaios foram conduzidos em cada animal e a força média de aderência foi calculada. Os resultados foram expressos como média ± EPM e comparados com o grupo de controle e foram resumidos na Tabela 16. Tabela 16

[123] Os valores são expressos como média ± SEM; n = 6 animais/grupo com base nos dados, é óbvio que os animais dos grupos tratados com composição 1 e LN16011 por 21 dias exibiram uma força de aderência relativamente melhor quando comparados ao controle. Portanto, pode-se concluir que esses compostos aumentam a força muscular.

Exemplo 19

[124] Eficácia da Composição-33, Composição-34, Composição-35, Composição-36 e Composição-37 para força muscular e potencial de resistência de energia em ratos albinos suíços: Os animais foram aclimatizados por um período de 3 dias antes da inscrição no estudo. Um grupo de 60 ratos albinos suíços machos do grupo etário de 79 semanas e peso corpóreo de 23,0-42,0 g foram examinados e 54 ratos saudáveis foram selecionados para o experimento e foram distribuídos aleatoriamente em nove grupos. Cada grupo era composto por 6 animais, cada um com controle de veículo, itens de teste e L-carnitina de controle positivo. Os itens de teste das Composições-33- 37 foram administrados por via oral a 200 mpk. A L- carnitina foi administrada por via oral a 150 mpk por um período de 21 dias. No dia 21, os animais foram avaliados quanto à força de aderência e teste de natação forçado. A força de aderência foi realizada permitindo que os ratos segurassem a barra com o membro anterior; puxando gentilmente os ratos pela cauda, a força de aderência em libras foi registrada em triplicatas para todos os animais. A natação forçada foi realizada brevemente em tanque de acrílico preenchido até 27 cm onde os ratos foram forçados a nadar com o peso de 5% do peso corporal sobrecarregado à cauda. Inicialmente a força de aderência após 1 hora de administração dos itens de teste foi realizada; seguido de teste de natação forçada por 10 min. No teste de natação forçada, os parâmetros de natação dos animais, como natação lenta, descanso, natação rápida e distância total (comprimento) coberta, foram registrados usando o software de rastreamento de vídeo SMART. Imediatamente após 10 minutos do tempo estipulado de natação, os animais foram sacrificados com o uso de doses excessivas de CO2; o músculo gastrocnêmio foi congelado para analisar o biomarcador mTOR.Tabela 17: Resumo dos parâmetros de natação no dia 21

[125] Os valores são expressos como média ± SEM, n = 6 animais/grupo Tabela 18: Resumo da força de aperto (lbs)

Exemplo 20

[126] Eficácia do LN16011 e do LN17090 na melhoria da força de aderência, resistência muscular e tamanho do diâmetro da fibra muscular no modelo de sarcopenia induzida por dexametasona de ratos Sprague Dawly (SD): Os animais foram aclimatizados por um período de 3 dias antes da inscrição no estudo. Um grupo de 40 ratos do grupo etário de 6 a 12 semanas e peso corporal de 170 a 320 g foram examinados e 36 ratos saudáveis foram selecionados para o experimento e eles foram aleatoriamente designados para 6 grupos. Todos os grupos compreendiam 6 animais, cada um com um veículo de controle (G1), de controle de doença induzido por dexametasona (G2), grupo suplementado com 200 mg/kg de LN17090 (G3), grupo suplementado com 400 mg/kg LN17090 (G4), 200 mg/kg LN16011 grupo suplementado (G5) e grupo controle positivo suplementado com 350 mg/kg de HMB (beta-hidroxi beta-metilbutirato) (G6). A suplementação de itens de teste e padrão foram iniciados no dia 1 e continuaram durante todo o estudo até o dia 21. A sarcopenia foi induzida em animais por dosagem dos animais com dexametasona a 4 mpk do dia 8 ao dia 14. No dia 21, os animais foram avaliados quanto à força de aderência, resistência muscular, diâmetro da fibra muscular no gastrocnêmio e tecido muscular do sóleo. A força de aderência foi realizada permitindo que os ratos segurassem a barra com o membro anterior; puxando gentilmente os ratos pela cauda e a força de aderência em libras foi registrada em triplicatas para todos os animais. A resistência muscular foi avaliada suspendendo o animal de cabeça para baixo em uma grade de aço e o tempo de queda em segundos foi registrado como resistência. Ao final do estudo, os animais foram eutanasiados e os músculos sóleo e gastrocnêmio foram submetidos à histomorfometria. Os tecidos musculares foram processados, seccionados, corados, examinados ao microscópio e o diâmetro da fibra muscular foi medido em fibras selecionadas aleatoriamente. Os dados para todos os parâmetros estão resumidos na Figura 4.

Claims

1) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, caracterizado por compreender um primeiro ingrediente selecionado de extratos ou frações derivadas de Mangifera indica e um segundo ingrediente selecionado de extratos ou frações derivadas de Sphaeranthus indicus para fornecer um início e aumento/manutenção constante de energia e alerta mental, melhorar a resistência muscular e massa muscular e para tratar sarcopenia e atrofia muscular em um animal de sangue quente ou mamífero em necessidade respectiva.

2) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela composição opcionalmente compreender, pelo menos, um ingrediente selecionado de excipientes, transportadores, diluentes, adoçantes, aromatizantes, corantes, vitaminas, proteínas ou aminoácidos como um potencializador de energia natural para aumentar os níveis de energia, resistência, alerta mental, massa muscular e resistência muscular e para tratar sarcopenia e atrofia muscular.

3) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição conter um ingrediente selecionado de extratos ou frações derivadas de uma parte da planta de Mangifera indica e o segundo ingrediente ser selecionado de extratos ou frações derivadas de uma parte da planta de Sphaeranthus indicus e opcionalmenteconter, ainda, um excipiente, diluente ou transportador.

4) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizado por a concentração de ingredientes derivados de Mangifera indica e Sphaeranthus indicus nas composições variar individual ou conjuntamente de 0,01% a 99,99%.

5) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição derivada de Mangifera indica e Sphaeranthus indicus para uso em bebidas, lanches e energéticos, contendo o(s) ingrediente(s) acima referido(s), melhorar a resistência muscular, atividade física, aptidão física, alerta mental, níveis de energia, níveis de resistência, saúde circulatória, saúde dos vasos sanguíneos ou para uma melhor saúde mental em animais de sangue quente em necessidade respectiva.

6) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a composição conter, ainda, pelo menos, um ingrediente opcional selecionado de componentes não limitantes, como vitaminas selecionadas de vitaminas B, incluindo tiamina, riboflavina, niacina, ácido pantotênico, piridoxina, biotina, cianocobalamina e colina e/ou ácido fólico, incluindo as formas reduzidas de ácido fólico, como, entre outros, ácido folínico, folinato de cálcio e metiltetrahidrofolato, as formas específicas de vitaminas B na composição podendo incluir pantotenato de d-cálcio, niacinamida, cloridrato de piridoxina e mononitrato de tiamina ou aminoácidos.

7) “MÉTODO PARA AUMENTO DOS NÍVEIS DE ENERGIA NATURAL, ATIVIDADE FÍSICA, INÍCIO E AUMENTO/MANUTENÇÃO CONSTANTE DE ENERGIA, RESISTÊNCIA, ALERTA MENTAL, MASSA MUSCULAR E RESISTÊNCIA MUSCULAR E TRATAMENTO DE SARCOPENIA E ATROFIA MUSCULAR EM UM MAMÍFERO OU ANIMAL DE SANGUE QUENTE”, caracterizado por o método compreender suplementar ou tratar o referido mamífero ou animal de sangue quente com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição sinérgica, compreendendo um primeiro ingrediente selecionado de extratos ou frações derivadas de Mangifera indica e um segundo ingrediente selecionado de extratos ou frações derivadas de Sphaeranthus indicus e compreendendo, opcionalmente, pelo menos, um composto selecionado de ativos biológicos, extratos de plantas, minerais, aminoácidos, proteínas, vitaminas, excipiente, diluente ou um transportador.

8) “MÉTODO PARA AUMENTO DOS NÍVEIS DE ENERGIA NATURAL, ATIVIDADE FÍSICA, INÍCIO E AUMENTO/MANUTENÇÃO CONSTANTE DE ENERGIA, RESISTÊNCIA, ALERTA MENTAL, MASSA MUSCULAR E RESISTÊNCIA MUSCULAR E TRATAMENTO DE SARCOPENIA E ATROFIA MUSCULAR EM UM MAMÍFERO OU ANIMAL DE SANGUE QUENTE”, caracterizado por o método compreender suplementar ou tratar o referido mamífero ou animal de sangue quente com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição compreendendo, pelo menos, um ingrediente selecionado de extratos ou frações derivadas da casca de Mangifera indica em combinação com um extrato ou fração derivada dos capítulos de Sphaeranthus indicus.

9) “MÉTODO PARA MELHORIA DA EXPRESSÃO / PRODUÇÃO / ATIVIDADE DOS BIOMARCADORES DE ENERGIA, RESISTÊNCIA E CRESCIMENTO MUSCULAR EM UM MAMÍFERO OU ANIMAL DE SANGUE QUENTE SELECIONADO DE ATP, ÓXIDO NÍTRICO, eNOS, mTOR, MyoD, COX1, PROTEASSOMA 20S E MIOGENINA E MÉTODO PARA MELHORIA DOS PROCESSOS BIOLÓGICOS SELECIONADOS DE BIOGÊNESE MITOCONDRIAL, MIOGÊNESE, PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS MUSCULARES E RECUPERAÇÃO DA DESPOLARIZAÇÃO DA MEMBRANA MITOCONDRIAL” caracterizado por o método compreender administrar a um indivíduo, mamífero ou animal de sangue quente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição sinérgica compreendendo um primeiro ingrediente selecionado de extratos ou frações derivadas de Mangifera indica e um segundo ingrediente selecionado de extratos ou frações derivadas de Sphaeranthus indicus, opcionalmente em combinação com, pelo menos, um composto selecionado de ativos biológicos, extratos de plantas, minerais, aminoácidos, proteínas, vitaminas, excipientes, diluente ou um transportador.

10) “MÉTODO PARA MELHORIA DOS PROCESSOS BIOLÓGICOS SELECIONADOS DE BIOGÊNESE MITOCONDRIAL, MIOGÊNESE, PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS MUSCULARES E RECUPERAÇÃO DA DESPOLARIZAÇÃO DA MEMBRANA MITOCONDRIAL”, caracterizado por o método compreender administrar a um indivíduo, mamífero ou animal de sangue quente uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição sinérgica compreendendo um primeiro ingrediente selecionado de extratos ou frações derivadas de Mangifera indica e um segundo ingrediente selecionado de extratos ou frações derivadas de Sphaeranthus indicus, opcionalmente em combinação com, pelo menos, um composto selecionado de ativos biológicos, extratos vegetais, minerais, aminoácidos, proteínas, vitaminas, excipiente, diluente ou um transportador.

11) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os meios solventes utilizados para produzir os extratos ou frações de Mangifera indica e Sphaeranthus indicus poderem ser selecionados de álcoois C1-C5, como etanol, metanol, isopropanol e butanol; água e misturas respectivas; hidrocarbonetos C1-C7, como hexano; ésteres, como acetato de etila; MIB K, acetona e semelhantes e misturas respectivas.

12) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as partes da planta de Mangifera indica e Sphaeranthus indicus usadas para produzir o extrato utilizado na invenção poderem ser selecionadas de folhas, caules, caule tenro, partes aéreas, frutos, casca de frutos, sementes, capítulos, raízes, casca ou plantas inteiras ou misturas respectivas.

13) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o extrato ou fração derivada de Mangifera indica e Sphaeranthus indicus ou sua composição ser padronizada para os marcadores fitoquímicos ativos seletivos ou marcadores fitoquímicos presentes nos respectivos extratos ou fração.

14) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os extratos ou frações individuais ou composições então divulgadas poderem ser formuladas na forma de dosagem de alimentos saudáveis ou alimentos para usos específicos da saúde, como alimentos sólidos tipo chocolate ou barras nutricionais, alimentos semissólidos tipo creme, geleia ou gel e também bebidas e similares, como bebidas refrescantes, bebidas de bactérias ácido-láticas, balas, doces, gomas de mascar, balas de goma, iogurte, sorvete, pudim, geleia de feijão azuki suave, geleia, biscoito, chá, refrigerante, suco, leite, café, cereais, petiscos e similares.

15) “COMPOSIÇÃO SINÉRGICA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os extratos ou frações individuais derivadas de Mangifera indica e Sphaeranthus indicus ou suas composições poderem ser, ainda, opcionalmente combinadas com um ou mais excipiente(s), transportador(es) e diluente(s) farmacêutica ou dieteticamente aceitável(is) que inclui(em), entre outros, glicose, frutose, sacarose, maltose, dextrina amarela, dextrina branca, aerosil, celulose microcristalina, estearato de cálcio, estearato de magnésio, sorbitol, esteviosídeo, xarope de milho, lactose, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido succínico, ácido lático, ácido L-ascórbico, dl-alfa- tocoferol, glicerina, propilenoglicol, éster graxo de glicerina, éster graxo de poliglicerina, éster graxo de sacarose, éster graxo de sorbitano, éster graxo de propilenoglicol, acácia, carragenina, caseína, gelatina, pectina, ágar, vitaminas do grupo B, nicotinamida, pantotenato de cálcio, aminoácidos, proteínas, sais de cálcio, pigmentos, sabores, conservantes, água destilada, solução salina, solução aquosa de glicose, álcool, propilenoglicol e polietilenoglicol, vários óleos animais e vegetais, parafina branca mole, parafina, aromatizantes, corantes e cera.