BR112020022665A2 - composição herbácea sinergística, método para obter pelo menos um benefício de saúde relacionado às atividades anabólicas e androgênicas no corpo e uso de uma composição herbácea sinergística - Google Patents

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Rama Raju Gokaraju
Kiran Bhupathiraju
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Venkata Kanaka Ranga Raju Gokaraju
Venkateswarlu Somepalli
Venkata Krishna Raju Alluri
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Abstract

Composições herbáceas sinergística compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados a partir de partes de plantas de Punica granutum e um segundo ingrediente selecionado a partir do extrato(s), fração(ões) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivado a partir das partes de plantas de Theobroma cacao para melhorar os níveis de testosterona. A invenção provê ainda o método para obter pelo menos um benefício de saúde relacionado para melhorar as atividades anabólicas e androgênicas no corpo selecionado a partir da melhora dos níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, estamina, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, função sexual de resistência muscular (libido e função erétil) e bem estar psicológico (humor e foco); e redução de estresse em humanos e aliviar os sintomas associados com os baixos níveis de testosterona em humanos tais como perda de libido, perda de função erétil, obesidade abdominal, massa e resistência muscular diminuída, fadiga, alterações de humor, densidade óssea diminuída, motivação diminuída, e memória e concentração diminuídas.

Description

“COMPOSIÇÃO HERBÁCEA SINERGÍSTICA, MÉTODO PARA OBTER PELO MENOS UM BENEFÍCIO DE SAÚDE RELACIONADO ÀS ATIVIDADES
ANABÓLICAS E ANDROGÊNICAS NO CORPO E USO DE UMA COMPOSIÇÃO HERBÁCEA SINERGÍSTICA” Campo técnico da invenção
[0001] A invenção refere-se a composições herbáceas sinergística compreendendo pelo menos um ingrediente selecionado a partir de extratos e frações, derivados de Punica granutum e pelo menos um ingrediente selecionado de extratos e frações de Theobroma cacao para melhorar os níveis de testosterona em humanos e/ou aliviar pelo menos um sintoma/condição associado com níveis normais mais baixos do hormônio testosterona em humanos. A invenção também se refere ao método para melhorar os níveis de testosterona em humanos e/ou método para aliviar pelo menos um sintoma associado com níveis baixos do hormônio testosterona em humanos. Antecedentes da invenção
[0002] O testosterona é um mensageiro químico de hormônio produzido primariamente pelas células de Leydig em estes e é responsável pelo desenvolvimento adequado das características sexuais masculinas. É um tipo de andrógeno essencial para o processo de espermatogênese. O testosterona é um hormônio anabólico e conhecido por regular um número de funções em homens em adição à produção de esperma, que inclui direcionamento sexual, massa óssea, crescimento muscular, resistência muscular, estamina, energia aumentada, humor, etc.. Conforme os homens envelhecem, os níveis de testosterona sérica diminuem gradualmente, resultando em várias mudanças físicas e mentais, como perda da libido, perda da função erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força muscular, fadiga, diminuição da densidade óssea, mudança de humor, diminuição da motivação e diminuição da memória e concentração.
[0003] Muitas terapias de reposição de testosterona estão disponíveis para tratar os homens que sofrem de deficiência de testosterona, as quais incluem desidroepiandrosterona (DHEA) e produtos à base de plantas (herbáceos), tais como Tribulus terrestris. Os baixos níveis de testosterona foram associados a níveis significativamente mais baixos de magnésio, ferro e zinco. Consequentemente, suplementos contendo esses nutrientes também estão disponíveis como intensificadores de testosterona.
[0004] A publicação da patente WO2011026500 A1 descreve composições compreendendo extratos de Tribulus terrestris e Lepidium meyenii para o tratamento da disfunção erétil aumentando os níveis de testosterona.
[0005] A publicação da patente US 20140086999 A1 descreve um suplemento dietético biologicamente ativo para normalizar os níveis de androgênio em homens, melhorando a saúde geral e reduzindo a obesidade, o referido suplemento dietético compreende raízes e rizomas de Cinquefoil branco, ou porções aéreas de Cinquefoil branco, ou uma mistura dos mesmos; e criação de zangões (“drone brood”) em uma proporção em peso de 20 a 80% em peso.
[0006] Outra publicação de patente US 5543146 A, descreve um suplemento dietético para o alívio dos sintomas associados ao aumento da próstata, compreendendo os seguintes ingredientes: sementes de abóbora em uma quantidade entre 12,5 a 25% em peso da composição; O extrato de Serenoa repens em uma quantidade entre 1,875 a 18,75% em peso da composição;
Pygeum africanum em uma quantidade entre 6,25 a 12,5% em peso da composição; glicinato de zinco em uma quantidade entre 3,125 a 6,25% em peso da composição; e excipientes.
[0007] Uma das principais razões para os níveis reduzidos de testosterona nos homens é sua conversão em estradiol. Aromatase é a enzima responsável pela conversão de andrógenos em estrógenos, especificamente, pela conversão da testosterona em estradiol. O ganho de peso e o envelhecimento são conhecidos por aumentar a perda de testosterona por essa conversão. Além disso, o excesso de estradiol em homens era conhecido por ser responsável por problemas de saúde relacionados à próstata, ginocomastia e erectilidade/libido/equilíbrio hormonal. Os inibidores da aromatase são conhecidos por aumentar os níveis de hormônio luteinizante (LH), hormônio folículo-estimulante (FSH) e testosterona. Portanto, os inibidores da aromatase podem ser usados como ferramenta para aumentar os níveis de testosterona.
[0008] Como é evidente a partir do acima, há uma necessidade contínua na técnica de fornecer tratamentos alternativos de baixo custo compreendendo extratos de ervas altamente eficazes para melhorar as concentrações de testosterona na vesícula seminal e na corrente sanguínea. Além disso, há uma necessidade na técnica de melhores opções de tratamento para melhorar os níveis de testosterona que fornecem efeitos colaterais mínimos, tornando a opção segura para consumo humano. Objetivo da invenção
[0009] Portanto, o objetivo da presente invenção é a provisão de composições herbáceas sinérgicas e seguras compreendendo pelo menos um ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, compostos ativos e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados de partes de plantas de Punica granatum e pelo menos um ingrediente selecionado a partir de extratos, frações, compostos ativos e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Theobroma cacao para a obtenção de pelo menos um benefício para a saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aumentadas no corpo selecionado de melhorar os níveis de testosterona na corrente sanguínea e/ou vesícula seminal, níveis energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, função sexual a resistência muscular (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e concentração); e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona em humanos, tais como perda da libido, perda da função erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força muscular, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação, diminuição da memória e concentração e melhorar a sensação de bem-estar.
[0010] Outro objetivo da invenção é a provisão do uso das composições herbáceas sinérgicas da presente invenção para aumentar os níveis de testosterona e tratar/aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona.
[0011] Outro objetivo da invenção é a provisão de métodos para obtenção de pelo menos um benefício para a saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aumentadas no corpo selecionado de melhorar os níveis de testosterona na corrente sanguínea e/ou na vesícula seminal, níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência,
envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, função sexual de resistência muscular (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e concentração); e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona em humanos, tal como perda de libido, disfunção erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força muscular, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação, diminuição da memória e concentração e melhora a sensação de bem-estar.
[0012] Ainda outro objetivo da invenção é a provisão de métodos para aumentar os níveis de energia natural, atividade física, início e aumento/manutenção constante de energia, resistência, alerta/atenção mental, massa muscular e força muscular em um mamífero ou animal de sangue quente usando as composições herbáceas sinérgicas da presente invenção. Sumário da invenção
[0013] A presente invenção fornece composições herbáceas sinérgicas que compreendem a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta Theobroma cacao para a obtenção de pelo menos um benefício de saúde relacionado ao aumento das atividades anabólicas e androgênicas no corpo selecionado de melhorar a testosterona níveis na corrente sanguínea e/ou na vesícula seminal, aumento dos níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular,
massa muscular, função sexual da resistência muscular, (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e foco); redução do estresse; e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona em humanos, tal como perda da libido, perda da função erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força muscular, fadiga, mudança de humor, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação e diminuição da memória e concentração e melhorar a sensação de bem-estar.
[0014] Em um aspecto, a invenção provê composições herbáceas/fitoterápicas sinérgicas que compreendem a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Punica granatum e um ingrediente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados de partes da planta de Theobroma cacao para a obtenção de pelo menos um benefício de saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aumentadas no corpo selecionado de melhorar os níveis de testosterona na corrente sanguínea e/ou na vesícula seminal, níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, função sexual da resistência muscular (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e foco); reduzir o estresse e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona em humanos, em que as composições contêm opcionalmente pelo menos um ingrediente adicional selecionado a partir de excipiente farmaceuticamente aceitável, diluente farmaceuticamente aceitável e veículo farmaceuticamente aceitável.
[0015] O outro aspecto da invenção provê o uso de composições herbáceas sinérgicas compreendendo um primeiro ingrediente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto (s) ativo (s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Theobroma cacao para a obtenção de pelo menos um benefício para a saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aumentadas no corpo selecionado de melhorar os níveis de testosterona na corrente sanguínea e/ou vesícula seminal, níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, função sexual de resistência muscular (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e foco); e reduzir o estresse em humanos e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona em humanos.
[0016] Ainda outro aspecto da invenção provê método para obter pelo menos um benefício de saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aumentadas no corpo, selecionado a partir da melhora dos níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, função sexual da resistência muscular (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e concentração); e reduzir o estresse em humanos; e tratar/aliviar os sintomas associados a baixos níveis de testosterona, tal como perda de libido, disfunção erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força/resistência muscular, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação e diminuição da memória e concentração em um humano, sendo que o método compreende suplementar humanos em necessidade do mesmo com uma dose eficaz de uma composição compreendendo um primeiro ingrediente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados de partes de plantas de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir dos extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou suas misturas derivados de partes da planta de Theobroma cacao e opcionalmente contendo pelo menos um ingrediente adicional selecionado a partir de excipiente farmaceuticamente aceitável, diluente farmaceuticamente aceitável e veículo farmaceuticamente aceitável.
[0017] Ainda outro aspecto da invenção são providos métodos para aumentar os níveis de energia natural, atividade física, início e aumento/manutenção constante de energia; resistência, alerta mental, massa muscular e/ou resistência muscular em um mamífero ou animal de sangue quente; sendo que o método compreende suplementar o referido mamífero ou animal de sangue quente com uma dose eficaz de uma composição compreendendo um primeiro ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou suas misturas derivadas da planta partes de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados de partes da planta de Theobroma cacao e opcionalmente contendo pelo menos um ingrediente adicional selecionado a partir de farmaceuticamente excipiente aceitável, diluente farmaceuticamente aceitável e veículo farmaceuticamente aceitável.
[0018] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê composições fitoterápicas sinérgicas compreendendo um primeiro ingrediente selecionado a partir do (s) extrato (s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou suas misturas derivadas das partes da planta de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou suas misturas derivados de partes da planta de Theobroma cacao e opcionalmente combinados com extratos/frações composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas de derivados das plantas tendo a atividade de aumento de testosterona ou atividade de inibição de aromatase/ou atividade de aumento de nitrito.
[0019] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece composições fitoterápicas sinérgicas compreendendo um primeiro ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou suas misturas derivadas das partes da planta de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Theobroma cacao e opcionalmente combinados com micronutrientes, tais como magnésio, zinco e boro, na forma elementar ou compostos contendo esses elementos; ou aminoácidos, tais como ácido D- aspártico. Descrição dos desenhos
[0020] Figura-I: O gráfico de barras representa o nível de testosterona sérica (ng/mL) no dia 22 no grupo de controle
(G1) e grupos de tratamento, G2 (composição-77: 100 mg/kg; p.o.) e G3 (composição-78: 100 mg/kg; p.o.); cada barra representa a média ± S.E.M e n = 7.
[0021] Figura-II: O gráfico de barras representa a contagem de espermatozoides no dia 22 no grupo de controle (G1) e grupos de tratamento, G2 (composição-77: 100 mg/kg; p.o.) e G3 (composição-78: 100 mg/kg; p.o.); cada barra representa a média ± S.E.M, n = 7. Os dados foram analisados usando ANOVA seguido pelo teste post-hoc de Dunnett. *P<0,05, ***P<0,001 versus controle normal. Descrição da descrição
[0022] A testosterona é um hormônio masculino androgênico chave e é produzida principalmente pelos testículos nas células de Leydig. É responsável pelo desenvolvimento dos tecidos reprodutivos masculinos e pela promoção de características sexuais secundárias. Em humanos adultos, a testosterona desempenha um papel importante na manutenção da massa muscular, resistência muscular, níveis de energia e massa óssea, função sexual e bem-estar psicológico. Níveis aumentados de testosterona aumentam a massa muscular e a resistência muscular; aumenta os níveis de energia, melhora a libido, a função erétil e melhora as sensações de bem-estar. Os níveis de testosterona diminuem gradualmente à medida que os homens envelhecem e os efeitos indesejáveis associados a esta condição, denominada “andropausa” têm recebido atenção crescente nos últimos anos. Os efeitos indesejáveis incluem diminuição do desejo sexual (libido), diminuição da qualidade erétil, particularmente para ereções noturnas, mudanças no humor, redução da função intelectual e cognitiva, fadiga, depressão e raiva, diminuição da massa e resistência muscular, diminuição dos níveis de energia, diminuição dos pelos corporais, alterações da pele, disfunção erétil, obesidade abdominal, diminuição da memória e concentração, diminuição da massa óssea/densidade mineral, aumento da massa gorda abdominal.
[0023] Muitas terapias de reposição de testosterona estão disponíveis para tratar os homens que sofrem de deficiência de testosterona, mas cada uma delas tem suas próprias desvantagens. (Os benefícios e riscos da terapia de reposição de testosterona: uma revisão. Nazem Bassil, Saad Alkaade, John E Morley Ther Clin Risk Manag. 2009; 5: 427–448. Publicado online em 22 de junho de 2009).
[0024] Portanto, os inventores do presente pedido selecionaram aleatoriamente um grande número de extratos de plantas e frações para sua atividade de aumento de testosterona em um modelo celular in vitro usando a linhagem celular MA-10 de Leyding de camundongo e o kit de ensaio EIA de testosterona baseado em ELISA (produtos químicos Cayman, EUA), e descobriram que os extratos e frações derivados de Punica granatum e Theobroma cacao apresentam potentes atividades de aumento de testosterona dependente da dose.
[0025] Punica granatum: Punica granatum Linn. (Romã) é uma espécie de planta frutífera da família Punicaceae conhecida localmente como Anar. É uma planta de grande antiguidade cultivada no Oriente Médio há mais de 5.000 anos. A planta é encontrada em toda a Índia e Bangladesh. Na medicina ayurvédica, a planta é descrita sob seu nome sânscrito “dalima” (fruta) como um “purificador do sangue” e usada para curar infecções parasitárias, aftas (úlceras na boca), diarréia e úlceras. A casca do fruto de P. granatum é rica em beta-caroteno, potássio, fósforo, cálcio e vários constituintes químicos como ácido elágico, elagitaninos, ácido púnico, flavonóides, antocianidinas, antocianinas e flavonas. As potenciais propriedades terapêuticas de ampla gama da casca ou casca de romã incluem o tratamento e a prevenção do câncer, doenças cardiovasculares, diabetes, problemas dentários e disfunção erétil, proteção contra radiação ultravioleta; e como antidiarreico e antimicrobiano. Outras aplicações potenciais incluem isquemia cerebral infantil, doença de Alzheimer, infertilidade masculina, artrite, feridas dérmicas e obesidade.
[0026] Theobroma cacao: Theobroma cacao L. é uma árvore pequena, mas economicamente importante. É uma árvore perene da família Sterculiaceae, nativa da região tropical das Américas. As sementes de Cocao são uma fonte significativa de polifenóis e teobromina. As sementes são utilizadas para fazer massa de cacau, cacau em pó, confeitaria, guache e chocolate. O extrato de cacau ou seus fitoquímicos mostraram diversos efeitos benéficos contra a agregação plaquetária, hipertensão, aterosclerose, hiperglicemia e hipercolesterolemia, inflamação, hepatocarcinogênese, dano ao DNA e efeito clastogênico.
[0027] Fonte das ervas usadas na invenção da seguinte forma: 1) A matéria-prima de casca de Punica granatum foi coletada na vila de Kothacheruvu, Kothacheruvu mandal, distrito de Ananthpur, Andhra Pradesh. 2) A matéria-prima da semente de Theobroma cacao foi obtida de cultivo próprio em Aswaraopet, Telangana.
[0028] A casca da fruta de Punica granatum foi pulverizada e o pó foi extraído com vários solventes, tais como etanol, etanol aquoso 90%, etanol aquoso 80%, etanol aquoso 70%, etanol aquoso 50%, água, metanol, metanol aquoso 50%, acetona, 50 % de acetona aquosa e acetato de etila para obter extrato de etanol (PG-1), extrato de etanol aquoso de 90% (PG-2), extrato de etanol aquoso de 80% (PG-3), extrato de etanol aquoso de 70% (PG-4), 50 % de extrato de etanol aquoso (PG-5), extrato de água (PG-6), extrato de metanol (PG-7), extrato de metanol aquoso de 50% (PG-8), extrato de acetona (PG-9), extrato de acetona aquoso de 50% (PG-10) e extrato de acetato de etila (PG-11), respectivamente. Os referidos extratos da casca da fruta de Punica granatum foram padronizados para punicalginas (I) pelo método de HPLC analítico e os resultados foram resumidos na Tabela 1. Punicalginas (I) é um elagitanino e sua estrutura química é mostrada abaixo.
OH HO O OH HO O O OH O HO O O OH OH O OH HO OH O O OH O O O OH HO O OH HO
OH Estrutura química de punicalginas (I)
[0029] A semente de Theobroma cacao foi pulverizada e o pó foi extraído com vários solventes, tais como água, 50% de etanol aquoso, etanol, 90% de etanol aquoso, 70% de etanol aquoso, metanol, 50% de metanol aquoso, acetona, 50% de acetona aquosa e acetato de etila para obter extrato de água
(TC-1), extrato de etanol aquoso de 50% (TC-2), extrato de etanol (TC-3), extrato de etanol aquoso de 90% (TC-4), extrato de etanol aquoso de 70% (TC-5), extrato de metanol (TC-6), extrato de metanol aquoso a 50% (TC-7), extrato de acetona (TC-8), extrato de acetona aquosa a 50% (TC-9) e extrato de acetato de etila (TC-10), respectivamente. Os referidos extratos de semente de Theobroma cacao foram padronizados para teobromina (II) pelo método de HPLC analítico e os resultados foram resumidos na Tabela 2. Teobromina (II) é o alcaloide principal em Theobroma cacao (Donald L. Pavia, Journal of Chemical Education, 1973, 50, 791-792) e sua estrutura química é mostrada abaixo. O CH3
HN N
O N N CH3 Estrutura química de Theobromina (II)
[0030] Os extratos de Punica granatum e Theobroma cacao aumentaram potentemente os níveis de testosterona em células MA-10 de Leydig de camundongo, quando comparadas às células tratadas com controle. O extrato etanólico 70% aquoso (P.G-4) da casca da fruta Punica granatum, por exemplo, nas concentrações de tratamento de 5 µg/mL, apresentou aumento de 34,15% na testosterona em relação ao controle. Da mesma forma, o extrato aquoso de semente de Theobroma cacao (T.C-1) e o extrato etanólico aquoso a 50% (T.C-2) na concentração de tratamento de 5µg/mL apresentaram aumento de 20,44% e 48,24% nos níveis de testosterona, respectivamente, sobre o controle.
[0031] A composição-1 até composição-76 foram preparadas combinando aleatoriamente um primeiro ingrediente selecionado dos extratos derivados da casca da fruta de Punica granatum com um segundo ingrediente selecionado dos extratos derivados da matéria-prima da semente de Theobroma cacao em diferentes proporções. As composições assim obtidas (composições-1 a 76) foram avaliadas quanto à atividade de aumento de testosterona em comparação com os ingredientes individuais correspondentes. Os dados do ensaio de testosterona in vitro mostraram que essas composições têm inesperadamente melhor eficácia no aumento dos níveis de testosterona quando comparadas aos seus ingredientes individuais correspondentes, sugerindo que os extratos individuais ou frações derivadas de Punica granatum têm a tendência de exibir sinergismo quando combinados com os extratos ou frações derivado de Theobroma cacao.
[0032] Por exemplo, extrato de etanol aquoso da casca de Punica granatum 70% (PG-4) a 0,16 µg/mL e extrato de água de Theobroma cacao (TC-1) a 0,04 µg/mL mostraram 7,10% e 0,86% de aumento nas concentrações de testosterona, respectivamente, no ensaio celular. A composição-1 contendo esses dois extratos na proporção de 4:1 mostrou 18,3% de aumento na testosterona na concentração de 0,2 µg/mL, o que é significativamente melhor do que o efeito aditivo (7,10% + 0,86% = 7,96%) desses dois ingredientes, sugerindo efeito sinérgico entre o extrato etanólico 70% aquoso da casca de Punica granatum (PG-4) e o extrato aquoso de Theobroma cacao (TC-1) no aumento dos níveis de testosterona. As composições 2, 3, 4, 5, 6 e 7 obtidas ao combinar esses dois ingredientes nas proporções 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 e 1:4 respectivamente, também mostraram sinergismo, quando comparado com seus ingredientes individuais correspondentes, conforme resumido na Tabela 3.
[0033] Em outro exemplo, extrato de etanol aquoso da casca de Punica granatum 70% (PG-4) a 0,16 µg/mL e extrato de etanol aquoso de Theobroma cacao 50% (TC-2) a concentrações de 0,04 µg/mL mostraram 7,10% e 3,85% de aumento em concentrações de testosterona respectivamente no ensaio celular. A composição 8 contendo esses dois extratos na proporção de 4:1 mostrou 25,74% de aumento na testosterona na concentração de 0,2 µg/mL, o que é significativamente melhor do que o efeito aditivo (7,10% + 3,85% = 10,95%) desses dois ingredientes, sugerindo efeito sinérgico no aumento dos níveis de testosterona por extrato etanólico aquoso da casca de Punica granatum 70% (PG-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 50% (TC-2). Estes dois ingredientes também mostraram sinergismo quando combinados nas proporções 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 e 1:4, como mostrado pelos efeitos de aumento de testosterona superiores exibidos pelas composições-9, 10, 11, 12, 13 e 14, respectivamente, conforme resumido na Tabela 4. Composições semelhantes (C-15 a C-76) contendo outros extratos de Punica granatum e Theobroma cacao também foram testadas quanto à atividade de aumento de testosterona e são consideradas sinérgicas, conforme resumido nas Tabelas 5 a 8. Aumento da testosterona através da inibição da aromatase
[0034] As principais razões para os baixos níveis de testosterona incluem distúrbios das glândulas pituitárias e hipotálamo, estresse mental e físico, envelhecimento, medicamentos, doenças simultâneas, etc. Mais do que níveis normais de testosterona são necessários para aumentar o impulso sexual, libido, aumentando a força muscular e muscular massa. A outra razão principal para os níveis reduzidos de testosterona nos homens é sua conversão em estradiol. Aromatase é a enzima responsável pela conversão de andrógenos em estrógenos, especificamente pela conversão da testosterona em estradiol. Assim, os inibidores da aromatase podem ser usados como uma ferramenta para inibir a conversão da testosterona, aumentando assim seus níveis nos sistemas biológicos. A suplementação de inibidores da aromatase é conhecida por aumentar os níveis de LH, hormônio folículo- estimulante (FSH) e testosterona.
[0035] Portanto, os inventores do presente pedido analisaram os extratos da casca de Punica granatum e semente de Theobroma cacao quanto à sua atividade de inibição de aromatase. Curiosamente, os extratos derivados de ambos os materiais vegetais mostraram uma potente atividade de inibição da aromatase dependente da dose. O extrato de etanol aquoso da casca de Punica granatum 70% (P.G-4), por exemplo, nas concentrações de tratamento de 25 µg/mL, mostrou 40,15% de inibição da aromatase. Da mesma forma, o extrato etanólico 50% aquoso da semente de Theobroma cacao (T.C-2) na concentração de tratamento de 25 µg/mL apresentou 20,9% de inibição da aromatase. Portanto, fica evidente que os extratos/frações da casca de Punica granatum e Theobroma cacao podem ter potencial para melhorar os níveis de testosterona por meio da inibição da aromatase.
[0036] Em seguida, as composições-1 a 76 (C-1 a C-76) contendo dois extratos, cada um derivado de Punica granatum ou Theobroma cacao, foram avaliadas para explorar a viabilidade de obter eficácia sinérgica na inibição da atividade da enzima aromatase. Os dados do ensaio de aromatase in vitro para essas composições mostraram inesperadamente melhor eficácia na inibição da atividade da enzima aromatase quando comparados aos seus ingredientes individuais correspondentes.
[0037] Por exemplo, extrato de etanol aquoso da casca de Punica granatum 70% (PG-4) a 20,0 µg/mL e extrato de etanol aquoso de Theobroma cacao 50% (TC-2) a 5,0 µg/mL mostraram 22,15% e 4,18% de inibição de aromatase respectivamente nas células ensaio. A composição 8 contendo esses dois extratos na proporção de 4:1 mostrou 35,2% de inibição da aromatase na concentração de 25,0 µg/mL, o que é significativamente melhor do que o efeito aditivo (22,15% + 4,18% = 26,33%) desses dois ingredientes, sugerindo efeito sinérgico na inibição da atividade da enzima aromatase por extrato etanólico aquoso da casca de Punica granatum 70% (PG-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 50% (TC-2). Esses dois ingredientes também mostraram inibição sinérgica da aromatase quando combinados nas proporções 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 e 1:4 para obter as composições 9, 10, 11, 12, 13 e 14 respectivamente, quando comparados com seus ingredientes individuais correspondentes, conforme resumido na Tabela 9. Da mesma forma, outras composições contendo os extratos de Punica granatum e Theobroma cacao (C-15 a C-76) foram testadas quanto à atividade inibidora de aromatase e os resultados sinérgicos estão resumidos nas Tabelas 10 a 13. Melhorar o desempenho físico, os níveis de energia, a massa muscular e a força muscular
[0038] A presença e o sustento da energia são os requisitos básicos e a condição por trás de todas as atividades da vida humana. O ATP é responsável por fornecer energia química para inúmeras funções celulares, incluindo transporte celular, produção de moléculas biológicas e funcionamento de macromoléculas, que são essenciais para a existência e sobrevivência da célula. Ele fornece energia ao músculo cardíaco (para a circulação sanguínea) e ao músculo esquelético (para as contrações musculares necessárias para o movimento corporal geral). O agrupamento de ATP que já está presente nas células musculares é bom para os primeiros 5 ou 6 segundos de ação física intensa, como corrida, atividade muscular. Além desse tempo, o novo ATP é produzido principalmente por meio do processo anaeróbico (glicólise) e metabolismo aeróbico (respiração celular por meio da glicólise, ciclo do ácido cítrico e transporte de elétrons/fosforilação oxidativa). No geral, o ATP permite a ativação de contrações musculares que são necessárias para suportar atividades físicas mais longas e vigorosas. Portanto, é essencial aumentar a fonte de energia intracelular ou conteúdo de ATP durante o exercício de resistência e por períodos mais longos e intensos de atividades físicas.
[0039] As mitocôndrias são o local de produção de energia (ATP) nas células por meio da fosforilação oxidativa, que muitas vezes é chamada de casa de força das células. As mitocôndrias fornecem a maior parte do ATP total necessário para manter a função celular normal e a homeostase. O ATP também desempenha um papel fundamental na função do músculo esquelético como gerador de força para a locomoção. A biogênese mitocondrial é o processo pelo qual novas mitocôndrias são formadas na célula por meio da proliferação de mitocôndrias pré-existentes. A biogênese mitocondrial é acompanhada não apenas por aumento em número, mas também em tamanho e massa. A biogênese mitocondrial pode ser induzida por atividades físicas e intervenções farmacológicas, incluindo ingredientes à base de ervas. PGC-1α [PPAR (receptor ativado por proliferador de peroxissoma)-γ coativador-1α] é um importante regulador da biogênese mitocondrial.
[0040] As mitocôndrias fornecem a maior parte da energia na forma de ATP para as células musculares durante o exercício aeróbico ou outras atividades físicas. Portanto, a biogênese mitocondrial, que gera mais mitocôndrias com melhor funcionamento, pode ter um efeito positivo no aumento do nível de energia e energia sustentada nas células. As mitocôndrias são suscetíveis a danos e perdas com o envelhecimento, pois são a principal maquinaria bioenergética e fonte de estresse oxidativo nas células. Além disso, a capacidade de biogênese mitocondrial também diminui com a idade. Como tal, o controle eficaz da biogênese mitocondrial é fundamental não apenas para a manutenção da produção de energia, mas também para a promoção do envelhecimento saudável. Assim, os extratos vegetais que podem induzir a biogênese mitocondrial (proliferação, tamanho e massa) podem ter o potencial de aumentar a energia, energia sustentada, resistência, massa muscular, força muscular e construção muscular; e promover um envelhecimento saudável.
[0041] A proteína é o bloco de construção primário dos músculos, ossos e cartilagem; e é essencial para o crescimento e reparo muscular. As proteínas são sintetizadas nas células através do processo de tradução do mRNA utilizando aminoácidos. Portanto, a estimulação da síntese de proteína muscular é um fator importante para o aumento da massa muscular. mTOR (alvo mamífero da rapamicina), uma serina/treonina-proteína quinase, é um regulador central da síntese de proteínas. O mTOR ativado regula positivamente a síntese de proteínas por fosforilação dos principais reguladores da tradução do mRNA e da síntese de ribossomos. Além disso, a ativação de mTOR aumenta a produção de fatores de transcrição específicos do músculo, como MyoD e miogenina. Portanto, extratos vegetais ou suplementos dietéticos, que ativam a sinalização mTOR, podem ter o potencial de aumentar o desenvolvimento muscular, massa muscular, força e resistência muscular.
[0042] Com base nas informações acima, formulamos a hipótese de que os extratos de ervas, frações ou suas composições/formulações que podem ativar a síntese de proteínas/sinalização mTOR e biogênese mitocondrial em células musculares esqueléticas seriam idealmente promissores para aumentar a energia, energia sustentada, nível de resistência, tecido muscular massa e força muscular. Portanto, os inventores do pedido de patente atual selecionaram aleatoriamente um grande número de extratos de plantas para atividades de biogênese m-TOR e mitocondrial.
[0043] O ensaio de biogênese mitocondrial foi realizado usando um kit ELISA in-cell em células de músculo esquelético de rato (L6). Os extratos derivados da casca de Punica granatum e da semente de Theobroma cacao aumentaram de forma dependente a biogênese mitocondrial. O extrato de etanol aq de casca de Punica granatum 70% (P.G-4), por exemplo, nas concentrações de tratamento de 10 ng/mL, apresentou aumento de 5,17% na biognose mitocondrial. Da mesma forma, o extrato de água de semente de Theobroma cacao (T.C-1) e o extrato de etanol aq 50% (T.C-2) na concentração de tratamento de 10 ng/mL mostraram 6,04% e 9,54% de aumento na biogênese mitocondrial, respectivamente.
[0044] As composições selecionadas C-1 a C-7, C8, C9, C-11, C-13, C-16 e C-17 contendo os extratos derivados da casca de Punica granatum e da semente de Theobroma cacao foram avaliadas em comparação com os extratos individuais correspondentes e descobriram que as composições exibem eficácia sinérgica, conforme resumido na Tabela 14.
[0045] Os extratos e composições individuais também foram avaliados usando o ensaio de fosforilação mTOR em mioblastos L6 de rato. As intensidades das bandas de fosfo-mTOR e bandas de proteína mTOR em Western Blot foram calculadas. Os índices relativos (valores arbitrários) obtidos pela razão fosfo- mTOR/mTOR indicaram a extensão da fosforilação de mTOR ou ativação de mTOR para cada condição de tratamento em comparação com o controle de veículo (sem tratamento). Os dados mostram que os extratos derivados da casca de Punica granatum e semente de Theobroma cacao e suas composições têm potencial para ativar mTOR, conforme resumido na tabela 15.
[0046] Atividade de aumento da testosterona de composições selecionadas em ratos Sprague Dawley: Algumas composições selecionadas da presente invenção, viz Composição-77 (C-77) contendo extrato de etanol 70% da casca de Punica granatum (PG-4) e extrato de água da semente de Theobroma cacao (TC - 1) junto com Ultrasperse A, celulose microcristalina e silóide como excipientes e Composição-78 (C-78) contendo extrato de etanol da casca de Punica granatum 70% (PG-4) e extrato de etanol aquoso da semente de Theobroma cacao 50%
(TC-2) juntamente com maltodextrina e silóide como excipientes, foram avaliados quanto à sua eficácia in vivo para aumentar os níveis de testosterona em ratos machos. Resumidamente, ratos Sprague Dawley machos saudáveis foram aclimatados e randomizados em três grupos (G1 a G3). Os animais do grupo de tratamento foram suplementados com C-77 (G2; 100 mg/kg) ou C-78 (G3; 100 mg/kg; p.o.) uma vez ao dia por 3 semanas em 0,5% de CMC em água. Os animais do grupo controle (G1) foram suplementados apenas com veículo (0,5% CMC em água).
[0047] No dia 22, amostras de sangue foram coletadas de todos os animais; os soros foram separados e analisados quanto aos níveis de testosterona usando um kit de imunoensaio enzimático disponível no mercado. No dia 22, os animais foram sacrificados, epidídimos caudais juntamente com vastos deferentes (ambos os lados) foram dissecados e as amostras de sêmen foram espremidas em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco para análise de sêmen. A análise do sêmen incluiu contagem total de espermatozoides, porcentagem de espermatozoides vivos, espermatozoides móveis e células espermáticas com morfologia normal. Os ratos suplementados com a composição-77 (G2) e a composição-78 (G3) apresentaram aumento significativo (<0,05) de testosterona sérica níveis no dia 22 com melhora de 57% e 155%, respectivamente, em relação ao grupo controle (G1). Os níveis de testosterona sérica em diferentes grupos de tratamento estão resumidos na Tabela 16 e representados na Figura I. Da mesma forma, os grupos de tratamento também mostraram parâmetros de sêmen melhorados, quando comparados com o grupo de controle, conforme resumido na Tabela 17 e representado na
Figura II. Estas observações sugerem claramente que as composições inventivas C-77 e C-78 aumentaram a atividade androgênica e as funções testiculares nos ratos experimentais.
[0048] O anterior demonstra, portanto, que as composições herbáceas/fitoterápicas sinérgicas da presente invenção compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou suas misturas derivadas de partes de plantas de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Theobroma cacao têm o potencial de melhorar os níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, resistência/força muscular, função sexual (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e concentração); e reduzir o estresse em humanos e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona em humanos, como perda de libido, disfunção erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força muscular, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação e diminuição da memória e concentração.
[0049] Portanto, em uma modalidade importante, a presente invenção fornece composições herbáceas sinérgicas que compreendem a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou suas misturas derivadas de partes de plantas de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Theobroma cacao para obter pelo menos um benefício para a saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aprimoradas no corpo selecionado de melhorar os níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, resistência muscular, função sexual (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e concentração); e reduzir o estresse em humanos e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona em humanos, como perda da libido, perda da função erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força muscular, fadiga, mudança de humor, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação, e diminuição da memória e concentração.
[0050] Em outra modalidade importante, a presente invenção fornece composições fitoterápicas sinérgicas que compreendem a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou suas misturas derivadas das partes da planta de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Theobroma cacao e opcionalmente contendo pelo menos um componente adicional selecionado do grupo que consiste em agente biológico (s); ingredientes ativos farmaceuticamente aceitáveis, vitaminas, minerais; farmaceuticamente ou nutraceuticamente ou dieticamente aceitáveis, excipientes, transportadores ou diluentes para a obtenção de pelo menos um benefício de saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aprimoradas no corpo selecionadas de melhorar os níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular , massa muscular, resistência muscular, função sexual (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e concentração); e reduzir o estresse em humanos e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona em humanos, como perda da libido, perda da função erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força muscular, fadiga, mudança de humor, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação, e diminuição da memória e concentração.
[0051] Em outra modalidade, a invenção fornece a(s) composição(ões) conforme descrito(s) acima para a obtenção de pelo menos um benefício para a saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aumentadas no corpo selecionadas de melhorar os níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, resistência muscular, função sexual (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e concentração); e reduzir o estresse em humanos e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona em humanos, como perda da libido, perda da função erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força muscular, fadiga, mudança de humor, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação, e memória e concentração diminuídas, em que os solventes usados para preparar os extratos e as frações usadas nas composições podem ser selecionados a partir de, mas não limitados a,
álcoois C1-C5, como etanol, metanol, n-propanol, álcool isopropílico; cetonas como acetona, metilisobutil cetona, solventes clorados como dicloreto de metileno e clorofórmio, água e suas misturas; Hidrocarbonetos C1-C7, tais como hexano; ésteres como acetato de etilo e semelhantes e suas misturas.
[0052] Em outra modalidade, a invenção fornece a(s) composição(ões) conforme descrito acima, em que as composições sinérgicas contêm opcionalmente pelo menos um componente adicional selecionado do grupo que consiste em agente(s) biológico(s); ingredientes farmaceuticamente ativos, vitaminas, minerais; farmaceuticamente ou nutraceuticamente ou dieticamente aceitáveis, excipientes, veículos ou diluentes.
[0053] Em outra modalidade, a invenção fornece a(s) composição(ões) conforme descrita(s) acima para a obtenção de pelo menos um benefício para a saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aumentadas no corpo selecionadas de melhorar os níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, resistência muscular, função sexual (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e concentração); e reduzir o estresse em humanos e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona em humanos, como perda da libido, perda da função erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força muscular, fadiga, mudança de humor, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação, e diminuição da memória e concentração, em que as partes da planta usadas para preparar os extratos podem ser selecionadas a partir de folhas, caules, caules tenros, galhos tenros, partes aéreas, frutos inteiros, cascas de frutos, sementes, cabeças de flores, raízes, cascas, madeira dura ou inteiros planta ou misturas dos mesmos.
[0054] Na outra modalidade, a presente invenção fornece composição(ões) conforme descritas acima para obter pelo menos um benefício para a saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aumentadas no corpo selecionado de melhorar os níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, resistência muscular, função sexual (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e concentração); e reduzir o estresse em humanos e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona em humanos, como perda da libido, perda da função erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força muscular, fadiga, mudança de humor, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação, e memória e concentração diminuídas, onde os extratos ou frações são padronizados para pelo menos um composto marcador de referência fitoquímica ou marcador biológico ativo no extrato ou fração.
[0055] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece métodos de obtenção de pelo menos um benefício para a saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aumentadas no corpo, selecionadas de melhorar os níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, resistência muscular, função sexual (libido e função erétil) e bem-estar psicológico (humor e concentração); e reduzindo o estresse; e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona, como perda de libido, perda da função erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e força muscular, fadiga, mudança de humor, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação e diminuição da memória e concentração em humanos, em que o método compreende suplementar o referido sujeito humano com uma dose eficaz de composições fitoterápicas sinérgicas compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados de as partes da planta de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou suas misturas derivados das partes da planta de Theobroma cacao.
[0056] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece métodos de obtenção de pelo menos um benefício para a saúde relacionado a atividades anabólicas e androgênicas aumentadas no corpo, selecionadas de melhorar os níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, resistência, envelhecimento saudável, longevidade celular, músculo massa, força muscular, função sexual (libido e função erétil) e bem- estar psicológico (humor e concentração); e reduzindo o estresse; e aliviar os sintomas associados aos baixos níveis de testosterona, como perda de libido, perda da função erétil, obesidade abdominal, diminuição da massa e resistência muscular, fadiga, mudança de humor, diminuição da densidade óssea, diminuição da motivação e diminuição da memória e concentração em um mamífero ou animal de sangue quente, em que o método compreende suplementar ou tratar o referido mamífero ou animal de sangue quente com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de ervas sinérgica compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(s), ativo composto(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir do (s) extrato (s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Theobroma cacao e opcionalmente contendo pelo menos um ingrediente adicional selecionado a partir de excipiente farmaceuticamente aceitável, farmaceuticamente aceitável diluente e veículo farmaceuticamente aceitável.
[0057] Em outra modalidade exemplar, as composições herbáceas sinérgicas inventivas compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou suas misturas derivadas das partes da planta de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados de partes da planta de Theobroma cacao podem ainda ser combinados opcionalmente com agentes biológicos e um ou mais excipientes, transportadores farmaceuticamente ou dieteticamente aceitáveis e diluentes selecionados de monossacarídeos, tais como glicose, dextrose, frutose, galactose etc .; Dissacarídeos, tais como, mas não limitados a sacarose, maltose, lactose, lactulose, trealose celobiose, quitobiose etc.; Policarboidratos, tais como amido e amido modificado, tais como glicolato de amido sódico, amido pré-gelatinizado, amido solúvel e outros amidos modificados tais como, mas não limitados a Ultrasperse A e Ultra-tex 4; Dextrinas que são produzidas por hidrólise de amido ou glicogênio, tais como dextrina amarela, dextrina branca, maltodextrina etc.; Álcoois poli-hídricos ou álcoois de açúcar, tais como, mas não limitados a, Sorbitol, manitol, inositol, xilitol, isomalte etc.; derivados à base de celulose, tais como, mas não se limitando a, celulose microcristalina, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxietilcelulose etc.; silicatos, tais como, mas não se limitando a neusilina, veegum, Talco, dióxido de silício coloidal etc.; estearatos metálicos, tais como, mas não se limitando a estearato de cálcio, estearato de magnésio, estearato de zinco, etc.; Ácidos orgânicos, tais como ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido succínico, ácido láctico, ácido L-ascórbico etc.; Ésteres de ácidos graxos e ésteres de polissorbato, gomas naturais, tais como, mas não se limitando a, acácia, carragenina, goma de guar, goma xantana etc.; grupo vitamina B, nicotinamida, pantotenato de cálcio, aminoácidos, proteínas tais como, mas não se limitando a caseína, gelatina, pectina, ágar; sais de metais orgânicos tais como mas não limitados a cloreto de sódio, cloreto de cálcio, fosfato dicálcico, sulfato de zinco, cloreto de zinco etc.; Pigmentos naturais, sabores, conservantes de Classe I e Classe II e soluções aquosas, alcoólicas, hidroalcoólicas e orgânicas dos ingredientes listados acima, sozinhos ou em combinação.
[0058] Em outra modalidade, a(s) composição(ões) da presente invenção podem ser formuladas em uma forma de dosagem selecionada a partir da forma de pó seco, forma líquida, bebida, produto alimentar, suplemento dietético ou qualquer forma adequada, tal como comprimido, uma cápsula ou um mastigável macio ou ursinho de goma.
[0059] Em outra modalidade da invenção, a(s) composição(ões) conforme divulgada(s) acima podem ser formuladas em suplementos nutricionais/dietéticos que podem ser contemplados/feitos na forma de dosagem de alimentos saudáveis, ou alimentos para usos específicos de saúde, como alimentos sólidos como chocolate ou barras nutricionais, alimentos semissólidos como creme ou geleia, ou gel e também bebidas e semelhantes, como bebida refrescante, bebida instantânea, bebidas funcionais para atletas esportivos, exercícios e construção muscular para indivíduos, bebida de bactérias de ácido lático, gotas, doces, mastigação goma, goma de goma, iogurte, sorvete, pudim, geleia de feijão azuki macio, geleia, biscoito, chá, refrigerante, suco, leite, café, cereal, petiscos de bar e semelhantes.
[0060] Em ainda outra modalidade, a presente invenção provê composições fitoterápicas/herbáceas sinérgicas compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou suas misturas derivadas de partes de plantas de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Theobroma cacao, em que o peso do primeiro ingrediente varia na faixa de 10% -90% e o peso do segundo ingrediente varia na faixa de 90% -10% na composição.
[0061] Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece composições fitoterápicas sinérgicas, em que a composição é padronizada para Punicalaginas na faixa de concentração de 0,1% a 20% em peso da composição e teobromina na faixa de concentração de 0,1% a 10% em peso de a composição.
[0062] Em um aspecto adicional, as composições fitoterápicas sinérgicas da presente invenção compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Punica granatum e um segundo ingrediente selecionado a partir do(s) extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados das partes da planta de Theobroma cacao podem ser opcionalmente combinados com micronutrientes, tais como magnésio, zinco e boro, em forma elementar ou compostos contendo esses elementos; ou aminoácidos, tais como ácido D- aspártico.
[0063] Em outra modalidade, a(s) composição(ões) da presente invenção podem ser entregues na forma de comprimidos de liberação controlada, usando revestimentos à base de polímero de liberação controlada pelas técnicas, incluindo nanotecnologia, microencapsulação, sistemas transportadores coloidais e outros sistemas de distribuição de drogas para obter o desejado benefício terapêutico.
[0064] Aqueles versados na técnica irão apreciar que mudanças podem ser feitas nas modalidades descritas acima, sem se afastar do amplo conceito inventivo das mesmas. Entende-se, portanto, que esta invenção não está limitada às modalidades particulares ou exemplos divulgados neste documento, mas se destina a cobrir modificações dentro dos objetivos e escopo da presente invenção, conforme definido no relatório descritivo. Os exemplos apresentados ilustram a invenção, mas não devem ser considerados como limitando o escopo da invenção de qualquer forma. Exemplos: Exemplo 1: Preparação de etanol de Punica granatum e extratos de etanol aquoso
[0065] Casca da fruta Punica granatum (100 g) foi pulverizada e o pó foi extraído com etanol (700 mL) à TA durante 1 h. O extrato foi filtrado e a matéria-prima usada foi extraída novamente duas vezes com etanol (2 × 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obter um resíduo de extrato etanólico (P.G-1; 17,5 g).
[0066] O extrato de etanol aquoso de 90% (PG-2; 16,5 g), extrato de etanol aquoso de 80% (PG-3; 27,0 g), extrato de etanol aquoso de 70% (PG-4; 35,7 g) e extrato de etanol aquoso de 50% (PG -5; 38,0 g) da casca da fruta Punica granatum foram obtidos através da adoção de procedimento de extração semelhante ao descrito acima usando etanol aquoso 90%, etanol aquoso 80%, etanol aquoso 70% e etanol aquoso 50% como solventes de extração, respectivamente. Exemplo 2: Preparação de extrato de água de Punica granatum
[0067] Casca de fruta Punica granatum (100 g) foi pulverizada e o pó foi extraído com água (700 mL) à TA durante 1 h. O extrato foi filtrado e a matéria-prima usada foi extraída novamente duas vezes com água (2 × 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obter um resíduo de extrato aquoso (P.G-6; 38,5 g). Exemplo 3: Preparação de metanol de Punica granatum e extratos de metanol aquosos
[0068] Casca da fruta de Punica granatum (100 g) foi pulverizada e o pó foi extraído com metanol (700 mL) à TA durante 1 h. O extrato foi filtrado e a matéria-prima usada foi extraída novamente duas vezes com metanol (2 × 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obter um resíduo de extrato de metanol (P.G-7; 25,0 g).
[0069] O extrato de metanol aquoso a 50% (P.G-8; 34,4 g) da casca da fruta de Punica granatum foi obtido adotando um procedimento semelhante usando metanol aquoso a 50% como solvente de extração. Exemplo 4: Preparação de Punica granatum acetona e extratos de acetona aquosos
[0070] Casca da fruta de Punica granatum (100 g) foi pulverizada e o pó foi extraído com acetona (700 mL) à temperatura ambiente durante 1 h. O extrato foi filtrado e a matéria-prima usada foi extraída novamente duas vezes com acetona (2 × 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obter um resíduo de extrato de acetona (P.G-9; 4,2 g).
[0071] O extrato de acetona aquosa a 50% (P.G-10; 47,6 g) de casca da fruta de Punica granatum foi obtido adotando procedimento semelhante usando acetona aquosa a 50% como solvente de extração. Exemplo 5: Preparação de extrato de acetato de etila Punica granatum
[0072] Casca de fruta Punica granatum (100 g) foi pulverizada e o pó foi extraído com acetato de etila (700 mL) à TA durante 1 h. O extrato foi filtrado e a matéria-prima usada foi extraída novamente duas vezes com acetato de etila (2 × 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obter um resíduo de extrato de acetato de etila (P.G-11; 1,1 g). Exemplo 6: Padronização de extratos de Punica granatum
[0073] Os vários extratos de Punica granatum foram padronizados para punicalagina pelo método de HPLC analítico e os resultados foram resumidos na Tabela 1. Tabela 1 S. No. Código do Solvente para Peso do Punicalaginas extrato extração produto (HPLC) 1 P.G-1 Etanol 17,5 g 8,05% 2 P.G-2 90% etanol 16,5 g 13,86% 3 P.G-3 80% etanol 27,0 g 14,6% 4 P.G-4 70% etanol 35,7 g 13,4% 5 P.G-5 50% etanol 38,0 g 9,5% 6 P.G-6 Água 38,5 g 2,5% 7 P.G-7 Metanol 25,0 g 11,6% 8 P.G-8 50% metanol 34,4 g 8,9% 9 P.G-9 Acetona 4,2 g 15,4% 10 P.G-10 50% acetona 47,6 g 12,14% 11 P.G-11 Acetato de Etila 1,1 g 0,43% Exemplo 7: Preparação do extrato de água da semente de Theobroma cacao
[0074] Sementes de Theobroma cacao (100 g) foram pulverizadas e o pó extraído com água (700 mL) à temperatura ambiente por 1 h. O extrato foi filtrado e a matéria-prima usada foi extraída novamente duas vezes com água (2 × 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obter um resíduo de extrato de água como um pó (T.C-1; 11,3 g). Exemplo 8: Preparação de etanol dA semente de Theobroma cacao e extratos de etanol aquoso
[0075] Sementes de Theobroma cacao (100 g) foram pulverizadas e o pó foi extraído com etanol aquoso a 50% (700 mL) à temperatura ambiente por 1 h. O extrato foi filtrado e a matéria-prima usada foi reextraída duas vezes com etanol aquoso a 50% (2 × 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obter um resíduo de extrato de etanol aquoso a 50% (T.C-2; 9,9 g).
[0076] O extrato etanólico (TC-3; 4,4 g), extrato etanólico aquoso 90% (TC-4; 4,5 g) e extrato etanólico aquoso 70% (TC- 5; 8,3 g) de sementes de Theobroma cacao foram obtidos adotando-se procedimento de extração semelhante usando etanol, etanol aquoso a 90% e etanol aquoso a 70% como solventes de extração, respectivamente. Exemplo 9: Preparação de metanol dA semente de Theobroma cacao e extratos de metanol aquosos
[0077] Sementes de Theobroma cacao (100 g) foram pulverizadas e o pó foi extraído com metanol (700 mL) à temperatura ambiente por 1 h. O extrato foi filtrado e a matéria-prima usada foi extraída novamente duas vezes com metanol (2 × 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obter um resíduo de extrato de metanol (T.C-6; 5,8 g).
[0078] O extrato de metanol aquoso a 50% (T.C-7; 10,0 g) das sementes de Theobroma cacao foram obtidos adotando procedimento semelhante usando metanol a 50% como solvente de extração. Exemplo 10: Preparação de acetona da semente de Theobroma cacao e extratos de acetona aquosos
[0079] Sementes de Theobroma cacao (100 g) foram pulverizadas e o pó foi extraído com acetona (700 mL) à temperatura ambiente por 1 h. O extrato foi filtrado e a matéria-prima usada foi extraída novamente duas vezes com acetona (2 × 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obter um resíduo de extrato de acetona (T.C-8; 27,5 g).
[0080] O extrato de acetona aquosa a 50% (T.C-9; 13,5 g) das sementes de Theobroma cacao foi obtido adotando procedimento semelhante usando acetona a 50% como solvente de extração. Exemplo 11: Preparação do extrato de acetato de etila da semente de Theobroma cacao
[0081] Sementes de Theobroma cacao (100 g) foram pulverizadas e o pó foi extraído com acetato de etila (700 mL) à temperatura ambiente por 1 h. O extrato foi filtrado e a matéria-prima usada foi extraída novamente duas vezes com acetato de etila (2 × 500 mL) em condições semelhantes. O extrato combinado foi filtrado e concentrado sob vácuo para obter o extrato de acetato de etila (T.C-10; 28,5 g). Exemplo 12: Padronização de extratos de sementes de Theobroma cacao
[0082] Os vários extratos da semente de Theobroma cacao foram padronizados para Teobromina pelo método de HPLC analítico e os resultados foram resumidos na Tabela 2. Tabela 2 S. Código do Solvente para Peso do Theobromina No. extrato extração produto (HPLC) 1 T.C-1 água 11,3 g 3,69% 2 T.C-2 50% etanol 9,9 g 6,8% 3 T.C-3 Etanol 4,4 g 7,5% 4 T.C-4 90% etanol 4,5 g 9,2% 5 T.C-5 70% etanol 8,3 g 7,7% 6 T.C-6 Metanol 5,8 g 5,99% 7 T.C-7 50% metanol 10,0 g 6,9% 8 T.C-8 Acetona 27,5 g 0,79% 9 T.C-9 50% acetona 13,5 g 7,26% 10 T.C-10 Acetato de Etila 28,5 g 0,35%
Exemplo 13: Preparação de composições contendo extrato de etanol aquoso a 70% da casca de Punica granatum e extrato da água da semente de Theobroma cacao
[0083] Composição-1 (C-1): A composição-1 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 4: 1.
[0084] Composição-2 (C-2): A composição-2 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 3: 1.
[0085] Composição-3 (C-3): A composição-3 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 2: 1.
[0086] Composição-4 (C-4): A composição-4 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 1.
[0087] Composição-5 (C-5): A composição-5 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 2.
[0088] Composição-6 (C-6): A composição-6 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 3.
[0089] Composição-7 (C-7): A composição-7 foi preparada combinando extrato de etanol 70% de Punica granatum (P.G-4) e extrato de água de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1:
4.
[0090] Exemplo 14: Preparação de composições contendo extrato de etanol aquoso a 70% da casca de Punica granatum e extrato de etanol aquoso a 50% da semente de Theobroma cacao.
[0091] Composição-8 (C-8): A composição-8 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 4: 1.
[0092] Composição-9 (C-9): A composição-9 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 50% (T.C-2) na proporção de 3: 1.
[0093] Composição-10 (C-10): A composição-10 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 2: 1.
[0094] Composição-11 (C-11): A composição-11 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 1: 1.
[0095] Composição-12 (C-12): A composição-12 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 1: 2.
[0096] Composição-13 (C-13): A composição-13 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 1: 3.
[0097] Composição-14 (C-14): A composição-14 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70%
(P.G-4) e extrato etanólico aquoso 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 1:4. Exemplo 15: Preparação de composições contendo extrato de etanol aquoso a 70% da casca de Punica granatum e etanol aquoso a 90% de semente de Theobroma cacao ou extrato de etanol aquoso a 70%
[0098] Composição-15 (C-15): A composição-15 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 90% (T.C-4) na proporção de 4: 1.
[0099] Composição-16 (C-16): A composição-16 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 90% (T.C-4) na proporção de 3: 1.
[0100] Composição-17 (C-17): A composição-17 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 90% (T.C-4) na proporção de 2: 1.
[0101] Composição-18 (C-18): A composição-18 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 90% (T.C-4) na proporção de 1: 1.
[0102] Composição-19 (C-19): A composição-19 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 90% (T.C-4) na proporção de 1: 2.
[0103] Composição-20 (C-20): A composição-20 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 90% (T.C-4) na proporção de 1: 3.
[0104] Composição-21 (C-21): A composição-21 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 90% (T.C-4) na proporção de 1: 4.
[0105] Composição-22 (C-22): A composição-22 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 70% (T.C-5) na proporção de 4: 1.
[0106] Composição-23 (C-23): A composição-23 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 70% (T.C-5) na proporção de 3: 1.
[0107] Composição-24 (C-24): A composição-24 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 70% (T.C-5) na proporção de 2: 1.
[0108] Composição-25 (C-25): A composição-25 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 70% (T.C-5) na proporção de 1: 1.
[0109] Composição-26 (C-26): A composição-26 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 70% (T.C-5) na proporção de 1: 2.
[0110] Composição-27 (C-27): A composição-27 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 70% (T.C-5) na proporção de 1: 3.
[0111] Composição-28 (C-28): A composição-28 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70%
(P.G-4) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 70% (T.C-5) na proporção de 1: 4. Exemplo 16: Preparação de composições contendo extrato de etanol aquoso da casca de Punica granatum 70% e metanol da semente de Theobroma cacao ou metanol aquoso 50% ou acetona ou acetona aquosa 50% ou extrato de acetato de etila
[0112] Composição-29 (C-29): A composição-29 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato metanólico de Theobroma cacao (T.C-6) na proporção de 2: 1.
[0113] Composição-30 (C-30): A composição-30 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato metanólico de Theobroma cacao (T.C-6) na proporção de 1: 1.
[0114] Composição-31 (C-31): A composição-31 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato metanólico de Theobroma cacao (T.C-6) na proporção de 1: 2.
[0115] Composição-32 (C-32): A composição-32 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato metanólico 50% de Theobroma cacao (T.C-7) na proporção de 2: 1.
[0116] Composição-33 (C-33): A composição-33 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato metanólico 50% Theobroma cacao (T.C-7) na proporção de 1: 1.
[0117] Composição-34 (C-34): A composição-34 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato metanólico 50% Theobroma cacao (T.C-7) na proporção de 1: 2.
[0118] Composição-35 (C-35): A composição-35 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato de acetona de Theobroma cacao (T.C-8) na proporção de 2: 1.
[0119] Composição-36 (C-36): A composição-36 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato de acetona de Theobroma cacao (T.C-8) na proporção de 1: 1.
[0120] Composição-37 (C-37): A composição-37 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato de acetona de Theobroma cacao (T.C-8) na proporção de 1: 2.
[0121] Composição-38 (C-38): A composição-38 foi preparada pela combinação de Punica granatum 70% do extrato de etanol aquoso (P.G-4) e Theobroma cacao 50% de extrato de acetona aquosa (T.C-9) na proporção de 2: 1.
[0122] Composição-39 (C-39): A composição-39 foi preparada pela combinação de Punica granatum 70% de extrato de etanol aquoso (P.G-4) e Theobroma cacao 50% de extrato de acetona aquosa (T.C-9) na proporção de 1: 1.
[0123] Composição-40 (C-40): A composição-40 foi preparada combinando extrato de etanol aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato de acetona aquosa de Theobroma cacao 50% (T.C-9) na proporção de 1: 2.
[0124] Composição-41 (C-41): A composição-41 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato de acetato de etila de Theobroma cacao (T.C-10) na proporção de 2: 1.
[0125] Composição-42 (C-42): A composição-42 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70%
(P.G-4) e extrato de acetato de etila de Theobroma cacao (T.C-10) na proporção de 1: 1.
[0126] Composição-43 (C-43): A composição-43 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 70% (P.G-4) e extrato de acetato de etila de Theobroma cacao (T.C-10) na proporção de 1: 2. Exemplo 17: Preparação de composições contendo etanol da casca de Punica granatum ou etanol aquoso a 50% ou extrato de água e etanol da semente de Theobroma cacao ou água ou extrato de etanol aquoso a 50%
[0127] Composição-44 (C-44): A composição-44 foi preparada combinando extrato etanólico de Punica granatum (P.G-1) e extrato etanólico Theobroma cacao (T.C-3) na proporção de 2:
1.
[0128] Composição-45 (C-45): A composição-45 foi preparada combinando o extrato etanólico de Punica granatum (P.G-1) e o extrato etanólico Theobroma cacao (T.C-3) na proporção de 1:
1.
[0129] Composição-46 (C-46): A composição-46 foi preparada combinando o extrato etanólico de Punica granatum (P.G-1) e o extrato etanólico Theobroma cacao (T.C-3) na proporção de 1:
2.
[0130] Composição-47 (C-47): A composição-47 foi preparada combinando o extrato etanólico de Punica granatum (P.G-1) e o extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 2:
1.
[0131] Composição-48 (C-48): A composição-48 foi preparada combinando o extrato etanólico de Punica granatum (P.G-1) e o extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1:
1.
[0132] Composição-49 (C-49): A composição-49 foi preparada combinando o extrato etanólico de Punica granatum (P.G-1) e o extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1:
2.
[0133] Composição-50 (C-50): A composição-50 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 50% (P.G-5) e extrato etanólico Theobroma cacao (T.C-3) na proporção de 2: 1.
[0134] Composição-51 (C-51): A composição-51 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 50% (P.G-5) e extrato etanólico de Theobroma cacao (T.C-3) na proporção de 1: 1.
[0135] Composição-52 (C-52): A composição-52 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 50% (P.G-5) e extrato etanólico de Theobroma cacao (T.C-3) na proporção de 1: 2.
[0136] Composição-53 (C-53): A composição-53 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 50% (P.G-5) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 2: 1.
[0137] Composição-54 (C-54): A composição-54 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 50% (P.G-5) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 1.
[0138] Composição-55 (C-55): A composição-55 foi preparada combinando extrato etanólico aquoso de Punica granatum 50% (P.G-5) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 2.
[0139] Composição-56 (C-56): A composição-56 foi preparada combinando extrato aquoso de Punica granatum (P.G-6) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 50% (T.C-2) na proporção de 2: 1.
[0140] Composição-57 (C-57): A composição-57 foi preparada combinando extrato de água de Punica granatum (P.G-6) e extrato de etanol aquoso a 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 1: 1.
[0141] Composição-58 (C-58): A composição-58 foi preparada combinando extrato de água de Punica granatum (P.G-6) e extrato de etanol aquoso a 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 1: 2.
[0142] Composição-59 (C-59): A composição-59 foi preparada combinando o extrato aquoso de Punica granatum (P.G-6) e o extrato aquoso Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 2: 1.
[0143] Composição-60 (C-60): A composição-60 foi preparada combinando o extrato aquoso de Punica granatum (P.G-6) e o extrato aquoso Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 1.
[0144] Composição-61 (C-61): A composição-61 foi preparada combinando extrato aquoso de Punica granatum (P.G-6) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1:
2. Exemplo 18: Preparação de composições contendo metanol da casca de Punica granatum ou 50% de metanol aquoso ou acetona ou 50% de acetona aquosa ou extrato de acetato de etila e semente de Theobroma cacao, 50% de etanol aquoso ou extrato de água
[0145] Composição-62 (C-62): A composição-62 foi preparada combinando extrato de metanol de Punica granatum (P.G-7) e extrato de etanol aquoso a 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 2: 1.
[0146] Composição-63 (C-63): A composição-63 foi preparada combinando extrato de metanol de Punica granatum (P.G-7) e extrato de etanol aquoso a 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 1: 1.
[0147] Composição-64 (C-64): A composição-64 foi preparada combinando extrato de metanol de Punica granatum (P.G-7) e extrato de etanol aquoso de Theobroma cacao 50% (T.C-2) na proporção de 1: 2.
[0148] Composição-65 (C-65): A composição-65 foi preparada pela combinação de Punica granatum 50% extrato de metanol aquoso (P.G-8) e extrato de água de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 2: 1.
[0149] Composição-66 (C-66): A composição-66 foi preparada combinando extrato metanólico aquoso de Punica granatum 50% (P.G-8) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 1.
[0150] Composição-67 (C-67): A composição-67 foi preparada combinando extrato metanólico aquoso de Punica granatum 50% (P.G-8) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 2.
[0151] Composição-68 (C-68): A composição-68 foi preparada combinando extrato de acetona de Punica granatum (P.G-9) e extrato de etanol aquoso a 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 2: 1.
[0152] Composição-69 (C-69): A composição-69 foi preparada combinando extrato de acetona de Punica granatum (P.G-9) e extrato de etanol aquoso a 50% de Theobroma cacao (T.C-2) na proporção de 1: 1.
[0153] Composição-70 (C-70): A composição-70 foi preparada combinando extrato de acetona de Punica granatum (P.G-9) e extrato etanólico aquoso de Theobroma cacao 50% (T.C-2) na proporção de 1: 2.
[0154] Composição-71 (C-71): A composição-71 foi preparada combinando extrato de acetona aquosa de Punica granatum 50% (P.G-10) e extrato de água de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 2: 1.
[0155] Composição-72 (C-72): A composição-72 foi preparada combinando extrato aquoso de acetona de Punica granatum 50% (P.G-10) e extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 1.
[0156] Composição-73 (C-73): A composição-73 foi preparada combinando extrato de acetona aquosa de Punica granatum 50% (P.G-10) e extrato de água de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 2.
[0157] Composição-74 (C-74): A composição-74 foi preparada combinando o extrato de acetato de etila Punica granatum (P.G-11) e o extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 2: 1.
[0158] Composição-75 (C-75): A composição-75 foi preparada combinando o extrato de acetato de etila de Punica granatum (P.G-11) e o extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 1.
[0159] Composição-76 (C-76): A composição-76 foi preparada combinando o extrato de acetato de etila Punica granatum (P.G-11) e o extrato aquoso de Theobroma cacao (T.C-1) na proporção de 1: 2. Exemplo 19: Formulação das composições
[0160] Composição-77 (C-77): A composição-77 foi preparada pela combinação de 60 g de extrato de etanol aquoso da casca de Punica granatum 70% (PG-4), 15 g de extrato de água de Theobroma cacao (TC-1), 10 g de Ultrasperse A, 13 g de celulose microcristalina e 2 g de silóide na presença de etanol/água e em seguida secagem para dar a composição.
[0161] Composição-78 (C-78): A composição-78 foi preparada combinando 60 g de extrato de etanol aquoso a 70% da casca de Punica granatum (PG-4), 15 g de extrato de etanol aquoso a 50% de Theobroma cacao (TC-2), 23 g de maltodextrina e 2 g de silóide na presença de etanol/água e, em seguida, secagem para dar a composição. Exemplo 20: Procedimento geral para ensaio de testosterona
[0162] Os extratos fitoterápicos e suas composições foram avaliados quanto à capacidade de induzir a produção de testosterona na linhagem celular de Leydig de camundongo MA- 10 (ATCC, Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em frascos revestidos com gelatina 0,1% na presença de meio DMEM: F12 (ATCC, Manassas, VA, EUA) suplementado com soro de cavalo 15% e HEPES 20mM a 37oC em uma incubadora de CO2. Um número igual de células foi plaqueado em cada poço de uma placa de cultura de células de 96 poços revestida com gelatina e deixou-se anexar durante a noite. As células lavadas foram suplementadas com meio DMEM livre de soro: F12 e tratadas com diferentes concentrações das amostras de teste e incubadas por mais 48 h. Os poços de cultura que receberam 0,2% de DMSO foram considerados como controle do veículo e o hormônio luteinizante foi usado como controle positivo. Os sobrenadantes da cultura foram coletados, clarificados a
10.000 g por 5 min a 4o C e usados para estimativa de testosterona usando um kit ELISA específico disponível comercialmente.
[0163] O ensaio ELISA foi realizado usando o kit Testosterona EIA (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.
Este ensaio é baseado na competição entre testosterona e um conjugado de testosterona-acetilcolinesterase (AchE) (marcador de testosterona) por uma quantidade limitada de anticorpo de testosterona.
O reagente de Ellman contendo o substrato de AchE é usado para detectar a atividade enzimática.
O produto da reação enzimática é de cor amarela e é fortemente absorvido a 412 nm.
A intensidade da cor é proporcional à quantidade do marcador de testosterona ligado ao poço e inversamente proporcional à testosterona disponível nas amostras de teste.
Amostras de cinquenta microlitros de sobrenadantes de cultura livre de células foram usadas para estimar o conteúdo de testosterona.
Uma curva padrão foi traçada com um conjunto de concentrações conhecidas de padrões de testosterona de acordo com o protocolo.
A sensibilidade relatada do kit de ensaio foi de 6 pg/ml.
Os resultados estão resumidos na Tabela 3-8. Tabela 3: Atividade de testosterona das composições contendo extrato de etanol a 70% da casca de Punica granatum e extrato de água da semente de Theobroma cacao.
Comp Dose % aumento de # da testosterona P.G-4 T.C-1 Comp sobre o controle razão µg/mL Aditivo % % (Calcu- Observado µg/mL µg/mL aumento aumento lado) C-1 0,16 7,10 0,04 0,86 4:1 0,2 7,96 18,3 C-2 0,15 6,66 0,05 1,07 3:1 0,2 7,73 21,28 C-3 0,13 5,77 0,07 1,50 2:1 0,2 7,27 32,55 C-4 0,1 4,44 0,1 2,14 1:1 0,2 6,58 21,35 C-6 0,25 3,95 0,75 2,93 1:3 1,0 6,88 12,52 C-7 0,2 3,16 0,8 3,13 1:4 1,0 6,29 20,29
Tabela 4: Atividade de testosterona das composições contendo extrato de etanol 70% da casca de Punica granatum e extrato de etanol aquoso a 50% da semente de Theobroma cacao.
Comp.
Dose % aumento do # da testosterona sobre P.G-4 T.C-2 Pro- Comp. o controle porção µg/mL Aditivo % % Observado µg/mL µg/mL (Calculado) aumento aumento C-8 0,16 7,10 0,04 3,85 4:1 0,2 10,95 25,74 C-9 0,15 6,66 0,05 4,81 3:1 0,2 11,47 28,1 C-10 0,13 5,77 0,07 6,74 2:1 0,2 12,51 28,1 C-11 0,1 4,44 0,1 9,62 1:1 0,2 14,06 27,13 C-14 0,04 3,56 0,16 15,4 1:4 0,2 18,96 23,41 Tabela 5: Atividade de testosterona das composições contendo extrato de etanol 70% da casca de Punica granatum e etanol aquoso 90% da semente de Theobroma cacao ou extrato de etanol aquoso de 70%. Comp.
Dose % aumento do # da testosterona sobre P.G-4 T.C-4 Pro- Comp o controle porção µg/mL Aditivo % % Observado µg/mL µg/mL (Calculado) aumento aumento C-16 0,15 0,27 0,05 1,93 3:1 0,2 2,20 19,04 C-17 0,67 6,49 0,33 3,56 2:1 1,0 10,05 22,02 C-18 0,5 4,84 0,5 5,39 1:1 1,0 10,23 18,59 C-21 0,04 0,07 0,16 6,19 1:4 0,2 6,26 11,75 P.G-4 T.C-5 C-23 0,75 4,29 0,25 4,08 3:1 1,0 8,37 17,06 C-24 0,67 3,83 0,33 5,39 2:1 1,0 9,22 24,92 C-25 0,5 2,86 0,5 8,17 1:1 1,0 11,03 24,92
Tabela 6: Atividade do testosterona nas composições contendo extrato de etanol 70% da casca de Punica granatum e metanol aquoso de semente de Theobroma cacao ou acetona aquosa a 50% ou extrato de acetato de etila.
Comp.
Dose % aumento do # da testosterona sobre P.G-4 T.C-7 Pro- Comp. o controle porção µg/mL Aditivo % % Observado µg/mL µg/mL (Calculado) aumento aumento C-34 0,07 10,13 0,13 4,42 1:2 0,2 1455 24,09 P.G-4 T.C-9 C-38 0,13 15,80 0,07 8,89 2:1 0,2 24,69 30,37 P.G-4 T.C-10 C-41 0,67 6,09 0,33 0,81 2:1 1,0 6,90 9,52 C-42 0,5 4,55 0,5 1,23 1:1 1,0 5,78 9,91 C-43 0,33 3,00 0,67 1,65 1:2 1,0 4,65 10,94 Tabela 7: Atividade de testosterona das composições contendo etanol da casca de Punica granatum ou etanol aquoso 50% ou extrato da água e etanol da semente de Theobroma cacao ou água ou 50% de extrato de etanol aquoso.
Comp.
Dose % aumento do # da testosterona sobre P.G-1 T.C-3 Comp. o controle Pro- µg/mL porção Aditivo Observado % % (Calculado) µg/mL µg/mL aumento aumento C-44 0,7 0,90 0,33 2,33 2:1 1,0 3,23 31,57 C-45 0,5 0,68 0,5 3,54 1:1 1,0 4,22 26,5 P.G-1 T.C-1 C-48 0,5 0.68 0,5 10,33 1:1 1,0 11,01 29,71 P.G-5 T.C-3 C-51 0,5 3,54 0,5 6,94 1:1 1,0 10,48 23,81 C-52 0,33 2,33 0,67 9,29 1:2 1,0 11,62 26,35 P.G-5 T.C-1 C-55 0,07 12,50 0,13 13,90 1:2 0,2 26,39 31,66 P.G-6 T.C-2 C-57 0,5 2,99 0,5 5,66 1:1 1,0 8,65 16,64
Tabela 8: Atividade do testosterona das composições contendo metanol da casca de Punica granatum ou 50% de metanol aquoso ou 50% de acetona aquosa ou extrato de acetato de etila e 50% de etanol aquoso da semente de Theobroma cacao ou extrato de água. Comp. Dose % aumento do # da testosterona sobre o P.G-7 T.C-2 Comp. controle Pro- porção µg/mL Aditivo % % Observado µg/mL µg/mL (Calculado) aumento aumento C-62 0,67 12,54 0,33 4,15 2:1 1,0 16,69 19,72 C-63 2,5 14,47 2,5 0,99 1:1 5,0 15,46 23,95 P.G-8 T.C-1 C-67 1,67 6,44 3,33 6,24 1:2 5,0 12,68 28,55 P.G-10 T.C-1 C-71 0,13 12,95 0,07 8,04 2:1 0,2 20,99 33,59 C-72 0,1 9,96 0,1 11,48 1:1 0,2 21,44 36,62 C-73 0,07 6,97 0,13 14,92 1:2 0,2 21,89 33,69 P.G-11 T.C-1 C-74 3,33 31,06 1,67 3,13 2:1 5,0 34,19 38,59 C-75 0,5 15,87 0,5 4,73 1:1 1,0 20,60 27,85 Exemplo 21: Procedimento geral para ensaio de inibição de aromatase
[0164] A inibição da aromatase foi determinada usando células intactas em cultura como descrito por Samson et al., (Samson M. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2009, 116, 154-159) com modificações. Resumidamente, células de coriocarcinoma da placenta (JEG-3) (ATCC; Cat # HTB-36) foram colhidas dos frascos de cultura e 40000 células/poço foram semeadas em uma placa de 96 poços em 200 µL de EMEM (Hi- Media; Cat # AL047S) + 5% de meio FBS sem carvão (Thermo Fisher; Cat # 12676011) e incubadas por 48 horas em uma incubadora de CO2. Após a incubação, o meio mais antigo foi reabastecido com 150 µL de meio EMEM + 5% de meio FBS separado com carvão vegetal. As células foram tratadas com diferentes concentrações de amostras de teste e incubadas por 1 hora em uma incubadora de CO2 (pré-tratamento). Após a incubação, todas as células foram tratadas com 50nM 4- Androstene-3, 17-diona (Indução; Sigma Cat # 46033-250MG), um substrato para aromatase, exceto para controle veículo (Células + 0,2% DMSO) e incubadas por 48 horas em uma incubadora de CO2. Após 48 horas, a placa de cultura foi centrifugada a 270xg por 10 minutos e os sobrenadantes livres de células foram coletados e armazenados em freezer -80°C até a análise. O imunoensaio enzimático (EIA) foi realizado para Estrona usando o kit EIA de ensaios Arbor (Cat # K031-H5) de acordo com o protocolo do fabricante. A inibição percentual da aromatase foi calculada pela seguinte fórmula: % de inibição da aromatase = [(concentração normalizada de estrona na indução) - (concentração normalizada de estrona nas amostras de teste)] / (concentração normalizada de estrona na indução) x 100.
[0165] Os resultados são apresentados nas tabelas 9-13. Tabela 9: Atividade inibidora da aromatase das composições contendo extrato de etanol a 70% da casca de Punica granatum e extrato de etanol aquoso a 50% da semente de Theobroma cacao. Comp. Dose da % inibição da # P.G-4 T.C-2 Comp aromatase Pro- µg/mL porção Aditivo µg/ % % Observado µg/mL (Calcudado) mL inibição inibição C-8 20,00 22,15 5,00 4,18 4:1 25,0 26,33 35,2 C-9 3,75 14,41 1,25 5,39 3:1 5,0 19,8 26,46 C-10 3,33 12,79 1,67 7,20 2:1 5,0 19,99 22,65 C-11 0,5 0,33 0,5 7,08 1:1 1,0 7,41 21,56 C-12 0,33 0,22 0,67 9,49 1:2 1,0 9,71 22,11 C-13 0,25 0,17 0,75 10,63 1:3 1,0 10,8 26,95 C-14 0,2 0,13 0,8 11,34 1:4 1,0 11,47 26,79
Tabela 10: Atividade inibidora da aromatase das composições contendo extrato de etanol a 70% da casca de Punica granatum e etanol aquoso a 90% da semente de Theobroma cacao ou extrato de etanol aquoso a 70%. Comp.
Dose % inibição da # P.G-4 T.C-4 da aromatase Pro- Comp porção µg/mL Aditivo % µg/mL inibição % µg/mL inibição (Calculado)Observado C-15 0,8 12,88 0,2 3,64 4:1 1,0 16,52 20,6 C-16 0,75 12,07 0,25 4,55 3:1 1,0 16,62 28,68 C-18 0,5 8,05 0,5 9,1 1:1 1,0 17,15 26,8 C-19 0,33 5,31 0,67 12,19 1:2 1,0 17,5 23,99 C-20 0,25 4,02 0,75 13,65 1:3 1,0 17,67 37,52 C-21 0,2 3,22 0,8 14,56 1:4 1,0 17,78 36,55 P.G-4 T.C-5 C-22 4,00 18,08 1,00 4,82 4:1 5,0 22,9 32,39 C-23 3,75 16,95 1,25 6,02 3:1 5,0 22,97 31,07 C-25 0,5 4,23 0,5 3,84 1:1 1,0 8,07 26,19 C-26 0,33 2,79 0,67 5,14 1:2 1,0 7,93 25,94 C-27 0.25 2.11 0,75 5,76 1:3 1,0 7,87 30,06 C-28 0.2 1.69 0,8 6,14 1:4 1,0 7,83 30,17 Tabela 11: Atividade inibidora da aromatase das composições que contêm extrato de etanol 70% da casca de Punica granatum e metanol aquoso da semente de Theobroma cacao ou extratos de acetona aquosa ou acetato de etila a 50%. Comp.
Dose % inibição da # P.G-4 T.C-6 da Aromatase Pro- Comp porção µg/mL Aditivo % % µg/mL inibição µg/mL inibição (Calculado) Observado C-29 3,33 1,59 1,67 5,27 2:1 5,0 6,86 24,8 C-30 2,5 1,19 2,5 7,8 1:1 5,0 8,99 20,03 C-31 1,67 0,80 3,33 10,39 1:2 5,0 11,19 18,89 P.G-4 T.C-7 C-34 8,33 9,26 16,67 6,48 1:2 25,0 15,74 23,59 P.G-4 T.C-8 C-35 3,33 1,59 1,67 2,78 2:1 5,0 4,37 27,22 C-36 2,5 1,19 2,5 4,16 1:1 5,0 5,35 25,73 C-37 1,67 0,80 3,33 5,55 1:2 5,0 6,35 20,88 P.G-4 T.C-9 C-39 0,5 3,58 0,5 6,78 1:1 1,0 10,36 29,88 C-40 0,33 2,37 0,67 9,09 1:2 1,0 11,46 22,98 P.G-4 T.C-10 C-41 0,67 4,80 0,33 8,08 2:1 1,0 12,88 26,00 C-42 0,5 3,58 0,5 12,24 1:1 1,0 15,82 31,88 C-43 0,33 2,37 0,67 16,40 1:2 1,0 18,77 24,95
Tabela 12: Atividade inibidora da aromatase das composições que contêm etanol da casca de Punica granatum ou etanol aquoso a 50% ou extrato de água e etanol da semente de Theobroma cacao ou extrato de etanol aquoso a 50%. Comp. Dose % inibição de # P.G-1 T.C-3 de Aromatase Pro- Comp porção µg/mL Aditivo % % Observado µg/mL µg/mL (Calculado) inibição inibição C-44 3,33 10,67 1,67 7,02 2:1 5,0 17,69 29,74 C-45 2,5 8,01 2,5 10,50 1:1 5,0 18,51 30,75 C-46 1,67 5,35 3,33 13,99 1:2 5,0 19,34 30,67 P.G-5 T.C-3 C-50 0,67 8,85 0,33 7,95 2:1 1,0 16,8 27,55 C-51 0,5 6,60 0,5 12,05 1:1 1,0 18,65 27,19 C-52 0,33 4,35 0,67 16,14 1:2 1,0 20,49 29,39 P.G-6 T.C-2 C-57 0,5 11,35 0,5 7,82 1:1 1,0 19,17 27,98 C-58 8,33 9,00 16,67 15,35 1:2 25,0 24,35 29,16 Tabela 13: Atividade inibidora da aromatase das composições contendo metanol da casca de Punica granatum ou metanol aquoso a 50% ou acetona aquosa a 50% ou extrato de acetato de etila e extrato de etanol aquoso a 50% de semente de Theobroma cacao. Comp. Dose % inibição da # de Aromatase P.G-7 T.C-2 Pro- Comp porção µg/mL Aditivo Observado % % (Calculado) µg/mL µg/mL inibição inibição C-62 0,67 3,74 0,33 5,33 2:1 1,0 9,07 24,1 C-63 0,5 2,79 0,5 8,07 1:1 1,0 10,86 21,34 C-64 0,33 1,84 0,67 10,82 1:2 1,0 12,66 23,06 P.G-9 T.C-2 C-68 0,67 8,45 0,33 5,33 2:1 1,0 13,78 27,83 C-69 0,5 6,30 0,5 8,07 1:1 1,0 14,37 25,93 C-70 0,33 4,16 0,67 10,82 1:2 1,0 14,98 26,92 Exemplo 22: Ensaio de biogênese mitocondrial
[0166] O ensaio de biogênese mitocondrial foi realizado usando um kit ELISA in-cell obtido da Abcam (Cambridge, UK; Cat # ab110217) seguindo o protocolo do fabricante. Os níveis das duas proteínas mitocondriais foram medidos simultaneamente em cada poço.
As duas proteínas são, cada uma, subunidades de um complexo de enzima de fosforilação oxidativa diferente, uma proteína sendo a subunidade I do Complexo IV (COX-I), que é codificada por DNA mitocondrial (mtDNA), e a outra sendo a subunidade de 70 kDa do Complexo II (SDH-A), que é codificado por DNA nuclear (nDNA). Para o ensaio, células esqueléticas de rato (L6) (ATCC, Manassas, VA; Cat # CRL-1458) em meio DMEM (Sigma Cat # D7777) suplementado com 10% de FBS foram semeadas (10000 células/poço) em um poli de 96 poços Placa revestida com L- lisina e incubada durante a noite a 37°C em uma incubadora de CO2. No dia seguinte, o meio foi removido e as células foram tratadas com as respectivas amostras de teste em diferentes concentrações.
O tratamento foi repetido todos os dias até o 3º dia.
Os poços de cultura que receberam 0,2% de DMSO foram considerados como controle do veículo.
Após o período de tratamento, as células foram fixadas com paraformaldeído 4% e sondadas com anticorpos primários (COX-1 e SDH-A). Fosfatase alcalina (AP) e peroxidase de rábano (HRP) - anticorpos secundários marcados foram usados para SDH-A e COX-1, respectivamente.
Finalmente, a solução de desenvolvimento AP/HRP foi adicionada e medida a absorbância a 405nm e 600nm em um espectrofotômetro multimodo (Spectramax 2e). A razão do sinal (COX-I) para (SDH-A) foi calculada para todos os tratamentos para análise do efeito dos tratamentos.
O aumento percentual da biogênese mitocondrial sobre o controle foi calculado usando a seguinte fórmula: COX-1/5DH–Valor de tratamento–COX-1/5DH-Valor de Controle X 100 COX-1/5DH-Valor do Controle
[0167] Os resultados estão apresentados na Tabela 14: Tabela 14: Aumento da biogênese mitocondrial das composições contendo extrato de etanol a 70% da casca de Punica granatum e água da semente de Theobroma cacao ou etanol aquoso a 50% ou extrato de etanol aquoso a 90% Comp. Dose % aumento da biogênese # P.G-4 T.C-1 da mitocondrial Pro- Comp. porção ng/mL Aditivo % % Observado ng/mL ng/mL (Calculado) aumento aumento C-1 8,0 1,87 2,0 1,21 4:1 10 3,08 8.52 C-2 7,5 1,76 2,5 1,51 3:1 10 3,27 7,61 C-3 6,67 1,56 3,33 2,01 2:1 10 3,57 5,07 C-4 5,0 1,17 5,0 3,02 1:1 10 4,19 8,78 C-5 3,33 0,78 6,67 4,03 1:2 10 4,81 8,11 C-6 2,5 0,59 7,5 4,53 1:3 10 5,12 10.96 C-7 2,0 0,47 8,0 4,83 1:4 10 5,30 9,76 P.G-4 T.C-2 C-8 8,0 4,14 2,0 1,91 4:1 10 6,05 7,63 C-9 7,5 3,88 2,5 2,39 3:1 10 6,27 9,67 C-11 50,0 2,61 50,0 0,98 1:1 100 3,59 7,67 C-13 2,5 1,29 7,5 7,16 1:3 10 8,45 10,85 P.G-4 T.C-4 C-16 7,5 1,76 2,5 2,30 3:1 10 4,06 12,06 C-17 6,67 1,56 3,33 3,06 2:1 10 4,62 14,91 Exemplo 23: Procedimento geral para ensaio de fosforilação mTOR
[0168] Avaliação da fosforilação de mTOR no ensaio de western blot: Mioblastos L6 de rato (6x105 células/poço em 2mL) foram semeados em placas de cultura de células de 60 mm e mantidos em meio DMEM contendo 10% de FBS a 37°C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2. No dia seguinte, as células foram substituídas por meio DMEM sem soro e mantidas por mais 18 horas. As células foram tratadas com diferentes concentrações de amostras de teste em meio DMEM sem soro (volume total de 1 mL) e incubadas por 120 minutos a 37°C em uma incubadora de CO2. As células tratadas com DMSO a 0,2% serviram como controle veículo.
[0169] Western blot: Após a incubação, os pratos de cultura de células foram colocados em uma bandeja de gelo e lavados duas vezes com 1XPBS.
Setenta microlitros de tampão de lise (Tris-HCl 10mM pH 7,4, NaCl 150mM, EDTA 1mM, PMSF 1mM, Aprotinina 10μg/mL, Leupeptina 10μg/mL, Triton X-100 1%, NaF 1mM, Na3VO4 1mM, desoxicolato de sódio 0,5%, e pepstatina 1 µM) a cada placa de cultura e sonicadas durante 30 segundos.
Após a homogeneização, as amostras foram centrifugadas a 16128xg por 10 minutos a 4°C para sedimentar células e núcleos inteiros.
O sobrenadante foi coletado e a proteína foi quantificada usando o kit de ensaio de proteína Pierce BCA (Thermo Scientific Cat # 23225). SDS-PAGE foi realizado para as amostras de proteínas e as proteínas resolvidas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose usando o método de mancha úmida.
Resumidamente, 22 µg de proteína foram carregados em gel de acrilamida (resolução de 7,5%) e funcionou a 100 V por aproximadamente 1 hora e 40 minutos.
No final da execução, as proteínas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose, colocando o sistema de transferência na câmara de 4°C (100 V por 2 horas). Após a transferência, a membrana foi lavada em solução salina tamponada com Tris 0,1 M contendo Tween20 a 0,05% (TBST) e bloqueada em tampão de bloqueio Superblock (Thermo Scientific Cat # 37535) com agitação constante por 30 minutos.
A membrana foi incubada com anticorpos primários que reconhecem as proteínas fosfo-mTOR (local de fosforilação: Ser2448; Cell Signaling Technology Cat # 2971) e mTOR (Cell signaling Technology Cat # 2983) em TBST por 16 horas a 4 ° C com agitação.
A membrana foi lavada três vezes e incubada com anticorpo secundário de cabra anti-coelho de afinipação de peroxidase (Jackson Immunoresearch Cat # 111-035-045; diluição 1: 10000) por 1 hora em temperatura ambiente com agitação, seguido por 3 vezes de lavagem em TBST para 5 minutos cada.
Bandas imunorreativas foram detectadas usando um substrato quimioluminiscente (Thermo Scientific Cat # 34080) e as imagens foram capturadas usando imagem molecular Bio-Rad (Modelo: ChemiDOC XRS +). A membrana foi removida dos anticorpos de fósforo-mTOR e mTOR e sondada novamente com anticorpo anti-β-actina (Sigma Cat # A4700-100uL; diluição 1: 10000) por incubação em temperatura ambiente por 1 hora e as imagens foram capturadas.
As intensidades das bandas de proteína fosfo-mTOR e mTOR foram calculadas usando o software Carestream MI e normalizadas usando β-Actina.
A ativação de mTOR foi calculada pela razão entre as intensidades de banda fosfo-mTOR (pmTOR) e mTOR.
A ativação relativa de mTOR pelos ingredientes individuais ou pelas composições foi calculada sobre a razão pmTOR/mTOR obtida no controle de veículo.
Os aumentos da ativação de mTOR (pmTOR/mTOR) são apresentados na tabela 15. Tabela-15: Aumento da ativação de mTOR pelas composições contendo extrato etanólico 70% da casca de Punica granatum e extrato etanólico aquoso a 50% da semente de Theobroma cacao.
Comp.
Comp Ativação mTOR (% # Dose aumento a partir P.G-4 T.C-2 ng/mL do conntrole)
Ativação Pro- de mTOR Ativação porção Aditivo Obser- (% aumento de mTOR (% (Calcu- ng/mL ng/mL vada a partir aumento no lado) do controle) controle) C-8 80,0 1,80 20,0 0,79 4:1 100 2,59 16,09 C-9 75,0 1,69 25,0 0,98 3:1 100 2,67 33,55 C-10 66,7 1,50 33,3 1,31 2:1 100 2,81 25,26
Exemplo-24: Avaliação In vivo da Composição-77 (C-77) e Composição-78 (C-78) para reforço do testosterona em ratos Sprague Dawley
[0170] Métodos: Ratos Sprague Dawley machos foram aclimatados e 21 animais foram randomizados em três grupos (G1 a G3). Os animais do grupo de tratamento foram suplementados com C-77 (G2; 100 mg/kg) ou C-78 (G3; 100 mg/kg; p.o.) uma vez ao dia por 3 semanas, todos em 10 mL de veículo (0,5% de CMC de sódio em água). Os animais do grupo controle (G1) foram suplementados apenas com 10 mL de veículo. Amostras de sangue foram coletadas de todos os animais; O soro foi separado e analisado quanto aos níveis de testosterona por ELISA no dia 22.
[0171] No dia do sacrifício, ou seja, no dia 22, os animais foram sacrificados e os epidídimos caudais juntamente com os vasos deferentes (ambos os lados) foram dissecados e o sêmen espremido em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco para análise de sêmen.
[0172] Os resultados expressos como média ± S.E.M. Os dados foram submetidos à análise estatística usando ANOVA de uma via seguida pelo teste post-hoc de Dunnett para traçar uma comparação de todos os grupos com controle Normal (G1) usando GraphPad Prism v5.01 (GraphPad Software, Inc., CA, EUA). P<0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Não foram observados sinais clínicos anormais e diferença de peso entre todos os grupos ao longo da duração do tratamento, indicando a segurança dos itens de teste, C-77 e C-78. Os grupos de tratamento apresentaram níveis aumentados de testosterona em amostras de soro do dia 22 em relação ao grupo de controle. Os níveis de testosterona exibidos por diferentes grupos de tratamento estão resumidos na Tabela 16 e representados na Figura I. Da mesma forma, todos os grupos de tratamento mostraram parâmetros de sêmen melhorados quando comparados ao grupo de controle, conforme resumido na Tabela 17 e representado na Figura II. Tabela- 16: Níveis de Testosterona no soro (ng/mL) Dose (mg/kg, Testosterona Grupo p.o.) (ng/mL) G1-Controle Normal -- 0,45 ± 0,05 G2 (C-77) 100 0,71 ± 0,09* G3 (C-78) 100 1,15 ± 0,17*
[0173] Os dados foram expressos como média + S.E.M., n=7; * indicou significância (p<0,05) versus G1, Anova via-única seguida pelo Teste Dunnet pós-hoc Vs. G1. Tabela 17: Parâmetros Motalidade Contagem Vivos Morfologia Grupo (%) (milhões/mL) (%) Normal (%) G1 (Controle 86 ± 2 29 ± 2 91 ± 1 92 ± 1 Veículo) G2 (C-77; 100 86 ± 3 30 ± 6 93 ± 1 93 ± 1 mg/kg) G3 (C-78; 100 89 ± 4 35 ± 2 94 ± 1 95 ± 1 mg/kg)
[0174] Os dados foram expressos como média + S.E.M. n=7.

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição herbácea sinergística, caracterizada pelo fato de compreender a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados de partes de plantas de Punica granutum e um segundo ingrediente selecionado a partir do extrato(s), fração(ões) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivado de partes de plantas de Theobroma cacao para obtenção de pelo menos um benefício de saúde relacionado a melhora das atividades anabólicas e androgênicas no corpo, selecionadas a partir da melhora de níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, estamina, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, função sexual de resistência muscular (libido e função erétil) e bem estar psicológico (humor e foco), redução de estresse e alivio de sintomas associados com os baixos níveis de testosterona em humanos.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de os sintomas associadas com os baixos níveis de testosterona serem selecionados a partir de perda de libido, perda da função erétil, obesidade abdominal, massa r existência muscular diminuída, fatiga, alteração de humor, densidade óssea diminuída, motivação diminuída, memória e concentração diminuída.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o peso do primeiro ingrediente variar na faixa de 10%-90% e o peso do segundo ingrediente variar na faixa de 90% - 10% na composição.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a referida composição ser padronizada para punicalaginas na faixa de concentração de 0,1% a 20% em peso da composição e o teobromina na faixa de concentração de 0,1% a 10% em peso da composição.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a composição sinergística conter opcionalmente pelo menos um componente adicional selecionado a partir do grupo consistindo de agentes biológicos; ingredientes ativos farmaceuticamente aceitáveis, vitaminas, minerais; excipientes farmaceuticamente ou nutraceuticamente ou dieteticamente aceitáveis, veículos ou diluentes.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de os excipientes farmaceuticamente ou nutraceuticamente ou dieteticamente aceitáveis, veículos e diluentes serem selecionados a partir de monossacarídeos tais como glicose, dextrose, frutose, galactose, etc., dissacarídeos tais como, mas não limitados a sacarose, maltose, lactose, lactulose, trehalose celobiose, quitobiose, etc., policarbohidratos tais como amido e amido modificado tal como glicolato de amido sódico, amido pré-gelatinizado, amido solúvel, e outros amidos modificados, tais como, mas não limitados a Ultrasperse A & Ultra-tex 4; dextrinas que são produzidas por hidrólise e amido ou glicogênio, tais como dextrina amarela, dextrina branca, maltodextrina, etc., álcoois polihídrico ou álcoois de açúcar tal como, mas não limitado a sorbitol, manitol, inositol, xilitol, isomalto, etc., derivados a base de celulose, tal como mas não limitado a celulose microcristalina, hidroxi-propil-metil celulose, hidroxi-etil celulose, etc., silicatos tais como mas não limitado a neusilina, VeeGum, talco, dióxido de silício coloidal, etc., estearatos metálicos tais como, mas não limitados a estearato de cálcio, estearato de magnésio, estearato de zinco, etc., ácidos orgânicos tais como ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico, ácido succínico, ácido láctico, ácido L-ascórbico, etc.; os ésteres de ácido graxo e ésteres de polissorbato, gomas naturais tais como, mas não limitados a acácia, carragena, goma guar, goma xantana, etc.; vitamina do grupo B, nicotinamida, pantotenato de cálcio, aminoácidos, proteínas tais como, mas não limitadas a caseína, gelatina, pectina, ágar, sais de metal orgânico tais como, mas não limitados a cloreto de sódio, cloreto de cálcio, fosfato dicálcico, sulfato de zinco, cloreto de zinco, etc., pigmentos naturais, aromas, conservantes da Classe I & Classe II e aquosos, alcoólicos, hidro-alcóolicos, soluções orgânicas dos ingredientes acima listados sozinhos ou em combinação.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de a composição poder ser formulada em uma forma de dosagem selecionada da forma de pó seco, forma líquida, bebida, produto alimentício, suplemento alimentar ou qualquer forma apropriada, tal como comprimido, uma cápsula, um tablete mastigável macio ou ursos de goma.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de a composição poder ser formulada em suplementos nutricionais/alimentícios selecionados a partir da forma de dosagem de alimentos saudáveis, ou alimentos para usos de saúde específicos tais como, alimento sólido do tipo chocolate ou barras nutricionais, alimento semissólido do tipo creme, compota, ou gel ou bebida, tal como bebida revigorante, bebida de bactéria do ácido láctico, balas,
doces, goma de mascar, pastilha de mascar, balas de goma, iogurte, sorvete, pudim, balas de gelatina macias, gelatinas, biscoito, chá, bebida leve, suco, leite, café, cereal, petiscos.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de o extrato, fração, composto ativo ou fitoquímico ser obtido a partir de pelo menos uma parte da planta selecionada a partir do grupo consistindo de folhas, caules, caules macios, galhos macios, partes aéreas, toda a fruta, casca da fruta, semente, raiz, cascas, madeira dura e misturas dos mesmos.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de o extrato, fração composto ativo ou fitoquímico ser produzido usando pelo menos um solvente selecionado a partir de, mas não limitado a álcool C1-C5 do tipo etanol, metanol, n-propanol, álcool isopropílico, cetonas do tipo acetona, metilisobutil cetona, solventes clorados do tipo dicloreto de metileno e clorofórmio, água e misturas dos mesmos; hidrocarbonetos C1- C7 tais como hexano; ésteres do tipo acetato de etila e do gênero e misturas dos mesmos.
11. Método para obter pelo menos um benefício de saúde relacionado às atividades anabólicas e androgênicas no corpo, selecionadas a partir da melhora de níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, estamina, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, função sexual de resistência muscular (libido e função erétil) e bem estar psicológico (humor e foco), redução de stress e alivio de sintomas associados com os baixos níveis de testosterona em humanos, sendo dito método caracterizado pelo fato de compreender suplementar o indivíduo humano com uma dose efetiva de uma composição herbácea sinergística compreendendo a combinação de um primeiro ingrediente selecionado a partir de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados de partes de plantas de Punica granutum e um segundo ingrediente selecionado a partir do extrato(s), fração(ões) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivado de partes de plantas de Theobroma cacao.
12. Método para obter pelo menos um benefício de saúde relacionado às atividades anabólicas e androgênicas no corpo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender suplementar ou tratar o referido animal mamífero ou animal de sangue quente com uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição herbácea sinergística compreendendo combinações de pelo menos um primeiro ingrediente selecionado de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados de partes de plantas de Punica granutum e um segundo ingrediente selecionado a partir do extrato(s), fração(ões) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivado de partes de plantas de Theobroma cacao e opcionalmente contendo pelo menos um ingrediente adicional selecionado do grupo consistindo de agentes biológicos, ingredientes farmaceuticamente ativos, vitaminas, minerais, excipientes farmaceuticamente ou nutraceuticamente ou dieteticamente aceitáveis, veículos ou diluentes.
13. Método para obter pelo menos um benefício de saúde relacionado às atividades anabólicas e androgênicas no corpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 e 12,
caracterizado pelo fato de os sintomas associados com os baixos níveis de testosterona em humanos serem selecionados de perda de libido, perda de função erétil, obesidade abdominal, massa e resistência muscular diminuída, fadiga, alterações de humor, densidade óssea diminuída, motivação diminuída, memória e concentração diminuídas.
14. Uso de uma composição herbácea sinergística, caracterizado pelo fato de compreender combina um primeiro ingrediente selecionado de extrato(s), fração(ões), composto(s) ativo(s) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivados de partes de plantas de Punica granutum e um segundo ingrediente selecionado a partir do extrato(s), fração(ões) e fitoquímicos ou misturas dos mesmos derivado de partes de plantas de Theobroma cacao para obter pelo menos um benefício de saúde relacionado para melhorar as atividades anabólicas e androgênicas no corpo selecionado de melhorar os níveis de testosterona, níveis de energia, energia sustentada, vigor, estamina, envelhecimento saudável, longevidade celular, massa muscular, função sexual de resistência muscular (libido e função erétil) e bem estar psicológico (humor e foco); e reduzir o stress e aliviar os sintomas associados com os baixos níveis de testosterona em humanos.
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