CN112843070A - 鲁斯可皂苷元在制备脑出血防治药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鲁斯可皂苷元在制备脑出血防治药物中的应用，属于天然药物技术领域。本发明通过脑立体定位注射胶原酶诱导小鼠脑出血模型，验证了鲁斯可皂苷元可降低小鼠脑出血量、脑出血面积、脑水肿、神经功能损伤及血脑屏障损伤，可开发或用于制备防治脑出血的药物。

Description

鲁斯可皂苷元在制备脑出血防治药物中的应用
技术领域
本发明属于天然药物技术领域，具体涉及鲁斯可皂苷元在制备脑出血防治药物中的应用。
背景技术
脑出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)，又称出血性脑卒中，是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血，是中老年人的多发病，具有高致残率、高死亡率的特点，严重威胁人类健康((1)Zhou M,Wang H,Zeng X,et al.Mortality,morbidity,and riskfactors in China and its provinces,1990-2017:a systematic analysis for theGlobal Burden of Disease Study 2017[J].Lancet 2019,394(10204):1-14.)。调查显示，脑卒中是导致中国人死亡的头号原因，其中脑出血发病率占约20％，而它却是临床死亡率最高的卒中亚型，脑出血急性期病死率为30％～40％，且绝大多数存活者遗留严重的神经功能缺损症状，给家庭和社会带来沉重的负担((2)Feigin VL,Nguyen G,Cercy K,etal.Global,regional,and country-specific lifetime risks of stroke,1990and 2016[J].New England Journal of Medicine,2018,379(25):2429-2437.(3)Gross BA,Jankowitz BT and Friedlander RM.Cerebral intraparenchymal hemorrhage:a review[J].JAMA,2019,321(13):1295-1303.)。高血压、抗凝药物的使用、脑缺血再灌注损伤、脑动脉瘤等脑血管疾病是脑出血发生的主要原因((4)van Asch C J,Luitse MJ,Rinkel GJ,etal.Incidence,case fatality,and functional outcome of intracerebralhaemorrhage over time,according to age,sex,and ethnic origin:a systematicreview and meta-analysis[J].Lancet Neurol,2010.9(2):167-176.)。目前对于脑出血的治疗，主要是手术治疗和药物治疗。外科手术切除血肿和急性期降压处理，可降低肿块效应，减少因红细胞溶解和延迟凝血酶释放而导致的损伤，但这两种方式产生副作用的风险较大，且临床结果显示患者神经功能恢复效果不佳((5)中华医学会神经病学分会脑血管病学组.中国脑出血诊治指南[J].中华神经科杂志,2015,48(6):435-444.(6)Li X,Feng Dand Chen G.An update on medical treatment for intracerebral hemorrhage[J].Translational Stroke Research,2018,5:1-6.)。而脑出血治疗药物研发主要从止血、神经保护、血脑屏障保护、抗炎、抗自由基等方面入手，相应的药物如重组因子Ⅶa、去铁胺、姜黄素、吡格列酮、依达拉奉等大多处于临床前实验或临床试验阶段，且一些临床前研究显示对于脑出血有改善作用的药物临床试验效果不佳((7)Keep RF,Hua Y and XiG.Intracerebral haemorrhage:mechanisms of injury and therapeutic targets[J].The Lancet Neurology,2012,11(8):720-731.(8)Adeoye O and BroderickJP.Advances in the management of intracerebral hemorrhage[J].Nature ReviewsNeurology,2010,6(11):593-601.(9)Bobinger T,Burkardt P,B.Huttner H,etal.Programmed cell death after intracerebral hemorrhage[J].CurrentNeuropharmacology,2018,16(9):1267-1281.)。因此，如何更好地治疗脑出血是全球，尤其是中国，亟待解决的医疗问题。
鲁斯可皂苷元(Ruscogenin，RUS)是一种白色针晶粉状化学物质，分子式是C27H42O4，具有显著的抗炎、抗血栓、抗肿瘤、降低毛细血管通透性等作用((10)Kou J P,SunY,Lin Y,et al.Anti-inflammatory Activities of Aqueous Extract from RadixOphiopogon japonicus and Its Two Constituents[J].Biol Pharm Bull.2005,28(7):1234-1238.(11)Kou J P,Tian Y,Tang Y.Antithrombotic Activities of AqueousExtract from Radix Ophiopogonjaponicus and Its Two Constituents[J].Biol PharmBull.2006,29(6):1267-1270.(12)Wang Y W,Wu Y H,Zhang J Z,et al.Ruscogeninattenuates particulate matter-induced acute lung injury in mice viaprotecting pulmonary endothelial barrier and inhibiting TLR4 signalingpathway[J].Acta Pharmacol Sin,2020:1-9.(13)Wu Y H,Wang Y W,Gong S,etal.Ruscogenin alleviates LPS-induced pulmonary endothelial cell apoptosis bysuppressing TLR4 signaling[J].Biomed pharmacother,2020,125:109868.(14)马爱珍.鲁斯可皂苷元对人肺癌A549和H460细胞的作用机理研究[D].南京:南京中医药大学，2014.)。但是，鲁斯可皂苷元能否改善脑出血还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供鲁斯可皂苷元可用于防治脑出血的医药用途。
鲁斯可皂苷元在制备脑出血防治药物中的应用。
所述鲁斯可皂苷元(Ruscogenin，RUS)的结构式如下式：
Figure BDA0002994379340000021
所述脑出血为非外伤性的多种致病因素如高血压、高血脂、脑淀粉样血管病、脑动脉瘤、抗凝药物的使用以及其他不良生活习惯等引起的脑内出血。
本发明通过脑立体定位注射胶原酶诱导小鼠脑出血模型，验证了鲁斯可皂苷元对脑出血的改善作用，从而说明鲁斯可皂苷元可以用于制备脑出血防治药物。
附图说明
图1为不同剂量RUS对小鼠脑出血及神经功能损伤的改善作用比较(
Figure BDA0002994379340000022
n＝6)。其中：###P<0.001vs.假手术组；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.模型组。
图2为不同时间点给予RUS对小鼠脑出血的改善作用(
Figure BDA0002994379340000023
n＝6)。其中：###P<0.001vs.假手术组；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.模型组。
图3为RUS单次给药对小鼠脑出血的改善作用维持时间(
Figure BDA0002994379340000031
n＝5)。其中：###P<0.001vs.假手术组；*P<0.05,***P<0.001vs.模型组。
图4为RUS每天给药一次对小鼠脑出血的改善作用维持时间(
Figure BDA0002994379340000032
n＝5)。其中：###P<0.001vs.假手术组；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.模型组。
图5为RUS对胶原酶诱导的的小鼠脑出血面积的影响(
Figure BDA0002994379340000033
n＝3)。其中：##P<0.01vs.假手术组；**P<0.01vs.模型组。
图6为RUS对胶原酶诱导的的小鼠脑出血后脑水含量的影响(
Figure BDA0002994379340000034
n＝6)。其中：###P<0.001vs.假手术组；*P<0.05vs.模型组。
图7为RUS对胶原酶诱导的的小鼠脑出血后伊文思蓝渗漏的影响(
Figure BDA0002994379340000035
n＝6)。其中：###P<0.001vs.假手术组；**P<0.01vs.模型组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
鲁斯可皂苷元(RUS)对胶原酶诱导的小鼠脑出血的改善作用
实验方法：
a)动物分组和药物干预：
雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、模型组、RUS给药组(1、2.5、5mg/kg)，每组4-6只动物。参照鼠脑定向图谱，进行右侧纹状体定位，距离中线右2.2mm，前囟前0.2mm，钻一直径约1.0mm的圆孔，用微量注射器沿钻孔方向垂直进针，深4mm，接着缓慢匀速推注胶原酶VII-S(0.075U溶于0.5μL生理盐水中)入脑构建脑出血(ICH)模型，留针5min，缓慢退出微量注射器。在造模后相应时间点腹腔注射RUS。于造模后24h处死小鼠，检测相应指标。
b)血红蛋白试剂盒法测小鼠脑出血量
各组小鼠于脑出血手术后24h，用1×磷酸缓冲盐溶液(PBS)从小鼠心脏处灌流，直至血液冲洗干净，取脑，拍照。吸干多余液体，冷冻。切去嗅球、脑干及小脑，取大脑右半球称重，每0.1g脑组织加1mL预冷的1×PBS进行匀浆，转移至1.5mL EP管中，离心(4℃、13000rpm，30min)，取上清50μL加入96孔板中，加血红蛋白检测试剂200μL，每组样品3个复孔。于室温反应5min后，在400nm波长处测定OD值，按试剂盒说明书中方程计算脑中血红蛋白含量，单位为μg/mg。
c)神经行为学评分的测定
根据神经功能缺损评分量表，各组小鼠于脑出血后24h进行判定，评价指标包括身体对称性、步态、攀爬能力、环绕行为、前肢对称性、强制绕圈及触须反应，将七项指标打分相加作为最终得分，评分越高，神经功能缺损越严重。具体评分标准如表1所示：
表1神经功能缺损评分量表
Figure BDA0002994379340000041
d)苏木素-伊红(H&E)染色法检测小鼠脑切片病理形态学变化
各组小鼠于脑出血手术后24h处死，取脑，放入盛有4％多聚甲醛的EP管中，送至江苏省药物安全性评价中心病理室检测。
e)脑水含量测定
各组小鼠于脑出血后24h处死，将完整脑组织取出，生理盐水润洗后，用滤纸吸干多余水分，将脑组织分为损伤侧半球、对侧半球和小脑三部分，称取各部分重量为湿重，将各部分脑组织置于100℃烘箱中烘干48h后，称取重量作为干重。脑水含量＝(湿重-干重)/湿重×100％。
f)伊文思蓝渗透率的测定
脑出血后22h，给各组小鼠尾静脉注射2％伊文思蓝溶液，2h后麻醉小鼠，用0.9％的生理盐水从小鼠心脏处灌流，直至血液冲洗干净，取脑，拍照。去掉嗅球，脑干及小脑，取大脑右半球，称重，每0.1g脑组织加入1mL预冷的甲酰胺充分研磨，转移至1.5mL EP管中，于60℃孵育18h后离心(5000g，30min)，取上清200μL加入96孔板中，每个样品3个复孔，于620nm波长处测定OD值，根据标准曲线计算含量，单位为μg/g。
实验结果：
a)不同剂量鲁斯可皂苷元对胶原酶诱导小鼠脑出血的改善作用
由图1可知，小鼠脑外观图及血红蛋白试剂盒检测结果均显示，与假手术组相比，模型组小鼠脑出血明显，血红蛋白含量显著增加，且神经功能学评分明显增高，而RUS组出血现象有所缓解，脑血红蛋白含量和神经功能缺损程度显著降低，其中5mg/kg RUS改善作用最显著。说明RUS可以显著减少胶原酶诱导的小鼠脑出血量，改善小鼠脑出血后神经损伤。
b)鲁斯可皂苷元在胶原酶诱导小鼠脑出血后不同时间点给药药效比较
如图2所示，5mg/kg RUS在小鼠脑出血后1、3h给药能显著降低小鼠脑出血量，在脑出血后各时间点给药对小鼠神经功能均有改善作用，其中脑出血后1h给药效果最显著。综合考虑，脑出血后1-3h给予5mg/kg RUS治疗效果最佳。
c)鲁斯可皂苷元对小鼠脑出血的改善作用维持时间
如图3结果所示，脑出血后1h给予5mg/kg RUS对小鼠脑出血及神经缺损的改善作用在24h内最显著，单次给药药效无法维持到48及72h。如图4结果所示，按照每天一次的方式腹腔注射RUS(5mg/kg)，在72h时可显著减轻小鼠脑出血量。对于神经功能缺损的改善在48h及72h均较为显著。综上所述，脑出血后1h给予RUS在24h对小鼠脑出血的改善作用最佳，按每天一次的方式给药药效可维持至72h。
d)鲁斯可皂苷元对胶原酶诱导的小鼠脑出血面积的改善作用
由图5脑切片H&E染色结果所示，脑出血组与假手术组及假手术+RUS组相比，脑出血面积显著增多，脑组织出现明显空泡化、梗死等损伤；模型+RUS组与模型组相比出血面积显著下降。提示RUS可以有效抑制胶原酶诱导的小鼠脑出血。
e)鲁斯可皂苷元对胶原酶诱导的小鼠脑出血后脑水肿的改善作用
如图6结果所示，脑出血后小鼠出血侧半球脑水含量显著增加，而对侧脑半球及小脑无脑水肿现象，RUS(5mg/kg)可显著改善脑出血小鼠出血侧脑半球脑水肿程度。
f)鲁斯可皂苷元对脑出血小鼠脑伊文思蓝渗漏的改善作用
图7伊文思蓝渗漏结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠脑伊文思蓝含量显著升高，表明胶原酶诱导的小鼠脑出血后血脑屏障通透性明显增加，而5mg/kg RUS能显著降低小鼠脑伊文思蓝渗漏量，表明RUS可以改善胶原酶诱导的小鼠脑出血后血脑屏障的破坏。
以上结果表明，鲁斯可皂苷元对胶原酶诱导的小鼠脑出血具有显著的治疗作用，其中5mg/kg鲁斯可皂苷元对小鼠脑出血量、脑出血面积、神经功能损伤、脑水肿及血脑屏障损伤的改善作用最显著。此外，在脑出血后3h内给药对小鼠脑出血及神经功能损伤的改善效果较好。本发明为临床脑出血的防治提供可能的有效策略，并为鲁斯可皂苷元的新药开发提供了数据支持。

Claims (4)

1.鲁斯可皂苷元在制备脑出血防治药物中的应用；
所述鲁斯可皂苷元的结构式如下式所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述脑出血是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的脑出血为高血压、高血脂、脑淀粉样血管病、脑动脉瘤、抗凝药物的使用或溶栓药物的使用引起的脑内出血。
4.一种脑出血防治药物，其特征在于：包括鲁斯可皂苷元和药学上可接受的载体；
所述鲁斯可皂苷元的结构式如下式所示：
Figure 512676DEST_PATH_IMAGE001
。
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