CN112830923A - 具有选择性抗菌作用的系列苯丙烯酸-异喹啉生物碱络合物及其无载体纳米药物的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类新型苯丙烯酸类与异喹啉类生物碱络合物制备、抗菌应用以及一种制备无载体纳米剂型的方法。所述络合物具备优良的选择性抑菌能力，在杀灭致病菌金黄色葡萄球菌的同时，不影响肠道内生菌大肠杆菌和益生菌枯草芽孢杆菌、屎肠球菌的活力；同时对多重耐药金黄色葡萄球菌有良好的抑制效果，优于诺氟沙星、苯唑西林、四环素、环丙沙星。其中，在无需辅料的情况下，为络合物开发了一种制备纳米药物的方法，该方法制备的纳米粒形态均一，分散度好，为开发成无载体纯药物递送体系提供支持。

Description

具有选择性抗菌作用的系列苯丙烯酸-异喹啉生物碱络合物 及其无载体纳米药物的制备
技术领域
本发明涉及60种苯丙烯酸类-异喹啉类生物碱络合物的制备方法及其抗菌应用，尤其是对临床上多重耐药金黄色葡萄球菌具有良好的抑制活性；并且开发了一种制备无载体纳米药物的方法。
背景技术
细菌感染是目前人类面临的巨大威胁之一。随着抗生素的滥用，出现了越来越多的耐药细菌，甚至是多重耐药的“超级细菌”。每年，耐药性感染在全球范围内造成约70万人死亡，大多数发生在发展中国家；到2050年，细菌耐药性每年会造成全球1000万人死亡。同时，长期大量使用广谱抗生素也会造成人体肠道菌群稳态的破坏，从而进一步影响人体健康。因此，开发选择性强，毒性低，副作用小的新型抗生素对抗耐药细菌，发展多层面的抗菌策略是迫在眉睫的。
中药是天然抗生素的来源之一，很多中药成分都具有明确的抗菌作用。以黄连为例，其中的异喹啉类生物碱具有优良的抗菌性能。其中的代表性成分小檗碱已经被开发成为对抗细菌性腹泻的一线用药。肉桂不仅是一种香料和调味品，更是我国的传统中药，含有多种小分子酚酸类化合物及其衍生物。在中医临床上，肉桂、黄连常以药对形式存在，组成了如芍药汤、黄连汤等多种经典名方可用于清热解毒。本发明受启发于肉桂、黄连药对的临床应用特点，以肉桂黄连药对中代表性天然活性成分苯丙烯酸类和异喹啉生物碱类为原料，涉及60种苯丙烯酸类-异喹啉类生物碱络合物的制备方法及其抗菌应用。
同时，纳米药物的研发是近年来的研究热点。纳米级药物传输系统主要用于促进药物溶解、改善吸收、提高靶向性从而提高有效性。将药物开发成纳米制剂，利用包括口服、注射等途径给药以提高吸收或靶向性。因此特别适合于大剂量的难溶性药物的口服吸收和注射给药。但许多纳米佐剂表现出较低的载药能力且无治疗效果，甚至有些在降解和代谢的过程中引起毒性和炎症。基于此，本发明涉及一种络合物有序自组装形成的无载体纳米剂型的制备方法。此种无载体纳米剂型具备了纳米级药物的优势，同时实现了无辅料纯药物自传递，提高了递送效率。
发明内容
本发明受启发与中医临床常用药对肉桂-黄连，采用简便的合成手段制备了60种苯丙烯酸类-异喹啉类生物碱络合物，并运用质谱和核磁方法对络合物结构进行确认；运用多种细菌模型表征其抑菌活性；对于具备自组装性能的络合物开发了一种制备无载体纳米剂型的方法。此发明对于从中药复方中发现和开发结构明确的有效药物具有重大的研究意义。
本发明的目的之一是提供60种苯丙烯酸类-异喹啉类生物碱络合物。
本发明的目的之二是提供60种苯丙烯酸类-异喹啉类生物碱络合物的结构信息。确定个别络合物的单晶结构，具体地，络合位点为苯丙烯酸羧基与异喹啉类生物碱季铵氮。
本发明的目的之三是提供60种苯丙烯酸类-异喹啉类生物碱络合物的制备方法。
本发明的目的之四是提供60种苯丙烯酸类-异喹啉类生物碱络合物在抗菌领域的应用。
本发明的目的之五是为具备自组装性能的络合物提供一种制备无载体纳米剂型的方法。所述纳米级自组装体具有良好的分散性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了60种络合物的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：
(1)加热使异喹啉生物碱溶解于水中。
(2)苯丙烯酸混悬于水中，加热，调节pH得澄清透明溶液。
(3)将步骤(1)、(2)中所制备异喹啉生物碱、苯丙烯酸水溶液混和搅拌，室温静置，离心得沉淀，水洗三次，冷冻干燥得黄色粉末即为络合物。
优选地，步骤(1)、(2)所述加热温度为25-100℃，例如25℃，30℃，50℃，80℃，100℃。
优选的，异喹啉生物碱和苯丙烯酸称取摩尔量比例为1∶0.1至1∶10，例如1∶0.1、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10。
优选地，步骤(1)、(2)、(3)所述用水为去离子水。
优选地，步骤(2)所述pH调节剂为有机或无机碱。例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水。
优选地，步骤(2)所述pH＝6.5-7.5，例如pH＝6.5、pH＝7、pH＝7.5。
优选地，步骤(3)所述离心纯化时的离心转速为5000-13000rpm，例如5000rpm、5500rpm、6000rpm、6500rpm、7000rpm、7500rpm、8000rpm、8500rpm、9000rpm、9500rpm或13000rpm。
在此基础上，本发明提供了络合物在抗菌领域的应用。
优选地，所用菌种为致病菌金黄色葡萄球菌、多重耐药金黄色葡萄球菌，条件致病菌大肠杆菌，益生菌枯草芽孢杆菌和屎肠球菌等评价络合物的选择性抑菌能力。
本发明还为具备自组装性能的络合物提供了一种制备无载体纳米剂型的方法。所述制备方法包括以下步骤：
(1)小檗碱溶解于甲醇中。
(2)肉桂酸溶解于二甲基亚砜中，调节pH＝6.5-7.5。
(3)将步骤(1)、(2)中所制备小檗碱与肉桂酸溶液混合，得到混合液。
(4)将步骤(3)慢慢加入20mLPBS(60℃)溶液中，继续加热搅拌5分钟，放入透析袋透析过夜，定期换水。得到肉桂酸-小檗碱纳米颗粒。
优选的，小檗碱和肉桂酸称取摩尔量比例为1∶0.1至1∶10，例如1∶0.1、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶5、1∶10。
优选地，优选地，步骤(1)、(2)、(3)所述加热温度为25-100℃，例如25℃，30℃，50℃，80℃，100℃。
优选地，步骤(2)所述pH调节剂为有机或无机碱。例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水。
优选地，步骤(2)所述pH＝6.5-7.5，例如pH＝6.5、pH＝7、pH＝7.5。
优选地，步骤(4)所述透析利用截留分子量为14000以下(例如3000、5000、7000、9000、12000、13000或14000)的透析袋进行。
优选地，步骤(4)所述透析的时间为1-3天(例如1天、1.5天、2天、2.5天或3天等)，每4-6小时(例如4小时、4.5小时、5小时、5.5小时或6小时)更换透析液。
优选的，肉桂酸-小檗碱纳米颗粒的水合粒径为30-300nm，例如40nm，50nm，55nm，60nm，100nm，300nm。
附图说明
图1为本发明实施例4制备所得肉桂酸-小檗碱自组装纳米颗粒扫描电镜图。
图2为本发明实施例4制备所得肉桂酸-小檗碱自组装纳米颗粒透射电镜图。
图3为本发明实施例4制备所得肉桂酸-小檗碱自组装纳米颗粒粒度分布图。
图4为本发明实施例4制备所得肉桂酸-小檗碱自组装晶体扫描电镜图。
图5为本发明实施例4制备所得肉桂酸-小檗碱自组装单晶单胞图。
图6为本发明实施例4制备所得肉桂酸-小檗碱自组装晶体作用力图。
图7为本发明实施例4制备所得肉桂酸-小檗碱自组装晶体堆积图。
具体实施方式
以下实施例旨在进一步说明本发明。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实例通过包括如下步骤的方法制备络合物。
以肉桂酸-小檗碱络合物为例，称取比例为10∶1至1∶10摩尔量的肉桂酸、小檗碱分别溶解于水中，加热，肉桂酸调节pH＝6.5-7.5得澄清透明溶液。混和搅拌，室温静置，离心得沉淀，水洗三次，冷冻干燥得黄色粉末即为络合物。其他59种络合物的制备方法相同。
进一步对实施例1所制备络合物进行质谱分析。质谱分析条件为，设置离子源为正离子检测模式，毛细管电压为3.5kV，锥孔电压为40V，离子源温度120℃，碰撞能为35eV，锥孔气流速50L/h，脱溶剂气流速800L/h，质谱采集范围：50～2000。质谱分析前无需色谱柱分离纯化。质谱分析得络合物得分子离子峰及分子结构如表2所示。
Figure BSA0000195513720000051
Figure BSA0000195513720000061
Figure BSA0000195513720000071
Figure BSA0000195513720000081
Figure BSA0000195513720000091
Figure BSA0000195513720000101
Figure BSA0000195513720000111
Figure BSA0000195513720000121
Figure BSA0000195513720000131
实施例2
在本实施例中对实施例1制备得到的部分络合物的核磁进行表征，结果如下：
肉桂酸-小檗碱络合物核磁归属：1H NMR(400MHz，CD3OD)δ9.74(s，1H，8-H，BBR)，8.64(s，1H，13-H，BBR)，8.08(d，J＝9.0Hz，1H，11-H，BBR)，7.97(d，J＝9.0Hz，1H，12-H，BBR)，7.62(s，1H，1-H，BBR)，7.46(m，2H，1-H，5-H，CA)，7.35(d，J＝16.0Hz，1H，7-CH＝C-，CA)，7.31(m，2H，2-H，4-H，CA)，7.27(d，1H，3-H，CA)，6.95(s，1H，4-H，BBR)，6.47(d，J＝16.0Hz，1H，8-C＝CH-，CA)，6.10(s，2H，15-CH2-，BBR)，4.92(t，J＝6.0Hz，2H，6-CH2-，BBR)，4.21(s，3H，9-OCH3，BBR)，4.10(s，3H，10-OCH3，BBR)，3.25(t，2H，J＝6.0Hz，5-CH2-，BBR).
2-甲氧基肉桂酸-巴马汀络合物核磁归属：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.92(s，1H，8-H，PA)，9.09(s，1H，13-H，PA)，8.16(d，J＝9.0Hz，1H，11-H，PA)，8.05(d，J＝9.0Hz，1H，12-H，PA)，7.73(s，1H，1-H，PA)，7.07(s，1H，4-H，PA)，4.98(t，2H，J＝6.0Hz，6-CH2-，PA)，4.09(s，3H，3-OCH3，PA)，4.05(s，3H，2-OCH3，PA)，3.94(s，3H，9-OCH3，PA)，3.86(s，3H，10-OCH3，PA)，3.22(t，2H，J＝6.0Hz，5-CH2-，PA)，7.44(d，J＝7.6Hz，1H，6-H，2-MCA)，7.37(d，J＝16.0Hz，1H，7-CH＝C-，2-MCA)，7.22(t，J＝7.7Hz，1H，5-H，2-MCA)，6.96(d，J＝8.1Hz，1H，3-H，2-MCA)，6.88(t，J＝7.4Hz，1H，4-H，2-MCA)，6.33(d，J＝16.0Hz，1H，8-C＝CH-，2-MCA)，3.78(s，3H，2-OCH3，2-MCA).
3-甲氧基肉桂酸-巴马汀络合物核磁归属：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.96(s，1H，8-H，PA)，9.11(s，1H，13-H，PA)，8.25(d，J＝9.0Hz，1H，11-H，PA)，8.09(d，J＝9.0Hz，1H，12-H，PA)，7.78(s，1H，1-H，PA)，7.28(t，J＝7.9Hz，1H，5-H，3-MCA)，7.18(d，J＝15.9Hz，1H，7-CH＝C-，3-MCA)，7.14(s，1H，4-H)，7.11(d，J＝6.5Hz，1H，6-H，3-MCA)，7.10(s，1H，2-H，3-MCA)，6.89(d，J＝8.0Hz，1H，4-H，3-MCA)，6.53(d，J＝15.9Hz，1H，8-C＝CH-，3-MCA)，5.02(t，2H，J＝6.0Hz，6-CH2-，PA)，4.15(s，3H，3-OCH3，PA)，4.12(s，3H，2-OCH3，PA)，3.99(s，3H，9-OCH3，PA)，3.92(s，3H，10-OCH3，PA)，3.81(s，3H，3-MCA)，3.28(t，2H，J＝6.0Hz，5-CH2-，PA).
4-甲氧基肉桂酸-巴马汀络合物核磁归属：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.92(s，1H，8-H，PA)，9.07(s，1H，13-H，PA)，8.16(d，J＝9.0Hz，1H，11-H，PA)，8.04(d，J＝9.0Hz，1H，12-H，PA)，7.72(s，1H，1-H，PA)，7.36(d，J＝7.8Hz，2H，6-H，4-MCA)，7.06(s，1H，4-H，PA)，7.02(d，J＝15.8Hz，1H，7-CH＝C-，4-MCA)，6.86(d，J＝7.8Hz，2H，3-H，5-H，4-MCA)，6.25(d，J＝15.8Hz，1H，8-C＝CH-，4-MCA)，4.97(t，2H，J＝6.0Hz，6-CH2-，PA)，4.09(s，3H，3-OCH3，PA)，4.05(s，3H，2-OCH3，PA)，3.93(s，3H，9-OCH3，PA)，3.86(s，3H，10-OCH3，PA)，3.74(s，3H，4-OCH3，4-MCA)，3.22(t，2H，J＝6.0Hz，5-CH2-，PA)
3，4，5-三甲氧基肉桂酸-小檗碱络合物核磁归属：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.91(s，1H，8-H，BBR)，8.94(s，1H，13-H，BBR)，8.18(d，J＝9.0Hz，1H，11-H，BBR)，7.98(t，J＝13.8Hz，1H，12-H，BBR)，7.79(s，1H，1-H，BBR)，7.04(s，1H，4-H，BBR)，6.94(d，1H，J＝15.8Hz，7-CH＝C-，3，4，5-TCA)，6.75(s，2H，2-H，6-H，3，4，5-TCA)，6.34(d，1H，J＝15.8Hz，1H，8-C＝CH-，3，4，5-TCA)，6.16(s，2H，15-CH2-，BBR)，4.95(t，J＝6.0Hz，2H，6-CH2-，BBR)，4.09(s，3H，9-OCH3，BBR)，4.06(s，3H，10-OCH3，BBR)，3.78(s，6H，3-OCH3，5-OCH3，3，4，5-TCA)，3.64(s，3H，4-OCH3，3，4，5-TCA)，3.25(t，2H，J＝6.0Hz，5-CH2-，BBR).
3，4，5-三甲氧基肉桂酸-巴马汀络合物核磁归属：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.92(s，1H，8-H，PA)，9.07(s，1H，13-H，PA)，8.19(d，J＝9.0Hz，1H，11-H，PA)，8.05(d，J＝9.0Hz，1H，12-H，PA)，7.73(s，1H，1-H，PA)，7.08(s，1H，4-H，PA)，6.94(d，1H，J＝15.8Hz，7-CH＝C-，3，4，5-TCA)，6.73(s，2H，2-H，6-H，3，4，5-TCA)，6.32(d，1H，J＝15.8Hz，1H，8-C＝CH-，3，4，5-TCA)，4.97(t，2H，J＝6.0Hz，6-CH2-，PA)，4.09(s，3H，3-OCH3，PA)，4.06(s，3H，2-OCH3，PA)，3.94(s，3H，9-OCH3，PA)，3.87(s，3H，10-OCH3，PA)，3.77(s，6H，3-OCH3，5-OCH3，3，4，5-TCA)，3.64(s，3H，4-OCH3，3，4，5-TCA)，3.22(t，2H，J＝6.0Hz，5-CH2-，PA).
实施例3
在本实施例中对实施例1制备得到的络合物的抑菌活性进行测定，方法如下：
采用比浊法分别观察络合物对致病菌金黄色葡萄球菌，选择性致病菌大肠杆菌，益生菌枯草芽孢杆菌和屎肠球菌以及临床分离所得多重耐药金黄色葡萄球菌菌的抑制作用。金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，益生菌枯草芽孢杆菌和屎肠球菌(来自北京中医药大学生命科学院)。多重耐药金黄色葡萄球菌来自北京中医药大学东直门医院检验科(样本号：19PXTH0119)。实施例1制备得到的络合物粉末密封好保存于4℃。用时用LB培养基溶解为1×104μg/mL的储存液备用(DMSO含量1％)。
细菌复苏和细菌储备液配制：细菌分散在LB培养基中，37℃、200rpm旋转培养过夜。然后用LB培养基配制菌量为2×106CFU/mL的细菌储备液，计数采用平板计数法。
采用对倍稀释法测定络合物的MIC。在48孔板中，用LB培养基配制浓度分别为0.4，0.2，0.1，0.05，0.025μmol/mL的络合物溶液1mL。随后分别加入20μL细菌储备液，置37℃恒温、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养16h。用酶标仪在600nm处测定OD值。试验重复三次，计算细菌存活率大于80％的药物浓度计为该样品的最小抑菌浓度。不加药不加菌组设为空白对照组；加菌不加药组设为空白菌组。细菌存活率(％)＝(样品组吸光度值-空白组吸光度值)/(空白菌组吸光度值-空白组吸光度值)×100％。
具体结果见表1。
表1：24种络合物对不同细菌的抑菌效果
Figure BSA0000195513720000161
Figure BSA0000195513720000171
Figure BSA0000195513720000181
Figure BSA0000195513720000191
结果表明，基于苯丙烯酸类和异喹啉类生物碱的络合物具备优良的选择性抗金黄色葡萄球菌活性，对于肠道中的选择性致病菌大肠杆菌以及益生菌枯草芽孢杆菌、屎肠球菌抑制活性较弱，对临床分离的多重耐药金黄色葡萄球菌仍具有优良的敏感性，尤其化合物肉桂酸-小檗碱针对临床分离的多重耐药金黄色葡萄球菌活性明显优于目前诸多一线抗菌药物，例如诺氟沙星、苯唑西林、四环素、环丙沙星，具有深入研究，进一步临床开发的价值。
实施例4
本实例通过包括如下步骤的方法制备络合物无载体纳米剂型。
本发明还提供了一种制备无载体纳米剂型的方法。称取比例为10∶1至1∶10摩尔量的小檗碱与肉桂酸分别溶解于甲醇和二甲基亚砜中，肉桂酸调节pH＝6.5-7.5，混合后，慢慢加入20mLPBS(60℃)溶液中，继续加热搅拌5分钟，放入透析袋透析过夜，定期换水，得到肉桂酸-小檗碱纳米粒。电镜下大小均一纳米颗粒(图1，2)，粒度65nm左右(图3)。冷冻干燥分别得淡黄色粉末。此外，将肉桂酸-小檗碱自组装成的纳米颗粒溶解在水溶液中成功获得了该晶体(图4，5，6，7)，阐明了肉桂酸与小檗碱之间的作用力。
从以上结果可以看出，本发明提供的络合物稳定，具备优良的选择性抑菌能力，在杀灭致病菌的同时，不影响益生菌的活力。同时对多重耐药菌有卓越的抑制效果。自组装而成的无载体纳米剂型形态均一，分散度好。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的纳米药物组合物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (11)

1.具有选择性抗菌作用的系列苯丙烯酸与异喹啉生物碱络合物，其通式为：
Figure RE-FSB0000189579060000011
其中，R1-R8各自独立地为氢、C1-C4的烷基、C1-C8的烷氧基、C2和C5-C8的羟基，其中，R1、R2可以相连形成五元或六元环，或者，R3、R4相连形成五元或六元环。
2.如权利要求1所述的具有抗菌作用的苯丙烯酸与异喹啉生物碱络合物，其特征在于：R1、R2各自独立地为C1-C6的烷基，或R1、R2相连形成五元或六元环；R3、R4各自独立地为C1-C6的烷基，或R3、R4相连形成五元或六元环；R5、R6、R7、R8各自独立地为氢、C1-C4的烷基、C1-C8的烷氧基或羟基。
3.如权利要求1或2所述的具有抗菌作用的苯丙烯酸与异喹啉生物碱络合物，其特征在于：其中，R选自以下结构的一种；
Figure RE-FSB0000189579060000012
Figure RE-FSB0000189579060000021
Figure RE-FSB0000189579060000031
Figure RE-FSB0000189579060000041
Figure RE-FSB0000189579060000051
Figure RE-FSB0000189579060000061
Figure RE-FSB0000189579060000071
Figure RE-FSB0000189579060000081
Figure RE-FSB0000189579060000091
Figure RE-FSB0000189579060000101
Figure RE-FSB0000189579060000111
4.如权利要求1所述的所述化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，加入制剂领域常规辅料制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、注射剂等常规剂型。
5.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，该方法为：
包括如下步骤：
取摩尔比为1∶0.1至1∶10的异喹啉生物碱与肉桂酸分别混悬于水中，异喹啉生物碱加热溶解，肉桂酸加热调节pH至6.5-7.5得澄清透明溶液。混和搅拌，离心得沉淀，水洗三次，冷冻干燥得黄色粉末即为络合物。
6.如权利要求1所述的化合物无载体纳米药物制备方法，其特征在于，该方法为：
包括如下步骤：
称取比例为10∶1至1∶10摩尔量的小檗碱与肉桂酸分别溶解于甲醇和二甲基亚砜中，肉桂酸调节pH＝6.5-7.5。混和搅拌，慢慢加入20mLPBS(60℃)溶液中，继续加热搅拌5分钟，放入透析袋透析过夜，定期换水，得到肉桂酸-小檗碱纳米粒。
7.如权利要求1、2、6任一所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗菌药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗菌作用为外用细菌感染、体内细菌感染、细菌性腹泻，尤其用于多重耐药金黄色葡萄球菌造成上述感染。
9.药物组合物，其特征在于，所述组合物包含以治疗有效量存在的权利要求1化合物与至少一种药学可接受的赋形剂的混合物。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含至少一种常规抗菌药。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述抗菌药选自环丙沙星、司帕沙星、苯唑西林、头孢他啶、头孢曲松、四环素、罗红霉素或阿奇霉素。
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