CN112805383A - 靶向snp的修饰的寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

提供了新颖的寡核苷酸，相对于相应野生型基因的表达，所述寡核苷酸增强了含有单核苷酸多态性(SNP)的基因的表达的沉默。提供了使用新颖的寡核苷酸的方法，相对于相应野生型基因的表达，所述寡核苷酸增强了含有SNP的基因的表达的沉默。

Description

靶向SNP的修饰的寡核苷酸
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年8月10日提交的美国临时专利申请号62/717,287和2019年3月28日提交的美国临时专利申请号62/825,429的优先权。这些申请的全部内容通过引用并入本文。
联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)资助的授权号NS104022和GM108803下由政府支持完成的。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
RNA干扰代表了用于抑制基因功能的简单且有效的工具。RNA沉默剂作为研究工具和治疗剂已受到特别的关注，因为它们具有以高度序列特异性敲低特定蛋白质表达的能力。RNA沉默剂的序列特异性特别适用于治疗由携带特定基因的一种突变体和一种野生型拷贝的杂合子中的显性突变引起的疾病。然而，仍然需要以下RNA沉默剂，其可以优先使导致疾病的突变型等位基因的表达沉默，而不会或仅最小程度地影响野生型等位基因的表达。
发明内容
本发明基于令人惊讶的发现，即相对于杂合子中相应野生型基因的表达，新颖的寡核苷酸增强了含有单核苷酸多态性(SNP)(例如，杂合SNP)的基因的表达的沉默，例如增强了高达超过100倍。在某些方面，提供了一种寡核苷酸(例如dsRNA)，其优先靶向用于降解的含SNP的核酸，其中所述寡核苷酸(例如双链RNA(dsRNA))不靶向或在较小程度上靶向用于降解的相应野生型(不含SNP的)核酸。在某些方面，本发明的寡核苷酸(例如dsRNA)：1)在靶核酸中与SNP位置互补；和2)相对于SNP，在靶核酸的特定位置处含有错配。在某些实施例中，相对于相应野生型靶核酸序列，本发明的寡核苷酸(例如dsRNA)还含有两个错配：1)在野生型SNP位置处；和2)在相对于野生型SNP位置的靶核酸序列的特定位置处。因此，示例性寡核苷酸(例如dsRNA)包含相对于含SNP的靶标的一个错配和相对于相应野生型序列的两个错配，因此导致相对于相应野生型序列而言优先切割含SNP的靶标。
在一方面，提供了一种具有5’末端、3’末端和种子区(seed region)的寡核苷酸，其中RNA与包含等位基因多态性的基因的区域互补，并且其中RNA包含：在所述种子区内位置处的SNP位置核苷酸、和位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的错配(MM)位置核苷酸，其中所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补，所述错配位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。在一些情况下，所述寡核苷酸与包含等位基因多态性的基因的区域互补，其中所述寡核苷酸包含在5’末端的位置2至6中任一个处的SNP位置核苷酸；和位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的错配位置核苷酸，所述错配位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。
在某些示例性实施例中，所述寡核苷酸是RNA。
在某些示例性实施例中，所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯(VP)修饰，所述亚基间键具有式：
Figure BDA0003009853070000021
在某些示例性实施例中，VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
在某些示例性实施例中，寡核苷酸选自由以下组成的组：siRNA、miRNA、shRNA、CRISPR指导物、DNA、反义寡核苷酸(ASO)、缺口体(gapmer)、混合体(mixmer)、miRNA抑制因子、剪接转换寡核苷酸(SSO)、磷二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)和肽核酸(PNA)。
在某些示例性实施例中，所述RNA是反义寡核苷酸(ASO)或dsRNA。
在某些示例性实施例中，所述dsRNA包含：与包含等位基因多态性的基因的区域互补的、具有约15-35个核苷酸的第一链，和与所述第一链的至少一部分互补的、具有约15-35个核苷酸的第二链，其中所述第一链包含与所述等位基因多态性互补的、在种子区(例如在5’末端的位置2-6处)中的SNP位置核苷酸，并且其中所述第一链包含位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处的MM位置核苷酸，所述MM位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。
在某些示例性实施例中，所述SNP位置核苷酸位于RNA的5’末端的位置2、4或6处，并且所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。
在某些示例性实施例中，所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2、3、4或6个核苷酸内。在某些示例性实施例中，所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的5个核苷酸内。
在某些示例性实施例中，所述dsRNA是平端的。在某些示例性实施例中，所述dsRNA包含至少一个单链核苷酸突出端。在某些示例性实施例中，所述dsRNA包含天然存在的核苷酸。在某些示例性实施例中，所述dsRNA包含至少一个修饰的核苷酸。在某些示例性实施例中，所述dsRNA中的每个核苷酸都是经修饰的。
在某些示例性实施例中，所述至少一个修饰的核苷酸选自由以下组成的组：2′-O-甲基修饰的核苷酸、包含5′-硫代磷酸酯基团的核苷酸、与胆甾烯基衍生物连接的末端核苷酸、和与十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。
在某些示例性实施例中，所述修饰的核苷酸选自由以下组成的组：2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、脱碱基核苷酸、2′-氨基-修饰的核苷酸、2′-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、以及包含非天然碱基的核苷酸。
在某些示例性实施例中，所述dsRNA包含至少一个2′-O-甲基修饰的核苷酸和5′-硫代磷酸酯基团。
在某些示例性实施例中，所述第一链包含至少三个2′-O-甲基修饰的核苷酸。在某些示例性实施例中，所述第一链包含在所述SNP位置核苷酸任一侧的2′-O-甲基修饰的核苷酸。
在某些示例性实施例中，所述dsRNA包含疏水部分。
在某些示例性实施例中，所述包含等位基因多态性的基因的区域包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO：1-10。在某些示例性实施例中，所述第一链包含UUCUGUAGCAUCAGCUUCUC。
在某些示例性实施例中，本文所述的RNA(例如dsRNA的第一链)包含选自由以下组成的组的SNP位置核苷酸(从5’末端参考)-MM位置核苷酸(从5’末端参考)组合：2-7、4-7、4-8、4-15、6-5、6-8、6-11、6-14、6-16、3-5、3-7和3-8。
在某些示例性实施例中，所述SNP位置核苷酸与htt SNP的等位基因多态性互补，所述htt SNP选自由以下组成的组：rs363125、rs362273、rs362307、rs362336、rs362331、rs362272、rs362306、rs362268、rs362267和rs363099。
在某些示例性实施例中，所述RNA进一步包含选自由以下组成的组的5’稳定部分：磷酸酯、乙烯基膦酸酯、C5-甲基(R或S或外消旋)、乙烯基上的C5-甲基和还原的乙烯基。
在某些示例性实施例中，所述RNA进一步包含选自由以下组成的组的缀合物部分：烷基链、维生素、肽、鞘糖脂、多不饱和脂肪酸、开环类固醇、类固醇激素和类固醇脂质。
在一方面，提供了一种dsRNA，其包含：与包含等位基因多态性的基因的区域互补的、具有约15-35个核苷酸的第一链，和与所述第一链的至少一部分互补的、具有约15-35个核苷酸的第二链，其中所述第一链包含与所述等位基因多态性互补的、在种子区中任一个位置处(例如5’末端的位置2至6中的一个)的SNP位置核苷酸，并且其中所述第一链包含位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处的MM位置核苷酸，所述MM位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。
在某些示例性实施例中，提供了一种dsRNA，其包含：与包含等位基因多态性的基因的区域互补的、具有约15-35个核苷酸的第一链，和与所述第一链的至少一部分互补的、具有约15-35个核苷酸的第二链，其中所述第一链包含与所述等位基因多态性互补的、在5’末端的位置2、4或6处的SNP位置核苷酸，并且其中所述第一链包含位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处的MM位置核苷酸，所述MM位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。
在某些示例性实施例中，所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure BDA0003009853070000051
在某些示例性实施例中，VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
在某些示例性实施例中，所述SNP位置核苷酸在第一链的5’末端的位置2处、5’末端的位置4处、或5’末端的位置6处。在其他示例性实施例中，所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2个核苷酸内、位于所述SNP位置核苷酸的3个核苷酸内、位于所述SNP位置核苷酸的4个核苷酸内、位于所述SNP位置核苷酸的5个核苷酸内、或位于所述SNP位置核苷酸的6个核苷酸内。在某些示例性实施例中，所述SNP位置核苷酸位于5’末端的4个核苷酸处，并且所述MM位置核苷酸位于5’末端的7个核苷酸处。在其他示例性实施例中，所述SNP位置核苷酸位于5’末端的6个核苷酸处，并且所述MM位置核苷酸位于5’末端的11个核苷酸处。
在另一方面，提供了一种dsRNA，其包含：与包含等位基因多态性的基因的区域互补的、具有约15-35个核苷酸的第一链，和与所述第一链的至少一部分互补的、具有约15-35个核苷酸的第二链，其中所述第一链包含与所述等位基因多态性互补的、在5’末端的位置6处的SNP位置核苷酸，并且其中所述第一链包含位于5’末端的位置11处的MM位置核苷酸，所述MM位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。
在某些示例性实施例中，所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure BDA0003009853070000061
在某些示例性实施例中，VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
在某些示例性实施例中，所述第一链包含在所述SNP位置核苷酸任一侧的2′-O-甲基修饰的核苷酸。在某些示例性实施例中，所述第一链包含至少三个2′-O-甲基修饰的核苷酸。
在某些示例性实施例中，所述dsRNA包含5′-硫代磷酸酯基团。
在某些示例性实施例中，所述包含等位基因多态性的基因是亨廷顿蛋白(htt)基因。
在某些示例性实施例中，所述包含等位基因多态性的基因的区域包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO：1-10。在某些示例性实施例中，所述第一链包含UUCUGUAGCAUCAGCUUCUC。
在某些方面，提供了一种药物组合物，其包含本文所述的RNA和药学上可接受的载体。
在某些方面，提供了一种抑制基因表达的方法，所述基因包含细胞中的等位基因多态性，所述方法包括使所述细胞与本文所述的接触。
在另一方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗特征在于或归因于包含等位基因多态性的基因的疾病或障碍的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的RNA，所述RNA具有5’末端、3’末端和种子区，并且与包含等位基因多态性的基因的区域互补，其中所述RNA包含：与所述等位基因多态性互补的、在所述种子区中位置处的SNP位置核苷酸，和位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的MM位置核苷酸，所述MM位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。
在某些示例性实施例中，所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure BDA0003009853070000071
在某些示例性实施例中，VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
在某些示例性实施例中，所述RNA是ASO或dsRNA。
在某些示例性实施例中，所述dsRNA包含与包含等位基因多态性的基因的区域互补的、具有约15-35个核苷酸的第一链，和与所述第一链的至少一部分互补的、具有约15-35个核苷酸的第二链，其中所述第一链包含与所述等位基因多态性互补的、在所述种子区内(例如5’末端的位置2至6中的任一个，如5’末端的位置2、4或6)的SNP位置核苷酸，并且其中所述第一链包含位于SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处的MM位置核苷酸，所述MM位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。
在某些示例性实施例中，将所述dsRNA施用于所述受试者的脑中。在某些示例性实施例中，通过纹状体内输注施用所述dsRNA。在某些示例性实施例中，纹状体中基因的表达得到了降低。在某些示例性实施例中，皮质中基因的表达得到了降低。
在某些示例性实施例中，所述包含等位基因多态性的基因是亨廷顿蛋白(htt)基因。在某些示例性实施例中，所述疾病是亨廷顿病。
在某些示例性实施例中，所述SNP位置核苷酸位于RNA的5’末端的位置2、4或6处，并且所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。
在另一方面，提供了一种包含两个RNA的二支链(di-branched)寡核苷酸化合物，其中所述RNA通过一个或多个部分彼此连接，所述部分选自接头、间隔子和分支点，其中每个RNA具有5’末端、3’末端和种子区，其中每个RNA与包含等位基因多态性的基因的区域互补，并且其中每个RNA包含在所述种子区内位置处的SNP位置核苷酸、和位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的MM位置核苷酸，所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补，所述MM位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。
在某些示例性实施例中，所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure BDA0003009853070000081
在某些示例性实施例中，VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
在某些示例性实施例中，所述二支链寡核苷酸化合物具有hsi-RNA结构。
在某些示例性实施例中，所述SNP位置核苷酸与htt SNP的等位基因多态性互补，所述htt SNP选自由以下组成的组：rs363125、rs362273、rs362307、rs362336、rs362331、rs362272、rs362306、rs362268、rs362267和rs363099。
在另一方面，提供了一种包含两个或更多个核酸序列的二支链寡核苷酸化合物，其中所述核酸序列(N)通过一个或多个部分彼此连接，所述部分选自接头(L)、间隔子(S)和任选地分支点(B)，其中每个核酸序列是双链的并且包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链各自具有5’末端和3’末端，其中所述有义链和所述反义链各自包含一个或多个化学修饰的核苷酸，其中每条反义链具有种子区，其中每条反义链与包含等位基因多态性的基因的区域互补，并且其中每条反义链包含在所述种子区内位置处的SNP位置核苷酸、和位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的错配(MM)位置核苷酸，所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补，所述错配位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。
在某些示例性实施例中，所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure BDA0003009853070000091
在某些示例性实施例中，VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
在某些示例性实施例中，所述有义链和所述反义链各自包含＞80％的化学修饰的核苷酸。
在某些示例性实施例中，在所述有义链和所述反义链的5’末端的位置1和2处的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。
在某些示例性实施例中，每条反义链包含至少15个连续的核苷酸，并且其中每条有义链包含至少15个连续的核苷酸并且与所述反义链具有互补性。
在某些示例性实施例中，所述化合物进一步包含附接至支链寡核苷酸化合物的末端5’位置处的疏水部分。
在某些示例性实施例中，每个双链核酸序列独立地与所述有义链或所述反义链的3’末端或5’末端处的接头、间隔子或分支点连接。
在某些示例性实施例中，所述SNP位置核苷酸与htt SNP的等位基因多态性互补，所述htt SNP选自由以下组成的组：rs363125、rs362273、rs362307、rs362336、rs362331、rs362272、rs362306、rs362268、rs362267和rs363099。
在另一方面，提供了一种具有5’末端、3’末端和种子区并且与包含等位基因多态性的基因的区域互补的核酸，其中所述核酸包含在所述种子区内位置处的SNP位置核苷酸(其中所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补)、与基因中的核苷酸是错配的MM位置、以及在所述SNP位置核苷酸的任一侧的至少一个修饰的核苷酸(X)(其中每个X位于所述SNP位置核苷酸的四个、三个或两个核苷酸内)。
在某些示例性实施例中，所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure BDA0003009853070000101
在某些示例性实施例中，VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
在某些示例性实施例中，X包含选自由以下组成的组的糖修饰：2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-氟(2’-F)、2’-核糖核酸、2’-脱氧核糖核酸、2′-F-4′-硫代阿拉伯糖(2’-F-ANA)、2-O-(2-甲氧基乙基)(2’-MOE)、4’-S-RNA、锁核酸(LNA)、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、2-氰乙基-RNA(CNet-RNA)、三环-DNA、环己烯基核酸(CeNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)和己糖醇核酸(HNA)。
在某些示例性实施例中，X位于紧靠所述SNP位置核苷酸的5’处或紧靠所述SNP位置核苷酸的3’处。在某些示例性实施例中，X位于紧靠所述SNP位置核苷酸的5’处和紧靠所述SNP位置核苷酸的3’处。
在某些示例性实施例中，所述SNP位置核苷酸存在于5’末端的从位置2至位置6处。在某些示例性实施例中，所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处。在某些示例性实施例中，所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。
在另一方面，提供了一种具有5’末端、3’末端和种子区并且与包含等位基因多态性的基因的区域互补的核酸，其中所述核酸包含在所述种子区内位置处的SNP位置核苷酸(其中所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补)、与基因中的核苷酸是错配的MM位置、以及在所述MM位置核苷酸的任一侧的至少一个修饰的核苷酸(Y)(其中每个Y位于所述MM位置核苷酸的四个、三个或两个核苷酸内)。
在某些示例性实施例中，所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure BDA0003009853070000111
在某些示例性实施例中，VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
在某些示例性实施例中，Y位于紧靠所述MM位置核苷酸的5’处或紧靠所述MM位置核苷酸的3’处。在某些示例性实施例中，Y位于紧靠所述MM位置核苷酸的5’处和紧靠所述MM位置核苷酸的3’处。
在某些示例性实施例中，所述SNP位置核苷酸存在于5’末端的从位置2至位置6处。在某些示例性实施例中，所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处。在某些示例性实施例中，所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。
在另一方面，提供了一种具有5’末端、3’末端和种子区并且与包含等位基因多态性的基因的区域互补的核酸，其中所述核酸包含在所述种子区内位置处的SNP位置核苷酸(其中所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补)、与基因中的核苷酸是错配的MM位置、以及在所述SNP位置核苷酸的任一侧的至少一个修饰的核苷酸(X)(其中每个X位于所述SNP位置核苷酸的四个、三个或两个核苷酸内)、以及在所述MM位置核苷酸的任一侧的至少一个修饰的核苷酸(Y)(其中每个Y位于所述MM位置核苷酸的四个、三个或两个核苷酸内)。
在某些示例性实施例中，所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure BDA0003009853070000121
在某些示例性实施例中，VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
在某些示例性实施例中，X包含选自由以下组成的组的糖修饰：2’-OMe、2’-F、2’-核糖核酸、2’-脱氧核糖核酸、2’-F-ANA、2’-MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA和HNA。在某些示例性实施例中，Y包含选自由以下组成的组的糖修饰：2’-OMe、2’-F、2’-核糖核酸、2’-脱氧核糖核酸、2’-F-ANA、2’-MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA和HNA。
在某些示例性实施例中，X位于紧靠所述SNP位置核苷酸的5’处或紧靠所述SNP位置核苷酸的3’处。在某些示例性实施例中，X位于紧靠所述SNP位置核苷酸的5’处和紧靠所述SNP位置核苷酸的3’处。
在某些示例性实施例中，Y位于紧靠所述MM位置核苷酸的5’处或紧靠所述MM位置核苷酸的3’处。在某些示例性实施例中，Y位于紧靠所述MM位置核苷酸的5’处和紧靠所述MM位置核苷酸的3’处。
在某些示例性实施例中，所述SNP位置核苷酸存在于5’末端的从位置2至位置6处。在某些示例性实施例中，所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处。在某些示例性实施例中，所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。
在某些示例性实施例中，X和Y是相同的。
附图说明
通过以下结合附图对说明性实施例的详细描述，将更全面地理解本发明的前述和其他特征和优势。本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。应请求并且支付必要的费用后，具有彩色附图的本专利或专利申请披露的副本将由专利局提供。
图1描绘了psiCHECK报告基因质粒，其含有htt的野生型区域或具有SNP(rs362273)的htt的相同区域。
图2描绘了条形图，其显示在用具有在不同位置处的SNP核苷酸的hsiRNAs转染的HeLa细胞中，psiCHECK报告基因质粒测定后的萤光素酶活性。该初步筛选产生了多个有效的疏水修饰的siRNA(hsiRNA)序列。
图3描绘了剂量反应曲线，其显示在psiCHECK报告基因质粒上本发明的三个示例性hsiRNA的沉默效应。
图4描绘了剂量反应曲线，其显示两个hsiRNA对沉默htt mRNA的功效。
图5描绘了条形图，其显示在用具有在不同位置处的第二错配的hsiRNA转染的HeLa细胞中，psiCHECK报告基因质粒测定后的萤光素酶活性。
图6描绘了剂量反应曲线，其比较了具有(mm2-7)或不具有(mm2-0)另外的错配的SNP2 hsiRNA的沉默效应。
图7描绘了剂量反应曲线，其比较了具有或不具有另外的错配的SNP4 hsiRNA的沉默效应。
图8描绘了剂量反应曲线，其比较了具有或不具有另外的错配的SNP6 hsiRNA的沉默效应。
图9描绘了剂量反应曲线，其比较了具有另外的错配(分别是SNP4-7和SNP6-11)的SNP4或SNP6 hsiRNA与不具有另外的错配(SNP4-0和SNP4-11)的相同hsiRNA相比的沉默效应。通过被动摄取，将用两个报告基因质粒之一转染的HeLa细胞用hsiRNA反转染，并处理72小时。用双萤光素酶测定来测量报告基因表达。
图10描绘了htt mRNA表达的剂量反应曲线，其测量了具有另外的错配的hsiRNA的沉默功效。
图11示意性地描绘了根据本发明的某些实施例的hsiRNA和示例性修饰。
图12A-图12C分别描绘了SNP2、SNP4和SNP6 hsiRNA文库。反义链按5’至3’进行描述，其中以红色表示SNP位点，并且以蓝色表示错配。
图13描绘了根据某些实施例的不同hsiRNA构建体的反义链序列和有义链序列以及修饰模式。mm4-7和mm6-11表现出优越的SNP判别，并选择用于进一步筛选。
图14描绘了设计成双siRNA的示例性SNP选择性化合物。
图15描绘了根据某些示例性实施例的骨架键。寡核苷酸骨架可以包含磷酸酯、硫代磷酸酯(外消旋混合物或立体特异性混合物)、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、肽核酸(PNA)、硼烷磷酸酯、2’-5’-磷酸二酯、酰胺、磷酰基乙酸酯、吗啉代等中的一种或任何组合。
图16描绘了根据某些示例性实施例的糖修饰。糖修饰包括2’-O-甲基、2’-氟、2’-核糖核酸、2′-脱氧核糖核酸、2’-F-ANA、MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA、HNA等中的一种或任何组合。
图17描绘了根据某些示例性实施例的核苷酸间键。潜在的核苷酸间键可以在任何给定寡核苷酸链的5’或3’末端的前两个核苷酸之间，其可以用所描述的任何部分进行稳定。
图18描绘了根据某些示例性实施例的5’稳定化修饰。合适的5’稳定化修饰可以是磷酸酯、无磷酸酯、乙烯基膦酸酯、C5-甲基(R或S或外消旋)、在乙烯基上的C5-甲基、还原的乙烯基(例如三个碳烷基)等。
图19描绘了根据某些示例性实施例的缀合部分。合适的缀合部分可以是任何长度的烷基链、维生素、配体、肽或生物活性缀合物，例如鞘糖脂、多不饱和脂肪酸、开环类固醇、类固醇激素、类固醇脂质等。
图20图示地描绘了SNP判别性支架的活性是序列独立性的，所述支架包含在5’末端的位置6处的SNP位置核苷酸和位于5’末端的位置11处的错配位置核苷酸。
图21展示了本文所述的乙烯基膦酸酯(VP)修饰的亚基间键的代表性合成。
图22描绘了用于制备具有VP修饰的亚基间键的寡核苷酸的方法。
图23是根据某些示例性实施例的VP修饰的RNA的图形表示。
图24展示了根据某些示例性实施例合成的VP修饰的寡核苷酸的序列。
图25是对siRNA功效的比较研究的总结。
图26是与围绕SNP位点rs362273的HTT序列比对的hsiRNA反义支架的示意图，其中绿色框描绘了SNP位点的位置。
图27A和27B展示了在siRNA序列中添加错配的作用，即改善了等位基因判别而不削弱突变型等位基因的沉默。
图28A和28B描绘了通过合成仪制备的VP修饰的序列。
图29示出了用于制备本文提供的VP修饰的寡核苷酸的另一种方法。
图30示出了VP修饰的键对SNP选择性siRNA的靶/非靶判别的作用。
图31展示了实例二支链siRNA化学支架。
图32A是用于测量HTT蛋白质水平的蛋白质印迹。图32B示出了归一化为黏着斑蛋白的蛋白质水平。
图33描绘了剂量反应曲线，其比较了在SNP位点处靶向G而不是A的寡核苷酸的沉默效应。
图34展示了在先前针对剂量反应选择的序列中引入单个错配的实例序列。
图35展示了示例性寡核苷酸骨架修饰的数目。
图36示出了根据某些示例性实施例的寡核苷酸分支基序。双螺旋线代表寡核苷酸。不同接头、间隔子和分支点的组合允许多种支链hsiRNA结构的产生。
图37示出了具有缀合的生物活性部分的本发明的支链寡核苷酸。
图38示出了示例性亚酰胺接头、间隔子和分支部分。
图39是与围绕替代性SNP位点rs362273的HTT序列比对的hsiRNA反义支架的示意图。
图40描绘了条形图，其显示在用图39的hsiRNA转染的HeLa细胞中，psiCHECK报告基因质粒测定后的萤光素酶活性。“SNP”之后的数字代表SNP在siRNA中的位置。
图41描绘了剂量反应曲线，其比较了靶向在SNP3位点处的C或T的图39的寡核苷酸的沉默效应。
图42描绘了条形图，其显示在用图39的hsiRNA(其被修饰以表征在不同位置处的第二错配)转染的HeLa细胞中，psiCHECK报告基因质粒测定后的萤光素酶活性。
图43展示了实例修饰的亚基间接头。
图44A示出了用于制备针对本文提供的修饰的含次膦酸酯的寡核苷酸的单体的代表性实例。图44B示出了用于制备针对本文提供的修饰的含次膦酸酯的寡核苷酸的另一个单体的代表性实例。图44C示出了用于制备本文提供的修饰的含次膦酸酯的寡核苷酸的代表性实例。
图45展示了HTT基因(SEQ ID NO：1-10(从上至下编号))内的示例性SNP。
图46是展示了用于产生和选择SNP判别性siRNA的方法的流程图。
图47展示了指示siRNA内SNP位置的命名规则。
具体实施方式
本披露涉及包含寡核苷酸(例如RNA)沉默剂(例如RNA，如双链RNA(“dsRNA”))、反义寡核苷酸(“ASO”)等的组合物，所述寡核苷酸可用于使位于编码突变型蛋白质的基因内的等位基因多态性沉默。在特定的方面，寡核苷酸(例如RNA)沉默剂是本文提供的dsRNA剂，其破坏具有核苷酸特异性和选择性的相应突变型mRNA(例如含SNP的mRNA)。寡核苷酸(例如RNA)沉默剂(如本文披露的dsRNA剂)靶向与突变基因的多态性区域对应的mRNA，导致突变型mRNA的切割，并且防止相应突变型蛋白质(例如功能获得型突变型蛋白质，如亨廷顿蛋白)的合成。
定义
除非本文另作定义，否则本文使用的科技术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外在定义。除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数形式，并且复数术语应包括单数形式。除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括”以及其他形式诸如“包含”和“含有”的使用不是限制性的。
如本文所用，在寡核苷酸序列的上下文中，“A”代表包含碱基腺嘌呤的核苷(例如腺苷或其化学修饰的衍生物)；“G”代表包含碱基鸟嘌呤的核苷(例如鸟苷或其化学修饰的衍生物)；“U”代表包含碱基尿嘧啶的核苷(例如尿苷或其化学修饰的衍生物)；并且“C”代表包含碱基腺嘌呤的核苷(例如胞苷或其化学修饰的衍生物)。
如本文所用，术语“封端基团”是指替代官能团(例如醇(ROH)、羧酸(RCO2H)或胺(RNH2))中的氢原子的化学部分。封端基团的非限制性实例包括：烷基(例如甲基、叔丁基)；烯基(例如乙烯基、烯丙基)；羧基(例如乙酰基、苯甲酰基)；氨基甲酰基；磷酸酯；和膦酸酯(例如乙烯基膦酸酯)。其他合适的封端基团对于本领域技术人员是已知的。
术语“核苷酸类似物”或“改变的核苷酸”或“修饰的核苷酸”是指非标准的核苷酸，包括非天然存在的核糖核苷酸或脱氧核苷酸。示例性核苷酸类似物在任何位置处被修饰，以便于改变核苷酸的某些化学特性，仍保留核苷酸类似物执行其预期功能的能力。可以衍生的核苷酸的位置的实例包括位置5，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷、5-丙炔尿苷、5-丙烯基尿苷等；位置6，例如6-(2-氨基)丙基尿苷；针对腺苷和/或鸟苷的位置8，例如8-溴鸟苷、8-氯鸟苷、8-氟鸟苷等。核苷酸类似物还包括脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；O-和N-修饰的(例如烷基化的，如N6-甲基腺苷，或本领域中另外已知的)核苷酸；以及其他杂环修饰的核苷酸类似物，例如在Herdewijn，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.[反义核酸药物进展]，2000年8月.10(4)：297-310中所述的那些。
术语“寡核苷酸”是指核苷酸和/或核苷酸类似物的短聚合物。术语“RNA类似物”是指与相应未改变的或未修饰的RNA相比，具有至少一个改变的或修饰的核苷酸，但保留与相应未改变的或未修饰的RNA相同或类似的性质或功能的多核苷酸(例如化学合成的多核苷酸)。如上所讨论的，寡核苷酸可以用键连接，其导致与具有磷酸二酯键的RNA分子相比，RNA类似物的水解速率更低。例如，类似物的核苷酸可以包含亚甲基二醇、乙烯二醇、氧基甲硫基、氧基乙硫基、氧基羰基氧基、磷二酰胺、磷酰胺和/或硫代磷酸酯键。在具体的实施例中，RNA类似物包括糖修饰的和/或骨架修饰的核糖核苷酸和/或脱氧核苷酸。此类改变或修饰可进一步包括将非核苷酸物质添加至例如RNA的一个或多个末端或(RNA的一个或多个核苷酸的)内部。RNA类似物仅需与天然RNA足够相似，使其具有介导RNA干扰的能力。
如本文所用，示例性寡核苷酸包括但不限于siRNA、miRNA、shRNA、CRISPR指导物、DNA寡核苷酸、反义寡核苷酸、AAV寡核苷酸、缺口体、混合体、miRNA抑制因子、SSO、PMO、PNA等。
如本文所用，术语“RNA干扰”(“RNAi”)是指RNA的选择性细胞内降解。RNAi天然存在于细胞中，以去除外源RNA(例如病毒RNA)。天然RNAi经由从游离dsRNA裂解的片段开始进行，所述片段将使降解机制指向其他相似的RNA序列。可替代地，RNAi可以由人为启动，例如使靶基因的表达沉默。
如本文所用，术语“hsiRNA”是指本文提供的双链RNA的实施例，其中RNA分子被完全地化学修饰，包括如本文所述的一个或多个疏水性修饰。
RNAi剂(例如RNA沉默剂)具有作为“足够与靶mRNA序列互补以指导靶特异性RNA干扰(RNAi)的序列”的链表示所述链通过RNAi机制或过程具有足够触发靶mRNA的破坏的序列。
如本文所用，术语“分离的RNA”(例如，“分离的siRNA”或“分离的siRNA前体”)是指当通过重组技术生产时基本上不含其他细胞材料或培养基、或当化学合成时基本上不合化学前体或其他化学物质的RNA分子。
如本文所用，术语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一组序列特异性调控机制(例如RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压制、共抑制、翻译遏制等)，导致相应蛋白质编码基因的表达的抑制或“沉默”。在许多类型的生物体(包括植物、动物和真菌)中都观察到了RNA沉默。
术语“判别性RNA沉默”是指例如当同一细胞中存在两个多核苷酸序列时，RNA分子基本上抑制“第一”或“靶”多核苷酸序列的表达而基本上不抑制“第二”或“非靶”多核苷酸序列的表达的能力。在某些实施例中，靶多核苷酸序列与靶基因相对应，而非靶多核苷酸序列与非靶基因相对应。在其他实施例中，靶多核苷酸序列与靶等位基因相对应，而非靶多核苷酸序列与非靶等位基因相对应。在某些实施例中，靶多核苷酸序列是编码靶基因的调控区(例如启动子或增强子元件)的DNA序列。在其他实施例中，靶多核苷酸序列是由靶基因编码的靶mRNA。
疾病或障碍中“涉及”的基因包括如下基因，所述基因的正常或异常表达或功能会影响或引起疾病或障碍或所述疾病或障碍的至少一种症状。
如本文所用，术语“靶基因”(例如，杂合多态性的突变型等位基因，如杂合SNP)是其表达将被基本上抑制或“沉默”的基因。该沉默可以通过RNA沉默(例如通过切割靶基因的mRNA或靶基因的翻译遏制)来实现。术语“非靶基因”(例如野生型等位基因)是其表达基本上不沉默的基因。在一个实施例中，靶基因和非靶基因的多核苷酸序列(例如由靶基因和非靶基因编码的mRNA)可以相差一个或多个核苷酸。在另一个实施例中，靶基因和非靶基因可以相差一个或多个多态性(例如单核苷酸多态性或SNP)。在另一个实施例中，靶基因和非靶基因可以共享少于100％的序列同一性。在另一个实施例中，非靶基因可以是靶基因的同源物(例如直向同源物或横向同源物)。
“靶等位基因”是其表达将被选择性抑制或“沉默”的等位基因(例如SNP等位基因)。该沉默可以通过RNA沉默(例如通过siRNA切割靶基因或靶等位基因的mRNA)来实现。术语“非靶等位基因”是其表达基本上不沉默的等位基因(例如相应的野生型等位基因)。在某些实施例中，靶等位基因和非靶等位基因可以与相同的靶基因对应。在其他实施例中，靶等位基因与靶基因相对应或相关，并且非靶等位基因与非靶基因相对应或相关。在一个实施例中，靶等位基因和非靶等位基因的多核苷酸序列可以相差一个或多个核苷酸。在另一个实施例中，靶等位基因和非靶等位基因可以相差一个或多个等位基因多态性(例如一个或多个SNP)。在另一个实施例中，靶等位基因和非靶等位基因可以共享少于100％的序列同一性。
如本文所用，术语“多态性”是指基因序列的变异(例如一个或多个缺失、插入或取代)，所述变异在比较来自不同来源或受试者(但来自相同的生物体)的相同基因序列时被鉴定或检测到。例如，当比较来自不同受试者的相同基因序列时，可以鉴定出多态性。此类多态性的鉴定在本领域是常规的，方法类似于用于检测例如乳腺癌点突变的那些方法。可以例如根据从受试者的淋巴细胞中提取的DNA进行鉴定，然后使用针对所述多态性区域的特异性引物扩增多态性区域。可替代地，在比较相同基因的两个等位基因时，可以鉴定多态性。
在具体的实施例中，多态性是单核苷酸多态性(SNP)。生物体内相同基因的两个等位基因之间的序列变异在本文中被称为“等位基因多态性”。在某些实施例中，等位基因多态性与SNP等位基因相对应。例如，等位基因多态性可以包含SNP的两个等位基因之间的单核苷酸变异，在本文中也称为杂合SNP。多态性可以在编码区内的核苷酸处，但是由于遗传密码的简并性，没有编码氨基酸序列中的改变。可替代地，多态性序列可以编码在特定位置处的不同氨基酸，但是氨基酸中的改变不影响蛋白质功能。多态性区域也可以在基因的非编码区中发现。在具体的实施例中，在基因的编码区或基因的非翻译区(例如5′UTR或3′UTR)中发现多态性。
如本文所用，术语“等位基因频率”是个体群体中单个基因座处等位基因(例如SNP等位基因)的相对频率的量度(例如比例或百分比)。例如，在个体群体在其每个体细胞中都携带特定染色体基因座(和占据基因座的基因)的n个基因座的情况下，等位基因的等位基因频率就是等位基因在所述群体内占据的基因座的分数或百分比。在具体的实施例中，在样品群体中等位基因(例如SNP等位基因)的等位基因频率为至少10％(例如至少15％、20％、25％、30％、35％、40％或更高)。
如本文所用，术语“功能获得性突变”是指基因中的任何突变，其中由所述基因编码的蛋白质(即，突变型蛋白质)获得与引起或导致疾病或障碍的蛋白质(即，野生型蛋白质)通常不相关的功能。功能获得性突变可以是基因中一个或多个核苷酸的缺失、添加或取代，从而引起所编码的蛋白质的功能改变。在一个实施例中，功能获得性突变改变了突变型蛋白质的功能或引起与其他蛋白质的相互作用。在另一个实施例中，例如，通过改变的突变型蛋白质与正常的野生型蛋白质的相互作用，功能获得性突变引起所述正常的野生型蛋白质的减少或去除。
如本文所用，术语“功能获得性障碍”是指以功能获得性突变为特征的障碍。在一个实施例中，功能获得性障碍是由功能获得性突变引起的神经系统变性疾病，例如聚谷氨酰胺障碍和/或三核苷酸重复疾病，如亨廷顿病。在另一个实施例中，功能获得性障碍由癌基因中获得的功能引起，突变的基因产物是功能获得性突变体，例如由ret癌基因(例如ret-1)中的突变引起的癌症，例如内分泌肿瘤、甲状腺髓样肿瘤、甲状旁腺激素肿瘤、多发性内分泌肿瘤2型等。另外的示例性功能获得性障碍包括但不限于阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、人类免疫缺陷障碍(HIV)和慢通道先天性肌无力综合征(SCCMS)。
如本文所用，术语“三核苷酸重复疾病”是指以位于基因内的扩展的三核苷酸重复区域为特征的任何疾病或障碍，所述扩展的三核苷酸重复区域是所述疾病或障碍的病因。三核苷酸重复疾病的实例包括但不限于12型脊髓小脑性共济失调、8型脊髓小脑性共济失调、脆性X综合征、脆性XE精神发育迟缓、弗里德赖希共济失调和强直性肌营养不良。根据本发明的用于治疗的优选的三核苷酸重复疾病是特征在于或归因于基因编码区的5′末端的扩展的三核苷酸重复区域的那些疾病，编码突变型蛋白质的基因引起所述疾病或障碍或是所述疾病或障碍的原因。某些三核苷酸疾病，例如脆性X综合征(其中突变与编码区不相关)可能不适合根据本发明的方法进行治疗，因为不存在合适的mRNA被RNAi靶向。相反，疾病(例如弗里德赖希共济失调)可能适合根据本发明的方法进行治疗，因为尽管致病突变不在编码区内(即，位于内含子内)，突变可能在例如mRNA前体(例如预剪接的mRNA前体)内。
如本文所用，术语“聚谷氨酰胺障碍”是指以编码区的5′末端处的(CAG)n重复的扩展(因此编码所编码的蛋白质中扩展的聚谷氨酰胺区)为特征的任何疾病或障碍。在一个实施例中，聚谷氨酰胺障碍以神经细胞的进行性变性为特征。聚谷氨酰胺障碍的实例包括但不限于亨廷顿病、1型脊髓小脑性共济失调、2型脊髓小脑性共济失调、3型脊髓小脑性共济失调(还称为马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease))、和6型脊髓小脑性共济失调、7型脊髓小脑性共济失调、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩(dentatoiubral-pallidoluysian atrophy)等。
术语“单核苷酸多态性障碍”或“SNP障碍”是指以SNP(例如杂合SNP)的存在为特征的障碍。SNP障碍包括但不限于苯丙酮尿症、囊性纤维化、镰状细胞性贫血、白化病、亨廷顿病、1型强直性肌营养不良、高胆固醇血症(常染色体显性，B型)、神经纤维瘤病(1型)、多囊肾病(1和2型)、血友病A、迪谢内肌营养不良、X连锁的低磷酸盐血症性佝偻病、雷特氏综合征、非阻塞性生精功能障碍等。示例性杂合SNP障碍是亨廷顿病。
在某些方面，提供了一种双链RNA(dsRNA)，其包含与包含等位基因多态性的基因的区域互补的、具有约15-35个核苷酸的第一链，和与所述第一链的至少一部分互补的、具有约15-35个核苷酸的第二链，其中所述第一链包含与所述等位基因多态性互补的、在5’末端的位置2至7处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸；和位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的错配(MM)位置核苷酸，所述错配位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。在一些情况下，MM位置位于SNP位置的2至10个核苷酸处。在一些情况下，SNP位置核苷酸在5’末端的位置2至6中的任一处。在示例性实施例中，SNP位置核苷酸在5’末端的位置2、4或6处，并且错配(MM)位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。在一些情况下，所述SNP位置核苷酸是在5’末端的位置2至6中的任一处，并且所述核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。
如本文所用，“单核苷酸多态性位置核苷酸”或“SNP位置核苷酸”是指与靶核酸序列的多态性位置对应的本文所述的RNA(例如dsRNA的第一链)的位置(即，与SNP等位基因对应的突变型核苷酸或与野生型等位基因对应的野生型核苷酸)。例如，链可以被标记为“SNP2”、“SNP3”或“SNP3”，以指示SNP的位置为链的5’末端的2、3或4个核苷酸。
在某些示例性实施例中，SNP位置核苷酸在种子区内。在某些示例性实施例中，SNP位置核苷酸位于5’末端的位置2至位置7处、5’末端的位置2至位置6处、或5’末端的位置2至位置5处。在某些示例性实施例中，SNP位置核苷酸位于本文所述的RNA(例如dsRNA的第一链)的5’末端的位置2处、5’末端的位置3处、5’末端的位置4处、5’末端的位置5处、5’末端的位置6处或5’末端的位置7处。在某些示例性实施例中，SNP位置核苷酸位于表5-7中列出的位置处。
如本文所用，术语“种子区”是指与RNA链的5’末端的位置2-7对应的六个核苷酸伸展。据信靶mRNA的siRNA识别由其反义链的种子区赋予。
如本文所用，“错配位置核苷酸”或“MM位置核苷酸”是指位于不与SNP位置核苷酸相应的位置处的本文所述的RNA(例如dsRNA的第一链)的位置。MM位置核苷酸可以由其在本文所述的RNA的5’末端或3’末端(例如dsRNA的第一链的5’或3’末端)的位置定义，或由其相对于本文所述的RNA(例如dsRNA的第一链)的SNP位置核苷酸的位置定义。
在某些示例性实施例中，MM位置核苷酸位于SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸、2-10个核苷酸、2-9个核苷酸、2-8个核苷酸、2-7个核苷酸或2-6个核苷酸处。在某些示例性实施例中，MM位置核苷酸位于SNP位置核苷酸的11个核苷酸、10个核苷酸、9个核苷酸、8个核苷酸、7个核苷酸、6个核苷酸、5个核苷酸、4个核苷酸、3个核苷酸或2个核苷酸处。在某些示例性实施例中，MM位置核苷酸位于表5-7中列出的位置处。
在一个实施例中，本文所述的RNA(例如dsRNA的第一链)与等位基因多态性同源，不同之处在于相对于与等位基因多态性对应的核苷酸的特定位置处的一个错配的寡核苷酸。在某些实施例中，错配在SNP位置核苷酸的约6个核苷酸内、SNP位置核苷酸的约5个核苷酸内、SNP位置核苷酸的约4个核苷酸内、SNP位置核苷酸的约3个核苷酸内、SNP位置核苷酸的约2个核苷酸内、或SNP位置核苷酸的约1个核苷酸内。在具体的实施例中，错配不与SNP位置核苷酸相邻。
在另一个实施例中，SNP位置核苷酸是在5’末端的位置2、3、4、5或6处。在实施例中，SNP位置核苷酸是在5’末端的位置2处。在实施例中，是在5’末端的位置3处。在实施例中，SNP位置核苷酸是在5’末端的位置4处。在实施例中，SNP位置核苷酸是在5’末端的位置5处。在实施例中，SNP位置核苷酸是在5’末端的位置6处。
在某些示例性实施例中，本文所述的RNA(例如dsRNA的第一链)包含在5’末端的位置5、7、8、11、14、15或16处的MM位置核苷酸。在某些示例性实施例中，本文所述的RNA(例如dsRNA的第一链)包含SNP位置核苷酸的1、2、3、4、5、8、9、10或11个核苷酸处的MM位置核苷酸。
在某些示例性实施例中，本文所述的RNA(例如dsRNA的第一链)包含选自由以下组成的组的SNP位置核苷酸(从5’末端参考)-MM位置核苷酸(从5’末端参考)组合：2-7、4-7、4-8、4-15、6-5、6-8、6-11、6-14、6-16、3-5、3-7和3-8。
在具体示例性实施例中，本文所述的RNA(例如dsRNA的第一链)包含在5’末端的位置6处的SNP位置核苷酸和在5’末端的位置11处的MM位置核苷酸。在另一个具体示例性实施例中，本文所述的RNA(例如dsRNA的第一链)包含在5’末端的位置4处的SNP位置核苷酸和在5’末端的位置7处的错配。
在一方面，本文提供的双链RNA选择性地使具有等位基因多态性的突变型等位基因沉默。在实施例中，本文提供的双链RNA使具有等位基因多态性的突变型等位基因沉默，并且不影响相同基因的野生型等位基因。在另一个实施例中，本文提供的双链RNA使具有等位基因多态性的突变型等位基因沉默，并且以与所述突变型等位基因相比更小的程度使相同基因的野生型等位基因沉默。
因此，在一方面，本发明提供了一种治疗患有疾病或处于患有疾病的风险的受试者的方法，所述疾病的特征在于或归因于与等位基因多态性相关的突变型蛋白质，所述方法通过向所述受试者施用有效量的、靶向编码突变型蛋白质(例如亨廷顿蛋白)的基因内的等位基因多态性的RNAi剂进行，使基因的序列特异性干扰发生，从而产生针对所述疾病的有效治疗。
在一方面，与相应野生型等位基因相比，本文披露的RNA沉默剂优先地使包含多态性的突变型等位基因更有效地沉默。在某些示例性实施例中，本文披露的dsRNA使包含多态性的等位基因比相应野生型等位基因多沉默约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在实施例中，本文披露的RNA沉默剂使包含多态性的等位基因比相应野生型等位基因多沉默至少约50％。在某些示例性实施例中，本文披露的dsRNA使包含多态性的等位基因沉默至少约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍、约85倍、约90倍、约95倍、约100倍、约110倍、约120倍、约130倍、约140倍、约150倍、约160倍、约170倍、约180倍、约190倍、约200倍、约250倍、约300倍、约350倍、约400倍、约450倍、或高达约500倍的相应野生型等位基因的沉默水平。
如本文所用，术语RNA沉默剂(例如siRNA或RNA沉默剂)的“反义链”是指与所靶向进行沉默的基因的mRNA的约10-50个核苷酸，例如约15-30、16-25、18-23或19-22个核苷酸的部分基本上互补的链。反义链或第一链具有足够与所希望的靶mRNA序列互补以指导靶特异性沉默的序列，例如足够通过RNAi机制或过程(RNAi干扰)触发所希望的靶mRNA的破坏的互补性、或足够触发所希望的靶mRNA的翻译遏制的互补性。
术语RNA沉默剂(例如siRNA或RNA沉默剂)的“有义链”或“第二链”是指与反义链或第一链互补的链。反义链和有义链还可以被称为第一链或第二链，所述第一链或第二链与靶序列具有互补性，并且各自的第二链或第一链与所述第一链或第二链具有互补性。miRNA双链体中间体或siRNA样双链体包括：与所靶向进行沉默的基因的mRNA的约10-50个核苷酸部分具有足够的互补性的miRNA链，和具有足够与miRNA链形成双链体的互补性的miRNA＊链。
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”或“ASO”是指与靶RNA(例如含SNP的mRNA或含SNP的前体mRNA)具有足够序列互补性的核酸(例如RNA)，以便于以有效的方式(例如以有效抑制靶mRNA的翻译和/或靶前体mRNA的剪接的方式)阻断靶RNA的区域。具有“足够与靶RNA互补的序列”的反义寡核苷酸是指具有足够掩盖蛋白质的结合位点(否则会调节剪接)的序列的反义剂；和/或具有足够掩盖核糖体的结合位点的序列的反义剂；和/或具有足够改变所靶向的RNA的三维结构以防止剪接和/或翻译的序列的反义剂。
如本文所用，“5′末端”，如在反义链的5′末端，是指5’末端核苷酸，例如在反义链5′末端的一个和约5个核苷酸之间。如本文所用，“3′末端”，如在有义链的3′末端，是指如下区域：例如与互补性反义链的5′末端的核苷酸互补的、在一个和约5个核苷酸之间的区域。
如本文所用，术语“碱基对”是指在寡核苷酸双链体(例如由RNA沉默剂的链和靶mRNA序列形成的双链体)的相对链上的核苷酸(或核苷酸类似物)对之间的相互作用，其主要是由于所述核苷酸(或核苷酸类似物)之间的氢键、范德瓦耳斯互作用等。如本文所用，术语“键强度”或“碱基对强度”是指碱基对的强度。
如本文所用，术语“错配的碱基对”是指由非互补性或非沃森-克里克(non-Watson-Crick)碱基对组成的碱基对，例如非正常互补性G∶C、A∶T或A∶U碱基对。如本文所用，术语“不明确的(ambiguous)碱基对”(也被称为非判别性碱基对)是指由通用核苷酸形成的碱基对。
在本发明的缀合的化合物中可用的接头包括乙二醇链(例如聚乙二醇)、烷基链、肽、RNA、DNA及其组合。如本文所用，缩写“TEG”是指三乙二醇。
寡核苷酸的设计
在某些实施例中，本发明的寡核苷酸(例如siRNA)是由有义链和互补性反义链组成的双链体，所述反义链与含有等位基因多态性的靶mRNA具有足够的互补性以介导RNAi。在示例性实施例中，siRNA分子具有约10-50个或更多个核苷酸的长度，即每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。在具体示例性实施例中，siRNA分子具有每条链中约15-35，例如约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34或约35个核苷酸的长度，其中一条链足够与靶区域互补。在示例性实施例中，将链进行比对，使得在链的末端存在至少1、2或3个不对齐的碱基(即，在相对链中不存在互补性碱基)，使得当链退火时，在双链体的一端或两端会出现1、2或3个残基的突出端。在示例性实施例中，siRNA分子具有约10-50个或更多个核苷酸的长度，即每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。在具体示例性实施例中，siRNA分子具有每条链中约15-35，例如约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34或约35个核苷酸的长度，其中一条链与含有等位基因多态性的靶序列基本上互补，并且另一条链与第一链互补或基本上互补。在实施例中，siRNA分子与含有等位基因多态性的靶序列完全互补，不同之处在于一个另外的错配，也称为次级错配。
通常，可通过使用本领域已知的任何方法，例如通过使用以下方案来设计siRNA：
1.siRNA可以对含有等位基因多态性的靶序列具有特异性。在示例性实施例中，第一链与含有等位基因多态性的靶序列基本上互补，其中与含有等位基因多态性的靶序列具有一个错配，并且另一条链与所述第一链基本上互补。在实施例中，靶序列在靶基因的编码区之外。示例性靶序列选自靶基因的5′非翻译区(5′-UTR)或内含子区。在这些位点处的mRNA的切割应消除相应突变型蛋白质的翻译。来自htt基因的其他区域的靶序列也适用于靶向。基于靶序列设计有义链。此外，具有较低G/C含量(35％-55％)的siRNA可能比G/C含量高于55％的siRNA具有更高的活性。因此，在一个实施例中，本发明包括具有35％-55％G/C含量的核酸分子。
2.基于所选靶位点的序列和等位基因多态性的位置来设计siRNA的有义链。在示例性实施例中，本发明的RNA沉默剂不引起PKR应答(即，具有足够短的长度)。然而，例如，在无法产生PKR应答的细胞类型中或在PKR应答已通过替代性方式下调或抑制的情况下，更长的RNA沉默剂可能是有用的。
本发明的siRNA分子与靶序列具有足够的互补性，使得siRNA可以介导RNAi。通常，使用与靶基因的靶序列部分具有足够的同一性以实现RISC介导的靶基因切割的含有核苷酸序列的siRNA。因此，在示例性实施例中，必须将siRNA的有义链设计为与含有等位基因多态性的靶部分具有足够同一性的序列。本发明具有能够耐受某些序列变异以增强RNAi的功效和特异性的优点。在一方面，有义链与含有等位基因多态性的靶区域(例如在野生型和突变型等位基因之间相差至少一个碱基对的靶区域，例如包含功能获得性突变的靶区域)具有1个错配的核苷酸，并且另一条链与第一链相同或基本上相同。在一些实施例中，错配是与等位基因多态性对应的核苷酸上游的4个核苷酸、上游的3个核苷酸，与等位基因多态性对应的核苷酸上游的2个核苷酸、上游的1个核苷酸，与等位基因多态性对应的核苷酸下游的1个核苷酸，与等位基因多态性对应的核苷酸下游的2个核苷酸，与等位基因多态性对应的核苷酸下游的3个核苷酸，与等位基因多态性对应的核苷酸下游的4个核苷酸，或与等位基因多态性对应的核苷酸下游的5个核苷酸。在某些实施例中，错配不与对应于等位基因多态性的核苷酸相邻。此外，具有1或2个核苷酸的小插入或缺失的siRNA序列也可以有效介导RNAi。可替代地，具有核苷酸类似物取代或插入的siRNA序列可以有效用于抑制。
序列同一性可以通过本领域已知的序列比较和比对算法来确定。为了确定两个核酸序列(或两个氨基酸序列)的百分比同一性，出于最佳比较目的将序列进行比对(例如，可以在第一序列或第二序列中引入缺口以进行最佳比对)。然后将相应核苷酸(或氨基酸)位置处的核苷酸(或氨基酸残基)进行比较。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置处的相同残基占据时，分子在那个位置处是相同的。两个序列之间的百分比同一性是由所述序列共享的相同位置的数目的函数(即，百分比(％)同源性＝相同位置的数目/位置的总数目x 100)，任选地对引入的缺口数目和/或引入的缺口长度的得分进行罚分。
序列比较和两个序列之间同一性百分比的测定可以使用数学算法来完成。在一个实施例中，针对比对的具有足够同一性的序列的特定部分进行比对，而非针对具有低程度同一性的部分(即，局部比对)。用于比较序列的局部比对算法的示例性非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87：2264-68的算法，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90：5873-77中所修改。这种算法被并入Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-10的BLAST程序(2.0版)中。
在另一个实施例中，通过引入合适的缺口来优化比对，并且针对比对的序列的长度来确定百分比同一性(即，缺口比对)。为了获得用于比较目标的有缺口的比对，可以利用如在Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25(17)：3389-3402中所述的Gapped BLAST。在另一个实施例中，通过引入合适的缺口来优化比对，并且针对比对的序列的整个长度来确定百分比同一性(即，全局比对)。用于全局比较序列的数学算法的示例性非限制性实例是Myers和Miller，CABIOS(1989)的算法。这种算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，所述程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残差表(weight residue table)、缺口长度罚分12和缺口罚分4。
3.siRNA的反义链或指导链通常与有义链的长度相同，并包含互补性核苷酸。在一个实施例中，指导链和有义链是完全互补的，即，当比对或退火时，链是平端的。在另一个实施例中，siRNA的链能以具有1至4个(例如2个)核苷酸的3′突出端的方式配对。突出端可以包含与靶基因序列(或其互补序列)对应的核苷酸(或由所述核苷酸组成)。可替代地，突出端可以包含以下或由以下组成：脱氧核苷酸(例如dT)或核苷酸类似物或其他合适的非核苷酸物质。因此，在另一个实施例中，核酸分子可以具有2个核苷酸的3′突出端，例如TT。突出的核苷酸可以是RNA或DNA。如以上所指出，所希望的是选择靶区域，其中突变型：野生型错配是嘌呤：嘌呤错配。
4.使用本领域已知的任何方法，将潜在的靶标与适当的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，并从考虑中消除与其他编码序列具有显著同源性的任何靶序列。一种用于这种序列同源性搜索的方法被称为BLAST，其可在美国国家生物技术信息中心网站上获得。
5.选择满足评估标准的一个或多个序列。
关于siRNA设计和使用的更多一般信息可见于“The siRNA User Guide [siRNA用户手册]”，其可获得自网站：The Max-Plank-Institut fur Biophysikalishe Chemie。
可替代地，可以将siRNA在功能上定义为能够与靶序列杂交(例如400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、在50℃或70℃下杂交12-16小时；随后洗涤)的核苷酸序列(或寡核苷酸序列)。另外的示例性杂交条件包括在70℃下1xSSC中或在50℃下1xSSC中、50％甲酰胺中杂交，随后在70℃下0.3xSSC中洗涤；或在70℃下4xSSC中或在50℃下4xSSC中、50％甲酰胺中杂交，随后在67℃下1xSSC中洗涤。预期少于50个碱基对长度的杂交体的杂交温度应该比所述杂交体的解链温度(Tm)低5℃-10℃，其中Tm根据以下方程式确定。对于长度少于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基的#)+4(G+C碱基的#)。对于长度在18和49个碱基对之间的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log 10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中的碱基数目，并且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子(针对1xSSC＝0.165M的[Na+])的浓度。针对多核苷酸杂交的严格性条件的另外实例提供于以下中：Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆，实验室手册]，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港出版社]，Cold SpringHarbor，N.Y.[冷泉港，纽约]，第9章和第11章，以及Current Protocols in MolecularBiology[分子生物学现代实验室指南]，1995，F.M.Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons，Inc.[约翰·威利父子出版社公司]，第2.10节和第6.3节-第6.4节，出于所有目的将其通过引用以其全文并入本文。
阴性对照siRNA应与所选siRNA具有相同的核苷酸组成，但与适当的基因组之间无显著的序列互补性。可以通过随机加扰所选siRNA的核苷酸序列来设计此类阴性对照。可以进行同源性搜索以确保阴性对照与适当基因组中的任何其他基因缺乏同源性。另外，可以通过将一个或多个碱基错配引入序列来设计阴性对照siRNA。
6.为验证siRNA破坏靶mRNA(例如野生型或突变型亨廷顿蛋白mRNA)的有效性，可以在基于果蝇(Drosophila)的体外mRNA表达系统中将siRNA与靶cDNA(例如亨廷顿蛋白cDNA)一起孵育。在琼脂糖凝胶上对32P放射性标记的、新合成的靶mRNA(例如亨廷顿蛋白mRNA)进行放射自显影检测。存在切割的靶mRNA指示mRNA核酸酶活性。合适的对照包括省略siRNA和使用非靶cDNA。可替代地，选择与所选siRNA具有相同核苷酸组成、但与适当的靶基因没有显著的序列互补性的对照siRNA。可以通过随机加扰所选siRNA的核苷酸序列来设计此类阴性对照。可以进行同源性搜索以确保阴性对照与适当基因组中的任何其他基因缺乏同源性。另外，可以通过将一个或多个碱基错配引入序列来设计阴性对照siRNA。
可以将siRNA设计为靶向上文描述的任何靶序列。所述siRNA包含与靶序列足够互补以介导靶序列沉默的反义链。在某些实施例中，RNA沉默剂是siRNA。
选择siRNA-mRNA互补的位点，其导致最佳的mRNA特异性和最大的mRNA切割。
siRNA样分子
本发明的siRNA样分子具有与mRNA(例如htt mRNA)的靶序列“足够互补”的序列(即，存在具有序列的链)，以通过RNAi或翻译遏制来指导基因沉默。以与siRNA分子相同的方式设计siRNA样分子，但有义链与靶RNA之间的序列同一性程度近似于在miRNA与其靶之间观察到的序列同一性。通常，随着miRNA序列和相应靶基因序列之间的序列同一性的程度降低，通过翻译遏制而不是RNAi来介导转录后基因沉默的趋势增加。因此，在替代性实施例中，在希望通过靶基因的翻译遏制而使转录后基因沉默的情况下，miRNA序列与靶基因序列具有部分互补性。在某些实施例中，miRNA序列与分散在靶mRNA内(例如在靶mRNA的3’-UTR内)的一个或多个短序列(互补位点)具有部分互补性(Hutvagner和Zamore，Science[科学]，2002；Zeng等人，Mol.Cell[分子细胞学]，2002；Zeng等人，RNA，2003；Doench等人，Genes&Dev.[基因与发育]，2003)。因为翻译遏制的机制是合作性的，所以在某些实施例中可以靶向多个互补位点(例如2、3、4、5或6)。
siRNA样双链体介导RNAi或翻译遏制的能力可以通过在靶基因序列与在互补性位点处沉默剂的核苷酸序列之间非相同核苷酸的分布来预测。在一个实施例中，在希望通过翻译遏制使基因沉默的情况下，在互补位点的中心部分中存在至少一个非相同核苷酸，从而由miRNA指导链和靶mRNA形成的双链体含有中心“凸起(bulge)”(Doench J G等人，Genes&Dev.[基因与发育]，2003)。在另一个实施例中，引入2、3、4、5或6个连续或不连续的非相同核苷酸。可以选择非相同核苷酸，以使其形成摆动碱基对(例如G∶U)或错配的碱基对(G∶A、C∶A、C∶U、G∶G、A∶A、C∶C、U∶U)。在另外的示例性实施例中，“凸起”位于miRNA分子的5′末端的核苷酸位置12和13处。
修饰的RNA沉默剂
在本发明的某些方面，可以对如上所述的本发明的RNA沉默剂(或其任何部分)进行修饰，从而进一步提高所述沉默剂的活性。例如，以上所述的RNA沉默剂可以用下文所述的任何修饰进行修饰。所述修饰可以部分地用于进一步增强靶判别、增强药剂的稳定性(例如，防止降解)、促进细胞摄取、增强靶效率、改善结合(例如，与靶结合)功效、提高患者对药剂物的耐受性和/或降低毒性。
1)用于增强靶判别的修饰
在某些实施例中，可以将本发明的RNA沉默剂用去稳定化核苷酸取代以增强单核苷酸靶判别(参见提交于2007年1月25日的美国申请序列号11/698,689和提交于2006年1月25日的美国临时申请号60/762,225，两者都通过引用并入本文)。这种修饰可能足够消除RNA沉默剂对非靶mRNA(例如野生型mRNA)的特异性，而不会明显影响RNA沉默剂对靶mRNA(例如功能获得性突变型mRNA)的特异性。
在某些示例性实施例中，通过在其反义链中引入至少一个通用核苷酸来修饰本发明的RNA沉默剂。通用核苷酸包含能够与四个常规核苷酸碱基(例如，A、G、C、U)中的任一个碱基配对的碱基部分。通常使用通用核苷酸，因为它对RNA双链体、或由RNA沉默剂的指导链和靶mRNA形成的双链体的稳定性影响较小。示例性通用核苷酸包括具有肌苷碱基部分或肌苷类似物碱基部分(选自由以下组成的组：脱氧肌苷(例如2′-脱氧肌苷)、7-脱氮-2′-脱氧肌苷、2′-氮杂-2′-脱氧肌苷、PNA-肌苷、吗啉代-肌苷、LNA-肌苷、氨基磷酸酯-肌苷、2′-O-甲氧基乙基-肌苷和2′-OMe-肌苷)的那些。在具体示例性实施例中，通用核苷酸是肌苷残基或其天然存在的类似物。
在某些实施例中，通过在特异性确定的核苷酸的11个核苷酸内(例如来自识别疾病相关多态性(例如SNP位置核苷酸)的核苷酸的11个核苷酸内)引入至少一个去稳定化核苷酸来修饰本发明的RNA沉默剂。例如，可以在特异性确定的核苷酸的11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸内的位置处引入去稳定化核苷酸。在示例性实施例中，在特异性确定的核苷酸的3个核苷酸的位置处引入去稳定化核苷酸(即，使得在去稳定化核苷酸与特异性确定的核苷酸之间存在2个稳定化核苷酸)。在具有两条链或链部分(例如，siRNA和shRNA)的RNA沉默剂中，可以将去稳定化核苷酸引入不含特异性确定的核苷酸的链或链部分中。在具体的示例性实施例中，将去稳定核苷酸引入含有特异性确定的核苷酸的相同链或链部分中。
在某些实施例中，通过引入修饰的具有式1的亚基间键来修饰本发明的RNA沉默剂：
Figure BDA0003009853070000345
其中：
D选自由以下组成的组：O、OCH2、OCH、CH2和CH；
C选自由以下组成的组：O-、OH、OR1、NH-、NH2、S-和SH；
A选自由以下组成的组：O和CH2；
R1是保护基团；
Figure BDA0003009853070000344
是任选的双键；以及
亚基间桥连了两个任选地修饰的核苷。
在实施例中，当C是O-时，A或D不是O。
在实施例中，D是CH2。在另一个实施例中，修饰的具有式VIII的亚基间键是修饰的具有式2的亚基间键：
Figure BDA0003009853070000341
在实施例中，D是O。在另一个实施例中，修饰的具有式VIII的亚基间键是修饰的具有式3的亚基间键：
Figure BDA0003009853070000342
在实施例中，D是CH2。在另一个实施例中，修饰的具有式VIII的亚基间键是修饰的具有式4的亚基间键：
Figure BDA0003009853070000351
在另一个实施例中，修饰的亚基间键是修饰的具有式5的亚基间键：
Figure BDA0003009853070000352
在实施例中，D是OCH2。在另一个实施例中，修饰的亚基间键是修饰的具有式6的亚基间键：
Figure BDA0003009853070000353
在另一个实施例中，修饰的具有式VII的亚基间键是修饰的具有式7的亚基间键：
Figure BDA0003009853070000354
在某些实施例中，通过引入一个或多个图43的亚基间接头来修饰本发明的RNA沉默剂。在示例性实施例中，将图43的亚基间接头插入SNP位置核苷酸与直接相邻于反义链的SNP位置核苷酸和在其任一侧的位置处的核苷酸之间。
在某些实施例中，通过引入具有下式的亚基间接头中的一个或多个乙烯基膦酸酯(VP)基序来修饰本发明的RNA沉默剂：
Figure BDA0003009853070000361
在某些实施例中，将VP基序插入寡核苷酸(例如RNA)的任何位置处。例如，对于长度为20个核苷酸的寡核苷酸，可以将VP基序插入位置1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、11-12、12-13、13-14、14-15、15-16、16-17、17-18、18-19或19-20以及在这些位置的任何组合处。
在某些示例性实施例中，将VP基序插入反义链的位置1-2、5-6、6-7、10-11、18-19和/或19-20中的一个或多个处。
在其他示例性实施例中，将VP基序插入反义链的位置1-2、6-7、10-11和/或19-20中的一个或多个处。
在示例性实施例中，将VP基序插入反义链的SNP位置核苷酸的旁边(即，在SNP位置核苷酸与直接相邻于反义链的SNP位置核苷酸和在其任一侧的位置处的核苷酸之间)。在另一个示例性实施例中，将VP基序插入反义链的MM位置核苷酸的旁边(即，在MM位置核苷酸与直接相邻于反义链的SNP位置核苷酸和在其任一侧的位置处的核苷酸之间)。
2)用于增强功效和特异性的修饰
在某些实施例中，根据不对称设计规则(参见美国专利号8，309,704、7,750,144、8,304,530、8,329,892和8,309,705)，可以改变本发明的RNA沉默剂以促进在介导RNAi方面增强的功效和特异性。此类改变促进siRNA的反义链(例如，使用本发明的方法设计的siRNA或由shRNA产生的siRNA)进入RISC(有利于有义链)，使得反义链优先地指导靶mRNA的切割或翻译遏制，并因此增加或改善靶切割和沉默的效率。在示例性实施例中，通过将RNA沉默剂的反义链5′末端(AS 5′)和有义链3′末端(S 3′)之间的碱基对强度降低至低于所述RNA沉默剂的反义链3′末端(AS 3′)和有义链5′末端(S′5)之间的键强度或碱基对强度，增强所述RNA沉默剂的不对称。
在一个实施例中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称，使得在第一链或反义链的5′末端与有义链部分的3′端之间存在的G∶C碱基对相比于在第一链或反义链的3′末端与有义链部分的5′末端之间存在的G∶C碱基对更少。在另一个实施例中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称，使得在第一链或反义链的5′末端与有义链部分的3′末端之间存在至少一个错配的碱基对。在示例性实施例中，错配的碱基对选自由以下组成的组：G∶A、C∶A、C∶U、G∶G、A∶A、C∶C和U∶U。在另一个实施例中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称，使得在第一链或反义链的5′末端与有义链部分的3′末端之间存在至少一个摆动碱基对，例如G∶U。在另一个实施例中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称，使得存在至少一个包含稀有核苷酸(例如肌苷(I))的碱基对。在示例性实施例中，所述碱基对选自由以下组成的组：I∶A、I∶U和I∶C。在又另一个实施例中，可以增强本发明的RNA沉默剂的不对称，使得存在至少一个包含修饰的核苷酸的碱基对。在具体的实施例中，所述修饰的核苷酸选自由以下组成的组：2-氨基-G、2-氨基-A、2，6-二氨基-G和2，6-二氨基-A。
在某些实施例中，通过引入乙烯基膦酸酯(VP)基序，本发明的RNA沉默剂在寡核苷酸的一个或多个亚基间键处发生改变，所述基序具有下式：
Figure BDA0003009853070000381
3)具有增强的稳定性的RNA沉默剂
可以修饰本发明的RNA沉默剂以改善在血清或用于细胞培养的生长培养基中的稳定性。为增强稳定性，可以使3′残基稳定以防止降解，例如，可以对其进行选择使得它们由嘌呤核苷酸(特别是腺苷核苷酸或鸟苷核苷酸)组成。可替代地，嘧啶核苷酸被修饰的类似物取代，例如，尿苷被2′-脱氧胸苷取代是容许的并且不影响RNA干扰的效率。
在特定的方面，本发明的特征在于RNA沉默剂，其包括第一链和第二链，其中所述第二链和/或第一链通过用修饰的核苷酸取代内部核苷酸来修饰，使得与相应未修饰的RNA沉默剂相比，体内稳定性增强。如本文所定义，“内部”核苷酸是除核酸分子、多核苷酸或寡核苷酸的5′末端或3′末端以外存在于任何位置处的核苷酸。内部核苷酸可以在单链分子内或在双链体或双链分子的链内。在一个实施例中，通过至少一个内部核苷酸的取代来修饰有义链和/或反义链。在另一个实施例中，通过至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个内部核苷酸的取代来修饰有义链和/或反义链。在另一个实施例中，通过至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的内部核苷酸的取代来修饰有义链和/或反义链。在又另一个实施例中，通过所有内部核苷酸的取代来修饰有义链和/或反义链。
在本发明的具体的实施例中，RNA沉默剂可以包含至少一个修饰的核苷酸类似物。核苷酸类似物可以位于基本上不影响靶特异性沉默活性(例如RNAi介导活性或翻译遏制活性)的位置处，例如在siRNA分子的5′末端和/或3′末端的区域。特别地，可以通过掺入修饰的核苷酸类似物来稳定末端。
在某些实施例中，通过引入乙烯基膦酸酯(VP)基序，本发明的RNA沉默剂在寡核苷酸的一个或多个亚基间键处发生改变，所述基序具有下式：
Figure BDA0003009853070000391
各种寡核苷酸类型(例如缺口体、混合体、miRNA抑制因子、剪接转换寡核苷酸(“SSO”)、磷二酰胺吗啉代寡核苷酸(“PMO”)、肽核酸(“PNA”)等)可以在本文所述的寡核苷酸中使用，任选地利用在本文所述和在例如美国序列号15/089,423、美国序列号15/236,051、美国序列号15/419,593、美国序列号15/697,120和美国专利号9,809,817、以及美国序列号15/814,350和美国专利号9,862,350(出于所有目的将每一个通过引用以其全文并入本文)中所述的修饰(例如化学修饰)和/或缀合的不同组合。
示例性核苷酸类似物包括糖修饰的和/或骨架修饰的核糖核苷酸(即，包括对磷酸酯-糖骨架的修饰)。例如，天然RNA的磷酸二酯键可以被修饰以包括氮或硫杂原子中的至少一个。在示例性骨架修饰的核糖核苷酸中，与相邻核糖核苷酸连接的磷酸酯基团被修饰的基团(例如硫代磷酸酯基团)替代。在示例性糖修饰的核糖核苷酸中，2′OH-基团被选自H、OR、R、卤代、SH、SR、NH2、NHR、NR2或ON的基团替代，其中R是C1-C6烷基、烯基或炔基，并且卤代是F、Cl、Br或I。
在具体的实施例中，修饰是2′-氟、2′-氨基和/或2′-硫代修饰。具体示例性修饰包括2′-氟-胞苷、2′-氟-尿苷、2′-氟-腺苷、2′-氟-鸟苷、2′-氨基-胞苷、2′-氨基-尿苷、2′-氨基-腺苷、2′-氨基-鸟苷、2，6-二氨基嘌呤、4-硫代-尿苷、和/或5-氨基-烯丙基-尿苷。在具体的实施例中，2′-氟核糖核苷酸是每个尿苷和胞苷。另外的示例性修饰包括5-溴-尿苷、5-碘-尿苷、5-甲基-胞苷、核糖核酸-胸苷、2-氨基嘌呤、2′-氨基-丁酰基-芘-尿苷、5-氟-胞苷和5-氟-尿苷。2′-脱氧-核苷酸和2′-Ome核苷酸还可以用于本发明的修饰的RNA沉默剂部分内。另外的修饰的残基包括脱氧-脱碱基、肌苷、N3-甲基-尿苷、N6，N6-二甲基-腺苷、假尿苷、嘌呤核糖核苷和三氮唑核苷。在具体示例性实施例中，2′部分是甲基基团，使得连接部分是2′-O-甲基寡核苷酸。
在示例性实施例中，本发明的RNA沉默剂包含锁核酸(LNA)。LNA包含抵抗核酸酶活性的糖修饰的核苷酸(是高度稳定的)，并具有针对mRNA的单核苷酸判别(Elmen等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，(2005)，33(1)：439-447；Braasch等人(2003)Biochemistry[生物化学]42：7967-7975，Petersen等人(2003)Trends Biotechnol[生物技术趋势]21：74-81)。这些分子具有2′-O，4′-C-亚乙基-桥连的核酸，并具有可能的修饰，例如2′-脱氧-2′-氟尿苷。此外，LNA通过将糖部分限制为3′-内切构象增加了寡核苷酸的特异性，从而预先组织了用于碱基配对的核苷酸，并使寡核苷酸的解链温度提高了高达10℃/碱基。
在另一个示例性实施例中，本发明的RNA沉默剂包含肽核酸(PNA)。PNA包含修饰的核苷酸，其中所述核苷酸的糖-磷酸酯部分被能够形成聚酰胺骨架的中性2-氨基乙基甘氨酸部分替代，所述聚酰胺骨架对核酸酶消化具有高度抗性并赋予提高的分子结合特异性(Nielsen，等人，Science[科学]，(2001)，254：1497-1500)。
在某些示例性实施例中，使用核碱基修饰的核糖核苷酸(即，含有至少一个非天然存在的核碱基而不是天然存在的核碱基的核糖核苷酸)。可以对碱基进行修饰以阻断腺苷脱氨酶的活性。示例性修饰的核碱基包括但不限于在5-位置处修饰的尿苷和/或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位置处修饰的腺苷和/或鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；O-和N-烷基化的核苷酸(例如N6-甲基腺苷)是合适的。应当注意可以将以上修饰进行组合。
在其他实施例中，可以采用交联来改变RNA沉默剂的药代动力学，例如以增加体内的半衰期。因此，本发明包括具有两条核酸互补链的RNA沉默剂，其中这两条链是交联的。本发明还包括与其他部分(例如，非核酸部分，如肽)、有机化合物(例如，染料)等缀合或未缀合(例如，在其3′末端处)的RNA沉默剂。以这种方式修饰siRNA衍生物可改善所得siRNA衍生物与相应siRNA相比的细胞摄取或增强细胞靶向活性，可用于追踪细胞中的siRNA衍生物，或与相应siRNA相比提高siRNA衍生物的稳定性。
其他示例性修饰包括：(a)2′修饰，例如在有义链或反义链(但特别是在有义链)的U上提供2′OMe部分，或在3′突出端(例如在3′末端)处提供2′OMe部分(如上下文所示，3′末端意指在分子的3′原子处或在最3′部分如最3′P或2′位置处)；(b)对骨架的修饰，例如在磷酸酯骨架中用S替代0，例如在U或A或两者上、特别是在反义链上提供硫代磷酸酯修饰；例如用S替代P；(c)用C5氨基接头替代U；(d)用G替代A(在大多数情况下，序列改变位于有义链而不是反义链上)；和(d)在2′、6′、7′或8′位置处的修饰。示例性实施例是其中这些修饰中的一个或多个存在于有义链而不是反义链上的那些实施例，或其中反义链具有较少此类修饰的实施例。又其他示例性修饰包括在3′突出端(例如在3′末端)处使用甲基化的P；2′修饰(例如提供2′O Me部分)和对骨架的修饰(例如用S替代P，例如提供硫代磷酸酯修饰，或在3′突出端(例如在3′末端)处使用甲基化的P)的组合；用3′烷基修饰；在3′突出端(例如3′末端)处用脱碱基吡咯烷酮进行修饰；用萘普生、布洛芬或其他在3′末端处抑制降解的部分进行修饰。
4)用于增强细胞摄取的修饰
在其他实施例中，可以用化学部分修饰RNA沉默剂，例如以通过靶细胞(例如神经元细胞)增强细胞摄取。因此，本发明包括与其他部分(例如，非核酸部分，如肽)、有机化合物(例如，染料)等缀合或未缀合(例如，在其3′末端处)的RNA沉默剂。可以通过本领域已知的方法完成缀合，例如使用如下方法：Lambert等人，Drug Deliv.Rev.[药物递送评论]：47(1)，99-112(2001)(描述了将核酸加载到聚烷基氰基丙烯酸酯(PACA)纳米颗粒上)；Fattal等人，J.Control Release[控制释放杂志]53(1-3)：137-43(1998)(描述了将核酸与纳米颗粒结合)；Schwab等人，Ann.Oncol.5Suppl.[肿瘤学年鉴，5增刊]4：55-8(1994)(描述了将核酸与嵌入剂、疏水性基团、聚阳离子或PACA纳米颗粒连接)；和Godard等人，Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]232(2)：404-10(1995)(描述了将核酸与纳米颗粒连接)。
在具体的实施例中，对本发明的RNA沉默剂的修饰包含在寡核苷酸的一个或多个亚基间接头中的乙烯基膦酸酯(VP)基序，其中所述VP基序具有下式：
Figure BDA0003009853070000421
在具体的实施例中，本发明的RNA沉默剂与亲脂性部分缀合。在一个实施例中，所述亲脂性部分是包括阳离子基团的配体。在另一个实施例中，所述亲脂性部分附接至siRNA的一条链或两条链。在示例性实施例中，所述亲脂性部分附接至siRNA的有义链的一个末端。在另一个示例性实施例中，所述亲脂性部分附接至有义链的3′末端。在某些实施例中，所述亲脂性部分选自由以下组成的组：胆固醇、维生素E、维生素K、维生素A、叶酸或阳离子染料(例如Cy3)。在示例性实施例中，所述亲脂性部分是胆固醇。其他亲脂性部分包括胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-O(十六烷基)丙三醇、栊牛儿基氧基己基基团、十六烷基丙三醇、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪。
5)束缚配体
可以将其他实体束缚至本发明的RNA沉默剂。例如，将配体束缚至RNA沉默剂，如通过内吞作用依赖性或非依赖性机制，以提高稳定性、与靶核酸的杂交热力学、靶向特定组织或细胞类型、或细胞通透性。配体和相关的修饰还可以增加序列特异性，并随后降低位点外靶向。束缚配体可以包括能充当嵌入剂的一个或多个修饰的碱基或糖。在某些示例性实施例中，它们位于内部区域中，例如在RNA沉默剂/靶双链体的凸起中。嵌入剂可以是芳香族化合物，例如多环芳香族或杂环芳香族的化合物。多环嵌入剂可以具有堆叠能力，并且可以包括具有2个、3个或4个稠环的系统。本文所述的通用碱基可包括在配体上。在一个实施例中，配体可以包括切割基团，所述切割基团通过切割靶核酸而有助于靶基因抑制。所述切割基团可以是例如博来霉素(例如博来霉素-A5、博来霉素-A2或博来霉素-B2)、芘、菲咯啉(例如O-菲咯啉)、聚胺、三肽(例如lys-tyr-lys三肽)或金属离子螯合基团。金属离子螯合基团可以包括例如Lu(III)或EU(III)大环络合物、Zn(II)2，9-二甲基菲咯啉衍生物、Cu(II)三联吡啶或吖啶，所述基团可以通过游离金属离子(例如Lu(III))促进在凸起位点处的靶RNA的选择性切割。在一些实施例中，可以将肽配体束缚至RNA沉默剂以促进靶RNA的切割(例如在凸起区域)。例如，可以将1，8-二甲基-1，3，6，8，10，13-六氮杂环十四烷(cyclam)与肽缀合(例如通过氨基酸衍生物)以促进靶RNA切割。束缚配体可以是氨基糖苷配体，其可以导致RNA沉默剂具有改善的杂交特性或改善的序列特异性。示例性氨基糖苷包括糖基化的聚赖氨酸、半乳糖化的聚赖氨酸、新霉素B、妥布霉素、卡那霉素A和氨基糖苷的吖啶缀合物，例如新霉素-N-吖啶、新霉素-S-吖啶、新霉素-C-吖啶、妥布霉素-N-吖啶和卡那霉素A-N-吖啶。使用吖啶类似物可以提高序列特异性。例如，与DNA相比，新霉素B对RNA具有高亲和力，但具有低序列特异性。新霉素-5-吖啶(一种吖啶类似物)对HIV Rev-应答元件(RRE)具有增加的亲和力。在一些实施例中，将氨基糖苷配体的胍类似物(胍基糖苷)束缚至RNA沉默剂。在胍基糖苷中，氨基酸上的胺基团被交换成胍基团。胍类似物的附接可以增强RNA沉默剂的细胞通透性。束缚配体可以是聚精氨酸肽、类肽或肽模拟物，可以增强寡核苷酸剂的细胞摄取。
示例性配体经由插入的拴链与缀合有配体的载体直接地或间接地(通常共价地)偶联。在示例性实施例中，配体经由插入的拴链附接至载体。在示例性实施例中，配体改变了将其掺入的RNA沉默剂的分布、靶向或寿命。在示例性实施例中，与例如不存在配体的物种相比，这种配体提供针对所选靶标(例如分子、细胞或细胞类型、区室(例如细胞或器官区室，身体组织、器官或区域)的增强的亲和力。
示例性配体可以改善运输、杂交和特异性特性，并且还可以改善所得天然的或修饰的RNA沉默剂或聚合物分子的核酸酶抗性，所述聚合物分子包含本文所述的单体和/或天然的或修饰的核糖核苷酸的任何组合。配体通常可包括治疗性修饰剂，例如用于增强摄取；诊断性化合物或报告基团，例如用于监测分布；交联剂；赋予核酸酶抗性的部分；以及天然或不寻常的核碱基。一般的实例包括亲脂质、脂质、类固醇(例如熊果醇、龙舌蓝皂苷配基(hecigenin)、薯蓣皂苷元)、萜烯(例如三萜烯，如菝葜皂苷元、软木三萜酮、表木栓醇衍生的石胆酸)、维生素(例如叶酸、维生素A、生物素、吡哆醛)、碳水化合物、蛋白质、蛋白质结合剂、整合素靶向分子、聚阳离子、肽、聚胺和肽模拟物。配体可以包括天然存在的物质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如葡聚糖、短梗霉聚糖、几丁质、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；氨基酸或脂质。配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如，合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括以下聚氨基酸：聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯酸-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟物聚胺、树状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐或α螺旋肽。
配体也可以包括靶向基团，例如，与指定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂，例如，凝集素，糖蛋白，脂质或蛋白质，例如，抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白质A、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生素B12、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶和取代的吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳香族烃(例如吩嗪、二氢吩嗪、菲咯啉、芘)、lys-tyr-lys三肽、氨基糖苷、胍基氨基糖苷、人工内切核酸酶(例如EDTA)、亲脂性分子例如胆固醇(及其硫代类似物)、胆酸、胆烷酸、石胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、丙三醇(例如酯(例如单、双或三脂肪酸酯，例如C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20脂肪酸)及其醚(例如C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20烷基)；例如1，3-双-O(十六烷基)丙三醇、1，3-双-O(十八烷基)丙三醇)、栊牛儿基氧基己基基团、十六烷基丙三醇、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、硬脂酸(例如甘油二硬脂酸酯)、油酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪)和肽缀合物(例如触角足肽，Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收易化物(例如阿司匹林、萘普生、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白、或肽例如对共配体具有特异亲和力的分子，或抗体例如与指定细胞类型(如癌细胞、内皮细胞或骨细胞)结合的抗体。配体也可以包括激素和激素受体。它们也可以包括非肽种类，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38 MAP激酶的活化剂、或NF-κB的活化剂。
配体可以是可以例如通过破坏细胞的细胞骨架(例如，通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝)增加RNA沉默剂摄入细胞中的物质(例如药物)。所述药物可以例如是泰素(taxon)、长春新碱、长春碱、松胞菌素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、红海海绵素(latrunculin)A、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)A、茚满诺星(indanocine)或myoservin。所述配体可以通过例如激活炎症反应来增加RNA沉默剂对细胞的摄取。具有这种作用的示例性配体包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1β或γ干扰素。
在一方面，所述配体是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子通常结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。结合HSA的配体允许缀合物分布至靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如，所述靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加缀合物对降解的抗性，(b)增加靶向或转运至靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用来调节与血清蛋白(例如HSA)的结合。基于脂质的配体可以用来调节(例如，控制)缀合物与靶组织的结合。在具体的实施例中，基于脂质的配体结合HSA。然而，所希望的是这种亲和力并不是这样强，从而HSA-配体结合不能逆转。在另一个示例性实施例中，基于脂质的配体与HSA弱结合或不结合。
在另一个方面，配体是由靶细胞(例如，正在增殖的细胞)摄取的部分，例如维生素。这些特别可用于治疗以不希望的细胞(例如，恶性或非恶性型，例如，癌细胞)增殖为特征的障碍。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括B维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或其他维生素或由癌细胞摄取的营养素。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
在另一方面，所述配体是细胞渗透剂，通常是螺旋形细胞渗透剂。在某些示例性实施例中，所述渗透剂是两亲性的。一种示例性渗透剂是肽，如tat或触角足蛋白。如果所述渗透剂是肽，则它可以是修饰的，包括肽酰基模拟物、反演体(invertomer)、非肽键或假肽键和使用D-氨基酸。所述螺旋形药剂通常是α-螺旋形药剂，其通常具有亲脂性面和疏脂性面。
所述配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称作寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽和肽模拟物与寡核苷酸剂的附接可以影响RNA沉默剂的药物代谢动力学分布，如通过增强细胞识别与吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5-50氨基酸长，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。肽部分可以是L-肽或D-肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包含疏水性膜转运序列(MTS)。肽或肽模拟物可以由随机DNA序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等人，Nature[自然]，354：82-84，1991)。在示例性实施例中，经由掺入的单体单元束缚至RNA沉默剂的肽或肽模拟物是靶向肽(例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽，或RGD模拟物)的细胞。肽部分的长度范围可以是从约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，如以便增加稳定性或指导构象特性。可以利用下文描述的任何结构修饰。
6)疏水部分
在本文提供的双链RNA的某些实施例中，RNA分子与一个或多个疏水部分缀合(参见PCT公开号WO 2018/031933，将其通过引用并入本文中)。在实施例中，疏水部分具有对低密度脂蛋白和/或中等密度脂蛋白的亲和力。在相关的实施例中，疏水部分是具有少于三个双键的饱和或不饱和部分。
在另一个实施例中，疏水部分对高密度脂蛋白具有亲和力。在相关的实施例中，疏水部分是具有三个或更多个双键(例如具有三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个双键)的多不饱和部分。在具体的实施例中，疏水部分是具有三个双键的多不饱和部分。在具体的实施例中，疏水部分是具有四个双键是多不饱和部分。在具体的实施例中，疏水部分是具有五个双键的多不饱和部分。在具体的实施例中，疏水部分是具有六个双键的多不饱和部分。
在另一个实施例中，疏水部分选自由以下组成的组：脂肪酸、类固醇、开环类固醇、脂质、神经节苷脂和核苷类似物以及内源性大麻素。
在另一个实施例中，疏水部分是神经调节性脂质，例如内源性大麻素。内源性大麻素的非限制性实例包括：大麻素、花生四烯基乙醇胺、2-花生四烯基甘油醚(诺兰丁醚(noladin ether))、2-花生四烯基甘油醚(诺兰丁醚)、2-花生四烯基丙三醇和N-花生四烯基多巴胺。
在另一个实施例中，疏水部分是Ω-3脂肪酸。Ω-3脂肪酸的非限制性实例包括但不限于：十六碳三烯酸(HTA)、α-亚麻酸(ALA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA、花生五烯酸)、二十一碳五烯酸(HPA)、二十二碳五烯酸(DPA、鰶鱼酸)、二十二碳六烯酸(DHA，塞沃尼酸(cervonic acid))、二十四碳五烯酸和二十四碳六烯酸(鲱酸)。
在另一个实施例中，疏水部分是Ω-6脂肪酸。Ω-6脂肪酸的非限制性实例包括但不限于：亚油酸、γ-亚麻酸(GLA)、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸(DGLA)、花生四烯酸(AA)、二十二碳二烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸(奥斯本酸(osbond acid))、二十四碳四烯酸和二十四碳五烯酸。
在另一个实施例中，疏水部分是Ω-9脂肪酸。Ω-9脂肪酸的非限制性实例包括但不限于：油酸、二十烯酸、米德酸(Mead acid)、芥酸和神经酸。
在另一个实施例中，疏水部分是缀合的亚麻酸。缀合的亚麻酸的非限制性实例包括但不限于：α-十八碳三烯酸、β-十八碳三烯酸、茉莉酸、α-桐油酸、β-桐油酸、梓树酸和石榴酸。
在另一个实施例中，疏水部分是饱和脂肪酸。饱和脂肪酸的非限制性实例包括但不限于：辛酸、癸酸、二十二烷酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、辣木子油酸、木蜡酸和蜡酸。
在另一个实施例中，疏水部分选自由以下组成的组的酸：鲁梅克伦酸(rumelenicacid)、α-十八碳四烯酸、β-十八碳四烯酸、伯色五烯酸(bosseopentaenoic acid)、皮诺敛酸(pinolenic acid)和罗汉松酸。
在另一个实施例中，疏水部分选自由以下组成的组：二十二烷酸(DCA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。在具体的实施例中，疏水部分是二十二烷酸(DCA)。在另一个具体的实施例中，疏水部分是DHA。在另一个具体的实施例中，疏水部分是EPA。
在另一个实施例中，疏水部分是开环类固醇。在具体的实施例中，疏水部分是钙化醇。在另一个实施例中，疏水部分是类固醇，而不是胆固醇。
在具体的实施例中，疏水部分不是胆固醇。
在另一个实施例中，疏水部分是烷基链、维生素、肽或生物活性缀合物，包括但不限于：鞘糖脂、多不饱和脂肪酸、开环类固醇、类固醇激素或固醇脂质。
在实施例中，本文提供的双链RNA包含一个或多个化学修饰的核苷酸。在具体的实施例中，双链RNA包含交替的2’-甲氧基-核苷酸和2’-氟-核苷酸。在另一个具体的实施例中，双链RNA的一个或多个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。在本文披露的dsRNA的某些实施例中，错配核苷酸和与所述错配核苷酸相邻的核苷酸是2’-甲氧基-核糖核苷酸。
在另一个具体的实施例中，在本文提供的双链RNA的3’末端的位置1和2处的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。在又另一个具体的实施例中，双链RNA的3’末端的位置1和2处的核苷酸和双链RNA的5’末端的位置1和2处的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。
在双链RNA的一个实施例中，第一寡核苷酸包含至少16个连续的核苷酸、5’末端、3’末端，并且与靶标具有互补性，其中：
(1)所述第一寡核苷酸包含交替的2’-甲氧基-核苷酸和2’-氟-核苷酸；
(2)5’末端的位置2和14处的核苷酸不是2’-甲氧基-核苷酸；
(3)核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接；以及
(4)3’末端的位置1-6处或3’末端的位置1-7处的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。
7)高级的稳定化模式
在本文提供的双链RNA的一个实施例中：
(1)所述第一寡核苷酸包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸，其中每个核苷酸是2’-甲氧基-核糖核苷酸或2’-氟-核糖核苷酸；并且所述第一寡核苷酸的5’末端的位置2和14处的核苷酸不是2’-甲氧基-核糖核苷酸；
(2)所述第二寡核苷酸包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸，其中每个核苷酸是2’-甲氧基-核糖核苷酸或2’-氟-核糖核苷酸；并且所述第二寡核苷酸的5’末端的位置2和14处的核苷酸是2’-甲氧基-核糖核苷酸；
(3)所述第一寡核苷酸的核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，其中在3’末端的位置1-6或3’末端的位置1-7处的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接；以及
(4)所述第二寡核苷酸的核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，其中在3’末端的位置1和2处的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。
在双链RNA的一个实施例中，第一寡核苷酸比第二寡核苷酸多3-7个核糖核苷酸。
在一个实施例中，双链RNA包含11-16个碱基对双链体，其中每个碱基对双链体的核苷酸具有不同的化学修饰(例如一个核苷酸具有2’-氟修饰，并且另一个核苷酸具有2’-甲氧基)。
在双链RNA的一个实施例中，第一寡核苷酸比第二寡核苷酸多3-7个核糖核苷酸。在另一个实施例中。
在一个实施例中，第一寡核苷酸是反义链，并且第二寡核苷酸是有义链。参见PCT公开号WO 2016/161388，将其通过引用并入本文。
在一个实施例中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸包含一个或多个VP亚基间修饰，其具有下式：
Figure BDA0003009853070000501
8)支链寡核苷酸
如以上披露的两种或更多种RNA沉默剂(例如寡核苷酸构建体，如siRNA)可以通过一个或多个部分(独立地选自接头、间隔子和分支点)彼此连接，形成含有两种或更多种RNA沉默剂的支链寡核苷酸。图31展示了用于递送两种siRNA的示例性双siRNA二支链支架。在代表性实施例中，支链寡核苷酸的核酸各自包含反义链(或其部分)，其中所述反义链与杂合单核苷酸多态性具有足够的互补性，以介导RNA介导的沉默机制(例如RNAi)。在其他实施例中，提供了一种第二类型的支链寡核苷酸，其特征在于包含用于沉默反义转录物的有义链(或其部分)的核酸，其中所述有义链与反义转录物具有足够的互补性以介导RNA介导的沉默机制。在另外的实施例中，提供了一种第三类型的支链寡核苷酸，其包括两种类型的核酸，即，包含反义链(或其部分)的核酸和包含有义链(或其部分)的寡核苷酸。
在示例性实施例中，支链寡核苷酸可具有通过接头附接的二种至八种RNA沉默剂。所述接头可以是疏水性的。在具体的实施例中，本申请的支链寡核苷酸具有两个至三个寡核苷酸。在一个实施例中，寡核苷酸独立地具有充分的化学稳定性(例如，至少40％的组成型碱基经化学修饰)。在具体的实施例中，寡核苷酸具有完全的化学稳定性(即，所有的组成型碱基均经化学修饰)。在一些实施例中，支链寡核苷酸包含一个或多个单链硫代磷酸酯化的尾，其各自独立地具有两个至二十个核苷酸。在具体的实施例中，每个单链尾具有八个至十个核苷酸。
在某些实施例中，支链寡核苷酸的特性在于以下三种特性：(1)支链结构；(2)完全代谢稳定化；和(3)包含硫代磷酸酯接头的单链尾的存在。在具体的实施例中，支链寡核苷酸具有2或3个支链。据信，支链结构总尺寸的增加促进了摄取的增加。此外，不受特定的活性理论的束缚，据信多个相邻的分支(例如2或3个)允许每个分支协同作用，并因此显著增强内化、运输和释放的速率。
在不同结构多样性的实施例中提供了支链寡核苷酸。如图36所示，例如，在一些实施例中，在分支点处附接的核酸是单链的，并且由miRNA抑制因子、缺口体、混合体、SSO、PMO或PNA组成。这些单链可以在其3’或5’末端处附接。siRNA和单链寡核苷酸的组合也可以用于双重功能。在另一个实施例中，将与缺口体、混合体、miRNA抑制因子、SSO、PMO和PNA互补的短核酸用于携带这些活性单链核酸并增强分布和细胞内化。短双链体区域具有低解链温度(Tm约37℃)，用于在将支链结构内化到细胞中后快速解离。
如图37所示，双siRNA支链寡核苷酸可包含化学上多样化的缀合物。缀合的生物活性配体可用于增强细胞特异性并促进膜缔合、内化和血清蛋白结合。有待用于缀合的生物活性部分的实例包括DHAg2、DHA、GalNAc和胆固醇。这些部分可以通过连接接头或间隔子附接至双siRNA，或通过附接至另一个游离siRNA末端的其他接头或间隔子添加。
与具有相同化学组成的非支链化合物相比，支链结构的存在将脑中的组织保留水平提高了超过100倍，表明细胞保留和分布的新机制。支链寡核苷酸在整个脊髓和脑中具有出乎意料的均匀分布。此外，支链寡核苷酸出乎意料的展现出向多种组织的有效全身递送、以及非常高水平的组织蓄积。
支链寡核苷酸包含多种治疗性核酸，包括ASO、miRNA、miRNA抑制因子、剪接转换、PMO、PNA。在一些实施例中，支链寡核苷酸进一步包含缀合的疏水部分，并且在体外和体内展现空前的沉默和功效。
接头
在支链寡核苷酸的实施例中，每个接头独立地选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑及其组合；其中所述接头的任何碳原子或氧原子任选地被氮原子替代，具有羟基取代基，或具有氧代取代基。在一个实施例中，每个接头是乙二醇链。在另一个实施例中，每个接头是烷基链。在另一个实施例中，每个接头是肽。在另一个实施例中，每个接头是RNA。在另一个实施例中，每个接头是DNA。在另一个实施例中，每个接头是磷酸酯。在另一个实施例中，每个接头是膦酸酯。在另一个实施例中，每个接头是氨基磷酸酯。在另一个实施例中，每个接头是酯。在另一个实施例中，每个接头是酰胺。在另一个实施例中，每个接头是三唑。在另一个实施例中，每个接头是选自图37的式的结构。
9)具有式(I)的化合物
在另一方面，本文提供了具有式(I)的支链寡核苷酸化合物：
L-(N)n
(I)
其中L选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑及其组合，其中式(I)任选地进一步包含一个或多个分支点B和一个或多个间隔子S；其中B在每次出现时独立地是多价有机物质或其衍生物；S在每次出现时独立地选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑及其组合；N是包含有义链和反义链的RNA双链体，其中所述反义链包含与包含等位基因多态性的基因的区域基本上互补的互补性区域，其中所述反义链包含：在5’末端的位置2至7处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，所述单核苷酸多态性位置核苷酸与等位基因多态性互补；和位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的错配(MM)位置核苷酸，所述错配位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。在示例性实施例中，SNP位置核苷酸在5’末端的位置2、4或6处，并且错配(MM)位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。
有义链和反义链各自独立地包含一个或多个化学修饰；并且n是2、3、4、5、6、7或8。
在实施例中，具有式(I)的化合物具有选自表1的式(I-1)-(I-9)的结构。
表1
Figure BDA0003009853070000531
Figure BDA0003009853070000541
在一个实施例中，具有式(I)的化合物是式(I-1)。在另一个实施例中，具有式(I)的化合物是式(I-2)。在另一个实施例中，具有式(I)的化合物是式(I-3)。在另一个实施例中，具有式(I)的化合物是式(I-4)。在另一个实施例中，具有式(I)的化合物是式(I-5)。在另一个实施例中，具有式(I)的化合物是式(I-6)。在另一个实施例中，具有式(I)的化合物是式(I-7)。在另一个实施例中，具有式(I)的化合物是式(I-8)。在另一个实施例中，具有式(I)的化合物是式(I-9)。
在具有式(I)的化合物的实施例中，每个接头独立地选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑及其组合；其中所述接头的任何碳原子或氧原子任选地被氮原子替代，具有羟基取代基，或具有氧代取代基。在具有式(I)的化合物的一个实施例中，每个接头是乙二醇链。在另一个实施例中，每个接头是烷基链。在具有式(I)的化合物的另一个实施例中，每个接头是肽。在具有式(I)的化合物的另一个实施例中，每个接头是RNA。在具有式(I)的化合物的另一个实施例中，每个接头是DNA。在具有式(I)的化合物的另一个实施例中，每个接头是磷酸酯。在另一个实施例中，每个接头是膦酸酯。在具有式(I)的化合物的另一个实施例中，每个接头是氨基磷酸酯。在具有式(I)的化合物的另一个实施例中，每个接头是酯。在具有式(I)的化合物的另一个实施例中，每个接头是酰胺。在具有式(I)的化合物的另一个实施例中，每个接头是三唑。在具有式(I)的化合物的另一个实施例中，每个接头是选自图36的式的结构。
在具有式(I)的化合物的一个实施例中，B是多价有机物质。在具有式(I)的化合物的另一个实施例中，B是多价有机物质的衍生物。在具有式(I)的化合物的一个实施例中，B是三醇或四醇衍生物。在另一个实施例中，B是三羧酸或四羧酸衍生物。在另一个实施例中，B是胺衍生物。在另一个实施例中，B是三胺或四胺衍生物。在另一个实施例中，B是氨基酸衍生物。在具有式(I)的化合物的另一个实施例中，B选自图38的式。
多价有机物质是包含碳和三个或三个以上化合价的部分(即，如上定义的与部分(例如S、L或N)的附接点)。多价有机物质的非限制性实例包括三醇(例如丙三醇、间苯三酚等)，四醇(例如核糖、季戊四醇、1，2，3，5-四羟基苯等)，三羧酸(例如柠檬酸、1，3，5-环己烷三羧酸、苯均三酸等)，四羧酸(例如乙二胺四乙酸、苯均四酸等)，叔胺(例如三炔丙基胺、三乙醇胺等)，三胺(例如二亚乙基三胺等)，四胺，以及包含羟基、硫醇、氨基和/或羧基部分(例如氨基酸，如赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等)的组合的物质。
在具有式(I)的化合物的实施例中，每个核酸包含一个或多个化学修饰的核苷酸。在具有式(I)的化合物的实施例中，每个核酸由化学修饰的核苷酸组成。在具有式(I)的化合物的某些实施例中，＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、＞65％、＞60％、＞55％或＞50％的每个核酸包含化学修饰的核苷酸。
在实施例中，每条反义链独立地包含选自表2中基团的5’末端基团R：
表2
Figure BDA0003009853070000551
Figure BDA0003009853070000561
在一个实施例中，R是R1。在另一个实施例中，R是R2。在另一个实施例中，R是R3。在另一个实施例中，R是R4。在另一个实施例中，R是R5。在另一个实施例中，R是R6。在另一个实施例中，R是R7。在另一个实施例中，R是R8。
具有式(II)的结构
在实施例中，具有式(I)的化合物具有式(II)的结构：
Figure BDA0003009853070000571
其中X在每次出现时独立地选自腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷及其化学修饰的衍生物；Y在每次出现时独立地选自腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷及其化学修饰的衍生物；-代表磷酸二酯核苷间键；＝代表硫代磷酸酯核苷间键；并且---(单独地在每次出现时)代表碱基配对相互作用或错配。
在某些实施例中，具有式(II)的结构不含错配。在一个实施例中，具有式(II)的结构含有1个错配。在另一个实施例中，具有式(II)的化合物含有2个错配。在另一个实施例中，具有式(II)的化合物含有3个错配。在另一个实施例中，具有式(II)的化合物含有4个错配。在实施例中，每个核酸由化学修饰的核苷酸组成。
在某些实施例中，具有式(II)的结构中＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、＞65％、＞60％、＞55％或＞50％的X是化学修饰的核苷酸。在其他实施例中，具有式(II)的结构中＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、＞65％、＞60％、＞55％或＞50％的X是化学修饰的核苷酸。
具有式(III)的结构
在实施例中，具有式(I)的化合物具有式(III)的结构：
Figure BDA0003009853070000572
其中X在每次出现时独立地是包含2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸；X在每次出现时独立地是包含2’-O-甲基修饰的核苷酸；Y在每次出现时独立地是包含2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸；并且Y在每次出现时独立地是包含2’-O-甲基修饰的核苷酸。
在实施例中，X选自由以下组成的组：2’-脱氧-2’-氟修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在实施例中，X选自由以下组成的组：2’-O-甲基修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在实施例中，Y选自由以下组成的组：2’-脱氧-2’-氟修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在实施例中，Y选自由以下组成的组：2’-O-甲基修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。
在某些实施例中，具有式(III)的结构不含错配。在一个实施例中，具有式(III)的结构含有1个错配。在另一个实施例中，具有式(III)的化合物含有2个错配。在另一个实施例中，具有式(III)的化合物含有3个错配。在另一个实施例中，具有式(III)的化合物含有4个错配。
具有式(IV)的结构
在实施例中，具有式(I)的化合物具有式(IV)的结构：
Figure BDA0003009853070000581
其中X在每次出现时独立地选自腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷及其化学修饰的衍生物；Y在每次出现时独立地选自腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷及其化学修饰的衍生物；-代表磷酸二酯核苷间键；＝代表硫代磷酸酯核苷间键；并且---(单独地在每次出现时)代表碱基配对相互作用或错配。
在某些实施例中，具有式(IV)的结构不含错配。在一个实施例中，具有式(IV)的结构含有1个错配。在另一个实施例中，具有式(IV)的化合物含有2个错配。在另一个实施例中，具有式(IV)的化合物含有3个错配。在另一个实施例中，具有式(IV)的化合物含有4个错配。在实施例中，每个核酸由化学修饰的核苷酸组成。
在某些实施例中，具有式(II)的结构中＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、＞65％、＞60％、＞55％或＞50％的X是化学修饰的核苷酸。在其他实施例中，具有式(II)的结构中＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、＞65％、＞60％、＞55％或＞50％的X是化学修饰的核苷酸。
具有式(V)的结构
在实施例中，具有式(I)的化合物具有式(V)的结构：
Figure BDA0003009853070000591
其中X在每次出现时独立地是包含2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸；X在每次出现时独立地是包含2’-O-甲基修饰的核苷酸；Y在每次出现时独立地是包含2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸；并且Y在每次出现时独立地是包含2’-O-甲基修饰的核苷酸。
在某些实施例中，X选自由以下组成的组：2’-脱氧-2’-氟修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在实施例中，X选自由以下组成的组：2’-O-甲基修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在实施例中，Y选自由以下组成的组：2’-脱氧-2’-氟修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在实施例中，Y选自由以下组成的组：2’-O-甲基修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。
在某些实施例中，具有式(V)的结构不含错配。在一个实施例中，具有式(V)的结构含有1个错配。在另一个实施例中，具有式(V)的化合物含有2个错配。在另一个实施例中，具有式(V)的化合物含有3个错配。在另一个实施例中，具有式(V)的化合物含有4个错配。
可变接头
在具有式(I)的化合物的实施例中，L具有L1的结构：
Figure BDA0003009853070000601
在L1的实施例中，R是R3，并且n是2。
在具有式(II)的结构的实施例中，L具有L1的结构。在具有式(III)的结构的实施例中，L具有L1的结构。在具有式(IV)的结构的实施例中，L具有L1的结构。在具有式(V)的结构的实施例中，L具有L1的结构。在具有式(VI)的结构的实施例中，L具有L1的结构。在具有式(VI)的结构的实施例中，L具有L1的结构。
在具有式(I)的化合物的实施例中，L具有L2的结构：
Figure BDA0003009853070000602
在L2的实施例中，R是R3，并且n是2。在具有式(II)的结构的实施例中，L具有L2的结构。在具有式(III)的结构的实施例中，L具有L2的结构。在具有式(IV)的结构的实施例中，L具有L2的结构。在具有式(V)的结构的实施例中，L具有L2的结构。在具有式(VI)的结构的实施例中，L具有L2的结构。在具有式(VI)的结构的实施例中，L具有L2的结构。
10)递送系统
在另外的方面，本文提供了针对治疗性核酸的递送系统，所述核酸具有式(VI)的结构：
L-(cNA)n
(VI)
其中L选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑及其组合，其中式(VI)任选地进一步包含一个或多个分支点B和一个或多个间隔子S；其中B在每次出现时独立地是多价有机物质或其衍生物；S在每次出现时独立地选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑及其组合；每个cNA独立地是包含一个或多个化学修饰的载体核酸；并且n是2、3、4、5、6、7或8。
在递送系统的一个实施例中，L是乙二醇链。在递送系统的另一个实施例中，L是烷基链。在递送系统的另一个实施例中，L是肽。在递送系统的另一个实施例中，L是RNA。在递送系统的另一个实施例中，L是DNA。在递送系统的另一个实施例中，L是磷酸酯。在递送系统的另一个实施例中，L是膦酸酯。在递送系统的另一个实施例中，L是氨基磷酸酯。在递送系统的另一个实施例中，L是酯。在递送系统的另一个实施例中，L是酰胺。在递送系统的另一个实施例中，L是三唑。
在递送系统的一个实施例中，S是乙二醇链。在另一个实施例中，S是烷基链。在递送系统的另一个实施例中，S是肽。在另一个实施例中，S是RNA。在递送系统的另一个实施例中，S是DNA。在递送系统的另一个实施例中，S是磷酸酯。在递送系统的另一个实施例中，S是膦酸酯。在递送系统的另一个实施例中，S是氨基磷酸酯。在递送系统的另一个实施例中，S是酯。在另一个实施例中，S是酰胺。在另一个实施例中，S是三唑。
在递送系统的一个实施例中，n是2。在递送系统的另一个实施例中，n是3。在递送系统的另一个实施例中，n是4。在递送系统的另一个实施例中，n是5。在递送系统的另一个实施例中，n是6。在递送系统的另一个实施例中，n是7。在递送系统的另一个实施例中，n是8。
在某些实施例中，每个cNA包含＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、＞65％、＞60％、＞55％或＞50％的化学修饰的核苷酸。
在实施例中，具有式(VI)的化合物具有选自表3的式(VI-1)-(VI-9)的结构：
表3
Figure BDA0003009853070000621
在实施例中，具有式(VI)的化合物是具有式(VI-1)的结构。在实施例中，具有式(VI)的化合物是具有式(VI-2)的结构。在实施例中，具有式(VI)的化合物是具有式(VI-3)的结构。在实施例中，具有式(VI)的化合物是具有式(VI-4)的结构。在实施例中，具有式(VI)的化合物是具有式(VI-5)的结构。在实施例中，具有式(VI)的化合物是具有式(VI-6)的结构。在实施例中，具有式(VI)的化合物是具有式(VI-7)的结构。在实施例中，具有式(VI)的化合物是具有式(VI-8)的结构。在实施例中，具有式(VI)的化合物是具有式(VI-9)的结构。
在实施例中，具有式(VI)(包括例如式(VI-1)-(VI-9))的化合物，每个cNA独立地包含至少15个连续的核苷酸。在实施例中，每个cNA独立地由化学修饰的核苷酸组成。
在实施例中，所述递送系统进一步包含n个治疗性核酸(NA)，其中每个NA包含与包含等位基因多态性的基因的区域基本上互补的互补性区域，其中所述反义链包含：在5’末端的位置2至7处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，所述单核苷酸多态性位置核苷酸与等位基因多态性互补；和位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的错配(MM)位置核苷酸，所述错配位置核苷酸是与基因中的核苷酸的错配。在示例性实施例中，SNP位置核苷酸在5’末端的位置2、4或6处，并且错配(MM)位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。此外，每个NA与至少一个cNA杂交。在一个实施例中，递送系统由2个NA组成。在另一个实施例中，递送系统由3个NA组成。在另一个实施例中，递送系统由4个NA组成。在另一个实施例中，递送系统由5个NA组成。在另一个实施例中，递送系统由6个NA组成。在另一个实施例中，递送系统由7个NA组成。在另一个实施例中，递送系统由8个NA组成。
在实施例中，每个NA独立地包含至少16个连续的核苷酸。在实施例中，每个NA独立地包含16-20个连续的核苷酸。在实施例中，每个NA独立地包含16个连续的核苷酸。在另一个实施例中，每个NA独立地包含17个连续的核苷酸。在另一个实施例中，每个NA独立地包含18个连续的核苷酸。在另一个实施例中，每个NA独立地包含19个连续的核苷酸。在另一个实施例中，每个NA独立地包含20个连续的核苷酸。
在实施例中，每个NA包含至少2个核苷酸的未配对突出端。在另一个实施例中，每个NA包含至少3个核苷酸的未配对突出端。在另一个实施例中，每个NA包含至少4个核苷酸的未配对突出端。在另一个实施例中，每个NA包含至少5个核苷酸的未配对突出端。在另一个实施例中，每个NA包含至少6个核苷酸的未配对突出端。在实施例中，突出端的核苷酸经由硫代磷酸酯键连接。
在实施例中，每个NA独立地选自由以下组成的组：DNA、siRNA、miRNA拮抗剂(antagomiRs)、miRNA、缺口体、混合体或指导RNA。在一个实施例中，每个NA独立地是DNA。在另一个实施例中，每个NA独立地是siRNA。在另一个实施例中，每个NA独立地是miRNA拮抗剂(antagomiR)。在另一个实施例中，每个NA独立地是miRNA。在另一个实施例中，每个NA独立地是缺口体。在另一个实施例中，每个NA独立地是混合体。在另一个实施例中，每个NA独立地是指导RNA。在实施例中，每个NA是相同的。在实施例中，每个NA是不同的。
在实施例中，进一步包含n个治疗性核酸(NA)的递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)以及本文所述的其实施例的结构。在一个实施例中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)以及本文所述的其实施例的结构，进一步包含2个治疗性核酸(NA)。在另一个实施例中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)以及本文所述的其实施例的结构，进一步包含3个治疗性核酸(NA)。在一个实施例中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)以及本文所述的其实施例的结构，进一步包含4个治疗性核酸(NA)。在一个实施例中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)以及本文所述的其实施例的结构，进一步包含5个治疗性核酸(NA)。在一个实施例中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)以及本文所述的其实施例的结构，进一步包含6个治疗性核酸(NA)。在一个实施例中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)以及本文所述的其实施例的结构，进一步包含7个治疗性核酸(NA)。在一个实施例中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)以及本文所述的其实施例的结构，进一步包含8个治疗性核酸(NA)。
在一个实施例中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)的结构，进一步包含具有结构L1或L2的接头，其中R是R3，并且n是2。在另一个实施例中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)的结构，进一步包含具有结构L1的接头，其中R是R3，并且n是2。在另一个实施例中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)的结构，进一步包含具有结构L2的接头，其中R是R3，并且n是2。
药物组合物和施用方法
在一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的一种或多种化合物、寡核苷酸或如本文所述的核酸、以及药学上可接受的载体。在一个实施例中，所述药物组合物包含如本文所述的一个或多个双链的、化学修饰的核酸，以及药学上可接受的载体。在具体的实施例中，所述药物组合物包含如本文所述的一个双链的、化学修饰的核酸，以及药学上可接受的载体。在另一个具体的实施例中，所述药物组合物包含如本文所述的两个双链的、化学修饰的核酸，以及药学上可接受的载体。
在具体的实施例中，所述药物组合物包含双链RNA分子，所述RNA分子包含约15-35个与编码杂合SNP突变型蛋白质的基因的区域互补的核苷酸，所述区域包含等位基因多态性，并且第二链包含约15-35个与第一链互补的核苷酸，其中所述dsRNA分子包含不在所述等位基因多态性位置中的错配；并且所述错配和与多态性对应的核苷酸不在所述dsRNA分子的中心。
在实施例中，错配是与等位基因多态性对应的核苷酸上游的4个核苷酸、上游的3个核苷酸，与等位基因多态性对应的核苷酸上游的2个核苷酸、上游的1个核苷酸，与等位基因多态性对应的核苷酸下游的1个核苷酸，与等位基因多态性对应的核苷酸下游的2个核苷酸，与等位基因多态性对应的核苷酸下游的3个核苷酸，与等位基因多态性对应的核苷酸下游的4个核苷酸，或与等位基因多态性对应的核苷酸下游的5个核苷酸。在某些实施例中，错配不与对应于等位基因多态性的核苷酸相邻。
在药物组合物的另一个实施例中，双链RNA包含与等位基因多态性对应的核苷酸，所述核苷酸在5’末端的位置2、3、4、5或6处。在实施例中，与等位基因多态性对应的核苷酸在5’末端的位置2处。在实施例中，与等位基因多态性对应的核苷酸在5’末端的位置3处。在实施例中，与等位基因多态性对应的核苷酸在5’末端的位置4处。在实施例中，与等位基因多态性对应的核苷酸在5’末端的位置5处。在实施例中，与等位基因多态性对应的核苷酸在5’末端的位置6处。
在药物组合物的实施例中，双链RNA选择性地沉默具有等位基因多态性(例如杂合SNP)的突变型等位基因。在药物组合物的实施例中，双链RNA使具有等位基因多态性的突变型等位基因沉默，并且不影响相同基因的野生型等位基因。在药物组合物的另一个实施例中，本文提供的双链RNA使具有等位基因多态性的突变型等位基因沉默，并且以与所述突变型等位基因相比更小的程度使相同基因的野生型等位基因沉默。
将本发明药物组合物配制成与预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外(例如，静脉内(IV)、皮内、皮下(SC或SQ)、腹膜内的、肌内)、口服(例如，吸入)、经皮(局部)、和经粘膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或混悬液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苄醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的药剂，如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，新泽西州派西派尼市(Parsippany，N.J.))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须是无菌的并且应当具有达到容易注射的程度的流动性。它在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用如卵磷脂的包衣、通过在分散情况下保持所需粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，希望在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起掺入适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备。通常，分散液通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物含有基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些干燥产生活性成分加来自其先前经无菌过滤溶液的任何另外的所需成分的粉末。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列的用于在人类中使用的剂量。此类化合物的剂量通常应在包括ED50在内的有很小毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于所使用的剂型和使用的施用途径。对于用于本发明方法的任何化合物，均可根据细胞培养试验初步估计治疗有效剂量。在动物模型中可以将剂量配制为达到循环血浆浓度范围，该范围包括如在细胞培养中确定的ECS0(即，实现应答的半最大时的测试化合物浓度)。这种信息可以用于更准确地确定人类中有用的剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。
治疗方法
本发明提供了一种治疗受试者的预防性和治疗性方法，所述受试者处于(或易感)全部或部分由等位基因多态性(例如杂合SNP)引起的疾病或障碍的风险。在一个实施例中，所述疾病或障碍是三核苷酸重复疾病或障碍。在另一个实施例中，所述疾病或障碍是聚谷氨酰胺障碍。在实施例中，所述方法包括施用治疗有效量的本文提供的双链RNA分子。在实施例中，所述疾病或障碍是与亨廷顿蛋白的表达相关的障碍，并且其中亨廷顿蛋白的改变(尤其是CAG重复拷贝数的扩增)导致亨廷顿蛋白基因(结构或功能)或亨廷顿蛋白(结构或功能或表达)的缺陷，使得临床表现包括在亨廷顿病患者中观察到的那些临床表现。
在方法的实施例中，本文披露的双链RNA与等位基因多态性同源，不同之处在于相对于与等位基因多态性对应的核苷酸的特定位置处的一个错配的寡核苷酸。在某些实施例中，错配在与等位基因多态性对应的核苷酸的约6个核苷酸内、与等位基因多态性对应的核苷酸的约5个核苷酸内、与等位基因多态性对应的核苷酸的约4个核苷酸内、与等位基因多态性对应的核苷酸的约3个核苷酸内、与等位基因多态性对应的核苷酸的约2个核苷酸内、或与等位基因多态性对应的核苷酸的约1个核苷酸内。在具体示例性实施例中，错配不与对应于等位基因多态性的核苷酸相邻。
在方法的另一个实施例中，双链RNA包含与等位基因多态性对应的核苷酸，所述核苷酸在5’末端的位置2、3、4、5或6处。在实施例中，与等位基因多态性对应的核苷酸在5’末端的位置2处。在实施例中，与等位基因多态性对应的核苷酸在5’末端的位置3处。在实施例中，与等位基因多态性对应的核苷酸在5’末端的位置4处。在实施例中，与等位基因多态性对应的核苷酸在5’末端的位置5处。在实施例中，与等位基因多态性对应的核苷酸在5’末端的位置6处。
在方法的实施例中，dsRNA包含在5’末端的位置6处与多态性对应的核苷酸、和在5’末端的位置11处的错配。在方法的实施例中，dsRNA包含在5’末端的位置4处与多态性对应的核苷酸、和在5’末端的位置7处的错配。
在方法的另一个实施例中，双链RNA选择性地沉默具有等位基因多态性的突变型等位基因。在实施例中，双链RNA使具有等位基因多态性的突变型等位基因沉默，并且不影响相同基因的野生型等位基因。在另一个实施例中，双链RNA使具有等位基因多态性的突变型等位基因沉默，并且以与所述突变型等位基因相比更小的程度使相同基因的野生型等位基因沉默。
在方法的实施例中，dsRNA包含一个或多个VP亚基间键修饰，其中所述亚基间键具有下式：
Figure BDA0003009853070000691
在另外的实施例中，dsRNA包含一个或多个在图43中描绘的亚基间键修饰。
如本文所用，“治疗(Treatment或treating)”被定义为向患者应用或施用治疗剂(例如RNA剂、或编码其的运载体或转基因)；或向分离自患者的组织或细胞系应用或施用治疗剂所述患者具有疾病或障碍、疾病或障碍的症状、或对疾病或障碍易感，治疗目的是治疗、治愈、缓解、解除、改变、补救、减轻、改善、或影响所述疾病或障碍、所述疾病或障碍的症状或对疾病的易感性。
在一方面，本发明提供了通过向受试者施用治疗剂(例如RNAi剂、或编码其的运载体或转基因)来预防所述受试者中如上所述的疾病或障碍的方法。可以通过例如本文所述的诊断性或预后性测定中的任一种或组合来鉴定处于疾病风险中的受试者。可以在疾病或障碍的症状特征表现之前施用预防性药剂，使得所述疾病或障碍被预防或可替代地延缓其发展。
本发明的另一方面涉及治疗性地治疗受试者的方法，即改变疾病或障碍的症状的发作。在示例性实施例中，本发明的调节性方法涉及使表达功能获得性突变体的细胞与对基因内一个或多个靶序列具有特异性的治疗剂(例如RNAi剂、或编码其的运载体或转基因)接触，从而实现对所述基因的序列特异性干扰序列。这些方法可以在体外(例如，通过与药剂一起培养细胞)或可替代地在体内(例如，通过向受试者施用药剂)进行。
修饰用于增强摄入神经细胞的RNA沉默剂可以按单位剂量低于约1.4mg/kg体重，或低于10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001mg/kg体重，和低于200nmole的RNA剂(例如约4.4x1016个拷贝)/kg体重，或低于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075或0.00015nmole的RNA沉默剂/kg体重施用。单位剂量例如可以通过注射(例如静脉内或肌肉内、鞘内或直接进入脑内)、吸入给药或局部应用来施用。在示例性实施例中，剂量小于2、1或0.1mg/kg体重。
将RNA沉默剂直接递送至器官(例如，直接递送至脑)的剂量可以为大约0.00001mg至约3mg/器官、或约0.0001-0.001mg/器官、约0.03-3.0mg/器官、约0.1-3.0mg/器官或约0.3-3.0mg/器官。剂量可以是有效治疗或预防神经性疾病或障碍(例如亨廷顿病)的量。在一个实施例中，单位剂量的施用频率少于一天一次，例如少于每2天、4天、8天或30天一次。在另一个实施例中，不以一定频率(例如，不以固定频率)施用单位剂量。例如，单位剂量可以在单个时间施用。在一个实施例中，将有效剂量与其他传统治疗方式一起施用。
在一个实施例中，向受试者施用RNA沉默剂的初始剂量和一个或多个维持剂量。一个或多个维持剂量通常低于初始剂量，例如，少于初始剂量的一半。维持方案可以包括用从0.01μg至1.4mg/kg的体重/天的范围，例如10、1、0.1、0.01、0.001或0.00001mg/kg体重/天的一个或多个剂量治疗受试者。维持剂量通常不超过每5天、10天或30天一次进行施用。此外，治疗方案可以持续一段时间，所述时间根据特定疾病的性质、其严重程度和患者的整体状况而变化。在具体的实施例中，剂量可以不超过每天一次递送，例如不超过每24小时、36小时、48小时或更多小时一次，例如，不超过每5天或8天一次。在治疗之后，可以监测患者的病情变化和疾病状态的症状减轻。如果患者对当前的剂量水平没有显著应答，则可以增加化合物的剂量；或者如果观察到疾病状态的症状有所缓解，如果疾病状态已经消除，或如果观察到不希望的副作用，则可以降低剂量。
亨廷顿病
在本发明的某些方面，将RNA沉默剂设计成靶向突变型人类亨廷顿蛋白(htt)中的多态性(例如杂合单核苷酸多态性)，用于治疗亨廷顿病。因此，在另一方面，本文提供了治疗或管理亨廷顿病的方法，所述方法包括向需要这种治疗或管理的患者施用治疗有效量的如本文所述的化合物、寡核苷酸或核酸，或包含所述化合物、寡核苷酸或核酸的药物组合物。
亨廷顿病作为常染色体显性疾病遗传，会导致认知障碍和运动疾病。患者可以伴随严重虚弱生活十多年，直到因饥饿或感染而过早死亡。在大多数情况下，所述疾病始于四十岁或五十岁，但是患者中一部分在青少年时期就表现出了疾病。亨廷顿病的基因突变是亨廷顿蛋白基因中延长的CAG重复序列。在正常的个体中，CAG重复序列的数量在8至35个拷贝之间变化(Kremer等人，1994)。基因突变(例如CAG重复序列的长度从正常亨廷顿蛋白基因中少于36个增加至高于所述疾病中的36个)与突变型亨廷顿蛋白的合成相关，所述突变型亨廷顿蛋白具有超过36个连续的聚谷氨酰胺残基(Aronin等人，1995)。通常，具有36个或更多CAG重复序列的个体将患上亨廷顿病。亨廷顿病是多达20种其他疾病的原型，其潜在突变是延长的CAG，对于亨廷顿病仍没有有效的治疗方法。各种干预措施(例如，中断凋亡途径、添加试剂以提高线粒体效率、以及阻断NMDA受体)在亨廷顿病的细胞培养和小鼠模型中已显示出前景。但是，这些方法充其量只能使细胞或动物存活短暂延长。
与亨廷顿病相关的疾病基因被称为亨廷顿蛋白(Huntingtin)或(htt)。亨廷顿蛋白基因座很大，跨越180kb，并且由67个外显子组成。亨廷顿蛋白基因广泛表达，并且对于正常发育是所必需的。它表示为2种替代性聚腺苷酸化的形式，在各种胎儿和成人组织中显示出不同的相对丰度。较大的转录物约为13.7kb，并且主要在成人和胎儿脑中表达；而较小的转录物约为10.3kb，其表达更广泛。两种转录物的3′非翻译区有所不同(Lin等人，1993)。预测这两种信息均编码含3144个氨基酸的348道尔顿蛋白。据信，导致亨廷顿病的遗传缺陷会给mRNA带来新的特性或改变蛋白质的功能。
亨廷顿病符合遗传学的中心法则：突变基因用作产生突变型mRNA的模板；然后，突变型mRNA指导突变型蛋白质的合成(Aronin等人，1995；DiFiglia等人，1997)。突变型亨廷顿蛋白(蛋白质)可能在纹状体和皮质的选择性神经元中积累，破坏尚未确定的细胞活性，并导致神经元功能障碍和死亡(Aronin等人，1999；Laforet等人，2001)。因为突变基因的单个拷贝就足以引起亨廷顿病，所以最简约的治疗将使所述突变基因无效。理论上的方法可能包括使突变型亨廷顿蛋白的基因转录停止，并且破坏突变型mRNA和阻断翻译。每个都具有相同的结果-突变型亨廷顿蛋白的丧失。
亨廷顿SNP
根据某些示例性实施例，亨廷顿蛋白基因序列中适合于靶向的示例性SNP披露于下表4中。每个SNP位点的基因组序列都可以在例如由NCBI维护的可公开获得的“SNPEntrez”数据库中找到。表4进一步展示了HD患者和对照DNA的每个SNP位点的杂合频率。频繁杂合SNP的靶向组合允许使用相对少量的等位基因特异性RNA沉默剂治疗在HD群体中大部分的个体。
表4.htt SNP
Figure BDA0003009853070000721
Figure BDA0003009853070000731
在一个实施例中，本发明的RNA沉默剂能够靶向表4中列出的SNP位点中的一个或多个。在一个实施例中，本发明的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs363125SNP位点。在另一个实施例中，本发明的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362273 SNP位点。在另一个实施例中，本发明的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362307 SNP位点。在另一个实施例中，本发明的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362336 SNP位点。在另一个实施例中，本发明的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362331 SNP位点。在另一个实施例中，本发明的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362272 SNP位点。在另一个实施例中，本发明的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362306 SNP位点。在另一个实施例中，本发明的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362268 SNP位点。在另一个实施例中，本发明的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362267 SNP位点。在另一个实施例中，本发明的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs363099 SNP位点。在一些实施例中，由RNA沉默剂靶向的SNP位点与亨廷顿病有关。在具体示例性实施例中，RNA沉默剂靶向的SNP位点与亨廷顿病显著有关。
在另外的示例性实施例中，RNA沉默剂包括表5-7中的一个或多个序列：
Figure BDA0003009853070000741
表5
Figure BDA0003009853070000742
Figure BDA0003009853070000751
表6
Figure BDA0003009853070000752
表7
递送核酸的方法
可以将本发明的RNA沉默剂直接引入细胞(例如神经细胞)(即，细胞内地)；或细胞外地引入腔、胞间隙至生物体循环，口服引入，或可以通过将细胞或生物体浸入含有核酸的溶液中而引入。血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊髓液是可以引入核酸的部位。
可以使用本领域已知的核酸递送方法来引入本发明的RNA沉默剂，所述方法包括注射含有核酸的溶液、用核酸覆盖的粒子轰击、将细胞或生物体浸入核酸溶液中、或在核酸存在的情况下进行细胞膜的电穿孔。可以使用本领域已知的用于将核酸引入细胞的其他方法，例如脂质介导的载体转运、化学介导的转运、和阳离子脂质体转染，例如磷酸钙等。可以将核酸与进行以下一项或多项活动的其他组分一起引入：增强细胞对核酸的摄取或以其他方式增加对靶基因的抑制。
引入核酸的物理方法包括注射含有RNA的溶液、用RNA覆盖的粒子轰击、将细胞或生物体浸入RNA溶液、或在RNA存在的情况下对细胞膜进行电穿孔。包装到病毒颗粒中的病毒构建体将完成表达构建体向细胞的有效引入和由表达构建体编码的RNA的转录。可以使用本领域已知的用于将核酸引入细胞的其他方法，例如脂质介导的载体转运、化学-IS介导的转运，例如磷酸钙等。因此，可以将RNA与进行以下一种或多种活动的组分一起引入：增强细胞对RNA的摄取、抑制单链退火、稳定单链或以其他方式增加对靶基因的抑制。
RNA可以直接引入细胞(即细胞内地)，或细胞外地引入腔、胞间隙至生物体循环，口服引入，或者可以通过将细胞或生物体浸入含有RNA的溶液中来引入。血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊髓液是可以引入RNA的部位。
具有靶基因的细胞可以来自种系或体细胞(全能或多能的、分裂或非分裂的)、薄壁组织或上皮细胞(永生的或转化的)等。细胞可以是干细胞或分化的细胞。分化的细胞类型包括脂肪细胞、纤维母细胞、肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经元、神经胶质、血细胞、巨核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、白细胞、粒细胞、角质细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、肝细胞、以及内分泌腺或外分泌腺细胞。
根据特定靶基因和所递送的双链RNA物质剂量，该过程可能会部分或完全丧失靶基因的功能。在至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多的靶细胞中基因表达的减少或丧失是示例性的。基因表达的抑制是指来自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物的水平不存在(或可观察到的降低)。特异性是指抑制靶基因而不对细胞的其他基因产生明显影响的能力。抑制的后果可以通过以下来确认：检查细胞或生物体的外在特性(如以下实例中所示)，或通过生物化学技术(例如RNA溶液杂交、核酸酶保护、RNA印迹杂交、逆转录、用微阵列进行基因表达监测、抗体结合，酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹法、放射免疫测定(RIA)、其他免疫测定、荧光激活的细胞分析(FACS)等)。
对于在细胞系或整个生物体中的RNA介导的抑制，可以通过使用易于测定的蛋白质产物的报告基因或抗药性基因来方便地测定基因表达。此类报告基因包括乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖苷酸酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、萤光素酶(Luc)、胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)及其衍生物。多种选择性标志物是可获得的，并且赋予了对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素和四环素的抗性。取决于测定，对基因表达量的定量允许确定抑制程度，与根据本发明的未处理的细胞相比，抑制程度大于10％、33％、50％、90％、95％或99％。较低剂量的注射材料和施用RNAi剂后的较长时间可能会导致较小比例的细胞(例如，至少10％、20％、50％、75％、90％或95％的靶细胞)受到抑制。细胞中基因表达的量化可能在靶mRNA积累或靶蛋白翻译的水平上显示出相似量的抑制。例如，可以通过评估细胞中基因产物的量来确定抑制效率。可以使用具有核苷酸序列的杂交探针来检测mRNA，所述核苷酸序列在用于抑制性双链RNA的区域之外，或者可以使用针对该区域的多肽序列的抗体来检测翻译的多肽。
可以按允许递送至少一个拷贝/细胞的量引入RNA。较高剂量(例如至少5、10、100、500或1000个拷贝/细胞)的物质可以产生更有效的抑制；较低剂量也可用于特定应用。
在特定的方面，针对以下方面测试了本发明的RNAi剂(例如，靶向突变基因中的多态性的siRNA)的功效：在细胞，特别是在神经元(例如纹状体或皮质神经元克隆系和/或原代神经元)中特异性降解突变型mRNA(例如突变型htt mRNA和/或突变型亨廷顿蛋白的产物)的能力。其他易于转染的细胞(例如HeLa细胞或COS细胞)也适用于基于细胞的验证测定。用人类野生型或突变型eDNA(例如人类野生型或突变型亨廷顿蛋白eDNA)转染细胞。标准的siRNA、修饰的siRNA或能够从U环形mRNA产生siRNA的运载体是共转染的。测量了突变型mRNA(例如突变型亨廷顿蛋白mRNA)和/或突变型蛋白质(例如突变型亨廷顿蛋白)的选择性减少。突变mRNA或蛋白质的减少可以与正常mRNA或蛋白质的水平进行比较。出于比较目的，可以分析外源引入的正常mRNA或蛋白质(或内源性正常mRNA或蛋白质)。当使用已知对标准转染技术有一定抗性的神经元细胞时，可能希望通过被动摄取引入RNAi剂(例如siRNA)。
在某些示例性实施例中，可以通过多种途径将包含本发明的RNA剂(例如dsRNA剂)的组合物递送至受试者的神经系统。示例性途径包括鞘内、实质(例如在脑中)、鼻和眼递送。该组合物也可以例如通过静脉内、皮下或肌肉内注射进行全身性地递送，这对于将RNA剂(例如dsRNA剂)递送至外周神经元特别有用。示例性的递送途径是直接到达脑，例如进入脑的脑室或下丘脑，或进入脑的外侧或背侧区域。可将用于神经细胞递送的RNA剂(例如dsRNA剂)掺入适合于施用的药物组合物中。
例如，组合物可以包含一种或多种类型的RNA剂(例如dsRNA剂)以及药学上可接受的载体。取决于希望局部治疗还是全身治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本发明的药物组合物按许多方式施用。施用可以是局部的(包括经眼的、鼻内的、经皮的)、口服的或肠胃外的。肠胃外施用包括静脉内滴注，皮下、腹膜内或肌肉内注射，鞘内或室内(例如脑室内)施用。在某些示例性实施例中，使用本文所述的各种合适的组合物和方法跨血脑屏障(BBB)递送本发明的RNA沉默剂。
递送途径可取决于患者的障碍。例如，可以向诊断患有亨廷顿病的受试者施用本发明的抗htt RNA剂(例如dsRNA剂)，直接进入脑(例如进入基底节的苍白球或纹状体，以及在纹状体的中型棘突神经元周围)。除了本发明的RNA沉默剂之外，可以向患者施用第二疗法，例如姑息疗法和/或疾病特异性疗法。所述第二疗法可以是，例如，症状性的(例如，用于缓解症状)、神经保护性的(例如，用于减缓或停止疾病进展)、或恢复性的(例如，用于逆转疾病过程)。例如，对于亨廷顿病的治疗，症状性的疗法可包括药物氟哌啶醇、卡马西平或丙戊酸盐。其他疗法可以包括心理疗法、物理疗法、言语疗法、交流和记忆辅助、社会支持服务以及饮食建议。
可以将RNA剂(例如dsRNA剂)递送至脑的神经细胞。可以使用不需要组合物穿过血脑屏障的递送方法。例如，可以通过直接注射到受疾病影响的细胞的区域中来向患者递送含有RNA剂(例如dsRNA剂)的药物组合物。例如，可以通过直接注射到脑中来递送药物组合物。注射可以通过立体定向注射到脑的特定区域(例如黑质体、皮质、海马体、纹状体或苍白球)。RNA剂(例如dsRNA剂)可以被递送到中枢神经系统的多个区域(例如，脑的多个区域和/或脊髓)。RNA剂(例如dsRNA剂)可以被递送到脑的扩散区域中(例如，扩散递送到大脑皮层)。
在一个实施例中，可以将RNA剂(例如dsRNA剂)通过套管、或一端植入组织(例如脑，如脑的黑质体、皮质、海马体、纹状体或苍白球)的其他递送装置的方式递送。套管可以连接至RNA剂(例如dsRNA剂)的储存库。流动或递送可以通过泵来调节，所述泵是例如渗透泵或微型泵，例如Alzet泵(杜瑞克公司(Durect)，库比蒂诺，加利福尼亚)。在一个实施例中，将泵和储存库植入远离组织的区域中(例如在腹部)，并且通过从所述泵或储存库通向释放部位的导管来进行递送。例如在美国专利号6,093,180和5,814,014中描述了用于递送至脑的装置。
本发明的RNA剂(例如dsRNA剂)可以被进一步修饰，使得能够穿过血脑屏障。例如，RNA剂(例如dsRNA剂)可以与使该药剂穿过屏障的分子缀合。可以通过任何所希望的方法(例如通过室内或肌肉内注射，或通过肺部递送)施用此类修饰的RNA剂(例如dsRNA剂)。
在某些实施例中，外排体被用于递送本发明的RNA剂(例如dsRNA剂)。在全身注射后，外排体可以穿过BBB，并向神经元特异性地递送siRNA、反义寡核苷酸、化学治疗剂和蛋白质(参见，Alvarez-Erviti L，SeowY，Yin H，Betts C，Lakhal S，Wood MJ.(2011).Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targetedexosomes[通过全身注射靶向外排体将siRNA递送至小鼠大脑].Nat Biotechnol.[自然生物技术]2011年4月；29(4)：341-5.doi：10.1038/nbt.1807；EI-Andaloussi S，Lee Y，Lakhal-Littleton S，Li J，Seow Y，Gardiner C，Alvarez-Erviti L，Sargent IL，WoodMJ.(2011).Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo[外排体介导的siRNA的体外和体内递送].Nat Protoc.[自然实验手册]2012年12月；7(12)：2112-26.doi：10.1038/nprot.2012.131；EL Andaloussi S，
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I，Breakefield XO，WoodMJ.(2013).Extracellular vesicles：biology and emerging therapeuticopportunities[细胞外囊泡：生物学和新兴的治疗机会].Nat Rev Drug Discov[自然评论药物发现].2013年5月；12(5)：347-57.doi：10.1038/nrd3978；El Andaloussi S，LakhalS，
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I，Wood MJ.(2013).Exosomes for targeted siRNA delivery acrossbiological barriers[用于跨生物学屏障靶向siRNA递送的外排体].Adv.Drug Deliv Rev[高级药物递送综述].2013年3月；65(3)：391-7.doi：10.1016/j.addr.2012.08.008)。
在某些实施例中，使用一个或多个亲脂性分子来允许穿过BBB递送本发明的RNA剂(例如dsRNA剂)(Alvarez-Ervit(2011))。然后，例如通过亲脂性伪装的酶降解以将药物释放为其活性形式来活化RNA沉默剂。
在某些实施例中，可以使用一种或多种受体介导的透化化合物来增加BBB的通透性，以允许递送本发明的RNA沉默剂。这些药物通过增加血液中的渗透压使内皮细胞之间的紧密连接松动，从而暂时增加BBB的通透性((EI-Andaloussi(2012))。通过使紧密连接松动，可以进行RNA沉默剂的正常静脉内注射。
在某些实施例中，将基于纳米颗粒的递送系统用于跨BBB的递送本发明的RNA剂(例如dsRNA剂)。如本文所用，“纳米颗粒”是指通常为固体可生物降解的胶体系统的聚合物纳米颗粒，纳米颗粒已作为药物或基因载体被广泛研究(S.P.Egusquiaguirre，M.Igartua，R.M.Hernandez和J.L.Pedraz，“Nanoparticle delivery systems for cancer therapy：advances in clinical and preclinical research[用于癌症治疗的纳米颗粒递送系统：临床和临床前研究的进展]，”Clinical and Translational Oncology[临床和转化肿瘤学]，第14卷，第2期，第83-93页，2012)。聚合物纳米颗粒被分类为两个主要类别：天然聚合物和合成聚合物。siRNA递送的天然聚合物包括但不限于环糊精、壳聚糖和去端肽胶原(Y.Wang，Z.Li，Y.Han，L.H.Liang和A.Ji，“Nanoparticle-based delivery system forapplication of siRNA in vivo [用于在体内应用siRNA的基于纳米颗粒的递送系统]，”Current Drug Metabolism[当前药物代谢]，第11卷，第2期，第182-196页，2010)。合成聚合物包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI)、聚(dl-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和树状聚合物，合成聚合物已被深入研究(X.Yuan，S.Naguib和Z.Wu，“Recent advances of siRNA deliveryby nanoparticles[通过纳米颗粒的siRNA递送的最新进展]，”Expert Opinion on DrugDelivery[对药物递送的专家意见]，第8卷，第4期，第521-536页，2011)。对于纳米颗粒和其他合适的递送系统的综述，参见Jong-Min Lee，Tae-Jong Yoon和Young-Seok Cho，“RecentDevelopments in Nanoparticle-Based siRNA Delivery for Cancer Therapy[用于癌症治疗的基于纳米颗粒的siRNA递送的最新进展]，”BioMed Research International[国际生物医学研究]，第2013卷，文章ID 782041，10页，2013.doi：10.1155/2013/782041(通过引用以其全文并入)。
本发明的RNA剂(例如dsRNA剂)可以眼内施用，例如以治疗视网膜障碍如视网膜病变。例如，可以将药物组合物施用于眼睛或附近组织(例如眼睑的内部)的表面。它们可以局部施用，例如通过喷雾、滴剂、洗眼水或软膏的形式。可以通过本领域已知的眼递送系统(例如涂抹器或滴眼管)来递送软膏或可滴液。此类组合物可以包括粘液模拟物(mucomimetic)，例如透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素或聚(乙烯醇)；防腐剂，例如山梨酸、EDTA或苄基氯化铬；以及通常量的稀释剂和/或载体。药物组合物还可以施用于眼睛内部，并且可以通过针或其他可以将其引入所选区域或结构的递送装置引入。还可以经由眼部贴剂应用含有RNA沉默剂的组合物。
通常，可以通过任何合适的方法施用本发明的RNA剂(例如dsRNA剂)。如本文所用，局部递送可以指将RNA剂(例如dsRNA剂)直接应用于身体的任何表面，包括眼睛、粘膜、体腔表面或任何内表面。用于局部施用的配制品可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、喷雾剂、以及液体。常规的药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可以是必要的或希望的。局部施用也可用作选择性地将RNA剂(例如dsRNA剂)递送至受试者的表皮或真皮，或其特定层或下层组织的方法。
用于鞘内或室内(例如脑室内)施用的组合物可以包括无菌水溶液，其也可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。除了例如附接至RNA剂(例如dsRNA剂)的亲脂性部分之外，用于鞘内或室内施用的组合物通常不包含转染试剂或另外的亲脂性部分。
用于肠胃外施用的配制品可包括无菌水溶液，其也可含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。室内注射可以通过例如附着于储存库的室内导管来进行。对于静脉内使用，应控制溶质的总浓度以使制剂等渗。
可以将本发明的RNA剂(例如dsRNA剂)通过肺部递送向受试者施用。肺部递送组合物可以通过吸入分散体来递送，使得分散体内的组合物可以到达肺部，在那里它可以容易地通过肺泡区域直接吸收到血液循环中。肺部递送对于全身递送和对于治疗肺部疾病的局部递送都可以是有效的。在一个实施例中，通过肺部递送施用的RNA剂(例如dsRNA剂)已经被修饰，使得能够穿越血脑屏障。
肺部递送可以通过不同方法实现，包括使用喷雾、雾化、微粉和干粉基配制品。可以使用液体雾化器、基于气溶胶的吸入器和干粉分散装置来实现递送。计量剂量装置是示例性的。使用雾化器或吸入器的一个好处是最小化污染的可能性，因为这些装置是自给(self-contained)的。例如，干粉分散装置递送可以容易地配制成干粉的药物。RNA沉默剂组合物可以通过其本身或与合适的粉末载体组合来稳定地储存为冻干的或喷雾干燥的粉末。用于吸入的组合物的递送可以通过给药定时元件来介导，所述给药定时元件可以包括定时器、剂量计数器、时间测量装置或时间指示器，当将其结合到所述装置中时在施用气溶胶药物期间能够实现患者的剂量跟踪、顺应性监测和/或剂量触发。
可用作载体的药物赋形剂的类型包括稳定剂，例如人血清白蛋白(HSA)、膨胀剂，例如碳水化合物、氨基酸和多肽；pH调节剂或缓冲剂；盐诸如氯化钠；等等。这些载体可以是结晶或无定形形式，或者可以是两者的混合物。
特别有价值的膨胀剂包括相容的碳水化合物、多肽、氨基酸或其组合。合适的碳水化合物包括单糖，例如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、海藻糖等；环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精；和多糖，例如棉子糖、麦芽糖糊精、葡聚糖等；糖醇，例如甘露醇、木糖醇等。碳水化合物的示例性基团包括乳糖、海藻糖、棉子糖麦芽糖糊精和甘露醇。合适的多肽包括阿斯巴甜。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，其中甘氨酸是示例性的。
合适的pH调节剂或缓冲剂包括由有机酸和碱制备的有机盐，例如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等；柠檬酸钠是示例性的。
可以通过口递送和鼻递送来施用本发明的RNA剂(例如dsRNA剂)。例如，通过这些膜施用的药物可以快速起效，提供治疗血浆水平，避免肝脏代谢的首过效应，并避免药物暴露于恶劣的胃肠(GI)环境。另外的优点包括容易进入膜位点，从而可以容易地施用，定位和去除药物。在一个实施例中，通过口递送或鼻递送来施用的RNA沉默剂已经被修饰，使得能够穿越血脑屏障。
在一个实施例中，通过植入装置分配包含RNA剂(例如dsRNA剂)的组合物的单位剂量或测量剂量。所述装置可以包括监测受试者内参数的传感器。例如，所述装置可以包括泵(例如渗透泵)以及任选地相关电子设备。
对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本文披露的实施例的范围的情况下，可以使用适当的等价方案对本文所述的方法进行其他适当的修改和改编。现在已经详细描述了某些实施例，通过参考以下实例将更清楚地理解它们，这些实例仅出于说明的目的而被包括，并且不旨在具有限制性。
实例
实例1：SNP判别根据错配的位置而变化
图46是展示用于产生和选择SNP判别性siRNA的方法的流程图，所述方法是针对HTT实施，但也适用于其他基因中的SNP。进行初步筛选以确定导致最高判别的SNP放置位置。然后，选择产生最佳结果的一个或多个错配位置，并在次级筛选中进一步降低对非靶等位基因的亲和力，在所述次级筛选中选择对具有提高的选择性和/或效能的siRNA分子进行化学优化和结构优化。
在HTT基因中存在若干SNP，其在HD患者中具有高杂合率(图45)。为了优化SNP特异性RNAi介导的亨廷顿蛋白的沉默，将HTT mRNA外显子57中的SNP rs362273用作优化SNP选择性沉默的模型靶标。这种SNP杂合性发生在35％的HD患者群体中。
本文所述的psiCHECK报告基因质粒在Rluc 3’UTR内含有SNP rs362273和htt的外显子57的部分侧翼区域。野生型psiCHECK报告基因质粒含有没有SNP的相同htt区域(图1)。
用psiCheck报告基因质粒系统，针对功效对设计为与含有突变型SNP(2273-1(A))的亨廷顿蛋白(htt)mRNA互补的疏水修饰的RNAs(hsiRNA)进行筛选。SNP后的数字代表SNP在siRNA中的位置(图47)。图2示出了将SNP置于位置2、4或6提供了最高的SNP判别，而没有丧失针对突变型等位基因的功效。通过被动摄取，将用两个报告基因质粒之一转染的HeLa细胞用1.5μM的hsiRNA反转染，并处理72小时。在转染后72小时测量萤光素酶活性(图2)。
在HeLa细胞中，在剂量反应双萤光素酶测定中进一步测试了hsiRNA的等位基因判别(图3)。与野生型报告基因质粒相比，多个hsiRNA优先沉默含有突变型SNP的报告基因质粒。通过被动摄取，将用两个报告基因质粒之一转染的HeLa细胞用1.5μM的hsiRNA反转染，并处理72小时。在转染后72小时测量报告基因质粒表达(图3)。
实例2：内源性Htt mRNA中的SNP判别
测试hsiRNA针对含有纯合rs362273SNP的内源性亨廷顿蛋白mRNA的功效。HeLa细胞在rs362273处是纯合的，在每个等位基因中均具有A，因此该测定未评估等位基因判别。相反，图4示出了两个hsiRNA(SNP4-0和SNP6-0)在使含有校正SNP的htt mRNA沉默方面非常有效。经由被动摄取，用hsiRNA处理HeLa细胞72小时后，使用Quantigene 2.0bDNA测定来测量mRNA水平。将人类htt mRNA水平归一化为人类HPRT。
实例3：用第二错配设计hsiRNA用于更高的等位基因判别
对于先前针对剂量反应所选择的三种hsiRNAs(SNP2-0、SNP4-0和SNP6-0，还分别命名为mm2、mm4和mm6)中的每一种，设计16种新的hsiRNA，并且进行轻微序列修饰以合成(图34)。这些序列沿原始序列在每个可能的位置处引入了单个错配，以便于测试第二错配是否比以前更显著地削弱脱靶SNP的沉默，并且对沉默靶SNP的影响很小。反义链序列显示为5’至3’，其中以红色表示SNP位点，并且以蓝色表示新的错配(图12)。
对图12中hsiRNA功效的初步筛选显示了相对于与SNP对应的核苷酸位置的第二错配位置，导致HeLa细胞中SNP判别的变化水平。将用两个psiCHECK报告基因质粒之一转染的HeLa细胞通过被动摄取用1.5μM的hsiRNA反转染，并处理72小时。在转染后72小时测量萤光素酶活性。图5示出与野生型报告基因质粒相比，多个hsiRNA判别地使含有SNP突变的报告基因质粒沉默。
在剂量反应曲线中进一步测试了含有第二错配的最有效的hsiRNA以验证提高的SNP判别。通过被动摄取，将用两个报告基因质粒之一转染的HeLa细胞用hsiRNA反转染，并处理72小时。用双萤光素酶测定来测量报告基因表达。图6-8示出了针对使含有SNP突变的报告基因质粒相对于野生型报告基因质粒发生沉默，具有两个错配的hsiRNA的IC50值。显示了SNP6-11hsiRNA(具有与5’末端的位置6处与多态性对应的核苷酸、和在5’末端的位置11处的错配的hsiRNA分子)和SNP4-7 hsiRNA(具有与5’末端的位置4处的多态性对应的核苷酸、和5’末端的位置7处的错配的hsiRNA分子)是最有效的(参见图7-9)。出人意料地，改变SNP周围的修饰模式通过引入第二错配挽救损失的功效，而不削弱判别。改变SNP6-11hsiRNA，使其具有侧翼于错配核苷酸的2’O-甲基修饰(以及具有2’O-甲基修饰的错配核苷酸本身)(参见图10)。
实例4：另外的修饰
各种寡核苷酸类型(例如缺口体、混合体、miRNA抑制因子、剪接转换寡核苷酸(“SSO”)、磷二酰胺吗啉代寡核苷酸(“PMO”)、肽核酸(“PNA”)等)可以在本文所述的寡核苷酸中使用，任选地利用在本文所述和在例如美国序列号15/089,423、美国序列号15/236,051、美国序列号15/419,593、美国序列号15/697,120和美国专利号9,809,817、以及美国序列号15/814,350和美国专利号9,862,350(出于所有目的将每一个通过引用以其全文并入本文)中所述的修饰(例如化学修饰)和/或缀合的不同组合。
例如，本文所述的寡核苷酸可以被设计为双siRNA(参见，例如图14)。本文所述的寡核苷酸可以包括一个或多个不同的骨架键(参见，例如图15)。本文所述的寡核苷酸可以包括各种糖修饰(参见，例如图16)。本文所述的寡核苷酸可以包括各种核苷酸间键(参见，例如图17)。本文所述的寡核苷酸可以包括一个或多个5’稳定化修饰(参见，例如图18)。本文所述的寡核苷酸可以包括一个或多个缀合的部分(参见，例如图19)。图35展示了示例性寡核苷酸骨架修饰的数目。
仅通过改变在SNP位置处的碱基，本文所述的寡核苷酸可有效地用于靶向在SNP位点处的G。如图33中所示，第二次合成化合物SNP6-11，这次靶向在SNP位点处的G而不是A。这允许选择性地沉默任一等位基因，这一策略对于在相同SNP位点处具有不同杂合性的患者非常有用。
在某些示例性实施例中，一个或多个脱碱基核苷酸在SNP位置核苷酸处、在MM位置核苷酸处、在5′末端处、在3′末端处或这些位置的任何组合处使用。
在某些示例性实施例中，合成在错配周围具有不同糖修饰的hsiRNA，以提高等位基因特异性，例如2’FANA代替2’F；SNP/错配位置周围的三重2’F或三重2’OMe。
实例5：HTT小鼠模型
BAC97-HD是指包含人类细菌人工染色体(BAC)转基因插入物的转基因小鼠，所述转基因插入物含有完整的病原性170kb人类亨廷顿蛋白(htt)基因组基因座，所述基因组基因座通过将人类htt外显子1替代为含有编码连续聚谷氨酰胺(polyQ)伸展的97个混合CAA-CAG重复序列的loxP侧翼的人类突变型htt外显子1序列来进行修饰。
将先导化合物(SNP6-11)合成至具有图31中展示的结构的二支链化学支架，并随后在8周龄的BAC97-HD雌性小鼠中、经由40nmol双侧脑室内(ICV)注射(20nmol，至每侧)来进行体内测试。小鼠具有两个拷贝的正常小鼠htt基因(其中G在SNP rs362273处)和病原性人类htt基因的转基因插入物(其中A在SNP rs362273A处)。RNA转录组中不具有靶匹配的无义序列也被合成至相同二支链支架中，并在小鼠中作为阴性对照(NTC)进行注射。
注射后1个月，从小鼠中收集若干个脑区域用于RNA和蛋白质分析，并使用Ab1抗体通过蛋白质印迹法测量HTT蛋白质水平。图32A是在所收集的纹状体组织上进行的蛋白质印迹，并且图32B示出了归一化为黏着斑蛋白的蛋白质水平。
实例6：SNP靶向是序列独立性的
评估先导化合物的SNP判别是否具有序列依赖性。使用设计为与亨廷顿蛋白(htt)mRNA互补的疏水修饰的RNA(hsiRNA)，所述亨廷顿蛋白mRNA含有在rs362273中U到G的错配或C到A的错配。与U到G错配互补的6-11个hsiRNA和与C到A错配互补的6-11个hsiRNA两者优先地切割靶SNP(图20)。
实例7：乙烯基膦酸酯修饰的亚基间键的合成
图21和29展示了本文所讨论的乙烯基次膦酸酯修饰的亚基间键的代表性合成。以下详细说明了图21的合成程序。
化合物3a的合成
向化合物2a(16.6g，20.8mmol)在吡啶(100mL)中的无水溶液里添加无水DIPEA(6.5mL，37.4mmol)和苯甲酰氯(3.6mL，31.2mmol)。将混合物在室温下搅拌4小时后，将过量的吡啶蒸发并且用CH2Cl2稀释。通过饱和水性NaHCO3洗涤有机溶液。将有机层收集，经MgSO4干燥，过滤和蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷-乙酸乙酯，4∶1至1∶1)进行纯化，得到呈淡黄色泡沫的化合物3a(14.5g，78％)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.88-7.87(m，2H)，7.84(d，1H，J＝8.3Hz)，7.67-7.58(m，5H)，7.48-7.45(m，4H)，7.39-7.32(m，4H)，7.25-7.23(m，3H)，7.18-7.17(m，2H)，7.12-7.07(m，4H)，6.80-6.75(m，4H)，6.08(dd，1H，JHH＝1.5Hz，JHF＝15.2Hz)，5.14，(d，1H，JHH＝8.3Hz)，4.59(ddd，1H，JHH＝3.7，1.5Hz，JHF＝51.9Hz)，4.43(ddd，1H，JHH＝7.4，4.0Hz，JHF＝19.1Hz)，4.24-4.23(m，1H)，3.79(s，6H)，3.62(dd，1H，JHH＝11.2，2.0Hz)，3.35(dd，1H，JHH＝11.1，2.0Hz)，1.00(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ168.4，161.8，158.72，158.66，148.9，143.9，139.4，135.71。135.70，135.1，134.8，134.7，132.3，132.2，131.3，130.4，130.2，130.1，129.1，128.2，128.0，127.91，127.89，127.2，113.19，113.16，102.2，92.5(d，JCF＝194.4Hz)，87.7(d，JCF＝34.5Hz)，87.2，82.4，70.0(d，JCF＝15.4Hz)，60.7，60.4，55.2，26.6。
化合物4a的合成
将化合物3a(14.5g，16.3mmol)溶解到含有三乙基硅烷(8.0mL，50.1mmol)的3％三氯乙酸/CH2Cl2溶液(200mL)中，并且在室温下搅拌1小时。通过饱和水性NaHCO3将溶液洗涤三次后，将收集的有机层经MgSO4干燥、过滤并且蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，4∶1至3∶7)进行纯化，得到呈白色泡沫的化合物4a(8.67g，91％)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.89-7.88(m，2H)，7.68-7.64(6H，m)，7.51-7.45(m，4H)，7.42-7.38(4H，m)，5.93(dd，1H，JHH＝2.9Hz，JHF＝15.1Hz)，5.73(d，1H，JHH＝8.2Hz)，4.74(ddd，1H，JHH＝4.1，3.2Hz，JHF＝52.2Hz)，4.31(ddd，1H，JHH＝5.8，4.7，JHF＝15.4Hz)，4.11-4.09(m，1H)，3.82-3.79(m，1H)，3.39(ddd，1H，JHH＝12.1，5.6，1.5Hz)，1.64(br，1H)，1.11(s，9H)；13CNMR(126Hz，CDCl3)δ168.3，161.8，149.0，140.5，135.7，135.2，132.8，132.3，131.3，130.5，130.4，130.3，129.2，128.02，127.96，102.4，91.8(d，JCF＝91.8Hz)，89.5(d，JCF＝33.6Hz)，69.5(d，JCF＝69.5Hz)，60.3，26.8。
化合物6a的合成
向化合物4a(6.5g，11.0mmol)的无水溶液中添加IBX(7.7g，27.6mmol)，并且在85℃下搅拌2小时。将混合物在冰浴中冷却，然后将溶液中的沉淀物通过硅藻土滤出。在氩气氛下，将收集的洗脱液蒸发，与无水CH3CN共蒸发三次，并且将获得的呈白色泡沫的化合物5a不经进一步纯化而使用。在单独的烧瓶中，在0℃下，向含有CBr4(7.3g，22.1mmol)的无水CH2Cl2(25mL)溶液中添加PPh3(11.6g，44.2mmol)，并且在0℃下搅拌0.5h。在0℃下，向该溶液中逐滴添加(10min)化合物5a的无水CH2Cl2溶液(25mL)，并且在0℃下搅拌2h。将有机溶液用CH2Cl2稀释，然后通过饱和水性NH4Cl洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且蒸发。将获得的物质溶解到最小量的二乙醚中，并且在0℃下、在剧烈搅拌下逐滴添加至过量的二乙醚溶液中。通过硅藻土将溶液中的沉淀物滤出，并且将洗脱剂蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，9∶1至1∶1)进行纯化，得到呈白色泡沫的化合物6a(4.3g，52％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.68-7.84(m，2H)，7.70-7.65(m，3H)，7.60-7.58(m，2H)，7.52-7.49(m，2H)，7.42-7.36(m，4H)，7.31-7.28(m，2H)，7.09(d，1H，J＝8.2Hz)，6.25(d，1H，J＝8.9Hz)，5.75(dd，1H，JHF＝8.24Hz)，5.49(dd，1H，JHF＝21.4Hz)，4.77(t，1H，JHH＝8.5Hz，JHF＝8.5Hz)，4.38(dd，1H，JHH＝4.1Hz，JHF＝52.1Hz)，4.25(ddd，1H，JHH＝8.1，4.9Hz，JHF＝19.4Hz)，1.10(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ167.9，161.6，148.3，141.4，135.8，134.7(d，JC-Br＝139.0Hz)，132.5，132.2，131.1，130.5，130.3，130.2，129.2，127.9，102.7，97.3，93.3(d，JCF＝39.1Hz)，91.5(d，JCF＝190.7Hz)，82.4，73.9(d，JCF＝16.4Hz)，26.7。
化合物7a-E和7a-Z的合成
在0℃下，向化合物6a(4-2g，5.66mmol)在DMF(25mL)中的无水溶液里添加二甲基亚磷酸酯(2.09mL，22.6mm0l)和三乙胺(1.58mL，11.3mmol)，然后在室温下搅拌过夜。将溶液用乙酸乙酯稀释后，将有机溶液用饱和水性NH4Cl和盐水洗涤。然后将有机溶液经MgSO4干燥，过滤并且蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，9∶1至1∶1)重复纯化，直到分别收集了所有纯的同分异构化合物，给出化合物7a-E(1.95g，52％)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.87-7.85(m，2H)，7.89-7.85(m，3H)，7.61-7.59(m，2H)，7.52-7.48(m，2H)，7.45-7.32(m，6H)，7.08(d，1H，JHH＝8.2)，6.49(d，1H，JHH＝13.7)，5.99(dd，1H，JHH＝13.7Hz，8.1Hz)，5.75(d，1H，JHH＝8.2)，5.63(d，1H，JHF＝19.8Hz)，4.43(dd，1H，JHF＝52.6Hz，JHH＝4.3Hz)，4.42(t，1H，JHH＝8.0Hz)，4.07(ddd，JHH＝7.8，4.7Hz，JHF＝19.5Hz)，1.08(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ148.4，140.4，135.8，135.7，135.3，133.3，132.3，132.4，132.1，131.1，130.5，130.4，130.3，129.2，127.95，127.93，112.4，102.7，91.7(d，JCF＝36.3Hz)，91.6(d，JCF＝191.6Hz)，82.8，73.9(d，JCF＝16.4Hz)，26.7，19.1；和7a-Z(0.58g，15％)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.87-7.85(m，2H)，7.68-7.65(m，3H)，7.61-7.59(m，2H)，7.52-7.48(m，2H)，7.42-7.39(m，2H)，7.34-7.29(m，4H)，7.12(d，1H，JHH＝8.2Hz)，6.51(d，1H，JHH＝7.4Hz)，5.96(dd，1H，JHH＝8.4Hz，7.4Hz)，5.75(d，1H，JHH＝8.2Hz)，5.57(dd，1H，JHH＝1.2Hz，JHF＝20.6Hz)，5.04(dd，1H，JHH＝8.2Hz)，4.48(JHH＝3.5Hz，JHF＝53.1Hz)，4.24(ddd，1H，JHH＝7.8，4.9Hz，JHF＝18.6Hz)，1.09(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ168.0，161.7，148.4，141.4，135.9，135.8，135.2，132.6，132.5，131.2，130.6，130.5，130.2，130.1，129.2，127.8，127.7，114.5，102.6，93.0(d，JCF＝37.2Hz)，91.6(d，JCF＝191.6Hz)，80.3，74.3(d，JCF＝16.4Hz)，26.7，19.1。
化合物9a的合成
将无水化合物7a-E(1.95g，2.94mmol)和Pd(OAc)2(125mg，0.59mm0l)和[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化靶(II)(652mg，1.18mmol)用氩气吹扫，然后溶解到无水THF(50mL)中。在添加氧化丙烯(2.06mL，29.4mmol)后，一次性添加化合物8a(2.07g，3.24mmol)，并且在70℃下搅拌4h。在减压下去除溶剂后，将粗混合物通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，50∶50至0∶100)进行纯化，并且将获得的含有化合物9a的级分通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2-MeOH，0％至5％)进一步纯化，得到呈非对映异构体-同分异构体的混合物的化合物9a(2.04g，57％)；31P NMR(202MHz，CDCl3)δ18.3。
化合物10a的合成
向在无水THF(22.5mL)中的化合物9a(2.0g，1.64mmol)里添加1.0M TBAF-THF(2.5mL，2.5mmol)，并且在环境温度下搅拌30分钟。将有机层用CH2Cl2(120mL)稀释，然后用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，然后蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(1％TEA-CH2Cl2/MeOH，0％至6％)进行纯化，得到化合物10a(1.52g，94％)；31P NMR(202MHz，CDCl3)δ19.0，18.7。
化合物11a的合成
化合物10a(589.7mg，0.6mmol)通过与无水CH3CN重复共蒸发呈无水状态，然后溶解到无水CH2Cl2(6.0mL)中。在0℃下，向该溶液中添加N，N-二异丙基乙胺(0.31mL，1.8mmol)和2-氰乙基N，N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.16mL，0.72mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30min，然后用过量的CH2Cl2稀释。将有机层用饱和水性NaHCO3重复洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(1％TEA-CH2Cl2/MeOH，从100％至4％)进行纯化，得到呈白色泡沫的化合物11a(570mg，80％)；31P NMR(202MHz，CDCl3)δ150.3，151.2，151.1，151.0，18.72，18.65，18.55，18.3。
化合物4b的合成
向化合物3b(1.35g，2.0mmol)在吡啶(10mL)中的无水溶液里添加DIPEA(0.63mL，3.6nnol)和苯甲酰氯(0.35mL，3.0mmol)，并且在室温下搅拌3小时。将有机溶液用过量的CH2Cl2稀释，然后用饱和水性NaHCO3和盐水洗涤。将获得的粗物质经MgSO4干燥、过滤并且蒸发，然后不经进一步纯化而用于下一反应。将获得的含有化合物3b的粗物质添加至在CH2Cl2(25mL)和三乙基硅烷(1mL，6.26mmol)中的3％三氯乙酸里，并且在室温下搅拌1小时。将反应混合物用CH2Cl2稀释后，将溶液用饱和NaHCO3水溶液洗涤三次、经MgSO4干燥、过滤、然后蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，4∶1至1∶4)进行纯化，得到纯的化合物4b(596.7mg，63％，经2步)；1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ8.13(d，1H，JHH＝8.2Hz)，7.95(d，2H，JHH＝7.3Hz)，7.81(t，1H，JHH＝7.5Hz)，7.69-7.68(m，2H)，7.64-7.59(m，4H)，7.49-7.42(m，6H)，5.93(d，1H，JHH＝4.6Hz)，5.26(t，1H，JHH＝4.6Hz)，4.36(dd，1H，JHH＝4.6，4.6Hz)，4.02-4.00(m，1H)，3.65-3.61(m，1H)，3.54(dd，1H，JHH＝4.6，4.6Hz)，3.09(s，3H)，1.03(s，9H)；13C NMR(126Hz，DMSO-d6)169.8，162.1，149.5，141.3，136.1，135.9，135.8，133.4，133.2，131.5，130.7，130.52，130.48，130.0，128.4，128.3，102.1，86.7，85.6，82.8，79.7，70.8，60.2，57.8，27.2，19.4；HRMS(ESI)m/z针对C33H35N2O7Si-[M-H]-的计算值：m/z599.2219，实测值；m/z 599.2258。
化合物6b的合成
向化合物4b(300.4mg，0.5mmol)在CH3CN(5mL)中的无水溶液里添加IBX(350mg，1.3mmol)，并且在85℃下搅拌2小时。将溶液在0℃下冷却后，通过硅藻土过滤将沉淀物滤出。将获得的含有化合物5b的洗脱剂蒸发，通过与无水CH3CN重复共蒸发呈无水状态，并且不经进一步纯化而用于下一反应。在0℃下，向CBr4(331.6mg，1.0mmol)在CH2Cl2(5.0mL)中的分离制备的无水溶液里一次性添加三苯基磷(524.6mg，2.0mmol)，并且在0℃下搅拌30分钟。向该溶液中，在0℃下，逐滴添加(10min)在无水CH2Cl2(1.5mL)中的化合物5b，并且在0℃下搅拌2h。然后将溶液用CH2Cl2稀释，并且用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。将有机溶液经MgSO4干燥、过滤并且蒸发，然后将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，9∶1至4∶6)进行纯化，得到化合物6b(210.9mg，56％)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.88(d，2H，JHH＝7.3Hz)，7.70-7.62(5H，m)，7.51-7.38(m，9H)，7.08(d，1H，JHH＝8.2Hz)，6.26(d，1H，JHH＝8.6Hz)，5.75(d，1H，JHH＝8.2Hz)，5.68(d，1H，JHH＝0.8Hz)，4.84(dd，1H，JHH＝8.6Hz，8.6Hz)，3.86(dd，1H，JHH＝7.5Hz，5.0Hz)，3.30(s，3H)，3.18(br，1H)，1.11(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)168.3，161.7，148.6，138.9，135.9，135.8，134.3，132.6，132.4，131.2，130.5，130.4，130.3，129.2，128.0，127.9，102.4，97.5，90.0，82.44，82.39，74.4，58.2，26.7，19.1；HRMS(ESI)m/z针对C34H33Br2N2O6Si-[M-H]-的计算值：m/z 751.0480[M-H]-，实测值：m/z 753.6495。
7b-E和7b-Z的合成
在0℃下，向化合物6b(6.11g，8.1mmol)在DMF(35mL)中的无水溶液里添加二甲基亚磷酸酯(2.97mL，34.0mmol)和三乙胺(2.26mL，17.0mmol)，然后在室温下搅拌过夜。将溶液用乙酸乙酯稀释后，将有机溶液用饱和NH4Cl水溶液和盐水洗涤。然后将有机溶液经MgSO4干燥，过滤并且蒸发，并且将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，9∶1至1∶1)重复进行纯化，直到分别收集了所有纯的同分异构化合物，给出化合物7b-E(3.0g，55％)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.89-7.87(m，2H)，7.70-7.62(m，5H)，7.51-7.39(m，8H)，7.10(d，1H，JHH＝8.3Hz)，6.47(dd，1H，JHH＝13.6，0.8Hz)，6.01(dd，1H，JHH＝13.6，7.9Hz)，5.76-5.74(m，2H)，4.51(dd，1H，JHH＝7.8，7.8Hz)，7.36(dd，1H，JHH＝7.8Hz，4.9Hz)，3.34(s，3H)，3.17(dd，1H，JHH＝4.7，1.2Hz)，1.09(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ168.3，161.7，148.7，138.4，135.9，135.8，135.3，133.8，132.6，132.4，131.2，130.5，130.4，130.3，129.2，128.0，127.9，112.1，102.3，88.9，82.8，82.6，77.2，74.2，58.1，26.8，19.1；和7b-Z(1.23g，22％)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.89-7.87(m，2H)，7.72-7.70(m，2H)，7.68-7.63(m，3H)，7.51-7.44(m，4H)，7.41-7.37(m，4H)，7.16(d，1H，J-8.2Hz)，6.53(dd，1H，JHH＝7.4，0.6Hz)，6.03(dd，1H，JHH＝8.5，7.4Hz)，5.75-5.73(m，2H)，5.12(t，1H，JHH＝8.1Hz)，3.93(dd，1H，JHH＝6.9，5.0Hz)，3.32(br，1H)，3.26(s，3H)，1.10(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ168.3，161.8，148.7，139.3，135.91，135.85，135.22，132.74，132.71，131.2，130.8，130.5，130.23，130.16，129.2，127.78，127.75，114.6，102.2，90.1，82.4，80.6，77.2，74.8，58.1，26.8，19.2。
化合物8b的合成
将无水5′-O-DMTr-2′-脱氧-2′-氟-3′-[甲基-N，N-(二异丙基)氨基]亚磷酰胺(4.26g，6.0mmol)溶解于0.45M 1H-四唑/CH3CN溶液(27mL，12mmol)中，并且在室温下搅拌30分钟。向该溶液中添加H2O(3.6mL)，并且在室温下搅拌30分钟。将有机溶液用乙酸乙酯稀释，然后用盐水洗涤六次，经MgSO4干燥，过滤，然后蒸发。将获得的具有少量杂质的化合物8b不经进一步纯化而用于下一反应；31P NMR(CDCl3，202MHz)δ8.92，8.28。
化合物9b的合成
将无水化合物7b-E(2.84g，4.20mmol)和Pd(OAc)2(188.6mg，0.84mmol)和[1，1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化靶(II)(931.4mg，1.68mmol)用氩气吹扫，然后溶解到无水THF(50mL)中。在添加氧化丙烯(2.94mL.42.0mmol)后，一次性添加化合物9b(3.16g，5.04mmol)，并且在70℃下搅拌4小时。在减压下去除溶剂后，将粗混合物通过硅胶柱色谱法(己烷-乙酸乙酯，50∶50至0∶100)进行纯化，并且将获得的含有化合物9b的级分通过硅胶柱色谱法(1％TEA-CH2Cl2/MeOH，0％至5％)进一步纯化，得到呈非对映异构体的混合物的化合物9b(3.3g，64％)；31P NMR(202MHz，CDCl3)δ19.31，18.72。
化合物10b的合成
向在无水THF(36.5mL)中的化合物9b(3.3g，2.70mmol)里添加1.0M TBAF-THF(4.05mL，4.05mmol)，并且在环境温度下搅拌30分钟。将有机层用CH2Cl2(150mL)稀释，然后用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，然后蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(1％TEA-CH2Cl2/MeOH，0％至8％)进行纯化，得到化合物10b(1.25g，47％)；31P NMR(202MHz，CDCl3)δ19.8，19.1。
化合物11b的合成
化合物10b(393.2mg，0.4mmol)通过与无水CH3CN重复共蒸发呈无水状态，然后溶解到无水CH2Cl2(4.0mL)中。在0℃下，向该溶液中添加N，N-二异丙基乙胺(0.21mL，1.2mmol)和2-氰乙基N，N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.11mL，0.48mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30min，然后用过量的CH2Cl2稀释。将有机层用饱和水性NaHCO3重复洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(1％TEA-CH2Cl2/MeOH，从100％至4％)进行纯化，得到呈白色泡沫的化合物11b(319.6mg，68％)；31P NMR(202MHz，CDCl3)6150.7，150.4，150.3，19.9，19.5，19.4，18.8。
实例8：乙烯基膦酸酯修饰的寡核苷酸的固体支持物介导的合成
图22展示了具有乙烯基次膦酸酯修饰的亚基间键的寡核苷酸的代表性合成。合成的VP修饰的序列的实例可见于图28A和28B中。
核苷酸间(E)-乙烯基膦酸酯修饰的RNA寡核苷酸的合成
在MerMade 12自动化RNA合成仪(BioAutomation公司)上，使用2′-修饰的(2′-氟、2′-O-甲基)亚磷酰胺和乙烯基膦酸酯连接的二聚体亚磷酰胺的0.1M无水CH3CN溶液，进行具有一个乙烯基膦酸酯键的RNA寡核苷酸的合成。对于固体支持物，使用UnyLinker支持物(ChemGenes公司)。通过标准的1.0μmol规模的RNA亚磷酰胺合成循环进行合成，所述合成循环由(i)脱三苯甲基化、(ii)偶联、(iii)封端和(iv)碘氧化组成。将无水CH3CN中的5-(苄硫基)-1H-四唑用作亚磷酰胺活化试剂，并且将在CH2Cl2中的3％二氯乙酸用于脱三苯甲基化。使用在四氢呋喃(封端剂A)和80∶10∶10(v/v/v)四氢呋喃-Ac2O-2，6-二甲基吡啶(封端剂B)中的16％N-甲基咪唑进行封端反应。将在THF-吡啶-H2O(7∶2∶1，v/v/v)中的0.02M I2用于氧化，并且将在吡啶：CH3CN(9∶1，v/v)中的0.1M 3-[(二甲基氨基-亚甲基)氨基]-3H-1，2，4-二噻唑3-硫酮用于硫化。使用双(2-氰乙基)-N，N-二异丙基亚磷酰胺进行5′-末端磷酸化。使用胆固醇3′-lcaa CPG
Figure BDA0003009853070000951
(ChemGenes公司)进行于3′-胆固醇修饰的RNA寡核苷酸合成，并且在与用于VP修饰的RNA的条件相同的条件下进行RNA合成。化学链延长后，在26℃下，通过NH4OH-EtOH(3∶1，v/v)，在固体支持物上进行48小时的脱保护和切割。在乙烯基膦酸酯修饰的RNA的情况下，在环境温度下，在RNA合成柱中，首先用TMSBr-吡啶-CH2Cl2(3∶1∶18，v/v/v)将固体支持物上的RNA处理1h。然后通过使溶液流过合成柱，将固体支持物用水(1mL x 3)、CH3CN(1mL x 3)和CH2Cl2(1mL x 3)洗涤，然后在真空下进行干燥。在将固体支持物转移到加旋盖的样品管中后，在26℃下通过NH4OH-EtOH(3∶1，v/v)进行碱处理48h。将不含胆固醇缀合物的粗RNA寡核苷酸通过标准阴离子交换HPLC进行纯化，而将含有胆固醇缀合物的RNA通过反相HPLC进行纯化。将获得的所有纯化的RNA通过Sephadex G-25(通用电气医疗集团(GE Healthcare))脱盐，并由电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析进行表征。
实例9：沉默功效
图23和24提供了本文研究的VP修饰的siRNA的视觉表征。图25例示了亚基间键中一个或多个乙烯基膦酸酯修饰在指导链不同位置处对沉默的作用。从图25中的数据可以看出，RISC对VP修饰非常敏感，并且在不同位置处具有错配碱基对可以破坏siRNA效能。
图26、27A和27B还展示了VP修饰的siRNA使突变型等位基因沉默的能力。由图27A和27B可以看出，在siRNA序列中添加错配可以提高等位基因判别而不影响突变型等位基因沉默。图30示出了在SNP位点旁边引入VP修饰的键显著增强了SNP选择性siRNA的靶/非靶判别。合成含有初级(位置6)和次级(位置11)SNP的化合物，所述化合物具有或不具有在位置5和6之间的VP-修饰。从图30可以看出，VP-修饰的存在对“在靶(on-target)”活性没有影响，但完全消除了对非靶mRNA的任何可检测的沉默。用于产生图25、26、27A和27B中的数据的方法描述如下。
hsiRNA被动递送
在96孔细胞培养板中，按8,000个细胞/孔，将细胞铺板在含有6％FBS的杜尔贝科改良的伊戈尔氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle′s Medium)中。在OptiMEM(卡尔斯巴德，加利福尼亚州；31985-088)中，将hsiRNA稀释至两倍的终浓度，并且将50μL稀释的hsiRNA添加至50μL细胞中，形成最终的3％FBS。在37℃，且在5％CO2中，将细胞孵育72小时。体外剂量反应测定中的最大剂量是1.5μM化合物。
用于定量分析靶mRNA的方法
使用QuantiGene 2.0测定试剂盒(艾菲矩阵公司(Affymetrix)，QS0011)，从细胞定量mRNA。在55℃下，将细胞在250μL稀释的裂解混合物中裂解30min，所述混合物由一部分裂解混合物(艾菲矩阵公司(Affymetrix)，13228)、两部分H2O和0.167μg/μL蛋白酶K(艾菲矩阵公司(Affymetrix)，QS0103)构成。将细胞裂解物充分混合，并且将40μL的每种裂解物与20μL不含蛋白酶K的稀释的裂解混合物添加至捕获板的每孔中。将针对人类HTT和HPRT(艾菲矩阵公司(Affymetrix)；#SA-50339，SA-10030)的探针组进行稀释，并且根据制造商推荐的方案使用。将数据集归一化为HPRT。
用于创建条形图的方法
使用GraphPad Prism 7软件(GraphPad软件公司，圣地亚哥，加利福尼亚州)对数据进行分析。使用log(抑制因子)相对于应答-变量斜率(四个参数)，对浓度依赖性IC50曲线进行拟合。对于每个细胞处理板，将每个剂量的敲低水平归一化为对照组(未处理的组)的平均值。曲线的下限被设置为小于5，并且曲线的上限被设置为大于95。为创建条形图，通过以下计算百分比差异：将每种化合物的iC50值从每种相应对照化合物的IC50值中减去，再除以所述对照化合物的IC50值，然后乘以100。如果百分比差异小于-500％，则将百分比差异人为设定为-500％。图的下限在-300％处断开。
在本申请中可能引用的所有引用的参考文献(包括文献参考、专利、专利申请和网站)的内容均出于任何目的通过引用以其全文明确地并入本文，其中引用的参考文献也是如此。除非另有说明，否则本披露将采用本领域熟知的免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规技术。
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实例10：初步筛选得到针对SNP rs362307杂合性的多个有效的siRNA序列
用含有目的SNP(图40)的靶区域的报告基因质粒，对所有设计为与含有替代性突变型SNP(rs362307)(图39)的HTTmRNA互补的siRNA进行筛选。通过被动摄取，将用两个报告基因质粒之一转染的HeLa细胞用1.5uM的hsiRNA反转染，并处理72小时。SNP之后的数字代表SNP在siRNA中的位置。预期基于其周围区域的高G/C含量，此SNP将更难被靶向。似乎将SNP置于位置3中提供了最强的SNP判别，而不会丧失针对突变型等位基因的功效，表明最佳的SNP位置是序列特异性的(图41)。因此，可以进行该初步筛选过程用于针对任何SNP来选择最佳的SNP位置。
实例11：当应用于SNP rs362307时，次级错配继续提高等位基因判别
如图42所报道，对具有在所有可能位置处引入错配的新序列进行的初步筛选得到多个有效的hsiRNA，并且在位置rs362307处也具有提高的SNP判别。在位置7和8处引入错配似乎增加了选择性，同时保留了靶沉默功效。其他次级错配可提供出色的判别，但总体活性较低。
实例12：在包括SNP的序列中测量SNP判别
为了测量表5-7中披露的每个序列(即，具有特定的SNP位置核苷酸和错配(MM)位置核苷酸组合的每个hsiRNA)的SNP判别，使用双萤光素酶，制备和测试含有htt的野生型区域、或具有序列的SNP的htt的相同区域的psiCHECK报告基因质粒。通过被动摄取，将用两个报告基因质粒之一转染的HeLa细胞用hsiRNA反转染，并处理72小时。在具有或不具有另外错配的情况下，在测定中测量萤光素酶活性，然后将其绘制在剂量反应曲线中并进行比较，以显示在判别和沉默功效方面产生最佳结果的序列。
实例13：次膦酸酯修饰的亚基间键的合成
图44A-44C总结了用于制备本发明的次膦酸酯修饰的亚基间键的方法。该方法涉及从游离醇到相应酮的琼斯氧化反应(Jones oxidation)，然后进行维蒂烯化作用(Wittigolefination)以获得中间体化合物3中所示的环外亚甲基部分。用BOM保护酰胺，然后进行硼氢化-氧化反应，生成游离醇中间体5。甲磺酰化作用后进行改良的芬克尔斯坦(Finkelstein)反应，生成碘化的中间体7，然后将其进一步官能化以获得甲基次膦酸酯单体9。
为获得单体18，采用各种保护和脱保护步骤来获得中间体13。IBX氧化产生相应酮，然后进行维蒂烯化作用以得到亚甲基。再次进行硼氢化-氧化反应，然后进行甲磺酰化作用和芬克尔斯坦反应，生成单体18。
在碱性条件下将单体9和18合并，产生次膦酸酯连接的二聚体19。进行酸介导的和珀尔曼(Pearlman)催化的脱保护反应，然后进一步进行膦胺(phosphanamine)官能化，生成二聚体22。

Claims (107)

1.一种具有5’末端、3’末端和种子区的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与包含等位基因多态性的基因的区域互补，并且其中RNA包含：
在所述种子区内位置处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，其中所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补；和
位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的错配(MM)位置核苷酸，所述错配位置核苷酸是与所述基因中的核苷酸的错配。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是RNA。
3.如权利要求2所述的RNA，其中所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯(VP)修饰，所述亚基间键具有式：
Figure FDA0003009853060000011
4.如权利要求3所述的RNA，其中VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
5.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸选自由以下组成的组：siRNA、miRNA、shRNA、CRISPR指导物、DNA、反义寡核苷酸(ASO)、缺口体、混合体、miRNA抑制因子、剪接转换寡核苷酸(SSO)、磷二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)和肽核酸(PNA)。
6.如权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是ASO或双链RNA(dsRNA)。
7.如权利要求6所述的dsRNA，其包含：
具有约15-35个核苷酸的第一链，所述第一链与包含等位基因多态性的基因的区域互补；和
具有约15-35个核苷酸的第二链，所述第二链与所述第一链的至少一部分互补，
其中所述第一链包含在5’末端的位置2-6处的SNP位置核苷酸，所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补，并且
其中所述第一链包含位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处的MM位置核苷酸，所述MM位置核苷酸是与所述基因中的核苷酸的错配。
8.如权利要求7所述的dsRNA，其中所述SNP位置核苷酸在5’末端的位置2处。
9.如权利要求7所述的dsRNA，其中所述SNP位置核苷酸在5’末端的位置4处。
10.如权利要求7所述的dsRNA，其中所述SNP位置核苷酸在所述第一链的5’末端的位置6处。
11.如权利要求7-10中任一项所述的dsRNA，其中所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2个核苷酸内或3个核苷酸内。
12.如权利要求7-10中任一项所述的dsRNA，其中所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的4个核苷酸内。
13.如权利要求7-10中任一项所述的dsRNA，其中所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的6个核苷酸内。
14.如权利要求7-13中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA是平端的。
15.如权利要求7-13中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一个单链核苷酸突出端。
16.如权利要求7-15中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含天然存在的核苷酸。
17.如权利要求7-16中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一个修饰的核苷酸。
18.如权利要求7-15中任一项所述的dsRNA，其中每个核苷酸都是经修饰的。
19.如权利要求17所述的dsRNA，其中所述至少一个修饰的核苷酸选自由以下组成的组：2′-O-甲基修饰的核苷酸、包含5′-硫代磷酸酯基团的核苷酸、与胆甾烯基衍生物连接的末端核苷酸、和与十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。
20.如权利要求17所述的dsRNA，其中所述修饰的核苷酸选自由以下组成的组：2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、脱碱基核苷酸、2′-氨基-修饰的核苷酸、2′-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、以及包含非天然碱基的核苷酸。
21.如权利要求7-20中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一个2′-O-甲基修饰的核苷酸和5′-硫代磷酸酯基团。
22.如权利要求7-21中任一项所述的dsRNA，其中所述第一链包含至少三个2′-O-甲基修饰的核苷酸。
23.如权利要求22所述的dsRNA，其中所述第一链包含在所述SNP位置核苷酸任一侧的2′-O-甲基修饰的核苷酸。
24.如权利要求7-23中任一项所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含疏水部分。
25.如权利要求7-24中任一项所述的dsRNA，其中所述包含等位基因多态性的基因的区域包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO：1-10。
26.如权利要求7-25中任一项所述的dsRNA，其中所述第一链包含UUCUGUAGCAUCAGCUUCUC。
27.一种双链RNA(dsRNA)，其包含：
具有约15-35个核苷酸的第一链，所述第一链与包含等位基因多态性的基因的区域互补；和
具有约15-35个核苷酸的第二链，所述第二链与所述第一链的至少一部分互补，
其中所述第一链包含在5’末端的位置4处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，所述单核苷酸多态性位置核苷酸与所述等位基因多态性互补，并且
其中所述第一链包含位于在5’末端的位置7处的错配(MM)位置核苷酸，所述错配位置核苷酸是与所述基因中的核苷酸的错配。
28.如权利要求27所述的dsRNA，其中所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure FDA0003009853060000051
29.如权利要求28所述的二支链寡核苷酸化合物，其中VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
30.如权利要求27所述的dsRNA，其中所述第一链包含在所述SNP位置核苷酸任一侧的2′-O-甲基修饰的核苷酸。
31.如权利要求30所述的dsRNA，其中所述第一链包含至少三个2′-O-甲基修饰的核苷酸。
32.如权利要求31所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含5′-硫代磷酸酯基团。
33.如权利要求27所述的dsRNA，其中所述包含等位基因多态性的基因是亨廷顿蛋白(htt)基因。
34.如权利要求27所述的dsRNA，其中所述包含等位基因多态性的基因的区域包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO：1-10。
35.如权利要求27所述的dsRNA，其中所述第一链包含UUCUGUAGCAUCAGCUUCUC。
36.一种双链RNA(dsRNA)，其包含：
具有约15-35个核苷酸的第一链，所述第一链与包含等位基因多态性的基因的区域互补；和
具有约15-35个核苷酸的第二链，所述第二链与所述第一链的至少一部分互补，
其中所述第一链包含在5’末端的位置6处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，所述单核苷酸多态性位置核苷酸与所述等位基因多态性互补，并且
其中所述第一链包含位于在5’末端的位置11处的错配(MM)位置核苷酸，所述错配位置核苷酸是与所述基因中的核苷酸的错配。
37.如权利要求36所述的dsRNA，其中所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure FDA0003009853060000071
38.如权利要求37所述的二支链寡核苷酸化合物，其中VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
39.如权利要求36所述的dsRNA，其中所述第一链包含在所述SNP位置核苷酸任一侧的2′-O-甲基修饰的核苷酸。
40.如权利要求39所述的dsRNA，其中所述第一链包含至少三个2′-O-甲基修饰的核苷酸。
41.如权利要求36所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含5′-硫代磷酸酯基团。
42.如权利要求36所述的dsRNA，其中所述包含等位基因多态性的基因是亨廷顿蛋白(htt)基因。
43.如权利要求36所述的dsRNA，其中所述包含等位基因多态性的基因的区域包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO：1-10。
44.如权利要求36所述的dsRNA，其中所述第一链包含UUCUGUAGCAUCAGCUUCUC。
45.一种药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的RNA和药学上可接受的载体。
46.一种抑制基因表达的方法，所述基因包含细胞中的等位基因多态性，所述方法包括使所述细胞与如前述权利要求中任一项所述的RNA接触。
47.一种在有需要的受试者中治疗特征在于或归因于包含等位基因多态性的基因的疾病或障碍的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的RNA，所述RNA具有5’末端、3’末端和种子区，并且与包含等位基因多态性的基因的区域互补，其中所述RNA包含：
在所述种子区中位置处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，所述单核苷酸多态性位置核苷酸与所述等位基因多态性互补；和
位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的错配(MM)位置核苷酸，所述错配位置核苷酸是与所述基因中的核苷酸的错配。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure FDA0003009853060000081
49.如权利要求48所述的二支链寡核苷酸化合物，其中VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
50.如权利要求47所述的方法，其中所述RNA是ASO或dsRNA。
51.如权利要求47所述的方法，其中所述dsRNA包含：
具有约15-35个核苷酸的第一链，所述第一链与包含等位基因多态性的基因的区域互补；和
具有约15-35个核苷酸的第二链，所述第二链与所述第一链的至少一部分互补，
其中所述第一链包含在5’末端的位置2-6处的SNP位置核苷酸，所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补，并且
其中所述第一链包含位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处的MM位置核苷酸，所述MM位置核苷酸是与所述基因中的核苷酸的错配。
52.如权利要求51所述的方法，其中将所述dsRNA施用于所述受试者的脑中。
53.如权利要求51所述的方法，其中通过纹状体内输注施用所述dsRNA。
54.如权利要求52所述的方法，其中纹状体中基因的表达得到了降低。
55.如权利要求52所述的方法，其中皮质中基因的表达得到了降低。
56.如权利要求47-55中任一项所述的方法，其中所述包含等位基因多态性的基因是亨廷顿蛋白(htt)基因。
57.如权利要求47-56中任一项所述的方法，其中所述疾病是亨廷顿病。
58.如权利要求1所述的RNA，其中所述SNP位置核苷酸位于所述RNA的5’末端的位置2、4或6处，并且所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。
59.一种包含两个RNA的二支链寡核苷酸化合物，其中所述RNA通过一个或多个部分彼此连接，所述部分选自接头、间隔子和分支点，其中每个RNA具有5’末端、3’末端和种子区，其中每个RNA与包含等位基因多态性的基因的区域互补，并且其中每个RNA包含：
在所述种子区内位置处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补；和
位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的错配(MM)位置核苷酸，所述错配位置核苷酸是与所述基因中的核苷酸的错配。
60.如权利要求59所述的二支链寡核苷酸化合物，其中所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure FDA0003009853060000101
61.如权利要求60所述的二支链寡核苷酸化合物，其中VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
62.如权利要求59所述的二支链寡核苷酸化合物，其中所述二支链寡核苷酸化合物具有hsi-RNA结构。
63.如权利要求59所述的二支链寡核苷酸化合物，其中所述SNP位置核苷酸与htt SNP的等位基因多态性互补，所述htt SNP选自由以下组成的组：rs363125、rs362273、rs362307、rs362336、rs362331、rs362272、rs362306、rs362268、rs362267和rs363099。
64.如权利要求1所述的RNA，其中所述SNP位置核苷酸与htt SNP的等位基因多态性互补，所述htt SNP选自由以下组成的组：rs363125、rs362273、rs362307、rs362336、rs362331、rs362272、rs362306、rs362268、rs362267和rs363099。
65.如权利要求1所述的RNA，其进一步包含选自由以下组成的组的5’稳定部分：磷酸酯、乙烯基膦酸酯、C5-甲基(R或S或外消旋)、乙烯基上的C5-甲基和还原的乙烯基。
66.如权利要求1所述的RNA，其进一步包含选自由以下组成的组的缀合物部分：烷基链、维生素、肽、鞘糖脂、多不饱和脂肪酸、开环类固醇、类固醇激素和类固醇脂质。
67.一种具有5’末端、3’末端和种子区并且与包含等位基因多态性的基因的区域互补的核酸，其中所述核酸包含：
在所述种子区内位置处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，其中所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补；
错配(MM)位置，所述错配位置是与所述基因中的核苷酸的错配；和
在所述SNP位置核苷酸任一侧的至少一个修饰的核苷酸(X)，其中每个X位于所述SNP位置核苷酸的四个、三个或两个核苷酸内。
68.如权利要求67所述的核酸，其中所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure FDA0003009853060000121
69.如权利要求68所述的二支链寡核苷酸化合物，其中VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
70.一种具有5’末端、3’末端和种子区并且与包含等位基因多态性的基因的区域互补的核酸，其中所述核酸包含：
在所述种子区内位置处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，其中所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补；
错配(MM)位置，所述错配位置是与所述基因中的核苷酸的错配；和
在所述SNP位置核苷酸任一侧的至少一个修饰的核苷酸(X)，其中每个X位于所述SNP位置核苷酸的四个、三个或两个核苷酸内。
71.如权利要求70所述的核酸，其中所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure FDA0003009853060000131
72.如权利要求71所述的二支链寡核苷酸化合物，其中VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
73.一种具有5’末端、3’末端和种子区并且与包含等位基因多态性的基因的区域互补的核酸，其中所述核酸包含：
在所述种子区内位置处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，其中所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补；
错配(MM)位置，所述错配位置是与所述基因中的核苷酸的错配；和
在所述MM位置核苷酸任一侧的至少一个修饰的核苷酸(Y)，其中每个Y位于所述MM位置核苷酸的四个、三个或两个核苷酸内。
74.如权利要求73所述的核酸，其中所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure FDA0003009853060000132
75.如权利要求74所述的二支链寡核苷酸化合物，其中VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
76.如权利要求70所述的核酸，其中X包含选自由以下组成的组的糖修饰：2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-氟(2’-F)、2’-核糖核酸、2’-脱氧核糖核酸、2′-F-4′-硫代阿拉伯糖(2’-F-ANA)、2-O-(2-甲氧基乙基)(2’-MOE)、4’-S-RNA、锁核酸(LNA)、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、2-氰乙基-RNA(CNet-RNA)、三环-DNA、环己烯基核酸(CeNA)、阿拉伯糖核酸(ANA)和己糖醇核酸(HNA)。
77.如权利要求73所述的核酸，其中Y包含选自由以下组成的组的糖修饰：2’-OMe、2’-F、2’-核糖核酸、2’-脱氧核糖核酸、2’-F-ANA、2’-MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA和HNA。
78.如权利要求70所述的核酸，其中X位于紧靠所述SNP位置核苷酸的5’处或紧靠所述SNP位置核苷酸的3’处。
79.如权利要求70所述的核酸，其中X位于紧靠所述SNP位置核苷酸的5’处和紧靠所述SNP位置核苷酸的3’处。
80.如权利要求73所述的核酸，其中Y位于紧靠所述MM位置核苷酸的5’处或紧靠所述MM位置核苷酸的3’处。
81.如权利要求73所述的核酸，其中Y位于紧靠所述MM位置核苷酸的5’处和紧靠所述MM位置核苷酸的3’处。
82.如权利要求70或73所述的核酸，其中所述SNP位置核苷酸存在于5’末端的从位置2至位置6处。
83.如权利要求70或73所述的核酸，其中所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处。
84.如权利要求70或73所述的核酸，其中所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。
85.一种具有5’末端、3’末端和种子区并且与包含等位基因多态性的基因的区域互补的核酸，其中所述核酸包含：
在所述种子区内位置处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，其中所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补；
错配(MM)位置，所述错配位置是与所述基因中的核苷酸的错配；和
在所述SNP位置核苷酸任一侧的至少一个修饰的核苷酸(X)，其中每个X位于所述SNP位置核苷酸的四个、三个或两个核苷酸内；和
在所述MM位置核苷酸任一侧的至少一个修饰的核苷酸(Y)，其中每个Y位于所述MM位置核苷酸的四个、三个或两个核苷酸内。
86.如权利要求85所述的核酸，其中所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure FDA0003009853060000151
87.如权利要求86所述的二支链寡核苷酸化合物，其中VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
88.如权利要求85所述的核酸，其中X包含选自由以下组成的组的糖修饰：2’-OMe、2’-F、2’-核糖核酸、2’-脱氧核糖核酸、2’-F-ANA、2’-MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA和HNA。
89.如权利要求85所述的核酸，其中Y包含选自由以下组成的组的糖修饰：2’-OMe、2’-F、2’-核糖核酸、2’-脱氧核糖核酸、2’-F-ANA、2’-MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA和HNA。
90.如权利要求85所述的核酸，其中X位于紧靠所述SNP位置核苷酸的5’处或紧靠所述SNP位置核苷酸的3’处。
91.如权利要求85所述的核酸，其中X位于紧靠所述SNP位置核苷酸的5’处和紧靠所述SNP位置核苷酸的3’处。
92.如权利要求85所述的核酸，其中Y位于紧靠所述MM位置核苷酸的5’处或紧靠所述MM位置核苷酸的3’处。
93.如权利要求85所述的核酸，其中Y位于紧靠所述MM位置核苷酸的5’处和紧靠所述MM位置核苷酸的3’处。
94.如权利要求85所述的核酸，其中所述SNP位置核苷酸存在于5’末端的从位置2至位置6处。
95.如权利要求85所述的核酸，其中所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处。
96.如权利要求85所述的核酸，其中所述MM位置核苷酸位于所述SNP位置核苷酸的2-6个核苷酸处。
97.如权利要求70、73或85所述的核酸，其中X和Y是相同的。
98.如权利要求70、73或85所述的核酸，其中X和Y是不同的。
99.一种包含两个或更多个核酸序列的二支链寡核苷酸化合物，其中所述核酸序列(N)通过一个或多个部分彼此连接，所述部分选自接头(L)、间隔子(S)和任选地分支点(B)，
其中每个核酸序列是双链的，并且包含有义链和反义链，其中所述有义链和所述反义链各自具有5’末端和3’末端，其中所述有义链和所述反义链各自包含一个或多个化学修饰的核苷酸，
其中每条反义链具有种子区，其中每条反义链与包含等位基因多态性的基因的区域互补，并且其中每条反义链包含：
在所述种子区内位置处的单核苷酸多态性(SNP)位置核苷酸，所述SNP位置核苷酸与所述等位基因多态性互补；和
位于所述SNP位置核苷酸的2-11个核苷酸处的错配(MM)位置核苷酸，所述错配位置核苷酸是与所述基因中的核苷酸的错配。
100.如权利要求99所述的二支链寡核苷酸化合物，其中所述RNA进一步包含在亚基间键中的至少一个乙烯基膦酸酯修饰，所述亚基间键具有式：
Figure FDA0003009853060000181
101.如权利要求100所述的二支链寡核苷酸化合物，其中VP基序被插入所述SNP位置核苷酸的旁边或所述MM位置核苷酸的旁边。
102.如权利要求99所述的二支链寡核苷酸化合物，其中所述有义链和所述反义链各自包含＞80％的化学修饰的核苷酸。
103.如权利要求99所述的二支链寡核苷酸化合物，其中在所述有义链和所述反义链的5’末端的位置1和2处的核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。
104.如权利要求99所述的二支链寡核苷酸化合物，其中每条反义链包含至少15个连续的核苷酸，并且其中每条有义链包含至少15个连续的核苷酸并且与所述反义链具有互补性。
105.如权利要求99所述的二支链寡核苷酸化合物，其中所述化合物进一步包含附接至支链寡核苷酸化合物的末端5’位置处的疏水部分。
106.如权利要求99所述的二支链寡核苷酸化合物，其中每个双链核酸序列独立地与所述有义链或所述反义链的3’末端或5’末端处的接头、间隔子或分支点连接。
107.如权利要求99所述的二支链寡核苷酸化合物，其中所述SNP位置核苷酸与htt SNP的等位基因多态性互补，所述htt SNP选自由以下组成的组：rs363125、rs362273、rs362307、rs362336、rs362331、rs362272、rs362306、rs362268、rs362267和rs363099。
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