CN112773887A - 一种用于结肠黏膜修复的温敏凝胶 - Google Patents

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Abstract

本发明属于修复药物制剂领域，具体涉及一种用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其包含以下原料组份：细胞生长因子、ε‑多聚赖氨酸或其盐、温敏材料、第一多酚、第二多酚；所述细胞生长因子与第一多酚形成多酚‑细胞生长因子纳米复合物，所述ε‑多聚赖氨酸或其盐、温敏材料、第二多酚形成温敏凝胶基质，所述多酚‑细胞生长因子纳米复合物包载在温敏凝胶基质中。该温敏凝胶既具备耐稀释性能、黏膜粘附性以及抗菌能力，又能提高细胞生长因子稳定性，灌注给药后能缓慢释放细胞因子，促进溃疡黏膜愈合，从而能高效治疗溃疡性结肠炎。该温敏凝胶制备方法简单、重现性好，容易实现大规模生产。

Description

一种用于结肠黏膜修复的温敏凝胶
技术领域
本发明属于修复药物制剂领域，具体涉及一种用于结肠黏膜修复的温敏凝胶。
背景技术
溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种以黏膜炎症和溃疡形成为主要病理特征的慢性疾病。UC发病机制目前不十分清楚，论为与遗传、环境等综合因素导致的结肠黏膜屏障损伤有关。结肠黏膜在毒性分子或病原微生物等攻击下，上皮细胞异常凋亡，肠上皮通透性增高，肠腔内的抗原异常暴露于固有层黏膜淋巴组织，致使大量的致炎因子释放，引起局部免疫炎性反应。上皮完整性的破坏与肠黏膜紊乱密切相关，包括炎症性肠病和肠上皮癌。目前临床UC治疗仍以口服小分子药物如抗炎免疫抑制和抗生素等缓解炎症反应为主要手段，但不能防止炎症的反复发作，而且多次治疗容易使UC演进为更为顽固的炎症病症。加之严重的药物副作用如肾损伤、免疫抑制引发的感染等，目前小分子药物对UC的治疗临床获益十分有限。
已有报道细胞生长因子包括表皮细胞生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、角质细胞生长因子(KGF)能有效促进肠道黏膜修复，抑制黏膜炎症。其机制与刺激细胞生长因子受体酪氨酸磷酸化，从而促进溃疡性结肠上皮细胞的增殖再生有关。研究表明UC模型小鼠口服给予表达EGF的Escherichia coli(Nissle 1917)可刺激肠上皮细胞增殖和促进肠黏膜屏障修复，进而抑制肠道黏膜炎症发生，有效治疗结溃疡性肠炎，而且不存在致癌风险(PMID:31434808)。但细胞生长因子属蛋白质/多肽类药物，在溃疡性结肠炎治疗方面仍然存在诸多的应用瓶颈如体内外稳定性差、免疫原性强、体内靶向性低以及组织渗透性差等问题。与大部分蛋白/多肽类药物相似，细胞生长因子暴露于生理温度、pH以及血液酶等因素下，存在因脱氨、氧化等引起的化学及物理稳定性问题。研究报道EGF在生理pH条件下分子内易形成二硫键，容易形成二聚体或多聚体，体内应用存在过敏性问题。而且EGF在众多器官组织均存在作用靶点，注射给药难以特异性靶向结肠病灶，存在潜在的脱靶致癌性，限制其在UC治疗应用。
温敏凝胶为结肠内药物递送提供较为理想的递送形式。Sidhartha R等人证实温敏泊洛沙姆水凝胶具有液体灌肠的优点，又具有固体栓剂的较长滞留时间(PMID:25863215)。此外，有研究报道表明Pluronic F127具有黏液渗透性，能促进布地奈德纳米灌肠剂的黏膜分布和组织渗透性，提高其对TNBS诱导小鼠模型的治疗效果(PMID:30236840)。但温敏泊洛沙姆水凝胶体递送蛋白药物用于溃疡性结肠炎治疗，存在不耐稀释，蛋白稳定能力弱以及不具有抗菌能力等缺陷。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种用于结肠黏膜修复的温敏凝胶。
本发明所采取的技术方案如下：一种用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其包含以下原料组份：细胞生长因子、ε-多聚赖氨酸或其盐、温敏材料、第一多酚、第二多酚；
所述细胞生长因子与第一多酚形成多酚-细胞生长因子纳米复合物，所述ε-多聚赖氨酸或其盐、温敏材料、第二多酚形成温敏凝胶基质，所述多酚-细胞生长因子纳米复合物包载在温敏凝胶基质中。
细胞生长因子占原料组分重量的百分比为2×10-6％～20×10-6％之间；ε-多聚赖氨酸或其盐占原料组分重量的百分比为1％～15％之间；温敏材料占原料组分重量的百分比为17％～35％之间；第一多酚与细胞生长因子的质量比为0.01-50:1；第二多酚占原料组分重量的百分比为0.01％～10％。
第一多酚与细胞生长因子的质量比为1:0.1～1:5。
所述细胞生长因子为表皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子中的一种或者多种的混合。
所述ε-多聚赖氨酸或其盐的分子量为1000～6000道尔顿。
所述温敏材料为
Figure BDA0002885947970000031
F127、聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)-聚乙二醇单甲醚中的一种。
所述第一多酚为表儿茶素没食子酸、丹宁酸中的一种或者二者混合物。
所述第二多酚为表儿茶素没食子酸、丹宁酸中的一种或者二者混合物。
多酚-细胞生长因子纳米复合物中的第一多酚和温敏凝胶基质中的第二多酚均为多酚类化合物，可以为同种，也可以为不同种。
其制备过程包括以下步骤：
(1)先细胞生长因子与第一多酚溶于蒸馏水，控制温度在4℃以下，轻轻搅拌反应，形成纳米复合物水分散液，保存备用；
(2)另将ε-多聚赖氨酸、温敏材料以及第二多酚在分散在生理盐水内，放4℃冰箱内搅拌过夜溶解，制备温敏凝胶基质溶液；
(3)将上述将步骤(1)所得纳米复合物分散液与(2)所制备的温敏凝胶基质溶液，在4℃以下的低温条件下，均匀混合，即可制备出温敏凝胶前体。
其制备过程还包括以下步骤：
(4)上述(3)所制备的温敏凝胶前体，放置在30～42℃水浴中孵育，能快速胶凝，形成半固态凝胶。
上述的温敏凝胶临床使用时，既可以溶液状态的凝胶前体，也可以半固体的凝胶状态，经腔道灌注给药。
本发明的有益效果如下：第一多酚与细胞生长因子复合，制备多酚-细胞生长因子纳米复合物，提高细胞生长因子稳定性；以ε-多聚赖氨酸为天然抑菌剂，多酚为增粘剂，联合温敏材料，制备抑菌活性的温敏凝胶基质；将多酚-细胞生长因子纳米复合物包载在抑菌活性的温敏凝胶基质内，制备出可供腔道灌注给药的温敏凝胶。该温敏凝胶既具备耐稀释性能、黏膜粘附性以及抗菌能力，又能提高细胞生长因子稳定性，灌注给药后能缓慢释放细胞因子，促进溃疡黏膜愈合，从而能高效治疗溃疡性结肠炎。该温敏凝胶制备方法简单、重现性好，容易实现大规模生产。
本发明相比同类温敏凝胶的产品存在如下优势：1)具有耐稀释性，稀释后能较长时间保持凝胶状态，不溶解流失；2)具有黏膜粘附性，能效仿贻贝粘附方式粘附于溃疡性结肠创面；3)细胞生长因子与多酚形成纳米复合物，提高细胞因子稳定性；4)含有ε-多聚赖氨酸组分，具有天然抗菌性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。
图1为实施例4制备的水凝胶用Alexa Fluro@647标记的活体成像图；
图2为实施例4制备的水凝胶灌肠4h后，Alexa Fluro@647标记的EGF在结肠部位的分布情况；
图3为实施例4制备的水凝胶灌肠4h后，结肠组织的EGF免疫荧光染色；
图4为实施例4制备的水凝胶给药4h后，结肠组织中EGF定量统计(数据以平均值±SEM；例4组与其他组相比，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；n＝3)；
图5为实施例4和实施例2制备的水凝胶灌肠对TNBS诱导的结肠炎大鼠的治疗方案；
图6为不同灌肠方法的存活率；
图7为不同灌肠方法的体重变化；
图8为不同灌肠方法大鼠的DAI评分；
图9为不同灌肠方法大鼠的结肠图像；
图10为不同灌肠方法大鼠的结肠长度统计；
图11为不同灌肠方法的大鼠结肠镜图像；
图12为基于结肠镜图像的结肠炎症评分(平均数±SEM；与TNBS组相比，**P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；与P-DA2-EGF-5组比较，P<0.01，*P<0.05；n＝5)；
图13为基于结肠镜图像的结肠溃疡评分(平均数±SEM；与TNBS组相比，**P<0.001，**P<0.01，*P<0.05；与P-DA2-EGF-5组比较，P<0.01，*P<0.05；n＝5)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例
一、细胞因子-多酚纳米复合物制备
多酚(Phol)与细胞生长因子(GF)按照表1所列投料，溶于蒸馏水，控制温度在0～4℃℃，轻轻搅拌反应0.5h，即可制备出细胞因子-多酚纳米复合物溶液。所制备的纳米复合物经蒸馏水适当稀释后，经超滤法测定复合效率，结果如表1。由表1结果可见，纳米复合物复合效率与处方中GF/Phol投料比有关，当细胞生长因子与多酚质量比为1:0.1～1:5时，复合效率相对较高，可达到75％以上。
表1细胞生因子-多酚纳米复合物配方及复合效率
Figure BDA0002885947970000051
Figure BDA0002885947970000061
注：EGCG：表儿茶素没食子酸；TA：丹宁酸；GF：细胞生长因子；TA+EGCG：TA与EGCG以1:1混合二、温敏凝胶的制备
按照表2投料，先称取温敏材料，分散在冷的生理盐水，0～4℃冰箱放置过夜溶解形成溶液，后分别称取ε-多聚赖氨酸、多酚以及保湿剂在0～4℃条件下，搅拌溶解在上述温敏材料溶液中，制备温敏凝胶基质溶液。将所制备的细胞因子-多酚纳米复合物分散在上述制备的温敏凝胶基质溶液，在0～4℃条件下，搅拌均匀，即可制备出可供临床使用的温敏凝胶前体。温敏凝胶前体继续放置在30～42℃水浴。
表2温敏凝胶配方
Figure BDA0002885947970000071
注：-表示不存在该组分；PF127代表
Figure BDA0002885947970000073
F127；P代表聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)-聚乙二醇单甲醚
表3温敏凝胶性能评价
Figure BDA0002885947970000072
Figure BDA0002885947970000081
试验例1：温敏凝胶耐溶蚀评价
量取2mL温敏凝胶前体于玻璃瓶中，37℃恒温水浴5min，待其完全胶凝，在水凝胶表面加入等体积的pH7.4 PBS(10mM)。将小瓶置于37℃恒温摇床中，速度设定为8rpm，振摇12h后，对剩余的水凝胶进行拍照并检测其体积。水凝胶溶蚀百分数按如下公式定量计算。溶蚀百分数(％)＝[1-(Vt/V0)]×100，其中Vt为t时刻水凝胶体积，V0为水凝胶初始体积。
各实施例和对照例所制备的凝胶溶蚀百分数结果如表3，凝胶溶蚀与处方中ε-多聚赖氨酸、多酚以及温敏材料用量有关。固定处方中多酚占凝胶原料组分重量的1％，当处方中ε-多聚赖氨酸占凝胶原料组分重量的百分比为1％～15％时，凝胶溶蚀随ε-多聚赖氨酸用量增加而降低，12h内溶蚀百分数小于65％；固定处方中ε-多聚赖氨酸占凝胶原料组分重量的3％，当处方中多酚占凝胶原料组分重量的0.01％～10％时，凝胶溶蚀随多酚用量增加而降低，12h内溶蚀百分数小于55％；在使用相同用量的ε-多聚赖氨酸和多酚情况下，随着处方中温敏材料用量增加，凝胶溶蚀百分数降低。
试验例2细胞生长因子稳定性
量取2mL的温敏水凝胶(含有200μg细胞生长因子)置于无菌Ep管(德国Eppendorf)中，37℃恒温箱孵育4h后，取50μL水凝胶，PBS稀释后进行ELISA检测。温敏水凝胶中细胞生长因子降解百分数按照如下公式计算：降解百分数(％)＝[1-Wt/W0]×100，其中Wt为t时刻水凝胶中细胞因子的量，W0为水凝胶中细胞因子的总量。
各实施例和对照例所制备的凝胶细胞因子降解结果如表3，细胞生长因子降解与处方中ε-多聚赖氨酸以及多酚用量有关，与温敏材料用量没有明显相关。当处方中ε-多聚赖氨酸占凝胶原料组分重量的百分比为1％～15％时，凝胶中细胞生长因子降解百分数随ε-多聚赖氨酸用量增加而降低，4h内细胞生长因子降解百分数可减小至30％；当处方中多酚占凝胶原料组分重量的0.01％～10％时，凝胶中细胞生长因子降解百分数随多酚用量增加而降低，4h内细胞生长因子降解百分数可减小至25％。
试验例3粘附性强度测定
采用万能试验评价凝胶的生物组织黏附性能。猪皮作为组织模型，去除脂肪层的新鲜猪皮(2cm宽，2.5cm长)，在pH 7.4PBS中冲洗30分钟后进行试验。将两片新鲜的猪皮用超强力胶分别粘接在两片载玻片上。取200μL的温敏水凝胶均匀涂抹在其中一张猪皮片表面，立即覆盖另一张猪皮(结合面积:2×2cm2)。接着将覆盖完整的破片置于200克的砝码下下，37℃，15分钟后，进行抗拉剪切强度测试。在整个测试过程中，温度保持在37℃，万能测试机(UTM,EZ-SX STD，岛津，日本)以1mm/min的旋转速度和20N的测压元件进行测试，测定凝胶剥离所需的最大粘附力。
各实施例和对照例所制备的凝胶粘附力结果如表3，粘附力与处方中ε-多聚赖氨酸、多酚以及温敏材料用量有关。当处方中ε-多聚赖氨酸占凝胶原料组分重量的百分比为1％～15％时，凝胶粘附力随ε-多聚赖氨酸用量增加而增强，最大粘附力可达3N；当处方中多酚占凝胶原料组分重量的0.01％～10％时，凝胶粘附力随多酚用量增加而降低，最大粘附力可达3.5N。在使用相同用量的ε-多聚赖氨酸和多酚情况下，随着处方中温敏材料用量增加，凝胶粘附力增大。
试验例4抑菌实验
取大肠杆菌K88、链球菌菌株接种到LB培养基上，37℃培养24h，用接种环挑单菌到3ml LB液体培养基中，37℃、200r/min震荡培养制备菌悬液。取100μL菌悬液均匀涂布于LB/SS平板，放置约30min后，直径为7mm的温敏凝胶放在平板上，同时抗菌药物浸泡后的药敏试纸放在平板上作为阳性对照，蒸馏水浸泡后的试纸放为阴性对照，37℃培养24h，用游标卡尺量出各抑菌圈的直径，每种样品重复3次取其平均值，观察抑菌圈的大小。本实验中使用0.2g/L林可霉素和0.5g/L的哌拉西林作为阳性对照。
各实施例和对照例所制备的凝胶抑菌结果如表3，抑菌率与处方中ε-多聚赖氨酸用量有关。当处方中ε-多聚赖氨酸占凝胶原料组分重量的百分比为1％～15％时，凝胶抑菌率随ε-多聚赖氨酸用量增加而增强，可达到与阳性抗菌药物(林可霉素或哌拉西林)相当抑菌效果。
试验例5大鼠模型体内滞留实验
为了评估温敏水凝胶在结肠中的滞留情况，将表2中例4制备的温敏水凝胶(0.6mL,1μg EGF@647)直肠灌注到TNBS诱导的结肠炎大鼠的结肠部位(距肛门6cm处)，倒置30s。接着，分别在0h、2h、4h、8h不同时间点，利用IVIS系统(IVISVR Lumina II)对大鼠腹部进行实时成像(激发波数为640nm；发射波数为672nm)。在温敏水凝胶灌注后8小时，取大鼠结肠进行体外成像。同时，通过共聚焦激光扫描显微镜间接观察结肠组织中
Figure BDA0002885947970000111
的荧光分布。
Figure BDA0002885947970000113
(P-EGF)和
Figure BDA0002885947970000112
溶液作为对照，在结肠腔的滞留以及结肠组织的渗透情况进行对比研究。EGF在结肠黏膜的渗透研究：先将离体结肠进行冷冻包埋，切成5μm薄片进行免疫荧光染色。结肠冰冻切片用兔单克隆EGF抗体(ab184265,1:200,Abcam)进行一抗孵育。PBS洗涤后，用驴抗兔IgG Alexa
Figure BDA0002885947970000114
标记的二抗(1:1000,ab150077,Abcam)进行孵育后，用激光共聚焦扫描显微镜(Leica TCS SP8)观察EGF的结肠组织荧光分布。
结果如图1，灌肠给药4h后，S-EGF组只有弱荧光主要集中在盲肠和发炎的结肠中。给药8h后，S-EGF组的EGF迅速从结肠腔内清除，未见荧光。而实施例4制备的温敏水凝胶在8h时的荧光强度明显强于P-EGF水凝胶，而实施例4温敏水凝胶中的EGF特异性分布于整个炎症结肠，几乎不分布于盲肠和直肠，而经P-EGF水凝胶处理的大鼠盲肠有大量EGF分布。实施例4温敏水凝胶的特异性分布是由于温敏水凝胶具有较强的黏膜黏附性，限制了其在直肠给药后沿结肠腔的扩散。给药2h后，黏膜上皮中已观察到S-EGF的黏膜吸收(图2)。但S-EGF在黏膜上皮细胞中的荧光强度很弱，且随着时间的推移逐渐减弱，说明S-EGF对结肠黏膜层的吸收和通透性有限。给药2h后，P-EGF主要存在于结肠腔(由三角形箭头所示)中，而在黏膜上皮中几乎没有分布。相比之下，给药2h后，实施例4温敏水凝胶在结肠中的分布更加均匀。在4h时，该组在基底膜周围检测到EGF的大量荧光。此外，EGF免疫荧光染色和ELISA检测也表明，实施例4温敏水凝胶中EGF在结肠的渗透明显高于S-EGF或P-EGF组(图3和图4)。
试验例6药效学
将TNBS诱导的溃疡性结肠炎大鼠分为5组(每组6只):(1)TNBS组(TNBS)疾病对照组；(2)P-EGF组(P-EGF):0.6ml P-EGF水凝胶灌肠给药，其中EGF给药剂量为5μg/kg；(3)例4组:0.6ml实施例4水凝胶灌肠，EGF剂量为5μg/kg；(4)例2组:0.6ml实施例2水凝胶灌肠，EGF剂量为5μg/kg；(5)地塞米松溶液组(S-DXM):5mg/kg剂量腹腔注射地塞米松溶液。其中，灌肠给药治疗组，每隔一天直肠给药，每组每次的凝胶量为0.6mL。健康大鼠(正常组)直肠灌肠pH7.4 PBS作为对照组。在治疗过程中，监测各组大鼠的存活率、体重和疾病活动指数(DAI)。同时采用高分辨率微型内窥镜(中国，ShenDa)对各组离肛门2-6cm处大鼠结肠进行成像。使用人粪便隐血试验联苯胺试剂盒(上海Yeasen)，分析每日粪便和直肠出血情况。DAI评分按以下标准计算:0＝正常粪便，1＝软性粪便，2＝未成形粪便，3＝稀便；0＝无出血，1＝隐血，2＝粪便带血，3＝血便。在21天后，处死大鼠，收集结肠，并测量结肠长度。结肠保存在-80℃以作进一步的组织学分析。
按照图5所示的给药方案进行评价，结果如附图6-13，未经治疗的TNBS组出现高死亡率，在21天时只有25％的大鼠存活。温敏水凝胶(包括实施例4和实施例2水凝胶)与P-EGF水凝胶或S-DXM治疗相比，能显著提高结肠炎大鼠的存活率。此外，与TNBS诱导的结肠炎大鼠或DXM治疗的结肠炎大鼠相比，温敏水凝胶灌肠可显著降低大鼠的体重和DAI评分(图7和图8)。例4组的疾病症状明显减轻(P<0.05)。另外，实施例4水凝胶对结肠炎大鼠的结肠有较好的治疗作用(图9和图10)。离体结肠观察显示，TNBS诱导的结肠炎大鼠结肠明显缩短，温敏水凝胶灌肠可使结肠长度恢复。其中，例4组恢复最快。此外，TNBS可诱导明显的结肠炎，通过使用小型动物内窥镜观察结肠炎大鼠的结肠的血管形态、溃疡大小和肠腔狭窄情况，并进行临床评分。值得注意的是，根据上述评分，温敏水凝胶或P-EGF水凝胶治疗的大鼠的结肠均有显著改善，而S-DXM没有明显的效果(图11-13)。温敏水凝胶由于其在炎症结肠中的滞留时间较长，因此也显示出比P-EGF水凝胶更好的治疗效果。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.一种用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其特征在于其包含以下原料组份：细胞生长因子、ε-多聚赖氨酸或其盐、温敏材料、第一多酚、第二多酚；
所述细胞生长因子与第一多酚形成多酚-细胞生长因子纳米复合物，所述ε-多聚赖氨酸或其盐、温敏材料、第二多酚形成温敏凝胶基质，所述多酚-细胞生长因子纳米复合物包载在温敏凝胶基质中。
2.根据权利要求1所述的用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其特征在于：细胞生长因子占原料组分重量的百分比为2×10-6％～20×10-6％之间；ε-多聚赖氨酸或其盐占原料组分重量的百分比为1％～15％之间；温敏材料占原料组分重量的百分比为17％～35％之间；第一多酚与细胞生长因子的质量比为0.01-50:1；第二多酚占原料组分重量的百分比为0.01％～10％。
3.根据权利要求2所述的用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其特征在于：第一多酚与细胞生长因子的质量比为1:0.1～1:5。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其特征在于：所述细胞生长因子为表皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、角质细胞生长因子中的一种或者多种的混合。
5.根据权利要求1-3任一项所述的用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其特征在于：所述ε-多聚赖氨酸或其盐的分子量为1000～6000道尔顿。
6.根据权利要求1-3任一项所述的用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其特征在于：所述温敏材料为
Figure FDA0002885947960000011
F127、聚乙二醇单甲醚-聚-(乳酸-羟基乙酸)-聚乙二醇单甲醚中的一种。
7.根据权利要求1-3任一项所述的用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其特征在于：所述第一多酚为表儿茶素没食子酸、丹宁酸中的一种或者二者混合物。
8.根据权利要求1-3任一项所述的用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其特征在于：所述第二多酚为表儿茶素没食子酸、丹宁酸中的一种或者二者混合物。
9.根据权利要求1-3任一项所述的用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其特征在于其制备过程包括以下步骤：
(1)先细胞生长因子与第一多酚溶于蒸馏水，控制温度在4℃以下，轻轻搅拌反应，形成纳米复合物水分散液，保存备用；
(2)另将ε-多聚赖氨酸、温敏材料以及第二多酚在分散在生理盐水内，放4℃冰箱内搅拌过夜溶解，制备温敏凝胶基质溶液；
(3)将上述将步骤(1)所得纳米复合物分散液与(2)所制备的温敏凝胶基质溶液，在4℃以下的低温条件下，均匀混合，即可制备出温敏凝胶前体。
10.根据权利要求9所述的用于结肠黏膜修复的温敏凝胶，其特征在于其制备过程包括以下步骤：
(4)上述(3)所制备的温敏凝胶前体，放置在30～42℃水浴中孵育，能快速胶凝，形成半固态凝胶。
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