CN112748200A - 一种用于从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的近红外质量监控方法 - Google Patents

一种用于从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的近红外质量监控方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的近红外质量监控方法，涉及质量监控技术领域。本发明提供的近红外质量监控方法可以快速检测从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺环节中孕马尿洗脱液的质量，比起常规取样后HPLC检测，时间上更省时，且无污染，节约了大量的人力物力。从另一个角度讲，针对从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的质量监控，一方面，可以对柱层析洗脱的起点和终点进行判断，另一方面，可以对柱层析过程进行主要质控指标成分的监控。本发明采用基于L1‑PCA的马氏距离法剔除异常光谱值，能够显著提高检测结果的准确性。

Description

一种用于从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的近 红外质量监控方法
技术领域
本发明涉及质量监控技术领域，具体涉及一种用于从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的近红外质量监控方法。
背景技术
众所周知，结合雌激素是治疗更年期综合症的有效药物，尤其是天然的结合雌激素混合物具有确切的功效和可靠的安全性，在临床上不仅可以用于治疗和预防女性生理或人工绝经期后出现的更年期综合症，而且能够预防和治疗骨质疏松症，得到人们长期的应用和认可。
早期报道的结合雌激素混合物提取方法的专利有美国专利：US2429398、US2519516、US2696265、US2711988、US2834712等，其多为采用有机溶剂萃取的方法。上世纪60年代开始出现采用活性炭、离子交换树脂、反向硅胶等方法从孕马尿中提取结合雌激素混合物的方法。目前的提取方法主要是利用结合雌激素为甾体结构物质的疏水性来分离制备；其中，国内外陆续有多个结合雌激素分离制备相关的发明专利被公开，包括反相硅胶、含有各种功能团的大孔树脂、苯乙烯-二乙烯聚合物非极性树脂、聚丙烯酸酯树脂、含季铵官能团的强碱性阴离子交换树脂等吸附树脂等。
采用大孔吸附树脂富集、提取是从孕马尿中提取结合雌激素的关键工艺步骤，常规的工艺监测方法是取样后，回到实验室采用HPLC检测雌酮硫酸钠和马烯雌酮硫酸钠等的含量，通常需要几小时甚至1天后才能获得结果，滞后于柱层析过程，无法实现柱层析工艺的过程控制。
在近红外光谱分析领域，异常光谱的剔除方法常采用马氏距离法，但马氏距离法要求总样本数要大于样本的维数，处理繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的近红外质量监控方法，本发明提供的方法能够快速检测从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺中孕马尿洗脱液的质量，相比于常规取样后再进行液相色谱检测，更加省时，且无污染，节约了大量人力物力。本发明采用基于L1-PCA的马氏距离法剔除异常光谱值，能够显著提高检测结果的准确性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的近红外质量监控方法，包括以下步骤：
采集孕马尿原液柱层析得到的洗脱液，作为待测样品；
将所述待测样品进行近红外光谱扫描，得到原始光谱数据，采用基于L1-PCA的马氏距离法剔除所述原始光谱数据中的异常光谱值，将剔除异常光谱值后的光谱数据导入校正模型，得到所述待测样品中结合雌激素的含量；
所述校正模型为真实值和测定值之间的线性方程，所述测定值为剔除异常光谱值后的近红外光谱数据；
所述结合雌激素包括17α-二氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠中的一种或多种。
优选地，所述校正模型的建立方法包括以下步骤：
(1)将孕马尿原液进行柱层析，得到孕马尿洗脱液样本；
(2)将所述孕马尿洗脱液样本进行液相色谱检测，得到孕马尿洗脱液样本中结合雌激素的真实含量值；
(3)将步骤(1)所述的孕马尿洗脱液样本进行近红外光谱扫描，得到原始样本光谱数据，采用基于L1-PCA的马氏距离法剔除异常样本光谱值，采集孕马尿洗脱液样本的光谱数据；
(4)对步骤(3)采集的光谱数据进行预处理，然后对所述预处理后的光谱数据进行波段选择，得到特征波段；采用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿洗脱液样本中对应的结合雌激素真实含量值做回归拟合，建立校正模型；
所述步骤(2)和步骤(3)没有时间顺序的限制。
优选地，不同结合雌激素的校正模型为：
17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9173x+0.0128；
马烯雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9079x+0.0258；
雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9151x+0.0396；
马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9148x+0.0636；
上述校正模型中，x代表真实值，y代表预测值。
优选地，当所述待测样品中结合雌激素的总含量大于0.001mg/mL时，判定为孕马尿柱层析洗脱的起点；
当所述待测样品中结合雌激素的总含量小于0.001mg/mL时，判定为孕马尿柱层析洗脱的终点。
优选地，所述基于L1-PCA的马氏距离法剔除异常光谱值包括：
将所述原始光谱数据构造光谱矩阵；
按照式I所示计算式，采用L1-PCA算法求解所述光谱矩阵，得到光谱主成分；
按照式II所示计算式将所述主成分构造协方差矩阵；
将所述方差矩阵按照式III所示计算式计算得到马氏距离；
设置阈值和剔除异常光谱值；
Figure BDA0002860216170000021
式I中，X'为n×m的光谱样本矩阵，n为样本数，m为每条光谱所采集的数据点数；U为投影矩阵；V为系数矩阵；L1为矩阵的1范数；
S＝T'T/n，式II；
式II中，T'为T的转置，n为样本数，T的计算方法为：获得光谱数据的信号子空间P后，然后P根据计算均值光谱向量μ，对于P矩阵的每个样本减去均值向量μ，得到T；
Figure BDA0002860216170000031
式III中，P为光谱数据的信号子空间；μ为均值光谱向量；S为由T构造的样本信号子空间协方差矩阵；
所述阈值为2～3。
优选地，步骤(2)所述液相色谱检测的参数包括：
色谱柱：C18色谱柱；
色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm，100A；
流动相：包括A相和B相，其中A相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/L，pH值为3.5；所述A相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；B相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/L，pH值为3.5；所述B相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；
流动相洗脱程序为：0～18min，A相体积分数由70％降低为67％；18～23min，A相体积分数由67％降低为20％；23～28min，A相体积分数由20％升高为70％；28～35min，A相体积分数稳定在70％；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：205nm；
进样量：1μL。
优选地，所述近红外光谱扫描包括：
采用在线或离线检测，以空气为背景，采用透射测样方式，波长检测范围为10000～4000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1，光程为2mm，每个待测样品重复扫描3～5次，取平均值作为原始光谱数据；
或者，依据光栅扫描分光原理，以卤钨灯为光源；光谱范围1000～1800nm，检测器：InGaAs检测器，分辨率：8cm-1；扫描次数：32次；光程1mm。
优选地，所述步骤(4)中预处理的方法包括：卷积平滑、一阶卷积求导、二阶卷积求导、多元散射校正、标准正态变量变换和归一化法中的一种或几种相结合的方法。
优选地，所述步骤(4)中波段选择的方法包括全波长、相关系数法选择波长区间、相关成分法选择波长区间、迭代优化波长选择方法1或迭代优化波长选择方法2。
本发明提供了一种用于从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的近红外质量监控方法，本发明建立校正模型，该校正模型为真实值和测定值之间的线性方程，所述测定值为剔除异常光谱值后的近红外光谱数据；本发明采用基于L1-PCA的马氏距离法剔除异常光谱值，能够显著提高检测结果的准确性。本发明采用基于L1-PCA的马氏距离法，通过数据降维，消除众多信息共存中相互重叠的信息部分，更方便用于小样本数量的处理，并且抑制了拖尾噪声，提高信号的识别度。另外，当提取的特征数量较少时，基于L1-PCA的马氏距离法更适用于异常光谱的剔除过程。
本发明的方法可以快速检测从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺环节中孕马尿洗脱液的质量，比起常规取样后HPLC检测，时间上更省时，且无污染，节约了大量的人力物力。从另一个角度讲，针对从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的质量监控，一方面，可以对柱层析洗脱的起点和终点进行判断，另一方面，可以对柱层析过程进行主要质控指标成分(17α-二氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠)的监控。
附图说明
图1为液相色谱检测中17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的含量数据图；
图2为液相色谱检测中马烯雌酮硫酸钠的含量数据图；
图3为液相色谱检测中雌酮硫酸钠的含量数据图；
图4为液相色谱检测中马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的含量数据图；
图5为结合雌激素近红外光谱图；
图6为基于L1-PCA的马氏距离法计算异常光谱的结果图；
图7为基于马氏距离法计算异常光谱的结果图；
图8为17α-二氢马烯雌酮硫酸钠建模样本集的含量趋势图；
图9为20181211-2批次样本17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的预测趋势图；
图10为剔除图9中的异常样本后得到的预测趋势图；
图11为马烯雌酮硫酸钠建模样本集的含量趋势图；
图12为20181211-2批次样本马烯雌酮硫酸钠的预测趋势图；
图13为剔除图12中的异常样本后得到的预测趋势图；
图14为雌酮硫酸钠建模样本集的含量趋势图；
图15为20181211-2批次样本雌酮硫酸钠的预测趋势图；
图16为剔除图15中的异常样本后得到的预测趋势图；
图17为马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠建模样本集的含量趋势图；
图18为20181211-2批次样本马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的预测趋势图；
图19为剔除图17中的异常样本后得到的预测趋势图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的近红外质量监控方法，包括以下步骤：
采集孕马尿原液柱层析得到的洗脱液，作为待测样品；
将所述待测样品进行近红外光谱扫描，得到原始光谱数据，采用基于L1-PCA的马氏距离法剔除所述原始光谱数据中的异常光谱值，将剔除异常光谱值后的光谱数据导入校正模型，得到所述待测样品中结合雌激素的含量；
所述校正模型为真实值和测定值之间的线性方程，所述测定值为剔除异常光谱值后的近红外光谱数据；
所述结合雌激素包括17α-二氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠中的一种或多种。
本发明采集孕马尿原液柱层析得到的洗脱液，作为待测样品。在本发明中，所述柱层析的固定相优选为大孔树脂，流动相优选为乙醇。本发明对所述柱层析的具体工艺参数没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的工艺即可。
得到待测样品后，本发明将所述待测样品进行近红外光谱扫描，得到原始光谱数据，采用基于L1-PCA的马氏距离法剔除所述原始光谱数据中的异常光谱值，将剔除异常光谱值后的光谱数据导入校正模型，得到所述待测样品中结合雌激素的含量；所述校正模型为真实值和测定值之间的线性方程，所述测定值为剔除异常光谱值后的近红外光谱数据；所述结合雌激素包括17α-二氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠中的一种或多种。
在本发明中，所述近红外光谱扫描优选包括：
采用在线或离线检测，以空气为背景，采用透射测样方式，波长检测范围为10000～4000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1，光程为2mm，每个供试品溶液重复扫描3～5次，取平均值作为光谱数据；
或者，依据光栅扫描分光原理，以卤钨灯为光源；光谱范围1000～1800nm，检测器：InGaAs检测器，分辨率：8cm-1；扫描次数：32次；光程1mm。
在本发明中，每次扫描平均需要3～5秒。
在本发明中，所述基于L1-PCA的马氏距离法剔除异常光谱值优选包括：
将所述原始光谱数据构造光谱矩阵；
按照式I所示计算式，采用L1-PCA算法求解所述光谱矩阵，得到光谱主成分；
按照式II所示计算式将所述主成分构造协方差矩阵；
将所述方差矩阵按照式III所示计算式计算得到马氏距离；
设置阈值和剔除异常光谱值；
Figure BDA0002860216170000051
式I中，X'为n×m的光谱样本矩阵，n为样本数，m为每条光谱所采集的数据点数；U为投影矩阵；V为系数矩阵；L1为矩阵的1范数；
S＝T'T/n，式II；
式II中，T'为T的转置，n为样本数，T的计算方法为：获得光谱数据的信号子空间P后，然后P根据计算均值光谱向量μ，对于P矩阵的每个样本减去均值向量μ，得到T；
Figure BDA0002860216170000061
式III中，P为光谱数据的信号子空间；μ为均值光谱向量；S为由T构造的样本信号子空间协方差矩阵；
所述阈值为2～3。
在本发明的具体实施例中，所述采用L1-PCA算法求解所述光谱矩阵，得到光谱主成分，即是求解优化问题，在求解式I的的最优化问题时，由于L1范数构成的目标函数并不是一个凸函数，因此不直接通过凸优化算法来求解，令U与V交替已知，该代价函数就变成一个凸函数，然后通过凸优化算法进行求解。
在本发明中，所述按照式II所示计算式将所述主成分构造协方差矩阵中所选主成分相应特征值占所有特征值之和的95％以上。
在本发明的具体实施例中，计算所得马氏距离即为L1范数约束主成分分析后的马氏距离；
在本发明的具体实施例中，所述阈值为2.5。本发明根据阈值的范围剔除异常样本光谱值。
在本发明中，所述校正模型的建立方法优选包括以下步骤：
(1)将孕马尿原液进行柱层析，得到孕马尿洗脱液样本；
(2)将所述孕马尿洗脱液样本进行液相色谱检测，得到孕马尿洗脱液样本中结合雌激素的真实含量值；
(3)将步骤(1)所述的孕马尿洗脱液样本进行近红外光谱扫描，得到原始样本光谱数据，采用基于L1-PCA的马氏距离法剔除异常样本光谱值，采集孕马尿洗脱液样本的光谱数据；
(4)对步骤(3)采集的光谱数据进行预处理，然后对所述预处理后的光谱数据进行波段选择，得到特征波段；采用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿洗脱液样本中对应的结合雌激素真实含量值做回归拟合，建立校正模型；
所述步骤(2)和步骤(3)没有时间顺序的限制。
在本发明中，建立校正模型时柱层析的工艺与采集待测样品时柱层析的工艺相同，这里就不再赘述。
在本发明中，所述液相色谱检测的参数优选包括：
色谱柱：C18色谱柱；
色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm，100A；
流动相：包括A相和B相，其中A相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/L，pH值为3.5；所述A相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；B相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/L，pH值为3.5；所述B相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；
流动相洗脱程序为：0～18min，A相体积分数由70％降低为67％；18～23min，A相体积分数由67％降低为20％；23～28min，A相体积分数由20％升高为70％；28～35min，A相体积分数稳定在70％；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：205nm；
进样量：1μL；
不同结合雌激素在同一色谱条件下的不同保留时间处出峰。
本发明优选在对所述孕马尿洗脱液样本进行液相色谱检测后，剔除异常数据值，得到孕马尿洗脱液样本中结合雌激素的真实含量值。本发明对所述剔除异常数据值的方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的方法即可。在本发明的具体实施例中，所述液相色谱检测所得异常数据可以直观观察到，直接剔除即可。
本发明将所述的孕马尿洗脱液样本进行近红外光谱扫描，得到原始样本光谱数据，采用基于L1-PCA的马氏距离法剔除异常样本光谱值，采集孕马尿洗脱液样本的光谱数据。在本发明中，所述近红外光谱扫描的参数，以及基于L1-PCA的马氏距离法剔除异常样本光谱值的方法与前文检测待测样品时的参数一致，这里不再赘述。
得到孕马尿洗脱液样本的光谱数据后，本发明对采集的光谱数据进行预处理，然后对所述预处理后的光谱数据进行波段选择，得到特征波段；采用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿洗脱液样本中对应的结合雌激素真实含量值做回归拟合计算，建立校正模型。
在本发明中，所述预处理的方法优选包括：卷积平滑、一阶卷积求导、二阶卷积求导、多元散射校正、标准正态变量变换和归一化法中的一种或几种相结合的方法，更优选为卷积平滑。
在本发明中，所述波段选择的方法优选包括全波长、相关系数法选择波长区间、相关成分法选择波长区间、迭代优化波长选择方法1或迭代优化波长选择方法2，更优选为迭代优化波长选择方法1。在本发明中，所述迭代优化波长选择方法1是指对N个波长区间段进行全排列组合，使用每一组合进行建模，最后选择SECV最小的为本次优化的最佳模型；所述迭代优化波长选择方法2是指从N个波长区间段中选择M段组合成一段光谱，进行建模，即N选M，对所有的可能组合进行建模，最后选择SECV最小的为本次优化的最佳模型，本部分选择的N为10，M为1、2或3。
在本发明中，所述结合雌激素包括17α-二氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠中的一种或多种，优选为17α-二氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、雌酮硫酸钠以及马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠；其中，马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠是指以二者的含量和为指标建立校正模型。
在本发明中，不同结合雌激素的校正模型优选为：
17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9173x+0.0128；
马烯雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9079x+0.0258；
雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9151x+0.0396；
马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9148x+0.0636；
上述校正模型中，x代表真实值，y代表预测值。
在本发明的具体实施例中，不同结合雌激素的校正模型如表1所示：
表1不同结合雌激素的校正模型
Figure BDA0002860216170000081
Figure BDA0002860216170000091
表1中预测-真实拟合方程中x代表真实值，y代表预测值。
在本发明的具体实施例中，将柱层析过程中的孕马尿洗脱液进行近红外光谱扫描后得到的光谱数据作为预测值，导入所述校正模型，得到柱层析过程中孕马尿洗脱液中结合雌激素的真实值，据此，实现孕马尿柱层析过程的质量监控。
在本发明中，当孕马尿洗脱液中结合雌激素的含量大于0.001mg/mL时，判定为孕马尿柱层析洗脱的起点；当孕马尿洗脱液中结合雌激素的含量小于0.001mg/mL时，判定为孕马尿柱层析洗脱的终点。
采用本发明提供的方法能够及时判断柱层析洗脱的起点和终点，精确控制柱层析过程。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中采用的实验仪器：
美国Waters 2996高效液相色谱仪(包括梯度泵G1311A、自动进样器G1329A、柱恒温系统G1316A、二极管阵列检测器DAD-G1315B、色谱工作站)；
采用的实验试剂：
磷酸(分析级，广州化学试剂厂)，甲醇、乙腈(色谱级，德国默克公司)，水(屈臣氏有限公司)。
实验材料：
孕马尿洗脱液样本(180个，新疆新姿源生物制药有限责任公司提供)，17α-二氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠、雌酮硫酸钠的混合标准品，由新疆新姿源生物制药有限责任公司提供。
实施例1
(1)将孕马尿原液经大孔树脂洗脱，得到的不同批次的孕马尿洗脱液样本；
(2)将所述孕马尿洗脱液样本进行液相色谱检测，得到孕马尿洗脱液样本中结合雌激素的真实含量值；所述液相色谱检测的参数为：
色谱柱：Sharpsil-UC18；
色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm，100A；
流动相：A相和B相，其中A相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述A相中磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/L，pH值为3.5；所述A相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；B相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述B相中磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/L，pH值为3.5；所述B相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；
流动相洗脱程序为：0～18min，A相体积分数由70％降低为67％；18～23min，A相体积分数由67％降低为20％；23～28min，A相体积分数由20％升高为70％；28～35min，A相体积分数稳定在70％；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：205nm；
进样量：1μL；
不同结合雌激素在同一色谱条件下的不同保留时间处出峰。
所得孕马尿洗脱液样本中结合雌激素的真实含量值如表2所示；
表2结合雌激素中各质控指标成分的含量值结果表
Figure BDA0002860216170000101
Figure BDA0002860216170000111
Figure BDA0002860216170000121
Figure BDA0002860216170000131
Figure BDA0002860216170000141
Figure BDA0002860216170000151
上述得到171个样品的测定结果，从各批次的趋势图进行分析，存在有测定的异常值，如图1～4所示，需要剔除圈出的异常含量数据，方可进行校正模型的建立。
本发明采用聚光NIR1500对所述孕马尿洗脱液样本进行近红外光谱扫描，采用基于L1-PCA的马氏距离法剔除异常样本光谱值，采集孕马尿洗脱液样本的光谱数据；采用离线检测，以空气为背景，采用透射测样方式，其中波长检测范围为10000～4000cm-1，扫描次数为64次，分辨率为8cm-1，光程为2mm；每个孕马尿样品重复扫描4次，每测一次平均需要4秒，取平均值作为光谱数据；采用卷积平滑对采集的光谱数据进行预处理，然后采用迭代优化波长选择方法1的波段选择方法，采用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿洗脱液样本中对应的结合雌激素真实含量值做回归拟合计算，建立校正模型，具体如下：
经聚光NIR1500对孕马尿洗脱液样本进行NIR光谱的采集，得出结果如图5所示，从图5中看出，存在有异常光谱，采用基于L1-PCA的马氏距离法，设置阈值2～3，可以找出MTC-20181209-1-1、MTC-20181210-2-1为异常光谱，剔除这两个异常光谱，再进行校正模型的建立，如图6所示。以采用马氏距离法计算异常光谱的结果为对比例，如图7所示。由图6～7对比可以看出，马氏距离法无法计算出异常光谱数据，而采用采用基于L1-PCA的马氏距离法可以准确地识别出异常光谱数据，有利于提高检测结果的准确性。
(1)17α-二氢马烯雌酮硫酸钠建模过程中，采用采集的5批结合雌激素样本，即MTC20181209-1、MTC20181209-2、MTC20181210-1、MTC20181210-2、MTC20181211-1作为校正集，将1批的结合雌激素样本MTC20181211-2作为验证集，同时，采用L1-PCA的马氏距离法，设置阈值2～3，剔除异常光谱，再进行校正模型的建立和未知样本的预测，如表3所示；
表3 17α-二氢马烯雌酮硫酸钠校正集样本
Figure BDA0002860216170000161
Figure BDA0002860216170000171
Figure BDA0002860216170000181
Figure BDA0002860216170000191
17α-二氢马烯雌酮硫酸钠建模样本集的含量趋势图如图8所示。
17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的校正模型如表4所示；
表4 17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的校正模型
Figure BDA0002860216170000192
表4中预测-真实拟合方程中x代表真实值，y代表预测值。
17α-二氢马烯雌酮硫酸钠样本的预测结果：
采用已建立的校正模型对20181211-2批次的样本进行含量预测，结果如表5所示：
表5 20181211-2批次样本17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的预测结果表
Figure BDA0002860216170000193
Figure BDA0002860216170000201
20181211-2批次样本17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的预测趋势图如图9所示。通过上述对17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的校正模型的验证，结果表明20181211-2批次中预测值与真实值的含量趋势一致。但在预测过程中，存在有异常点，即洗脱过程中的第6个点，出现预测值产生较大偏差的原因可能是因为近红外光谱采集过程中出现的误差、或者样品放置时间太久影响最终测定含量导致的。除去洗脱过程中的第6个点，得到的预测趋势图如图10所示。由图10可以看出，20181211-2批次中预测值与真实值的含量趋势一致。
(2)马烯雌酮硫酸钠建模过程中，采用采集的5批的结合雌激素样本作为校正集，将1批的结合雌激素样本作为验证集，采用L1-PCA的马氏距离法，设置阈值2～3，剔除异常光谱，再进行校正模型的建立和未知样本的预测，如表6所示；
马烯雌酮硫酸钠建模样本集的含量趋势图如图11所示。
马烯雌酮硫酸钠的校正模型如表6所示；
表6马烯雌酮硫酸钠的校正模型
Figure BDA0002860216170000211
表6中预测-真实拟合方程中x代表真实值，y代表预测值。
马烯雌酮硫酸钠样本的预测结果：
采用已建立的校正模型对20181211-2批次的样本进行含量预测，结果如表7所示：
表7 20181211-2批次样本马烯雌酮硫酸钠的预测结果表
Figure BDA0002860216170000212
Figure BDA0002860216170000221
20181211-2批次样本马烯雌酮硫酸钠的预测趋势图如图12所示。通过上述对马烯雌酮硫酸钠校正模型的验证，结果表明20181211-2批次中预测值与真实值的含量趋势一致。但在预测过程中，存在有异常点，即洗脱过程中的第6个点和第25个点，出现预测值产生较大偏差的原因可能是因为近红外光谱采集过程中出现的误差、或者样品放置时间太久影响最终测定含量导致的。除去洗脱过程中的第6个点和第25个点，得到的预测趋势图如图13所示。由图13可以看出，20181211-2批次中预测值与真实值的含量趋势一致。
(3)雌酮硫酸钠建模过程中，采用采集的5批的结合雌激素样本作为校正集，将1批的结合雌激素样本作为验证集，采用L1-PCA的马氏距离法，设置阈值2～3，剔除异常光谱，再进行模型的建立和未知样本的预测，如表8所示；
雌酮硫酸钠建模样本集的含量趋势图如图14所示。
雌酮硫酸钠的校正模型如表8所示；
表8雌酮硫酸钠的校正模型
Figure BDA0002860216170000222
表8中预测-真实拟合方程中x代表真实值，y代表预测值。
雌酮硫酸钠样本的预测结果：
采用已建立的校正模型对20181211-2批次的样本进行含量预测，结果如表9所示：
表9 20181211-2批次样本雌酮硫酸钠的预测结果表
Figure BDA0002860216170000223
Figure BDA0002860216170000231
20181211-2批次样本雌酮硫酸钠的预测趋势图如图15所示。通过上述对雌酮硫酸钠校正模型的验证，结果表明20181211-2批次中预测值与真实值的含量趋势一致。但在预测过程中，存在有异常点，即洗脱过程中的第6个点和第25个点，出现预测值产生较大偏差的原因可能是因为近红外光谱采集过程中出现的误差、或者样品放置时间太久影响最终测定含量导致的。除去洗脱过程中的第6个点和第25个点，得到的预测趋势图如图16所示。由图16可以看出，20181211-2批次中预测值与真实值的含量趋势一致。
(4)马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠建模过程中，采用采集的5批的结合雌激素样本作为校正集，将1批的结合雌激素样本作为验证集，采用基于L1-PCA的马氏距离法，设置阈值2～3，剔除异常光谱，再进行模型的建立和未知样本的预测，如表10所示；
马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠建模样本集的含量趋势图如图17所示。
马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的校正模型如表10所示；
表10马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的校正模型
Figure BDA0002860216170000241
表10中预测-真实拟合方程中x代表真实值，y代表预测值。
马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠样本的预测结果：
采用已建立的校正模型对20181211-2批次的样本进行含量预测，结果如表11所示：
表11 20181211-2批次样本马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的预测结果表
Figure BDA0002860216170000242
Figure BDA0002860216170000251
20181211-2批次样本马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的预测趋势图如图18所示。通过上述对马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠校正模型的验证，结果表明20181211-2批次中预测值与真实值的含量趋势一致。但在预测过程中，存在有异常点，即洗脱过程中的第6个点和第25个点，出现预测值产生较大偏差的原因可能是因为近红外光谱采集过程中出现的误差、或者样品放置时间太久影响最终测定含量导致的。除去洗脱过程中的第5个点、第6个点和第25个点，得到的预测趋势图如图19所示。由图19可以看出，20181211-2批次中预测值与真实值的含量趋势一致。
对比例
与实施例1基本相同，不同之处仅在于，未剔除异常光谱数据。包含异常光谱数据进行模型建立，得出如下：
17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的校正模型如表12所示：
表12 17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的校正模型
Figure BDA0002860216170000252
表12中预测-真实拟合方程中x代表真实值，y代表预测值。
17α-二氢马烯雌酮硫酸钠样本的预测结果：
采用已建立的校正模型对20181211-2批次的样本进行含量预测，结果如表13所示：
表13 20181211-2批次样本17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的预测结果表
Figure BDA0002860216170000253
Figure BDA0002860216170000261
马烯雌酮硫酸钠的校正模型表14所示：
表14马烯雌酮硫酸钠的校正模型
Figure BDA0002860216170000262
表14中预测-真实拟合方程中x代表真实值，y代表预测值。
马烯雌酮硫酸钠样本的预测结果：
采用已建立的校正模型对20181211-2批次的样本进行含量预测，结果如表15所示：
表15 20181211-2批次样本马烯雌酮硫酸钠的预测结果表
Figure BDA0002860216170000263
Figure BDA0002860216170000271
雌酮硫酸钠的校正模型如表16所示：
表16雌酮硫酸钠的校正模型
Figure BDA0002860216170000272
Figure BDA0002860216170000281
表16中预测-真实拟合方程中x代表真实值，y代表预测值。
雌酮硫酸钠样本的预测结果：
采用已建立的校正模型对20181211-2批次的样本进行含量预测，结果如表17所示：
表17 20181211-2批次样本雌酮硫酸钠的预测结果表
Figure BDA0002860216170000282
Figure BDA0002860216170000291
马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的校正模型如表18所示：
表18马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的校正模型
Figure BDA0002860216170000292
表18中预测-真实拟合方程中x代表真实值，y代表预测值。
马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠样本的预测结果：
采用已建立的校正模型对20181211-2批次的样本进行含量预测，结果如表19所示：
表19 20181211-2批次样本马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的预测结果表
Figure BDA0002860216170000293
Figure BDA0002860216170000301
上述包含异常光谱的预测值与实施例1中不包含异常光谱的预测值比较起来，绝对偏差更大，预测不够准确。根据实施例的记载内容可以看出，本发明提供的方法准确度较高，可以快速检测孕马尿柱层析工艺环节中孕马尿洗脱液的质量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于从孕马尿中获取结合雌激素成分的柱层析工艺的近红外质量监控方法，包括以下步骤：
采集孕马尿原液柱层析得到的洗脱液，作为待测样品；
将所述待测样品进行近红外光谱扫描，得到原始光谱数据，采用基于L1-PCA的马氏距离法剔除所述原始光谱数据中的异常光谱值，将剔除异常光谱值后的光谱数据导入校正模型，得到所述待测样品中结合雌激素的含量；
所述校正模型为真实值和测定值之间的线性方程，所述测定值为剔除异常光谱值后的近红外光谱数据；
所述结合雌激素包括17α-二氢马烯雌酮硫酸钠、马烯雌酮硫酸钠和雌酮硫酸钠中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的近红外质量监控方法，其特征在于，所述校正模型的建立方法包括以下步骤：
(1)将孕马尿原液进行柱层析，得到孕马尿洗脱液样本；
(2)将所述孕马尿洗脱液样本进行液相色谱检测，得到孕马尿洗脱液样本中结合雌激素的真实含量值；
(3)将步骤(1)所述的孕马尿洗脱液样本进行近红外光谱扫描，得到原始样本光谱数据，采用基于L1-PCA的马氏距离法剔除异常样本光谱值，采集孕马尿洗脱液样本的光谱数据；
(4)对步骤(3)采集的光谱数据进行预处理，然后对所述预处理后的光谱数据进行波段选择，得到特征波段；采用偏最小二乘法对特征波段的光谱数据和孕马尿洗脱液样本中对应的结合雌激素真实含量值做回归拟合，建立校正模型；
所述步骤(2)和步骤(3)没有时间顺序的限制。
3.根据权利要求1或2所述的近红外质量监控方法，其特征在于，不同结合雌激素的校正模型为：
17α-二氢马烯雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9173x+0.0128；
马烯雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9079x+0.0258；
雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9151x+0.0396；
马烯雌酮硫酸钠+雌酮硫酸钠的校正模型为：y＝0.9148x+0.0636；
上述校正模型中，x代表真实值，y代表预测值。
4.根据权利要求1所述的近红外质量监控方法，其特征在于，当所述待测样品中结合雌激素的总含量大于0.001mg/mL时，判定为孕马尿柱层析洗脱的起点；
当所述待测样品中结合雌激素的总含量小于0.001mg/mL时，判定为孕马尿柱层析洗脱的终点。
5.根据权利要求1或2所述的近红外质量监控方法，其特征在于，所述基于L1-PCA的马氏距离法剔除异常光谱值包括：
将所述原始光谱数据构造光谱矩阵；
按照式I所示计算式，采用L1-PCA算法求解所述光谱矩阵，得到光谱主成分；
按照式II所示计算式将所述主成分构造协方差矩阵；
将所述方差矩阵按照式III所示计算式计算得到马氏距离；
设置阈值和剔除异常光谱值；
Figure FDA0002860216160000021
式I中，X'为n×m的光谱样本矩阵，n为样本数，m为每条光谱所采集的数据点数；U为投影矩阵；V为系数矩阵；L1为矩阵的1范数；
S＝T'T/n，式II；
式II中，T'为T的转置，n为样本数，T的计算方法为：获得光谱数据的信号子空间P后，然后P根据计算均值光谱向量μ，对于P矩阵的每个样本减去均值向量μ，得到T；
Figure FDA0002860216160000022
式III中，P为光谱数据的信号子空间；μ为均值光谱向量；S为由T构造的样本信号子空间协方差矩阵；
所述阈值为2～3。
6.根据权利要求2所述的近红外质量监控方法，其特征在于，步骤(2)所述液相色谱检测的参数包括：
色谱柱：C18色谱柱；
色谱柱规格：250mm×4.6mm，5μm，100A；
流动相：包括A相和B相，其中A相为磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的混合溶液，所述磷酸二氢钠水溶液的浓度为20mmol/L，pH值为3.5；所述A相中磷酸二氢钠水溶液、乙腈和甲醇的体积比为17:2:1；B相为磷酸氢二钠水溶液和乙腈的混合溶液，所述磷酸氢二钠水溶液的浓度为10mmol/L，pH值为3.5；所述B相中磷酸氢二钠水溶液和乙腈的体积比为3:7；
流动相洗脱程序为：0～18min，A相体积分数由70％降低为67％；18～23min，A相体积分数由67％降低为20％；23～28min，A相体积分数由20％升高为70％；28～35min，A相体积分数稳定在70％；
流速：1.0mL/min；
柱温：40℃；
检测波长：205nm；
进样量：1μL。
7.根据权利要求1或2所述的近红外质量监控方法，其特征在于，所述近红外光谱扫描包括：
采用在线或离线检测，以空气为背景，采用透射测样方式，波长检测范围为10000～4000cm-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm-1，光程为2mm，每个待测样品重复扫描3～5次，取平均值作为原始光谱数据；
或者，依据光栅扫描分光原理，以卤钨灯为光源；光谱范围1000～1800nm，检测器：InGaAs检测器，分辨率：8cm-1；扫描次数：32次；光程1mm。
8.根据权利要求2所述的近红外质量监控方法，其特征在于，所述步骤(4)中预处理的方法包括：卷积平滑、一阶卷积求导、二阶卷积求导、多元散射校正、标准正态变量变换和归一化法中的一种或几种相结合的方法。
9.根据权利要求2所述的近红外质量监控方法，其特征在于，所述步骤(4)中波段选择的方法包括全波长、相关系数法选择波长区间、相关成分法选择波长区间、迭代优化波长选择方法1或迭代优化波长选择方法2。
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