CN111024643B - 一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药材质量控制及识别技术领域，具体涉及一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法。该方法步骤：麻花艽药材样品的处理及近红外光谱数据的采集和处理，提取样品中龙胆苦苷和马钱苷酸进行高效液相色谱含量的测定并将数据及对应的近红外光谱数据导入TQ Analysis软件中，以龙胆苦苷及马钱苷酸二者总量为评价指标进行模型建立及评价。本发明方法能够简便、快捷、准确、高效的检测药材的品质；样点布局时资源分布区涵盖广泛，样本量大，采集的样品具有系统性、代表性与差异性；采用的红外光谱数据提取软件可对目标吸收峰的相关数据进行快速提取，节省2/3的数据提取时间；该方法能够保证样品最原始信息，体现药材化学成分的相互作用及整体关系。
Description
技术领域
本发明涉及中药材质量控制及识别技术领域，具体涉及一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法。
背景技术
麻花艽（Gentiana straminea Maxim.）为龙胆科（Gentianaceae）龙胆属（Gentiana）秦艽组（Sect. Cruciata）多年生草本植物，为青藏高原特有种，是中药材秦艽的四种正品药材之一，2015版《药典》规定秦艽饮片为秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）、麻花艽（G. straminea Maxim.）、粗茎秦艽（G. crassicaulis Duthie ex Burk.）或小秦艽（G. dahurica Fisch.，又名小秦艽）的干燥根。具有祛风湿、清湿热、止痹痛等功效，用于治疗风湿痹痛、中风、湿热黄疸等症，2015版《中华人民共和国药典》规定麻花艽中龙胆苦苷及马钱苷酸的总量不低于2.5 %。
常用的中药材质量检测有高效液相色谱法、紫外-可见分光光度法等，这些方法需先对混合物进行分离，然后对单纯组分或成分进行分析，这样做不仅费时、费力，而且不能保证样品最原始信息，无法体现药材化学成分的相互作用及整体关系。
因此，亟需建立一种简便、快捷、准确的药材品质检测方法。本申请以麻花艽药用部位为研究对象，利用近红外光谱技术，结合化学计量学方法建立了一种麻花艽品质的快速检测方法。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于提供一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法。
一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法，该方法具体包括如下步骤：
步骤1：麻花艽药材样品的来源及处理；
步骤2：麻花艽药材样品近红外光谱数据的采集及处理，其中数据的处理采用红外光谱数据提取软件；
步骤3：提取麻花艽药材样品中的有效成分龙胆苦苷和马钱苷酸进行高效液相色谱含量的测定；
步骤4：将样品高效液相色谱实测得到的龙胆苦苷和马钱苷酸含量数据及对应的近红外光谱数据导入TQ Analysis软件中，以龙胆苦苷及马钱苷酸二者总量为评价指标进行模型建立，并以软件自带的建模方法进行模型建立条件的优化，其中，所述模型建立时利用浓度梯度法进行建模样本集的选择，利用Correlition coefficient方法进行建模波段的选择，并对模型进行交叉验证，根据马氏距离剔除异常值；
步骤5：对建立的模型进行评价；
步骤6：将待检测麻花艽样品近红外谱图代入上述模型中，在短时间内即可得出样品龙胆苦苷及马钱苷酸的总量。
进一步的，所述步骤1：从青藏高原大的地理分布尺度和不同生态梯度上，在典型分布区开展多点采样，采集时间集中在7~9月植物花期，样品分袋单独放置；样品带回实验室后，分别用自来水和超纯水冲洗干净后，置于阴凉通风处晾干，取药用部位根部，粉碎，备用；进行近红外光谱分析前，将样品过100目筛，置于45℃烘箱内烘干至恒重，放于干燥器内，待分析用。
进一步的，所述步骤2：每个麻花艽药材样品以重装样的方式，重复采集3次；样品采集时，即时去除水和CO2的背景干扰，求其平均谱图；所述麻花艽药材样品近红外光谱数据采集时条件为：分辨率8 cm-1；扫描次数64次；装样厚度0.1 cm，样品粒度100目；将采集的数据全部输入红外光谱数据提取软件，对4000~10000cm-1范围内目标吸收峰相关数据进行快速提取。
进一步的，所述红外光谱数据提取软件是一种样品近红外光谱数据提取的软件，可对目标吸收峰的相关数据进行快速提取。
进一步的，所述步骤3的色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8，4.6×250mm，5µm；流动相：A-5 %乙腈，其中含2.5 mmol/L甲酸，B-95 %乙腈；梯度洗脱：0~15 min，A由100 %线性变化为90 %；15~30 min，90 % A等度洗脱；流速：1.0 mL/min；进样量：10µL；柱温：25℃；龙胆苦苷检测波长为276 nm，马钱苷酸检测波长为235 nm。
进一步的，所述步骤3中提取麻花艽药材样品中的有效成分龙胆苦苷和马钱苷酸的条件为：取0.0300±0.0005g麻花艽药材样品，加入浓度为40 %甲醇8 mL进行超声提取，提取时间为30 min，提取功率为200 W。
进一步的，所述的建模方法有SMLR、PLS及PCR。
进一步的，所述对建立的模型进行评价，评价指标为RMSEC、RMSEP、RMSECV、Rcal、Rval、Rcv、RPD。
进一步的，所述步骤6中，待检测麻花艽样品近红外谱图代入上述模型中，谱图可为一个样品的谱图，也可为一批样品的谱图，一个样品测定用时为2s。
本发明的有益效果：本发明方法能够简便、快捷、准确、高效的检测药材的品质。样点布局时资源分布区涵盖广泛，分析样本量大，所采集的样品具有系统性、代表性与差异性；采用的红外光谱数据提取软件可对目标吸收峰的相关数据进行快速提取，可节省2/3的数据提取时间；同时进行了建模方法的优化，优选了最佳建模条件；该检测方法能够保证样品最原始信息，体现药材化学成分的相互作用及整体关系。
附图说明
图1为麻花艽样品近红外光谱图；
图2为标准品及样品高效液相色谱图；
图3为定量模型建模结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法，该方法具体包括如下步骤：
步骤1：麻花艽药材样品的来源及处理
从青藏高原大的地理分布尺度和不同生态梯度上，在典型分布区开展多点采样，采集时间集中在7-9月植物花期；样品分袋单独放置，共采集得到373份样品；样品带回实验室后，分别用自来水和超纯水冲洗干净后，置于阴凉通风处晾干，取药用部位根部，粉碎，备用；进行近红外光谱分析前，将样品过100目筛，置于45℃烘箱内烘干至恒重，放于干燥器内，待分析用。
步骤2：麻花艽药材样品近红外光谱数据的采集及处理：
每个麻花艽药材样品以重装样的方式，重复采集3次；样品采集时，即时去除水和CO2的背景干扰，求其平均谱图；所述麻花艽药材样品近红外光谱数据采集时条件为：分辨率8 cm-1；扫描次数64次；装样厚度0.1 cm，样品粒度100目；将采集的数据全部输入红外光谱数据提取软件，对4000~10000cm-1范围内目标吸收峰相关数据进行快速提取。
麻花艽样品近红外光谱数据采集结果如下（详见附图1）。麻花艽近红外一维谱图吸收差异较小，单纯从谱图上根据吸收峰不能对麻花艽样品进行有效的判别分析。
不同样点近红外光谱吸收数据如表1所示，麻花艽共有8个特征吸收峰，分别为8335 cm-1、6838 cm-1、5788 cm-1、5674 cm-1、5175cm-1、4739 cm-1、4330 cm-1、4259 cm-1，8个吸收峰吸光度RSD均大于8.00 %，说明样品的吸收差距较大，原因可能是样品采样点分布范围较广，样品中各化合物的含量差异大（详见表1）。
表 1 麻花艽近红外光谱吸收结果
注：*代表共有峰
步骤3：提取麻花艽药材样品中的有效成分龙胆苦苷和马钱苷酸进行高效液相色谱含量的测定；
1. 高效液相色谱方法学验证
（1）精密度试验
取样品0.0300±0.0005g，用8 mL浓度为40 %甲醇在200 W条件下提取30 min，并将提取液定容至10 mL。连续进样5针，分别计算5种化合物含量百分比及保留时间的RSD值，判断方法及仪器的精密度。
（2）重复性试验
取0.0300±0.0005g样品5份，分别用8 mL浓度为40 %甲醇在200 W条件下提取30min，并将提取液定容至10 mL。各进样1针，分别计算5种化合物含量百分比及保留时间的RSD值，判断方法的重复性。
（3）稳定性试验
日内稳定性：取样品0.0300±0.0005g，用8 mL浓度为40 %甲醇在200 W条件下提取30 min，并将提取液定容至10 mL。以间隔0、2、8、12、16、24 h的时间进样，分别计算5种化合物含量百分比及保留时间的RSD值，判断方法的日内稳定性。
日间稳定性：取样品0.0300±0.0005 g，用8 mL浓度为40%甲醇在200 W条件下提取30 min，并将提取液定容至10 mL。以间隔0、24、48、72 h的时间进样，分别计算5种化合物含量百分比及保留时间的RSD值，判断方法的日间稳定性。
（4）加标回收率
取0.0300±0.0005g样品5份，分别加入2 mL的对照品混合液及5 mL 40 %甲醇在200 W条件下提取30 min，并将提取液定容至10 mL。混合液中各标品浓度为龙胆苦苷517.5mg/L，马钱苷酸160 mg/L。分别测两种化合物的含量，计算其加样回收率及RSD值，计算公式如下：
加标回收率=（加标样品测定值-已知样品含量）/加标量×100%。
高效液相色谱方法学验证结果
（1）精密度试验
样品提取后，连续进样5针，进样量10L，龙胆苦苷和马钱苷酸含量百分比及保留时间RSD结果如下（表2）。由结果可知，两种化合物保留时间的RSD均小于0.1 %，含量RSD值均小于1.0%，说明方法精密度较好。
表 2 精密度试验结果
（2）重复性试验
样品重复5次，两种化合物含量百分比及保留时间RSD结果如下（表3）。由结果知，两种化合物保留时间的RSD均小于0.2 %，含量RSD值均≤2 %，说明方法重复性较好。
表3 重复性试验结果
（3）稳定性试验
日内稳定性：同一样品在同一天的6个时间点进行检测，两种化合物含量百分比及保留时间RSD结果如下（表4）。由结果可知，两种化合物保留时间的RSD≤0.5 %，含量RSD值均小于1 %，说明方法日内稳定性较好。
表 4 日内稳定性试验结果
日间稳定性：同一样品在三天的同一时间点进行检测，两种化合物含量百分比及保留时间RSD结果如下（表5）。由结果可知，两种化合物保留时间的RSD均在0.5 %左右，含量RSD值均小于2 %，说明方法日间稳定性较好。
表 5 日间稳定性试验结果
在精密度试验、重复性试验及稳定性试验中，化合物保留时间的
RSD 均较小，说明仪器具有较好的稳定性。
（4）加标回收率
5 次平行加标回收率试验，其结果如下（表 6）。由结果知，龙
胆苦苷及马钱苷酸加标回收效果较好。
表 6 加标回收率结果
3. 样品高效液相色谱含量测定
提取麻花艽药材样品中的有效成分龙胆苦苷和马钱苷酸进行高效液相色谱含量的测定。其中，龙胆苦苷和马钱苷酸的提取条件为：取0.0300±0.0005g样品，加入浓度为40%甲醇8 mL进行超声提取，提取时间为30 min，提取功率为200 W。色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8，4.6×250 mm，5µm；流动相：A-5 %乙腈，其中含2.5 mmol/L甲酸，B-95 %乙腈；梯度洗脱：0~15 min，A由100 %线性变化为90 %；15~30 min，90 % A等度洗脱；流速：1.0 mL/min；进样量：10µL；柱温：25℃；龙胆苦苷检测波长为276 nm，马钱苷酸检测波长为235 nm。
样品高效液相色谱含量测定结果
以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，龙胆苦苷及马钱苷酸的标准曲线如表7所示，两种化合物的峰面积与进样量之间线性关系良好，R2均在0.9990以上。龙胆苦苷标品、马钱苷酸标品及样品的高效液相色谱结果（如附图2），由结果可知，样品分离效果良好，基本达到基线分离，马钱苷酸在12 min左右出峰，龙胆苦苷在19 min左右出峰。
表 7 龙胆苦苷和马钱苷酸线性回归方程
所做373份麻花艽样品中龙胆苦苷、马钱苷酸的高效液相色谱测定结果如下表（表8）所示。由结果可知，龙胆苦苷的平均含量为4.36 %，马钱苷酸的平均含量为0.94 %，二者总含量均值为5.31 %，含量分布在1.35-9.57 %，SD=1.37 %。
表 8 龙胆苦苷和马钱苷酸HPLC含量测定结果(n=3)
步骤4：将样品高效液相色谱实测得到的龙胆苦苷和马钱苷酸含量数据及对应的近红外光谱数据导入TQ Analysis软件中，以龙胆苦苷及马钱苷酸二者总量为评价指标进行模型建立，并以软件自带的建模方法进行模型建立条件的优化。
模型建立
将样品高效液相色谱实测得到的龙胆苦苷和马钱苷酸含量数据及对应的近红外光谱数据导入到TQ Analysis软件中，以龙胆苦苷及马钱苷酸二者总量为评价指标进行建模。软件自带的化学计量学方法有PCR、PLS、SMLR，光谱处理方法有多元散射校正（MSC）、变量标准化（SNV）、一阶导数谱图、二阶导数谱图、SG平滑等。
根据软件自带的化学计量学及光谱处理方法，将这些方法分为3部分进行正交试验，正交试验因素水平如下（详见表9），正交试验表（详见表10）。建模时利用浓度梯度法进行样本集的选择（K=3），利用Correlition coefficient方法进行建模波段得选择，并对模型进行交叉验证。此外，在模型建立的时候，还需要剔除异常值，异常值的剔除主要根据马氏距离分析进行。
表 9 建模正交试验因素水平表
表 10 建模正交试验表
判断模型好坏的指标有很多，比如校正误差均方根（Root Mean Square Error ofCalibration，RMSEC）、预测误差均方根（Root Mean Square Error of Prediction，RMSEP）、交叉验证误差均方根（Root Mean Square Error of Cross Validation，RMSECV）、相关系数（R）、RPD等。其中，RMSEC越小则说明模型回归性越好，RMSEP越小则说明模型预测结果越准确，一般情况下，RMSECV > RMSEC；R值越接近1，表明模型的回归或预测的结果越好。RPD < 2时模型没有实用价值；2 < RPD < 3时，模型可用于非精确性测定；RPD>3时，模型较为准确，可用于质量控制；RPD>8时，模型为优秀模型，可用于任何分析。
RPD=预测集参考值标准差/预测集误差均方根
以龙胆苦苷及马钱苷酸含量之和为指标进行建模，建模时样本集的划分结果如下（表11）。由表可知，验证集地浓度范围在建模集地浓度范围内，建模集、验证集地均值及RSD值相近，符合定量检测模型建立时样本集的要求。
表 11 模型建模集及验证集样品分布
2. 模型建立条件优化
近红外定量检测模型建模时，设计了3因素3水平的正交试验，结果如表12所示。由结果可知，实际最优组合为5号试验，即A2B2C3组合（PLS+MSC+D2），对正交试验结果进行极差分析，结果如下（表13），由结果知理论最优组合为A2B2C3，理论最优建模条件与实际最优建模条件相同，因此定量检测模型的建立条件组合为PLS+MSC+D2。
表 12 模型优化正交试验结果
表 13 正交试验极差分析
步骤5：对建立的模型进行评价。
利用优化的建模方法进行模型的建立，即模型的建立采用PLS+MSC+D2方法，建模波段的选择利用Correlation Coefficient方法进行，最终确定建模波段为8843~4347 cm-1，所建模型如附图3所示，模型的RMSEC、RMSEP、RMSECV、Rcal、Rval、Rcv分别为0.0048、0.0039、0.0063、0.9302、0.9467、0.8805，所建模型RMSE值较小，在0.0050左右，R值在0.9000左右，经计算模型RPD值为3.14，表明所建模型效果较好，可以用于麻花艽质量地快速检测。
将待检测麻花艽样品近红外谱图代入上述模型中，在短时间内即可得出样品龙胆苦苷及马钱苷酸的总量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法，其特征在于：该方法具体包括如下步骤：
步骤1：麻花艽药材样品的来源及处理；
步骤2：麻花艽药材样品近红外光谱数据的采集与处理，其中数据的处理采用红外光谱数据提取软件；每个麻花艽药材样品以重装样的方式，重复采集3次；样品采集时，即时去除水和CO2的背景干扰，求其平均谱图；所述麻花艽药材样品近红外光谱数据采集时条件为：分辨率8 cm-1；扫描次数64次；装样厚度0.1 cm，样品粒度100目；将采集的数据全部输入红外光谱数据提取软件，对4000~10000cm-1范围内目标吸收峰相关数据进行快速提取；
步骤3：提取麻花艽药材样品中的有效成分龙胆苦苷和马钱苷酸进行高效液相色谱含量的测定；色谱条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8，4.6×250 mm，5μm；流动相：A-5 %乙腈，其中含2.5 mmol/L甲酸，B-95 %乙腈；梯度洗脱：0~15 min，A由100 %线性变化为90%；15~30 min，90 % A等度洗脱；流速：1.0 mL/min；进样量：10μL；柱温：25℃；龙胆苦苷检测波长为276 nm，马钱苷酸检测波长为235 nm；
步骤4：将样品高效液相色谱实测得到的龙胆苦苷和马钱苷酸含量数据及对应的近红外光谱数据导入TQ Analysis软件中，以龙胆苦苷及马钱苷酸二者总量为评价指标进行模型建立，并以软件自带的建模方法进行模型建立条件的优化，其中，所述模型建立时利用浓度梯度法进行建模样本集的选择，利用Correlation Coefficient方法进行建模波段的选择，并对模型进行交叉验证，根据马氏距离剔除异常值；
步骤5：对建立的模型进行评价；
步骤6：将待检测麻花艽样品近红外谱图代入上述模型中，在短时间内即可得出样品龙胆苦苷及马钱苷酸的总量。
2.根据权利要求1所述的一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法，其特征在于：所述步骤1为：从青藏高原大的地理分布尺度和不同生态梯度上，在典型分布区开展多点采样，采集时间集中在7~9月植物花期，样品分袋单独放置；样品带回实验室后，分别用自来水和超纯水冲洗干净后，置于阴凉通风处晾干，取药用部位根部，粉碎，备用；进行近红外光谱分析前，将样品过100目筛，置于45℃烘箱内烘干至恒重，放于干燥器内，待分析用。
3.根据权利要求1所述的一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法，其特征在于：所述红外光谱数据提取软件是一种样品近红外光谱数据提取的软件，可对目标吸收峰的相关数据进行快速提取。
4.根据权利要求1所述的一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法，其特征在于：所述提取麻花艽药材样品中的有效成分龙胆苦苷和马钱苷酸的条件为：取0.0300±0.0005g麻花艽药材样品，加入浓度为40 %甲醇8 mL进行超声提取，提取时间为30 min，提取功率为200 W。
5.根据权利要求1所述的一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法，其特征在于：所述的建模方法有SMLR、PLS及PCR。
6.根据权利要求1所述的一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法，其特征在于：所述对建立的模型进行评价，评价指标为RMSEC、RMSEP、RMSECV、Rcal、Rval、Rcv、RPD。
7.根据权利要求1所述的一种麻花艽药材品质评价的近红外光谱检测方法，其特征在于：所述待检测麻花艽样品近红外谱图代入上述模型中，谱图为一个样品的谱图或者一批样品的谱图，一个样品测定用时为2s。
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