CN103487395A

CN103487395A - 一种重楼药材多指标快速检测方法

Info

Publication number: CN103487395A
Application number: CN201310399571.2A
Authority: CN
Inventors: 吴永江; 刘博文; 金叶; 陈勇; 刘雪松
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Yunnan Baiyao Group Co Ltd
Current assignee: Zhejiang University ZJU; Yunnan Baiyao Group Co Ltd
Priority date: 2013-09-05
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-09-05
Also published as: CN103487395B

Abstract

本发明提供一种重楼药材多指标快速检测方法，通过采集不同批次的重楼药材作为样品，采用液相色谱法测定样品中各类单体皂苷和总皂苷的含量，采用烘干称重法测定样品中水分的含量，样品的近红外光谱数据采集，选择合适的建模波段和光谱预处理方法，采用偏最小二乘回归法建立各类单体皂苷、总皂苷和水分的快速分析定量模型，用所建模型快速测定未知样品中各类单体皂苷、总皂苷和水分的含量，根据近红外光谱技术测得的总皂苷和水分含量判断该重楼药材是否可以投入提取等后续生产环节。本发明将近红外分析技术应用于重楼药材中皂苷类成分和水分含量的测定中，与传统分析方法相比，本发明方法更快速、高效，具有现场药材筛选和质量全面评价的应用前景。

Description

一种重楼药材多指标快速检测方法

技术领域

本发明属于近红外检测领域，具体涉及一种重楼药材多指标快速检测方法。

背景技术

中药重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith Var.yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz.或七叶一枝花Prais polyphylla Smith Var.chinensis (Franch.)Hara的干燥根茎，其主要化学成分为甾体皂苷，并含有β-蜕皮激素、多糖、黄酮苷及氨基酸，具有较强的生理和药理活性，包括抗肿瘤、止血止痛、抑菌消炎、免疫调节等作用，广泛应用于临床。

原药材检查是过程质量分析和控制的源头。由于地理位置、气候条件、生长环境等因素差异，不同产地的同一类药材在活性成分的含量和种类上往往差异较大，因此对原药材进行质量评价十分必要。重楼药材中含有重楼皂苷-I、重楼皂苷-II、重楼皂苷-VII等多种化合物，化学成分复杂，而且水分的存在可能影响这些有效成分的药效，影响药材的稳定性，影响生产成本等。目前，对原药材的质量控制主要依靠传统质量分析方法，耗时费力，故研究开发一种重楼药材多指标快速检测方法，具有现场药材筛选和质量全面评价的应用前景。

近红外光谱（NIR）技术是一种间接分析技术，是通过定标模型的建立来实现对未知样本的定性或定量分析，具有快速、无损、原位与无污染等特点。近年来，近红外分析技术作为一种间接分析技术，已应用于中药质量控制及生产应用领域中，包括药材、复方中药和中药各种剂型的定性定量，以及利用光纤探头技术实现对中药生产工艺的在线连续监控等。

《川滇地区重楼商品药材质量评价》（尹鸿翔等，《中药材》，2007年7月第30卷第7期，p771-774），虽公开了高效液相色谱法的条件，但其参数与本专利中参数差异较大。此外，将近红外分析技术用于重楼药材中关键质控指标的含量测定国内外均无此方面的应用报道，因此研究一种方法来快速检测重楼药材中各关键质控指标是非常有必要的，有助于提高中药产品的稳定性、安全性和有效性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重楼药材多指标快速检测方法。采用近红外分析技术能够快速测定重楼药材中重楼皂苷-I、重楼皂苷-II、重楼皂苷-VII、总皂苷和水分的含量，实现原药材质量的快速评价。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

（1）重楼药材样品的收集；

收集不同批次且具有代表性的重楼药材不少于80批，随机选择其中19~30个的样品作为验证集，其余样品作为校正集进行定量校正模型的建立。

（2）用传统方法测定各关键质控指标：

重楼药材中各关键质控指标包括：重楼皂苷-I、重楼皂苷-II、重楼皂苷-VII、总皂苷和水分；

将样品经预处理后采用液相色谱法测定重楼皂苷-I、重楼皂苷-II、重楼皂苷-VII的含量，总皂苷含量为以上三种皂苷的总和；使用烘干称重法测定水分含量。

样品预处理方法：将重楼药材打粉，过80目筛，取细粉约0.5 g，精密称定，置平底烧瓶中，精确加入甲醇10 mL，称定质量，超声波提取45 min，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，离心10 min（转速为13000 rp·min^-1），取上清液用于高效液相色谱分析。

高效液相色谱法条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱0~25 min：25~95%A，25~30 min：95%A；检测波长203 nm；流速：1.0 mL·min^-1；柱温：30℃；进样量：10 μL；理论板数按重楼皂苷-I峰计算应不低于4000。

烘干称重法为：将重楼药材打粉，过80目筛，精密称取重楼粉末2 mg于干燥恒重的扁形瓶中，置烘箱内100-105℃干燥5 h，移至干燥器中冷却30 min，精密称定，再在上述温度下干燥1 h，冷却，称重，至连续两次差不超过5 mg，计算水分含量。

（3）采集样品的近红外光谱图：

分别使用漫反射采样器件采集步骤（1）所述的校正集和验证集样品的近红外光谱，采样次数为32次，分辨率为8 cm^-1，以仪器内置背景为参比，扫描光谱范围为4000~10000 cm^-1，每个样品扫描重复3次，取平均光谱作为样品光谱；

（4）定量模型的建立：

在建立定量模型之前，需要对光谱进行异常光谱的剔除、波段选择和预处理；

对步骤（3）所述的校正集样品的原始光谱采用马氏距离、样品杠杆值和学生残差的方法来判断异常光谱，当一个样品的马氏距离＞2或者杠杆值和学生残差都比较高时，该样品为异常样品，予以剔除；

对剔除了光谱异常值的光谱选择合适的光谱波段和预处理方法得到重楼药材特征光谱信息，采用偏最小二乘回归法建立近红外光谱与关键质控指标之间的校正模型，并通过各模型评价指标考察模型性能。具体是：

重楼皂苷-I采用多元散射校正+一阶导数+ Savitsky-Golay平滑的方法进行光谱预处理，建模波段为4500-4900 cm^-1和5550-6290 cm^-1；

重楼皂苷-II采用矢量归一化+一阶导数+Norris平滑的方法进行光谱预处理，建模波段为5449.8-7501.7 cm^-1；

重楼皂苷-VII采用多元散射校正+一阶导数+ Norris平滑的方法进行光谱预处理，建模波段为4248.4-4601.3 cm^-1和5775.8-6101.7 cm^-1；

总皂苷采用多元散射校正+一阶导数+ Savitsky-Golay平滑的方法进行光谱预处理，建模波段为4248.4-4601.3 cm^-1和5449.8-6101.7 cm^-1；

水分采用矢量归一化+一阶导数+Norris平滑的方法进行光谱预处理，建模波段为6099.7-7501.7 cm^-1；

再将验证集数据导入已建立的校正模型，验证模型的稳定性和预测性能；

定量模型性能的评价：采用相关系数（R）、校正集均方差（RMSEC）、预测均方差（RMSEP）为指标来优化建模，考察模型性能。当R值越接近于1，RMSEC和RMSEP值越小且越接近时，评价模型稳定性越佳、预测精准度越高，能够满足原药材直接分析的预测精度要求。以下为相关系数、校正集均方差、预测均方差的具体计算公式：

Figure 2013103995712100002DEST_PATH_IMAGE002

Figure 2013103995712100002DEST_PATH_IMAGE004

Figure 2013103995712100002DEST_PATH_IMAGE006

各式中C _i ——传统分析方法测定的参比值；

——通过近红外测量及定量模型预测得到的结果；

C _m——C _i平均值；

n ——建立模型所用的校正集样本数；

m ——用于检验模型的验证集样本数；

（5）未知样品中各关键指标的快速测定

将未知各关键质控指标值的重楼药材，按校正集样品相同近红外光谱采集参数，采集未知样品的近红外光谱数据，选择相同的建模波段和光谱预处理方法，把特征光谱输入步骤（4）所述的定量模型，便可快速计算得到各关键指标值；

并采用t检验法对未知样品的平均参比值与近红外平均预测值进行显著性差异验证，若无显著性差异，则步骤（4）所述的模型质量高，可用于实际生产过程，若有显著性差异，则重复步骤（1）~（4）对模型进行修正；

（6）根据以上近红外分析技术测得的重楼药材总皂苷含量≥0.6%且水分含量≤12%时，则判断该重楼药材为合格样品，符合质量要求，可以投入提取等后续生产环节。

本发明的另一个目的是提供所述的检测方法在重楼药材检测中的应用。

本发明将近红外分析技术引入到重楼药材检测中，实现对各关键质控指标（重楼皂苷-I、重楼皂苷-II、重楼皂苷-VII、总皂苷和水分）的快速测定，在中药生产中从源头上控制了原材料的质量，缩短检测时间，节约生产成本，提高生产效率，充分保证产品质量稳定、可靠。

附图说明

附图1是重楼样品的近红外原始吸收光谱图。

附图2是重楼药材中重楼皂苷-I近红外预测值与实际测得值的相关图。

附图3是重楼药材中重楼皂苷-II近红外预测值与实际测得值的相关图。

附图4是重楼药材中重楼皂苷-VII近红外预测值与实际测得值的相关图。

附图5是重楼药材中总皂苷近红外预测值与实际测得值的相关图。

附图6是重楼药材中水分近红外预测值与实际测得值的相关图。

附图7是重楼药材中重楼皂苷-I实际测得值与近红外预测值的柱状比较图。

附图8是重楼药材中重楼皂苷-II实际测得值与近红外预测值的柱状比较图。

附图9是重楼药材中重楼皂苷-VII实际测得值与近红外预测值的柱状比较图。

附图10是重楼药材中总皂苷实际测得值与近红外预测值的柱状比较图。

附图11是重楼药材中水分实际测得值与近红外预测值的柱状比较图。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1：

1.重楼药材样品的收集：

收集不同批次且具有代表性的重楼药材160批，随机选择其中19~30个的样品作为验证集，其余样品作为校正集进行定量校正模型的建立；

2.用传统方法测定各关键质控指标：

1．各类单体皂苷和总皂苷的测定：

分别取不同批次重楼样品细粉（过80目筛）约0.5 g，精密称定，置平底烧瓶中，精确加入甲醇10 mL，称定质量，超声波提取45 min，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，离心10 min（转速为13000 rp·min^-1），取上清液用于测定重楼皂苷I、重楼皂苷II、重楼皂苷VII和总皂苷的含量。

高效液相色谱法条件为：Agilent SB-C₁₈色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱0~25 min：25~95%A，25~30 min：95%A；检测波长203 nm；流速：1.0 mL·min^-1；柱温30℃；进样量10 μL。

2．水分的测定：重楼药材经粉碎（过80目筛）后，精密称取重楼粉末2 mg于干燥恒重的扁形瓶中，置烘箱内100-105℃干燥5 h，移至干燥器中冷却30 min，精密称定，再在上述温度下干燥1 h，冷却，称重，至连续两次差不超过5 mg，计算水分含量；

3.采集样品的近红外光谱图：

使用ANTARIS傅立叶变换近红外光谱仪（Thermo Nicolet, USA）进行光谱采集。将重楼样品粉碎后，过80目筛，粉末装入样品池中，样品的装样厚度和装填密度保持一致，以仪器内置背景为参比，按下述实验方法进行扫描：测样方式为积分球漫反射，光谱扫描范围4000~10000 cm^-1，扫描次数32次，分辨率8 cm^-1，每个样品扫描重复3次，取平均光谱。重楼药材样品的近红外漫反射光谱图见图1。

4.定量模型的建立：

由于校正集与验证集样品要求具有代表性，因此需要首先剔除异常点，以保证建立的模型稳定可靠。本发明对步骤3中样品近红外原始图谱采用化学计量学软件（美国Thermo Nicolet公司TQ Analyst软件）中提供的马氏距离、样品杠杆值和学生残差的方法进行异常光谱的剔除，当一个样品的马氏距离＞2或者杠杆值和学生残差都比较高时，视该样品为异常样品，予以剔除。

在剔除异常点之后，对建模波段和光谱预处理方法进行优化，选取包含目标成分信息的波段，并且采用合适的光谱预处理提取有效信息。本发明将一阶导数法和平滑相结合对光谱数据进行预处理，平滑可以降低随机误差和噪声，导数法可消除由于制样条件和仪器参数引起的谱图的平移、倾斜以及图谱的其它变形。各质控指标模型采用的预处理方式和建模波段见表1。

Figure 2013103995712100002DEST_PATH_IMAGE010

将经过预处理后的光谱数据与样品含量数据关联，采用偏最小二乘回归法，建立近红外定量校正模型。并将验证集数据导入已建立的校正模型，验证模型的稳定性和预测性能。表2为各质控指标模型的性能评价指标参数，图2~6是各质控指标模型校正集样品近红外预测值与实际测得值的相关图，图7~11是各质控指标模型验证集样品实际测得值与近红外预测值的柱状比较图。从表2和图2~6可看出，以重楼皂苷-I、重楼皂苷-II、重楼皂苷-VIII、总皂苷和水分为指标所建立的模型相关系数R均大于0.9，RMSEC、RMSEP和RMSECV值均较小，说明模型拟合效果好，具有较好的校正效果；从图7~11中可以看出，这五个模型验证集中样品的参比方法测定值与近红外预测值基本上是吻合的，说明模型的分析预测能力较高，模型稳定。

5.未知样品中各关键指标的快速测定：

将未知各关键质控指标值的重楼药材，按校正集样品相同近红外光谱采集参数，采集未知样品的近红外光谱数据，选择相同的建模波段和光谱预处理方法，把特征光谱输入步骤4所述的定量模型，快速测得待测样品中各类单体皂苷、总皂苷和水分的含量见表3。

Figure 2013103995712100002DEST_PATH_IMAGE014

表中t表示在置信度为95%的条件下，对各质控指标的参比数据的平均结果与近红外预测数据的平均结果进行配对t检验，按常规的t检验方法即用SPSS18.0软件计算出两组数据间的配对t检验值（见表3），并通过t分布临界值表查处两组数据在95%条件下的t值为4.303，将用SPSS软件计算出的t值与查表可知的t值进行对比，表3中的t值均小于4.303，表明用近红外预测的数据与用参比方法测得的数据间无显著性差异，说明本发明建立的一种重楼药材中多指标快速检测方法是准确可靠的。

6.根据以上近红外分析技术测得的重楼药材总皂苷含量≥0.6%且水分含量≤12%时，则判断该重楼药材为合格样品，符合质量要求，可以投入提取等后续生产环节。

本发明提出一种重楼药材中多指标快递检测方法。结果表明，使用近红外光谱分析技术可以对重楼皂苷-I、重楼皂苷-II、重楼皂苷-VII、总皂苷和水分指标进行快速分析。本方法省时、无损，提高生产效率，为重楼药材的质量控制提供新的方法。

Claims

1.一种重楼药材多指标快速检测方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）样品的收集

收集不同批次的重楼药材，随机选择其中20个样品作为验证集，其余样品作为校正集进行定量校正模型的建立；

（2）用传统方法测定各关键质控指标

将样品经预处理后采用高效液相色谱法测定重楼药材中重楼皂苷-I、重楼皂苷-II、重楼皂苷-VII的含量，总皂苷含量为以上三种皂苷的总和；采用烘干称重法测定重楼药材中水分的含量；

（3）采集样品的近红外光谱图

使用漫反射采样器件采集近红外光谱图，采样次数为32次，分辨率为8 cm^-1，以仪器内置背景为参比，扫描光谱范围为4000~10000 cm^-1，每个样品扫描重复3次，取平均光谱作为样品的近红外光谱；

（4）定量模型的建立

选择合适的光谱波段和预处理方法得到重楼药材特征光谱信息，采用偏最小二乘回归法建立近红外光谱与关键质控指标之间的校正模型，并根据模型评价指标来考察模型性能，将验证集数据导入已建立的校正模型，验证模型的稳定性和预测性能；

（5）未知样品中各关键指标的快速测定

将未知各关键质控指标值的重楼药材，按校正集样品相同近红外光谱采集参数，采集未知样品的近红外光谱数据，并选择相同的建模波段和光谱预处理方法，把特征光谱输入步骤（4）所述的定量模型中，计算得到各关键指标值；

（6）根据以上近红外分析技术测得的重楼药材总皂苷含量≥0.6%且水分含量≤12%时，则判断该重楼药材为合格样品，符合质量要求，投入提取的后续生产环节。

2.根据权利要求1所述的一种重楼药材多指标快速检测方法，其特征在于，步骤（2）所述的重楼样品预处理方法为：将重楼药材打粉，过80目筛，取细粉约0.5 g，精密称定，置平底烧瓶中，精确加入甲醇10 mL，称定质量，超声波提取45 min，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，离心10 min（转速为13000 rp·min^-1），取上清液用于高效液相色谱分析。

3.根据权利要求1所述的一种重楼药材多指标快速检测方法，其特征在于，步骤（2）所述的高效液相色谱法条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱0~25 min：25~95%A，25~30 min：95%A；检测波长203 nm；流速：1.0 mL·min^-1；柱温：30℃；进样量：10 μL；理论板数按重楼皂苷-I峰计算应不低于4000。

4.根据权利要求1所述的一种重楼药材多指标快速检测方法，其特征在于，步骤（4）所述的各关键质控指标合适的光谱波段和预处理方法为：

水分采用矢量归一化+一阶导数+Norris平滑的方法进行光谱预处理，建模波段为6099.7-7501.7 cm^-1。

5.根据权利要求1所述的一种重楼药材多指标快速检测方法在重楼药材检测中的应用。