CN112683624A - 一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法 - Google Patents
一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,属于检验技术领域,包括如下步骤:A1、样品预处理:将牡蛎干剪切成小段,放入烘箱中烘烤至表面干脆,取出后放入超离心研磨仪中进行粉碎并过筛;A2、微波‑超声协同萃取:将研磨好的牡蛎干粉末与去离子水按照固液比1:3~12的比例进行混合,后进行微波‑超声协同萃取,即得提取液;A3、荧光分光光度计检测;A4、计算水溶性钙的含量。本发明建立了利用钙绿黄素荧光探针检测牡蛎干中水溶性钙含量的方法,利用本方法检测牡蛎中水溶性钙含量时,用时短、检测数据准确、稳定性高。
Description
技术领域
本发明属于检验技术领域,具体涉及一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法。
背景技术
牡蛎是我国重要且常见的海产贝壳作物,研究发现,牡蛎干肉中蛋白质含量为43%~50%,脂肪含量为5%~10%,总糖为20%~39%,除此之外,维生素种类和含量也相当丰富,含碘量更是远远高于奶制品。牡蛎所含的矿物质在数量和质量上也远强于鱿鱼、海参、花蛤等同类型海产品,其中钙含量为40~94.04mg/g。
牡蛎中的钙属于无机钙源中的生物钙,这类钙可以通过一些独特的加工工艺处理后转变成更易于人体利用摄取的钙,因此它可作为钙制剂优良的天然原料之一。牡蛎提取物中的水溶性离子钙具有预防癌症、治疗慢性肾功能不全、防治佝偻病、局部骨质疏松症、糖尿病以及预防和治疗皮肤过敏性疾病等作用。
目前,钙离子常用的检测方法有分光光度计检测法、EDTA滴定法、高锰酸钾测定法等。但这些方法都存在一定的缺陷:采用分光光度法检测钙含量时存在待测样品稀释处理误差;EDTA法在样品处理中误差最小,但是消耗时间长,难以满足实践要求;利用沉淀的产生和溶解来间接测得钙离子含量的高锰酸钾法,使用原料损耗大,且原料的前期处理造成较大的难以弥补的偏差。由于这些方法的样品处理工艺和测定方法的适用范围不一样,在钙离子检测的精确度上难以统一,因而迫切需要一种检测更快速、结果更精准方法对牡蛎干中水溶性钙含量进行检测。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的在于提供了一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,首先通过微波-超声协同萃取对牡蛎干中的水溶性钙进行提取,用时短且提取效率高,再利用钙黄绿素荧光探针作为指示剂对待测液进行荧光光谱检测,再根据荧光探针标准曲线计算从而得到样品中水溶性钙的含量,检测过程用时较短、检测数据精准且稳定性高。
为了实现上述目标,本发明采用如下技术方案:
一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,包括如下步骤:
A1、样品预处理:将牡蛎干剪切成2~3mm长的小段,放入烘箱中烘烤至表面干脆,取出后放入超离心研磨仪中进行粉碎并过筛;
A2、微波-超声协同萃取:将研磨好的牡蛎干粉末与去离子水按比例混合放入萃取仪,进行微波-超声协同萃取,即得提取液;
A3、荧光分光光度计检测:向样品池中加入3-吗啉丙磺酸、氨三乙酸和钙绿黄素荧光探针,再加入步骤A2制得的未知水溶性钙浓度的提取液,以495nm作为激发光进行荧光光谱测定,根据荧光探针标准曲线计算待测液中水溶性钙的含量,即C;
A4、计算水溶性钙的含量:按以下公式计算试样中水溶性钙的含量:
式中:
X—试样中水溶性钙含量,单位为mg/g;
C—从标准工作曲线得到的试样溶液中水溶性钙含量,单位为mol/L;
V—样品体积,单位为mL;
M—钙的相对原子质量,40.078,单位为g/mol;
m—称取样品质量,单位为g;
f—稀释倍数。
其中,所述步骤A3荧光分光光度计检测中,荧光探针标准曲线制备过程如下:向不同的样品池中加入3-吗啉丙磺酸、氨三乙酸和钙绿黄素荧光探针,再分别加入不同浓度梯度的氯化钙标准溶液,以495nm作为激发光进行荧光光谱测定,根据所得数据进行标准工作曲线绘制。
其中,所述3-吗啉丙磺酸的工作浓度为100mM,氨三乙酸的工作浓度为100μM,钙绿黄素荧光探针的工作浓度为10mM。
其中,所述钙黄绿素英荧光探针制备过程如下:称取6.205mg钙黄绿素三钠盐,溶于1mL二甲基亚砜,即得到10mM的钙黄绿素荧光探针。
其中,所述步骤A1中,烘箱温度设置为60℃,烘烤处理2~4h。烘干目的是避免试样中水分在研磨仪高速工作产生的摩擦热作用下而引起挥发,致使牡蛎干黏度增大,引起部分灼烧糊底,导致机器损坏。烘干样品同时还提高了研磨效率,保证品质。
其中,所述步骤A1中,干燥的牡蛎样品进行粉粹后,用100目的筛圈重复过滤,至粉末均匀无明显大颗粒。
其中,所述步骤A2微波-超声协同萃取过程中,微波功率为300W,超声功率为1500W,提取温度为50~100℃,连续超声处理5min。
其中,所述步骤A2中,牡蛎干粉末与去离子水按照固液比1:3~12的比例进行混合。
其中,检测所用牡蛎干均为同一批从福建平潭购得。
钙离子荧光指示剂钙黄绿素(Calcein)是一种高亲和力的钙离子指示剂,具有穿透性强、不损伤细胞且能生成绿色荧光物质的优点。有研究发现,发现钙黄绿素染料在495nm波长激发时,在pH=12时对Ca2+络合反应敏感,因此本实验的pH值取12。
本发明有益效果如下:
1、本发明中采用超声-微波协同萃取对牡蛎干中的水溶性钙进行萃取,超声-微波协同萃取技术利用超声波振动的空化作用和微波的高能作用,使牡蛎干样品在强烈的振动能和强穿透力下破坏细胞。与其他提取方式相比,可以有效避免萃取物中热不稳定和极性组分丧失活性,较好地维持了分子的结构。
2、本发明采用超离心研磨仪对牡蛎进行粉碎,超离心研磨仪是由漏斗、转刀、圈筛和收集盘这四个主要组成部分构成,利用高速旋转的转刀和固定不动的圈筛之间的切割作用来实现样品的粉碎。其中,漏斗可避免样品产生回溅,样品通过漏斗落到具有极高转速的旋翼,与外延的楔形旋翼齿相互冲击碰撞使物质粉碎;转刀和圈筛产生的剪切作用使物质达到细粉碎状态。这种两级粉碎制样方式优点在于不会改变物质的特性且过程温和快速。
3、本发明建立了利用荧光探针检测牡蛎干中水溶性钙含量的方法,利用本方法检测牡蛎干中水溶性钙含量时,用时短、检测数据准确、稳定性高。本发明中的检测方法还可以应用于其它食品中水溶性钙的检测,具有良好的发展前景。
附图说明
图1为钙黄绿素探针对不同Ca2+浓度(0nM至38.8μM)的紫外吸收光谱;
图2为钙黄绿素探针对不同Ca2+浓度(0nM至38.8μM)的荧光光谱;
图3为钙黄绿色探针测定[Ca2+]free(0nM至38.8μM)的标准曲线图;
图4为钙黄绿素探针对不同浓度NTA(0至200μM)的荧光光谱;
图5为钙黄绿素探针对不同物料比样品的荧光光谱;其中,1:3为实施例2,
1:12为实施例4,1:6为实施例6;
图6为钙黄绿素探针针对不同提取萃取温度处理下样品的荧光光谱;其中,1:1250℃为实施例4,1:12 100℃为实施例5。
具体实施方式
为了更好的理解本发明,下面结合实施例和附图实施例对本发明做进一步说明,实施例只用于解释本发明,并不会对本发明构成任何限定。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1
荧光探针标准曲线的制备
1、药品的配制
(1)1M的3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲液:称取20.926g MOPS,加入80mL去离子水溶解,用2M NaOH调节溶液的pH值至12,最后加去离子水定容至100mL,即可得到1M的MOPSBuffer(pH=12)缓冲液。
(2)10mM的钙黄绿素荧光探针:称取0.006205g钙黄绿素三钠盐,溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中。
(3)0.1M的氨三乙酸(NTA)溶液:称取1.9114g氨三乙酸(NTA),溶于100mL去离子水中。
(4)0.1M的CaCl2溶液:称取1.1098g氯化钙,溶于100mL蒸馏水中。2、不同浓度梯度的Ca2+缓冲体系的配制:
取0.1M的CaCl2溶液0μL、50μL、100μL、500μL、1.25mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL、4.75mL、4.95mL、4.975mL,加入5mL的0.1M的NTA,和5mL的1M的MOPS,加入去离子水,并用2M NaOH调节溶液的pH值至12;配置成自由钙离子浓度分别为0nM、1.733nM、3.485nM、18.16nM、38.33nM、115nM、147.8nM、230nM、345nM、804.9nM、1.3μM、3μM、6.4μM、27μM、38.8μM的浓度梯度CaCl2溶液。取5μL上述浓度梯度的氯化钙溶液于EP管中,配置成Ca2+-NTA缓冲液。
3、吸收光谱检测
打开紫外分光光度计,先预热10~20min,然后分别向参比池和样品池内加入3mLCa2+-NTA缓冲液(0nM[Ca2+]free),进行基线校正。随后将3μL 10mM的钙绿黄素荧光探针加入样品池中,用移液枪轻轻对溶液进行吹吸混匀,随后进行紫外可见吸收光谱测定。清洗样品池,从小到大依次测量不同浓度的Ca2+-NTA缓冲液的钙绿黄素紫外吸收光谱,结果如图1所示。
结论:由图1可知,在未加入Ca2+时,钙黄绿素荧光探针在波长为500nm处出现吸收峰;加入不同Ca2+(0至38.8μM)后,吸收峰无明显变化。由此可以得出,紫外可见光分析不能用于检测钙黄绿素探针对Ca2+的标识。
4、荧光光谱检测
打开荧光光谱仪,先预热20min,样品池内加入3mL Ca2+-NTA缓冲液(0nM[Ca2+]free),再加入3μL 10mM的荧光探针钙绿黄素加入样品池,用移液枪缓缓吹吸混匀,用495nm作为激发光进行荧光光谱扫描。然后加入不同浓度Ca2+-NTA缓冲液(0至38.8μM),用495nm作为激发光进行荧光光谱测定,检测结果如图2所示。
结论:由图2可知,加入Ca2+后,钙黄绿素荧光强度增强,且随着Ca2+浓度的提高荧光强度逐渐增强。
5、标准工作曲线的绘制
根据Ca2+缓冲体系中自由钙离子浓度和荧光探针的荧光强度制作荧光探针标准曲线,结果如图3所示,经数据拟合处理后公式为:
式中:
X—试样中水溶性钙含量,单位为mg/g;
C—从标准工作曲线得到的试样溶液中水溶性钙含量,单位为mol/L;
V—样品体积,单位为mL;
M—钙的相对原子质量,40.078,单位为g/mol;
m—称取样品质量,单位为g;
f—稀释倍数。
6、工作溶液的确定
打开荧光光谱仪,先预热30min,随后向荧光池加入3mL 100mM MOPS(pH=12)和不同浓度的NTA(0至200μM)溶液,加入3μL 10mM钙绿黄素荧光探针,用移液枪缓缓吹吸混匀,用495nm作为激发光进行荧光光谱扫描。结果如图4所示。
结论:由图4可知,探针的荧光强度随NTA溶液浓度的增加而下降。对比图2和图4,当体系中只加入MPOS缓冲液,此时的荧光强度与图2中Ca2+浓度为38.8μM时荧光强度相当,说明钙黄绿素探针接近饱和,MOPS不能单独用作缓冲液。所以选用100μM NTA+100mM MOPS作为荧光法的缓冲液较为合适。
实施例2
一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,包括如下步骤:
A1、样品预处理:将牡蛎干剪切成2~3mm长的小段,便于后续研磨;将剪碎的牡蛎干小段放入烘箱,烘箱温度调至60℃,烘干2小时至表面干脆;将干燥的样品放入超离心研磨仪中进行粉碎,然后用100目的筛圈重复多次研磨,至粉末均匀无明显大颗粒;
A2、微波-超声协同萃取:取10g研磨好的牡蛎干粉末,按照固液比1:3的比例添加去离子水进行混合,放入萃取仪中,进行微波-超声协同萃取,即得提取液。微波功率为300W,超声功率为1500W,提取温度为50℃,连续超声处理5min。
A3、荧光分光光度计检测:向样品池中加入100mM MOPS、100μM NTA和10mM钙绿黄素荧光探针,再加入步骤A2制得的未知水溶性钙浓度的提取液,以495nm作为激发光进行荧光光谱测定,根据荧光探针标准曲线计算待测液中水溶性钙的含量,再带入公式计算牡蛎样品中中水溶性钙的含量。
实施例3
一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,包括如下步骤:
A1、样品预处理:将牡蛎干剪切成2~3mm长的小段,便于后续研磨;将剪碎的牡蛎干小段放入烘箱,烘箱温度调至60℃,烘干3小时至表面干脆;将干燥的样品放入超离心研磨仪中进行粉碎,然后用100目的筛圈重复多次研磨,至粉末均匀无明显大颗粒;
A2、微波-超声协同萃取:取10g研磨好的牡蛎干粉末,按照固液比1:6的比例添加去离子水进行混合,放入萃取仪中,进行微波-超声协同萃取,即得提取液。微波功率为300W,超声功率为1500W,提取温度为70℃,连续超声处理5min。
A3、荧光分光光度计检测:向样品池中加入100mM MOPS、100μM NTA和10mM钙绿黄素荧光探针,再加入步骤A2制得的未知水溶性钙浓度的提取液,以495nm作为激发光进行荧光光谱测定,根据荧光探针标准曲线计算待测液中水溶性钙的含量,再带入公式计算牡蛎样品中中水溶性钙的含量。
实施例4
一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,包括如下步骤:
A1、样品预处理:将牡蛎干剪切成2~3mm长的小段,便于后续研磨;将剪碎的牡蛎干小段放入烘箱,烘箱温度调至60℃,烘干2小时至表面干脆;将干燥的样品放入超离心研磨仪中进行粉碎,然后用100目的筛圈重复多次研磨,至粉末均匀无明显大颗粒;
A2、微波-超声协同萃取:取10g研磨好的牡蛎干粉末,按照固液比1:12的比例添加去离子水进行混合,放入萃取仪中,进行微波-超声协同萃取,即得提取液。微波功率为300W,超声功率为1500W,提取温度为50℃,连续超声处理5min。
A3、荧光分光光度计检测:向样品池中加入100mM MOPS、100μM NTA和10mM钙绿黄素荧光探针,再加入步骤A2制得的未知水溶性钙浓度的提取液,以495nm作为激发光进行荧光光谱测定,根据荧光探针标准曲线计算待测液中水溶性钙的含量,再带入公式计算牡蛎样品中中水溶性钙的含量。
实施例5
实施例5与实施例4的不同之处在于,在步骤A2微波-超声协同萃取中,提取温度为100℃。
实施例6
实施例6和实施例2、实施例4的不同之处在于,在步骤A2微波-超声协同萃取中,牡蛎干粉末与去离子水按照固液比1:6的比例进行混合。
具体测试方法
一、为了探究不同料液比对牡蛎干中水溶性钙含量检测的影响,选取经实施例2、4、6(三组实施例检测方法中除料液比不同外,其它处理条件均相同;其中实施例2、4、6的料液比分别为1:3、1:12、1:6)处理的样品进行荧光光谱检测,检测步骤如下:
向荧光池加入3mL 100mM MOPS和100μM NTA,加入3μL 10mM荧光探针钙绿黄素,用移液枪缓缓吹吸混匀,用495nm作为激发光进行荧光光谱扫描。然后分别加入经实施例2、4、6处理的提取液,用495nm作为激发光进行荧光光谱测定。结果如图5所示:
结论:由图5可知,在萃取温度相同下,荧光强度随物料比的增大而增强,当物料比为1:3时,样品的荧光强度达到最大。
二、为了探究不同萃取温度对牡蛎干重水溶性钙含量检测的影响,选取经实施例4和实施例5(两组实施例中牡蛎干提取液的处理过程中,除萃取温度不同,其它处理条件均相同;其中,实施例4和实施例5的萃取温度分别为50℃、100℃)处理的牡蛎干样品进行荧光光谱检测,步骤如下:
向荧光池加入3mL 100mM MOPS和100μM NTA,加入3μL 10mM荧光探针钙绿黄素,用移液枪缓缓吹吸混匀,用495nm作为激发光进行荧光光谱扫描。然后分别加入经实施例4、5处理的提取液,用495nm作为激发光进行荧光光谱测定。结果如图6所示:
结论:由图6可知,在物料比相同时,萃取温度为50℃的样品荧光强度略高于100℃。
三、将经实施例2-6处理的提取液样品均进行荧光光谱检测,将所得数值带入荧光探针标准曲线中得到提取液中的水溶性钙含量,再带入公式计算实施例2-6中牡蛎干的水溶性钙含量总量,检测结果如表1所示:
表1提取样品Ca2+总量
由表1可知,在料液比相同的情况下,萃取温度为50℃的样品水溶性钙的总量比100℃高;在温度相同的情况下,水溶性钙离子总量随着料液比中牡蛎的增加而增加,料液比为1:3处理的样品提取钙离子的总量最高;在所测的样品中,实施例2中处理的牡蛎干中水溶性钙含量最高,为0.5605mg/g,料液比为1:3,萃取温度为50℃。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,故凡未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰,均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,其特征在于:包括如下步骤:
A1、样品预处理:将牡蛎干剪切成小段,放入烘箱中烘烤至表面干脆,取出后放入超离心研磨仪中进行粉碎并过筛;
A2、微波-超声协同萃取:将研磨好的牡蛎干粉末与去离子水按比例混合放入萃取仪,进行微波-超声协同萃取,即得提取液;
A3、荧光分光光度计检测:向样品池中加入3-吗啉丙磺酸、氨三乙酸和钙绿黄素荧光探针,再加入步骤A2制得的未知水溶性钙浓度的提取液,以495nm作为激发光进行荧光光谱测定,根据荧光探针标准曲线计算待测液中水溶性钙的含量;
A4、计算水溶性钙的含量。
2.如权利要求1所述的一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,其特征在于:所述步骤A3荧光分光光度计检测中,荧光探针标准曲线制备过程如下:向不同的样品池中加入3-吗啉丙磺酸、氨三乙酸和钙绿黄素荧光探针,再分别加入不同浓度梯度的氯化钙标准溶液,以495nm作为激发光进行荧光光谱测定,根据所得数据进行标准工作曲线绘制。
3.如权利要求1或2任一所述的一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,其特征在于:所述3-吗啉丙磺酸的工作浓度为100mM,氨三乙酸的工作浓度为100μM,钙绿黄素荧光探针的工作浓度为10mM。
4.如权利要求1所述的一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,其特征在于:所述步骤A1中,烘箱温度设置为60℃,烘烤处理2~4h。
5.如权利要求1所述的一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,其特征在于:所述步骤A1中,干燥的牡蛎样品进行粉粹后,用100目的筛圈重复过滤,至粉末均匀无明显大颗粒。
6.如权利要求1所述的一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,其特征在于:所述步骤A2微波-超声协同萃取过程中,微波功率为300W,超声功率为1500W,提取温度为50~100℃,连续超声处理5min。
7.如权利要求1所述的一种牡蛎干中水溶性钙含量的检测方法,其特征在于:所述步骤A2中,牡蛎干粉末与去离子水按照固液比1:3~12的比例进行混合。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210420 |
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