CN112675255A - 用于预防治疗受试者抑郁症的药物组合物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开用于预防治疗受试者抑郁症的药物组合物及用途。本发明的药物组合物包含以下原料：黄花菜、酸枣仁、百合和佛手。将原料按照(2‑5):(2‑5):(1‑4):(1‑4)重量比混合后，加入水煎煮、过滤、浓缩干燥后得到欣宁颗粒。本发明的药物组合物通过中草药提取物组分的科学配伍而成，原料易得且制备方法简单，制备得到的药物组合物或欣宁颗粒能够有效预防治疗抑郁症。

Description

用于预防治疗受试者抑郁症的药物组合物及用途

技术领域

本发明涉及中医药领域，具体地涉及用于预防治疗受试者抑郁症的药物组合物及用途。

背景技术

抑郁症是一种常见的精神类疾病，全球有超过3亿人患有抑郁症，分布于各个年龄层。对于抑郁症患者而言，抗抑郁药物治疗是最主要的方法。目前已经开发出众多可用于抗抑郁新型药物。在各种抑郁症疾病患者当中，西药，例如氟西汀、西酞普兰、氟伏沙明、阿米替林、帕罗西汀、度洛西汀等的服用数量与服用人群是最大的。虽然这些西药在国内倍受青睐，然而，我国抑郁症临床一线药物基本被进口药与合资化药所垄断，且这些药物大多存在效率低、毒副反应多、价格昂贵等严重缺陷。以中药，尤其是中草药开发具有抗抑郁药物的研究逐渐受到人们的关注。

例如，CN108143741A公开了厚朴酚糖苷在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用，研究发现具有厚朴酚-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷结构，或其药用盐及其药物组合物能够应用于制备褪黑素受体激动剂和治疗或预防与褪黑素受体相关的中枢神经系统疾病的药物。厚朴酚-4-O-β-D-葡萄吡喃糖苷可通过化学合成方法获得。不过该专利并没有详细的阐述其在抗抑郁过程的机理。

再例如，CN103431375A公开了一种抑郁症患者食用的特殊膳食，其包括以香橼、佛手、菊花、玫瑰花、紫苏叶、金橘、各类益生菌、螺旋藻等原料为主料，酸枣仁、莲子芯、黄花菜、平卧菊三七、百合等为辅料，经煎汁浓缩后得到的一种特殊膳食。该膳食中含有众多中草药以及辅料(例如黄花菜)，原料多，且并没有进行抗抑郁效果的验证。

虽然目前市场上以中草药或其提取物的食品或制剂用于预防或治疗抑郁症的产品逐渐增多，不过这些产品或药物一方面存在组分单一或组分极其复杂的问题。另一方面，此类以中草药为主的产品或药物对抗抑郁症机理尚不明确，同时也缺少抗抑郁症效果的有效性验证。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种用于预防治疗受试者抑郁症的药物组合物及用途，该药物组合物通过中草药提取物组分的科学配伍制备得到，本发明的组合物以黄花菜和酸枣仁为主要原料，制备得到的药物组合物具有预防和治疗抑郁症的效果，并进一步对其用于抑郁症防治的机理进行了阐述。另外，通过实验进行了有效性验证。具体地，本发明包含以下内容。

本发明的第一方面，提供欣宁颗粒在制备用于预防治疗受试者抑郁症的药物中的用途，所述欣宁颗粒为由黄花菜、酸枣仁、百合和佛手作为原料得到的提取物。

本发明中，作为原料的黄花菜有时也称为萱草、忘忧草、金针菜或萱草花等，为多年生草本。其入药部位不特别限定，例如根、茎、花或全草均可作为原料的入药部位。作为原料的酸枣仁为鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子。作为原料的百合的入药部位为百合科植物卷丹或细叶百合的干燥肉质鳞叶。作为原料的佛手的入药部位为芸香科植物佛手的干燥果实。

优选地，所述欣宁颗粒的制备方法包括将黄花菜、酸枣仁、百合和佛手按(2-5):(2-5):(1-4):(1-4)，优选(2-5):(2-5):(2-4):(2-4)的重量比混合，加入8-12倍的水煎煮后过滤得到滤液，然后在100-120℃浓缩、干燥得到粉末。进一步优选地，所述欣宁颗粒的制备方法包括将黄花菜、酸枣仁、百合和佛手按(2-5):(2-5):(1-3):(1-3)的重量比混合，加入9-11倍的水煎煮后过滤得到滤液，然后在100-110℃浓缩、干燥得到粉末。

本发明中，所述预防治疗包括通过向受试者提供欣宁颗粒，从而改善、缓解、减轻、消除抑郁样行为或焦虑样行为的步骤，欣宁颗粒可溶于水溶液形成具有一定浓度的制剂。优选地，欣宁颗粒溶于水溶液后得到的制剂按受试者体重0.1-0.4ml/10g给药。更优选地，按体重0.15-0.35ml/10g给药。还优选地，按体重0.17-0.25ml/10g给药。

优选地，所述预防治疗包括以0.2-3g/kg重量的量向受试者提供欣宁颗粒，从而改善、缓解、减轻、消除抑郁样行为或焦虑样行为的步骤。进一步优选地，向受试者提供欣宁颗粒的量为0.3-2.5g/kg。还优选地，向受试者提供欣宁颗粒的量为0.375-2.5g/kg。

根据本发明的欣宁颗粒在制备用于预防治疗受试者抑郁症的药物中的用途，优选地，所述抑郁症为应激所致抑郁。

本发明的第二方面，提供欣宁颗粒在制备用于提高或增强受试者体内的单胺类递质的药物中的用途，其特征在于，所述欣宁颗粒为由黄花菜、酸枣仁、百合和佛手作为原料得到的提取物。本发明中，欣宁颗粒的制备以黄花菜和酸枣仁为主要原料，发明人研究发现，黄花菜和酸枣仁作为主要原料，并在固定配比时，可以有效改善利血平致抑郁样啮齿类动物模型的抑郁症状，其通过提高中枢单胺类递质来达到改善抑郁的目的。

本发明的第二方面，提供一种用于预防治疗受试者抑郁症的药物组合物，其包含由黄花菜、酸枣仁、百合和佛手作为原料得到的提取物。

根据本发明的用于预防治疗受试者抑郁症的药物组合物，优选地，所述药物组合物通过下述方法制备得到：将由黄花菜、酸枣仁、百合和佛手按2：2：1：1配比，加10倍量水，煎煮1小时，过80目滤网，得滤液，滤渣按相同方法提取2-5次，合并滤液。

根据本发明的用于预防治疗受试者抑郁症的药物组合物，优选地，所述制备方法进一步包括在100℃浓缩、干燥所述滤液得到粉末的步骤。

本发明的药物组合物通过中草药提取科学配伍而成，原料易得且制备方法简单。本发明人通过实验发现基于特定原料制备得到的欣宁颗粒能够有效的发挥抗抑郁作用。此外，本发明进一步通过空场实验消除了假阳性或假阴性结果的可能性，并通过实验对欣宁颗粒抗抑郁效果进行了有效性验证。

附图说明

图1为给药后小鼠体重结果示意图(n＝12，Mean±SEM，其中A表示给药前体重；B表示给药3周后体重)。

图2为给药3周后空场检测的实验结果(n＝10-12，与对照组比较，*P＜0.05)。

图3为给药3周后悬尾检测的实验结果(n＝10-12，与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01)。

图4为给药3周后强迫游泳检测的实验结果(n＝10-12，与对照组比较，*P＜0.05)。

图5为欣宁颗粒对利血平拮抗实验小鼠眼睑下垂、体温降低的影响(**P＜0.01，与对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与利血平模型组相比；&P＜0.05，两组方同剂量比较(n＝10-12，Mean±SEM)。

图6为欣宁颗粒对CUMS大鼠体重的影响(n＝9-10，结果显示为均值±标准误(n＝9-10)，与对照组比较，##P＜0.01；与CUMS组比较，**P＜0.01)。

图7为欣宁颗粒对CUMS大鼠糖水偏爱指数的影响(n＝9-10，结果显示为均值±标准误(n＝9-10)，与对照组比较，#P＜0.05；与CUMS组比较，*P＜0.05，**P＜0.01)。

图8为欣宁颗粒对CUMS大鼠自主活动的影响(n＝8-10，结果显示为均值±标准误(n＝8-10)；与对照组比较，##P＜0.01)。

图9为欣宁颗粒对CUMS大鼠摄食潜伏期的影响(n＝10，结果显示为均值±标准误(n＝10))。

图10为欣宁颗粒对CUMS大鼠高架十字迷宫的影响(n＝9-10，结果显示为均值±标准误(n＝9-10)；与对照组比较，##P＜0.01；与CUMS组比较，*P＜0.05)。

图11为欣宁颗粒对CUMS大鼠悬尾检测不动时间的影响(n＝8-10，结果显示为均值±标准误(n＝8-10)；与对照组比较，##P＜0.01；与CUMS组比较，**P＜0.01)。

图12为欣宁颗粒对CUMS大鼠强迫游泳检测不动时间的影响(n＝9-10，结果显示为均值±标准误(n＝9-10)；与CUMS组比较，**P＜0.01)。

图13为欣宁颗粒对CUMS致抑郁大鼠模型海马尼氏体的影响(尼氏染色，×400，其中，黑色箭头表示细胞萎缩呈空泡状；空白箭头表示细胞间隙增大)。

图14为欣宁颗粒对CUMS致抑郁大鼠模型海马组织病理形态的影响(HE染色，×400，其中，黑色箭头表示细胞萎缩呈空泡状；空白箭头表示细胞间隙增大)。

图15为两种黄花菜复方对小鼠体重的影响(n＝12，Mean±SEM，其中A表示给药前；B表示给药3周后)。

图16为两种黄花菜复方连续给药21d小鼠旷场实验中的总距离和运动时间(*P＜0.05，与对照组比较(n＝10-12，Mean±SEM))。

图17为两种黄花菜复方连续给药21d小鼠悬尾实验中的不动时间(*P＜0.05，**P＜0.01，与对照组比较(n＝10-12，Mean±SEM))。

图18为两种黄花菜复方连续给药21d小鼠强迫游泳实验中的不动时间(*P＜0.05，与对照组比较(n＝10-12，Mean±SEM))。

图19为两种黄花菜复方对利血平拮抗实验小鼠眼睑下垂、体温降低的影响(**P＜0.01，与对照组比较；#P＜0.05，##P＜0.01，与利血平模型组相比；&P＜0.05，两组方同剂量比较(n＝10-12，Mean±SEM))。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

实施例1

一、欣宁颗粒抗抑郁药效学急性实验

1.材料与方法

1.1实验仪器：

小鼠悬尾实时检测分析系统(中国医学科学院药用植物研究所、中国航天员中心、北京康森益友科技有限公司共同研发)，小鼠强迫游泳仪(中国医学科学院药用植物研究所、中国航天员中心、北京康森益友科技有限公司共同研发)，小鼠自主活动实时检测分析系统(中国医学科学院药用植物研究所、中国航天员中心、西南医科大学、北京康森益友科技有限公司共同研发)，AL104电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2试剂和药品：

盐酸帕罗西汀(中国食品药品检定研究院，批号100357-201102)；欣宁颗粒(批号：201908，由中国医学科学院药用植物研究所提供)由黄花菜、酸枣仁、百合和佛手按2：2：1：1配比研制而成。

取适量药材，加10倍量水，煎煮1小时，过80目滤网，得滤液，滤渣按相同方法提取2次。合并3次滤液，即得。在100℃，浓缩后干燥成粉末，提取率都是26％。苦味酸(成都格雷西亚化学技术有限公司，批号201209135)。

1.3实验动物

SPF级ICR雄性小鼠，体质量20±2g，共60只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(批号：scxk(京)2016-0006)。

实验期间喂养于实验动物房，自由供给标准饲料和清洁自来水，光照时间12h：12h(光：暗)，室温22-25℃，湿度条件为55±10％。

2.实验方法

2.1实验分组：

小鼠每6只饲养在一笼内，自由进食禁水，动物在新饲养环境适应5d后开始实验。小鼠被分为5组(n＝12)，各给药组药物溶于纯净水至相应浓度灌胃给药，空白组给纯净水，按体重0.2ml/10g给药，连续21d后进行行为学测试：

(1)对照组：每日灌胃纯净水一次；

(2)阳性药组：每日灌胃10mg/kg盐酸帕罗西汀一次；

(3)欣宁颗粒低剂量：每日灌胃0.625g/kg欣宁颗粒一次；

(4)欣宁颗粒中剂量：每日灌胃1.25g/kg欣宁颗粒一次；

(5)欣宁颗粒高剂量：每日灌胃2.5g/kg欣宁颗粒一次。

2.2空场实验

2.2.1检测

将小鼠放入空场测试箱，检测5min。观察统计小鼠在测试时间内的活动情况。

2.2.2评价指标

总路程、运动总时间、平均速度、站立次数、中央区运动时间。运动的路程、时间、速度、站立次数值越大就越不抑郁，抗焦虑模式判断指标为中央区运动时间，时间越长越不焦虑。

2.3悬尾实验

2.3.1检测

将胶布粘在小鼠尾端1cm处，将胶布挂在压力传感器的勾上，使小鼠呈倒悬体位，头部离悬尾箱底面约5cm。观察6min，记录后4min的累计不动时间。

2.3.2评价指标

后4min的累计不动时间。累计不动时间增加认为有“抑郁样”表现，反之则认为有抗抑郁作用。

2.4强迫游泳实验

2.4.1检测

水温调至25℃。灌胃给药1h后进行游泳实验，观察6min，记录后4min的累计不动时间。

2.4.2评价指标

后4min的累计不动时间。累计不动时间增加认为有“抑郁样”表现，反之则认为有抗抑郁作用。

3.实验数据统计

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有数据均以均数±SEM表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组间差异有统计学意义。显著性水平为P<0.01或P<0.05。图形由GraphPad Prism 5,GraphPad Software提供。

4.实验结果

4.1体重实验结果

如图1所示，最开始各组体重无显著性差异，后来各组体重都在稳步上升，SPSS分析显示给药3周后各组体重无显著性差异(P＞0.05)。

4.2空场实验结果

空场实验结果如图2所示，结果表明阳性药组的总路程、运动路程与对照组有差异(P＜0.05)。欣安颗粒高剂量组(2.5g/kg)、解郁颗粒高(2.5g/kg)中(1.25g/kg)低(0.625g/kg)剂量组的总路程、运动路程、运动时间与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。

4.3悬尾实验结果

如图3所示，实验结果显示与对照组比较，氟西汀10mg/kg与心宁颗粒1.25和2.5g/kg均可显著缩短小鼠悬尾不动时间(分别为P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01)。

4.4强迫游泳实验结果

如图4所示，实验结果显示与对照组相比，氟西汀组、欣宁颗粒低中高剂量组与空白组的不动时间都显著性下降(P＜0.05)。

5.结论

空场实验说明没有中枢激发或抑制作用，从而消除了假阳性或假阴性结果的可能性。欣宁颗粒悬尾实验与强迫游泳实验证明，欣宁颗粒具有抗抑郁样效果。

二、欣宁颗粒对利血平拮抗模型的影响

1.实验材料

1.1主要仪器

DT^-1TB电子体温计(上海医用仪表厂)。

1.2试剂和药品：

盐酸帕罗西汀(中国食品药品检定研究院，批号100357-201102)；欣宁颗粒(批号：201908，由中国医学科学院药用植物研究所提供)由黄花菜、酸枣仁、百合和佛手按2：2：1：1配比研制而成。

取适量药材，加10倍量水，煎煮1小时，过80目滤网，得滤液，滤渣按相同方法提取2次。合并3次滤液，即得。在100℃，浓缩后干燥成粉末，提取率都是26％。苦味酸(成都格雷西亚化学技术有限公司，批号201209135)；利血平(天津金耀药业有限公司，批号1803211)。

1.3实验动物

SPF级ICR雄性小鼠，体质量20±2g，共70只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(批号：scxk(京)2016-0006)。实验期间喂养于实验动物房，自由供给标准饲料和清洁自来水，光照时间12h：12h(光：暗)，室温22-25℃，湿度条件为55±10％。

2.实验方法

2.1实验分组：

(1)对照组：灌胃纯净水1h后，按体重2mg/kg腹腔注射生理盐水；

(2)模型组：灌胃纯净水1h后，按体重2mg/kg腹腔注射利血平；

(3)阳性药组：灌胃10mg/kg盐酸帕罗西汀1h后，按体重2mg/kg腹腔注射利血平；

(4)欣宁颗粒低剂量：灌胃0.625g/kg欣宁颗粒1h后，按体重2mg/kg腹腔注射利血平；

(5)欣宁颗粒中剂量：灌胃1.25g/kg欣宁颗粒1h后，按体重2mg/kg腹腔注射利血平；

(6)欣宁颗粒高剂量：灌胃2.5g/kg欣宁颗粒1h后，按体重2mg/kg腹腔注射利血平。

2.2利血平拮抗实验

2.2.1检测

于给药1h后注射利血平(2mg/kg)，注射时注意避光，其后依次进行检测。

2.2.2评价指标

注射利血平1h后实验者观察动物眼睑下垂程度，根据分数等级进行打分，眼闭1/4记1分，眼闭1/2记2分，眼闭3/4记3分，全闭记4分；注射利血平4h后通过测量小鼠肛温检测动物体温下降程度。

3.实验数据统计

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有数据均以均数±SEM表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组间差异有统计学意义。显著性水平为P<0.01或P<0.05。图形由GraphPad Prism 5,GraphPad Software提供。

4.实验结果

如图5所示，实验结果显示空白组与模型组及给药各组眼睑下垂程度、肛温有显著性差异(P＜0.01)。阳性药、欣宁颗粒中(1.25g/kg)高(2.5g/kg)剂量组与模型组的眼睑下垂程度有显著性差异(P＜0.01)。欣宁颗粒中(1.25g/kg)剂量组与模型组的肛温有显著性差异(P＜0.01)，阳性药与模型组的肛温有差异(P＜0.05)。

5.结论

实验结果表明，欣宁颗粒可能通过增强中枢单胺类递质来发挥抗抑郁作用。

三、欣宁颗粒对慢性不可预知温和应激所致抑郁的效果

1.实验材料

1.1主要仪器：

Digbehv动物行为分析系统，上海吉量软件科技有限公司产品；JL Behv-ORG-4新物体识别视频分析系统，上海吉量软件科技有限公司产品；JL BehvEPMG高架十字迷宫，上海吉量软件科技有限公司产品；树脂玻璃圆筒中(高46厘米，直径21厘米)；AUY220型分析天平，AUW-220D型分析天平，梅特勒公司产品；ME2002E型电子天平，梅特勒公司产品。ST8R型台式高速冷冻离心机，湖南飞默科技有限公司产品。

1.2试剂和药品：

盐酸氟西汀片(常州四药制药有限公司，批号H19980139)；蔗糖(国药集团化学试剂有限公司，批号20190918)；水合氯醛(麦克林公司，批号C10232289)；欣宁颗粒(批号：201908，由中国医学科学院药用植物研究所提供)由黄花菜、酸枣仁、百合和佛手按2：2：1：1配比研制而成。

取适量药材，加10倍量水，煎煮1小时，过80目滤网，得滤液，滤渣按相同方法提取2次。合并3次滤液，即得。在100℃，浓缩后干燥成粉末，提取率都是26％。

1.3实验动物

SPF级SD大鼠(200±20g)，雄性，60只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(批号：scxk(湘)2016-0002)，实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2015-0016。实验期间在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境饲养，自由供给标准饲料和清洁自来水，光照时间12h/12h(光/暗)，室温22-25℃，湿度条件为55±10％。动物在新饲养环境适应7d后开始实验。

2.实验方法

2.1实验分组：

(1)对照组：每天按体重10ml/kg灌胃给纯净水；

(2)模型组：每天给予刺激前的1h，每天按体重10ml/kg灌胃给纯净水；

(3)阳性药组：每天给予刺激前的1h，每天按体重10ml/kg灌胃给3.6mg/kg氟西汀；

(4)欣宁颗粒低剂量：每天给予刺激前的1h，每天按体重10ml/kg灌胃给0.375g/kg欣宁颗粒；

(5)欣宁颗粒中剂量：每天给予刺激前的1h，每天按体重10ml/kg灌胃给0.75g/kg欣宁颗粒；

(6)欣宁颗粒高剂量：每天给予刺激前的1h，每天按体重10ml/kg灌胃给1.5g/kg欣宁颗粒。

2.2糖水偏爱实验

所有大鼠都适应了1％的蔗糖溶液(w/v):24h两瓶蔗糖溶液，24h一瓶蔗糖溶液和一瓶水。禁食禁水24h，进行1h的糖水偏好检测。期间老鼠被安置在单独的笼子和两个瓶子，一个包含200ml1％的蔗糖溶液和一个包含200ml水。糖水偏爱指数按照下式计算：

糖水偏爱指数(％)＝蔗糖水饮用量/(蔗糖水饮用量+自来水饮用量)*100％

2.3空场实验

旷场检测使用Behav动物行为分析系统(上海吉量科技有限公司产品)。将大鼠面壁放入空场测试箱，自由探索5min，电脑会记录5min内所走过的距离，并使用软件进行分析计算。每次动物检测结束后，清理动物粪便，并用酒精擦拭。空场箱尺寸为70*70*70cm，中央区的定义为距离边缘50％的区域。

2.4新奇环境摄食抑制实验

采用方形敞箱，中心放3粒同等大小的食丸。大鼠在禁食禁水24小时后，放入敞箱中，每次从同一方向、同一位置放入，记录15min内第一次摄食潜伏期(以开始咬食食丸为标准)，即动物自放入笼中至首次摄取食物的时间，15min内未摄食计为15min。

2.5高架十字迷宫

将大鼠面向开臂放入高架十字迷宫的中央臂中，测试5min。观察大鼠5min内进入开臂或闭臂的次数，在开臂或闭臂停留的时间。每次实验后，清理高架十字迷宫，使用75％的酒精消除气味。

2.6悬尾实验

将胶布粘在大鼠尾把，将胶布挂在大鼠笼上，使大鼠呈倒悬体位，头部离悬尾箱底面约5cm，观察6min，并用DV记录，后续让人员数大鼠后4min的累计不动时间。试验过程(6min)由定位在圆柱体正前方的摄像机记录。行为分析由有经验的实验对象，记录的参数是后4min的不动时间。

2.7强迫游泳实验

在测试游泳前24小时，先进行预游(15分钟)。在测试当天，所有的动物都被再次放入装有30厘米深度水(54℃)的树脂玻璃圆筒中(高46厘米，直径21厘米)。试验过程(5min)由定位在圆柱体正前方的摄像机记录。行为分析由有经验的实验对象，记录的参数是5min内的不动时间。

3.实验数据统计

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有数据均以均数±SEM表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组间差异有统计学意义。显著性水平为P<0.01或P<0.05。图形由GraphPad Prism 5,GraphPad Software提供。

4.实验结果

4.1体重实验结果

如图6所示，各组体重稳步上升，空白组以及阳性药组与CUMS组体重有显著性差异(P＜0.01)，欣宁颗粒组与CUMS组体重无差异(P＞0.05)。

4.2糖水偏爱实验结果

糖水偏爱实验结果如图7所示，空白组与CUMS组的糖水偏爱指数有差异(P＜0.05)，CUMS组的明显降低，说明模型建立成功。阳性药组、欣宁颗粒低中剂量组与CUMS组的糖水偏爱指数有差异(P＜0.05)，欣宁颗粒高剂量组与CUMS组的糖水偏爱指数有显著性差异(P＜0.01)。

4.3空场实验结果

如图8所示，空白组与CUMS组的总路程(P＜0.01)，其余各组无显著性差异。类似中央区时间、中央区路程等指标，各组无显著性差异(P＞0.05)。4.4新奇环境摄食抑制实验结果

如图9所示，与模型组相比，空白组以及给药组的摄食潜伏期虽然更短但无显著性差异(P＞0.05)。

4.5高架十字迷宫实验结果

如图10所示，与对照组相比，模型组的开臂停留时间与开臂进入次数百分比明显降低(P＜0.01)，但氟西汀与欣宁颗粒中、高剂量组可以逆转这种降低(P＜0.05)。

4.6悬尾实验结果

如图11所示，空白组与CUMS组的不动时间有差异(P＜0.05)，阳性药组、欣宁颗粒低、中、高剂量组与模型组的不动时间有显著性差异(P＜0.01)。

4.7强迫游泳实验结果

如图12所示，空白组与CUMS组的不动时间有差异(P＜0.05)，欣宁颗粒高剂量组与模型组的不动时间有显著性差异(P＜0.01)，其余组无显著性差异(P＞0.05)。

5.结论

欣宁颗粒对慢性不可预知温和应激(CUMS)诱导的抑郁样行为有保护作用。欣宁颗粒对慢性不可预知温和应激(CUMS)诱导的焦虑样行为有保护作用。

四、尼氏染色和HE染色实验

1.尼氏染色实验

1.1实验动物

CUMS大鼠、SPF级小鼠，实验期间喂养于实验动物房，自由供给标准饲料和清洁自来水，光照时间12h：12h(光：暗)，室温22-25℃，湿度条件为55±10％。

1.2.实验分组：

(1)对照组：每天按体重10ml/kg灌胃给纯净水；

(2)模型组：每天按体重10ml/kg灌胃给纯净水；

(3)阳性药组：每天按体重10ml/kg灌胃给3.6mg/kg氟西汀；

(4)欣宁颗粒低剂量：每天按体重10ml/kg灌胃给0.375g/kg欣宁颗粒；

(5)欣宁颗粒中剂量：每天按体重10ml/kg灌胃给0.75g/kg欣宁颗粒；

(6)欣宁颗粒高剂量：每天按体重10ml/kg灌胃给1.5g/kg欣宁颗粒。

1.3尼氏染色实验结果

如图13所示，尼氏染色显示尼氏体(神经元密度)改变。对照组小鼠海马CA1-4区及齿状回(DG)的椎体细胞层细胞带结构完整，分层明显神经元排列整齐紧密,胞体饱满、边界清晰、尼氏小体丰富,核大而圆、结构清晰，胞浆透明。与对照组相比，模型组大部分神经元呈弱染色，说明海马神经元普遍退化，大量尼氏体和神经元丢失，细胞间隙增大，细胞萎缩成空泡状。相比之下，欣宁颗粒处理组表现出较强的染色，海马中神经元排列规律。中、高剂量组尼氏体和神经元密度显著增加。

2.HE染色实验

HE染色实验结果如图14所示，对照组神经细胞结构形态正常，细胞轮廓清晰，结构致密，核仁清晰可见。与对照组相比，CUMS大鼠海马DG区及CA1、CA2、CA3、CA4区域神经元形态发生明显变化；模型组部分神经元间隙增大，神经元稀疏(空白箭头标记)，神经元肿胀或萎缩，核仁消失，核膜溶解，细胞萎缩成空泡状(黑色箭头标记)。与模型组相比，欣宁颗粒中、高剂量可减轻小鼠的神经细胞变化；只有少数神经细胞退化、不规则散在，欣宁颗粒逆转了观察到的神经元弥漫性退化的现象。

五、两种黄花菜复方抗抑郁作用的比较研究

1.实验材料

本实验采用欣安颗粒、欣宁颗粒研究两种黄花菜复方抗抑郁作用，其中，欣安颗粒由生黄芪，茯苓，黄花菜，酸枣仁按3：3：4：4配比研制而成。

2.方法

2.1试验分组及给药

根据之前的急性实验的结果来设置剂量筛选实验。适应期结束后，根据小鼠体重随机分为8组(每组12只)：空白对照组、阳性对照组(盐酸帕罗西汀10mg/kg)、欣宁颗粒低(0.625g/kg)中(1.25g/kg)高(2.5g/kg)剂量组、解郁颗粒低(0.625g/kg)中(1.25g/kg)高(2.5g/kg)剂量组。各给药组药物溶于纯净水至相应浓度灌胃给药，空白组给纯净水，按体重0.2ml/10g给药，连续21d后进行行为学测试。

2.2行为绝望模型

2.2.1小鼠空场试验(OFT)

小鼠给药1h后进行空场试验，将小鼠置于开放场地盒中央(40cm×40cm×40cm)，允许小鼠自由进入场地探索5分钟。活动被固定在设备顶部的摄像机记录下来，并使用软件进行分析。测量了总距离，记录了运动时间。在测试期间，仪器被酒精和水擦拭以消除气味。

2.2.2小鼠悬尾试验(TST)

小鼠悬尾试验与文献报道的类似，将医用胶带粘在小鼠尾端1cm处，将胶布挂在小鼠悬尾试验箱的压力传感器上，使小鼠头部朝下，头部离悬尾箱底面约5cm(小鼠被各自隔开)。使动物适应2min，系统自动记录后4min小鼠的累计不动时间。

2.2.3小鼠强迫游泳试验(FST)

强迫游泳试验在悬尾试验的第二天进行，每只小鼠被单独置于一个装有清洁水的透明圆柱形塑料桶内(高20cm，直径18cm，水深12cm)，水温调至25℃。使小鼠适应2min，分析处理系统自动记录后4min的累计不动时间。每只小鼠测试后及时换水，将小鼠用毛巾擦干后放入鼠笼中。

2.3小鼠利血平耗竭实验

106只ICR小鼠除增加模型组(10只)外，其余分组同2.1。空白对照组与模型组灌胃给纯净水，给药组给相应的药，给药1h后，空白对照组皮下注射给予生理盐水，其余组均皮下注射给予利血平(2mg/kg)，注射时注意避光，其后依次进行检测。评价指标：注射利血平1h后实验者观察动物眼睑下垂程度，根据分数等级进行打分，眼闭1/4记1分，眼闭1/2记2分，眼闭3/4记3分，全闭记4分；注射利血平4h后用电子温度计测量小鼠肛温。

2.4数据分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有数据均以均数±SEM表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组间差异有统计学意义。显著性水平为P<0.01或P<0.05。图形由GraphPad Prism 5,GraphPad Software提供。

3.实验结果

3.1两种黄花菜复方对小鼠体重的影响

图15显示的为小鼠给药前和给药3周后的体重。如图15中的A所示，各组初始体重基本一致，给药3周后各组的体重也无显著性差异(P＞0.05)。表明欣宁颗粒与欣安颗粒不会对动物体重造成影响。

3.2两种黄花菜复方对小鼠OFT中自主活动的影响

如图16所示，与溶剂对照组比较，帕罗西汀10mg/kg组的总距离有显著性差异(P＜0.05)，运动时间更长但无显著性差异(P＞0.05)。欣宁颗粒及欣安颗粒低、中、高剂量组小鼠总距离和运动时间均无显著性差异(P＞0.05)，提示欣宁颗粒和欣安颗粒在受试剂量下无中枢兴奋或抑制作用，对小鼠的自主运动无影响。

3.3两种黄花菜复方对小鼠TST中不动时间的影响

与对照组比较，帕罗西汀10mg/kg与欣宁颗粒1.25和2.5g/kg均可显著缩短小鼠悬尾不动时间(P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01，图17)，提示欣宁颗粒具有抗抑郁作用。欣安颗粒的各剂量组与对照组相比，悬尾的不动时间虽有下降趋势，但无显著性。与欣安颗粒相比，欣宁颗粒同剂量组的悬尾不动时间更少，但无显著性差异。

3.4两种黄花菜复方对小鼠FST中不动时间的影响

在小鼠强迫游泳实验中，与对照组比较，帕罗西汀10mg/kg与欣宁颗粒0.625、1.25和2.5g/kg均可显著缩短不动时间(P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05，图18)，提示欣宁颗粒具有抗抑郁作用。欣安颗粒的各剂量组与对照组相比，强迫游泳的不动时间虽有下降趋势，但无显著性。与欣安颗粒相比，欣宁颗粒同剂量组的强迫游泳不动时间更少，但无显著性差异。

3.5两种黄花菜复方对小鼠利血平拮抗的影响

如图19所示，小鼠皮下注射给予利血平1h后，与对照组相比，利血平模型组小鼠出现明显的眼睑下垂、体温降低(P＜0.01，P＜0.01)，表明利血平拮抗模型成功。与利血平模型组比较，帕罗西汀可显著逆转利血平引起的眼睑下垂和体温下降(P＜0.01，P＜0.05)；欣宁颗粒1.25g/kg对利血平引起的眼睑下垂和体温下降有显著逆转作用(P＜0.01，P＜0.01)，欣宁颗粒2.5g/kg和欣安颗粒2.5g/kg也显著性逆转利血平引起的眼睑下垂(P＜0.01，P＜0.01)，但对利血平化引起的体温降低无显著影响，欣安颗粒0.625g/kg对利血平引起的体温下降有显著逆转作用(P＜0.01)，但对利血平化引起的眼睑下垂无显著影响。此外，欣宁颗粒1.25g/kg对眼睑下垂的逆转作用明显比同剂量的欣安颗粒强(P＜0.05)。

3.6两种黄花菜复方抗抑郁作用比较

欣宁与欣安颗粒比较结果如表1所示，欣宁颗粒在悬尾、强迫游泳及利血平拮抗实验中均表现了较好的抗抑郁效果；但欣安颗粒只在利血平拮抗实验中均表现了抗抑郁效果，且只有一个剂量有效。在逆转眼睑下垂方面，欣宁颗粒中剂量与欣安颗粒中剂量有显著性差异(P＜0.05)。

表1两种黄花菜复方抗抑郁作用比较

注：+有效浓度数量1个，++有效浓度数量2个，+++有效浓度数量3个，-无效。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (6)

1.欣宁颗粒在制备用于预防治疗受试者抑郁症的药物中的用途，其特征在于，所述欣宁颗粒为由黄花菜、酸枣仁、百合和佛手作为原料得到的提取物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述欣宁颗粒的制备方法包括将黄花菜、酸枣仁、百合和佛手按(2-5):(2-5):(1-4):(1-4)的重量比混合，加入8-12倍的水煎煮后过滤得到滤液，然后在100-120℃浓缩、干燥得到粉末。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述预防治疗包括以0.5-3g/kg重量的量向受试者提供欣宁颗粒，从而改善、缓解、减轻、消除抑郁样行为或焦虑样行为的步骤。

4.一种用于预防治疗受试者抑郁症的药物组合物，其特征在于，包含由黄花菜、酸枣仁、百合和佛手作为原料得到的提取物。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物通过下述方法制备得到：将由黄花菜、酸枣仁、百合和佛手按2：2：1：1配比，加10倍量水，煎煮1小时，过80目滤网，得滤液，滤渣按相同方法提取2-5次，合并滤液。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述制备方法进一步包括在100℃浓缩、干燥所述滤液得到粉末的步骤。

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