CN112661840A - 一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，属于生物技术领域。本申请以牛血为原料，集成混菌微生物发酵技术、现代生物分离技术，研制开发出高提取率的免疫球蛋白产品。本发明通过生物发酵法提升利用牛血制备免疫球蛋白的免疫活性和提取率，实现牛屠宰加工牛血废弃物的资源化再利用；本申请利用毕赤酵母、汉逊酵母和假丝酵母共同发酵牛血，充分利用微生物间的协同作用，提升免疫球蛋白得率；多菌种混合发酵不仅提高了免疫球蛋白素的得率，而且通过微生物间的发酵作用提升了免疫球蛋白的免疫活性；该工艺制备的免疫球蛋白产品提取率和活性保留率高，具有较好的转化价值，具有广阔的市场应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，尤其是一种利用生物发酵技术和低温干燥技术制备高纯度和高活性保留率的免疫球蛋白的工艺，属于生物技术领域。
背景技术
畜牧业是我国的农业支柱产业。随着我国集约化养殖业的迅猛发展，畜产品加工的副产物也随之大量增加，其中畜禽血液是最大的副产品，且资源日益丰富。我国每年饲养近2亿多头牛羊，2018年末我国牛存栏数为10576.0万头，出栏肉牛约1363万头，按牛的总出血量为活牛体质量的4.2% 计算，每头牛采血量为11～15kg，小牛为2.7kg左右，我国每年可获得57.25万吨牛血。猪血的开发利用情况较好，但牛血的利用还未得到大的进展和应有的重视。由于牛血液有较重的血腥味、消化性和适口性差、色泽感官不佳且原料血液极难保存等因素，只有少量加工成食品，大量血液遭到丢弃，严重制约了牛血资源的综合利用。目前国内对畜禽血液的利用率和深加工程度还普遍偏低，且都难以产业化，产品也主要是初加工产品，如饲用血粉和食用血豆腐等，所以综合开发利用牛血资源，具有极其重要的意义，将是当前及未来的发展趋势。
大量研究证明，免疫球蛋白能凝集细菌，中和细菌毒素，并能在体内其他因素的参与下彻底杀死细菌和病毒、激活补体、增强机体的免疫功能。其中IgG的含量最高，约占血清中Ig总量的75%，是体液免疫中的主力抗体；IgM约占10%，其溶血、溶菌、杀菌、促吞噬和凝聚作用均比IgG 高，是高效的抗微生物抗体。每公斤血液可提取10g 的免疫蛋白。目前免疫球蛋白在临床上的作用日益突出，无论是应用领域、品种，还是适应条件都在拓展。分离免疫球蛋白可采用饱和硫酸铵盐析法、有机溶剂沉淀法、柱色谱分离法、超滤法等。由于盐析法和有机溶剂法成本低、操作简单、快速，应用较为广泛。青海省以屠宰牦牛产生大量的血液作为特色资源，提出利用牦牛血液制取免疫蛋白技术，完成了多项利用血液资源开发生产高附加值的免疫球蛋白产品的项目。如专利2011101193811公开了一种从牛毛牛血中提取免疫球蛋白的方法，新鲜艳牛血加抗凝剂，离心出血浆。血浆通过超滤膜除杂浓缩。截留相用乙醇超声提取，冷冻干燥即得，该方法提取方法简单、快速、安全、无污染，且成本低、低碳无公害。
综合分析现有技术，尽管目前已经实现了牛血制备免疫球蛋白的产业化，但目前利用牛血制备免疫球蛋白仍存在活性保留率较低、产业化经济效益低等技术弊端，亟需关键技术的集成及应用。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，实现牛血制备高纯度免疫球蛋白的高效制备，本发明提供一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，集成现代生物分离技术、混菌微生物发酵技术等，实现牛血牛血免疫球蛋白的高效提取和高值化资源综合利用，满足免疫球蛋白市场需求。该工艺制备的免疫球蛋白产品提取率和活性保留率高，具有较好的转化价值。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，具体包括如下步骤：
（1）制备血浆：配制O.1M的拧棱酸纳溶液作为抗凝剂，将新鲜牛血液与抗凝剂按照9:1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，除去红细胞，得到血浆，置于-20～-40℃条件下备用；
（2）发酵液制备：将步骤（1）中的血浆加水溶解，然后加入血浆质量比2%葡萄糖、0.15%(NH4)2SO4、0.10% KH2PO4、0.1%MgSO4，制备液体发酵培养基；在121℃条件下灭菌15min；
（3）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比2%的复合微生物，在28～35℃条件下好氧发酵12h；
（4）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物，得免疫球蛋白粗品溶液；
（5）超滤：将免疫球蛋白粗品溶液通过超滤膜浓缩，洗涤除杂，得截留相；
（6）超声提取:将截留相加入到乙醇中超声提取重复2次，合并提取液；
（7）沉淀：将提取液调酸，离心得沉淀；
（8）冷冻干燥：将沉淀冷冻干燥即得。
优选的，上述步骤（2）加水比例为血浆：纯净水为1:1。
优选的，上述步骤（3）中复合微生物为毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母中的一种或几种混合物。
最优的，毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母接种量比例为2:1:2。
进一步，上述毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母的活化方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
优选的，上述步骤（5）中超滤膜为截留分子量3000～10000D的多孔纤维超滤膜。
优选的，上述步骤（6）中的提取溶剂用量为10-15倍量(V/W)，提取时间为20-30min，室温操作。
优选的，上述步骤（7）中的酸为盐酸或硫酸之一，酸化后的pH为7.3-7.7。
本发明提供一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，与现有技术相比，具有以下显著优势：
（1）本发明通过生物发酵法提升利用牛血制备免疫球蛋白的免疫活性和提取率，实现牛屠宰加工牛血废弃物的资源化再利用，现有技术中并未发现利用酵母发酵提高免疫球蛋白提取率的报道；
（2）本申请利用毕赤酵母、汉逊酵母和假丝酵母共同发酵牛血，充分利用微生物间的协同作用，提升免疫球蛋白得率；多菌种混合发酵不仅提高了免疫球蛋白素的得率，而且通过微生物间的发酵作用提升了免疫球蛋白的免疫活性；
（3）该工艺制备的免疫球蛋白产品提取率和活性保留率高，具有较好的转化价值，具有广阔的市场应用价值。
具体实施方式
以下实施例中复合微生物菌剂活化方法均采用以下工艺制备：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；然后将毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母按接种量比例2:1:2混合均匀。
实施例1
一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，具体包括如下步骤：
（1）制备血浆：配制O.1M的拧棱酸纳溶液作为抗凝剂，将新鲜牛血液与抗凝剂按照9:1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，除去红细胞，得到血浆，置于-20～-40℃条件下备用；
（2）发酵液制备：将步骤（1）中的血浆加水溶解，加水比例为血浆：纯净水为1:1；然后加入血浆质量比2%葡萄糖、0.15%(NH4)2SO4、0.10% KH2PO4、0.1%MgSO4，制备液体发酵培养基；在121℃条件下灭菌15min；
（3）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比2%的复合微生物，在28～35℃条件下好氧发酵12h；所述复合微生物为毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母中的混合物，毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母接种量比例为2:1:2；
（4）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物，得免疫球蛋白粗品溶液；
（5）超滤：将免疫球蛋白粗品溶液通过超滤膜浓缩，洗涤除杂，得截留相；其中超滤膜为截留分子量3000～10000D的多孔纤维超滤膜；
（6）超声提取:将截留相加入到乙醇中超声提取重复2次，合并提取液；提取溶剂用量为10-15倍量(V/W)，提取时间为20-30min，室温操作；
（7）沉淀：将提取液调酸，离心得沉淀；所用的酸为盐酸，酸化后的pH为7.3-7.7；
（8）冷冻干燥：将沉淀冷冻干燥即得。
实施例2
一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，具体包括如下步骤：
（1）制备血浆：配制O.1M的拧棱酸纳溶液作为抗凝剂，将新鲜牛血液与抗凝剂按照9:1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，除去红细胞，得到血浆，置于-20～-40℃条件下备用；
（2）发酵液制备：将步骤（1）中的血浆加水溶解，加水比例为血浆：纯净水为1:1；然后加入血浆质量比2%葡萄糖、0.15%(NH4)2SO4、0.10% KH2PO4、0.1%MgSO4，制备液体发酵培养基；在121℃条件下灭菌15min；
（3）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比2%的复合微生物，在28～35℃条件下好氧发酵12h；所述复合微生物为毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母中的混合物，毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母接种量比例为1:2:1；
（4）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物，得免疫球蛋白粗品溶液；
（5）超滤：将免疫球蛋白粗品溶液通过超滤膜浓缩，洗涤除杂，得截留相；其中超滤膜为截留分子量3000～10000D的多孔纤维超滤膜；
（6）超声提取:将截留相加入到乙醇中超声提取重复2次，合并提取液；提取溶剂用量为10-15倍量(V/W)，提取时间为20-30min，室温操作；
（7）沉淀：将提取液调酸，离心得沉淀；所用的酸为盐酸，酸化后的pH为7.3-7.7；
（8）冷冻干燥：将沉淀冷冻干燥即得。
实施例3
一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，具体包括如下步骤：
（1）制备血浆：配制O.1M的拧棱酸纳溶液作为抗凝剂，将新鲜牛血液与抗凝剂按照9:1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，除去红细胞，得到血浆，置于-20～-40℃条件下备用；
（2）发酵液制备：将步骤（1）中的血浆加水溶解，加水比例为血浆：纯净水为1:1；然后加入血浆质量比2%葡萄糖、0.15%(NH4)2SO4、0.10% KH2PO4、0.1%MgSO4，制备液体发酵培养基；在121℃条件下灭菌15min；
（3）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比2%的复合微生物，在28～35℃条件下好氧发酵12h；所述复合微生物为毕赤酵母；
（4）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物，得免疫球蛋白粗品溶液；
（5）超滤：将免疫球蛋白粗品溶液通过超滤膜浓缩，洗涤除杂，得截留相；其中超滤膜为截留分子量3000～10000D的多孔纤维超滤膜；
（6）超声提取:将截留相加入到乙醇中超声提取重复2次，合并提取液；提取溶剂用量为10-15倍量(V/W)，提取时间为20-30min，室温操作；
（7）沉淀：将提取液调酸，离心得沉淀；所用的酸为盐酸，酸化后的pH为7.3-7.7；
（8）冷冻干燥：将沉淀冷冻干燥即得。
实施例4
一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，具体包括如下步骤：
（1）制备血浆：配制O.1M的拧棱酸纳溶液作为抗凝剂，将新鲜牛血液与抗凝剂按照9:1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，除去红细胞，得到血浆，置于-20～-40℃条件下备用；
（2）发酵液制备：将步骤（1）中的血浆加水溶解，加水比例为血浆：纯净水为1:1；然后加入血浆质量比2%葡萄糖、0.15%(NH4)2SO4、0.10% KH2PO4、0.1%MgSO4，制备液体发酵培养基；在121℃条件下灭菌15min；
（3）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比2%的复合微生物，在28～35℃条件下好氧发酵12h；所述复合微生物为汉逊酵母；
（4）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物，得免疫球蛋白粗品溶液；
（5）超滤：将免疫球蛋白粗品溶液通过超滤膜浓缩，洗涤除杂，得截留相；其中超滤膜为截留分子量3000～10000D的多孔纤维超滤膜；
（6）超声提取:将截留相加入到乙醇中超声提取重复2次，合并提取液；提取溶剂用量为10-15倍量(V/W)，提取时间为20-30min，室温操作；
（7）沉淀：将提取液调酸，离心得沉淀；所用的酸为盐酸，酸化后的pH为7.3-7.7；
（8）冷冻干燥：将沉淀冷冻干燥即得。
实施例5
一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，具体包括如下步骤：
（1）制备血浆：配制O.1M的拧棱酸纳溶液作为抗凝剂，将新鲜牛血液与抗凝剂按照9:1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，除去红细胞，得到血浆，置于-20～-40℃条件下备用；
（2）发酵液制备：将步骤（1）中的血浆加水溶解，加水比例为血浆：纯净水为1:1；然后加入血浆质量比2%葡萄糖、0.15%(NH4)2SO4、0.10% KH2PO4、0.1%MgSO4，制备液体发酵培养基；在121℃条件下灭菌15min；
（3）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比2%的复合微生物，在28～35℃条件下好氧发酵12h；所述复合微生物为假丝酵母；
（4）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物，得免疫球蛋白粗品溶液；
（5）超滤：将免疫球蛋白粗品溶液通过超滤膜浓缩，洗涤除杂，得截留相；其中超滤膜为截留分子量3000～10000D的多孔纤维超滤膜；
（6）超声提取:将截留相加入到乙醇中超声提取重复2次，合并提取液；提取溶剂用量为10-15倍量(V/W)，提取时间为20-30min，室温操作；
（7）沉淀：将提取液调酸，离心得沉淀；所用的酸为盐酸，酸化后的pH为7.3-7.7；
（8）冷冻干燥：将沉淀冷冻干燥即得。
实施例6 不同工艺条件对免疫球蛋白活性保留率（%）的影响
1、指标测定方法
根据张效容等《猪血免疫球蛋白提取条件的优化研究》所述方法测定免疫球蛋白活性保留率（%）。
2、分组方法
实验分为实施例1-5实验组，对照组不含发酵工艺，其余工艺同实施例1；
3、试验结果
表1 不同工艺条件对免疫球蛋白活性保留率（%）的影响
| 试验组别 | 免疫球蛋白活性保留率（%） |
| 对照组 | 76.42 |
| 实施例1试验组 | 95.26 |
| 实施例2试验组 | 87.91 |
| 实施例3试验组 | 80.84 |
| 实施例4试验组 | 82.08 |
| 实施例5试验组 | 82.27 |
上述实验结果表明，本发明实施例均具有较好的免疫球蛋白活性保留率，说明本申请工艺取得了较好的提取效果；此外，试验结果还表明在复合微生物的组成及接种比例对免疫球蛋白活性保留率具有显著的影响。本发明中实施例1为最佳实施例。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）制备血浆：配制O.1M的拧棱酸纳溶液作为抗凝剂，将新鲜牛血液与抗凝剂按照9:1的比例混合均匀，用离心机以2500～3000rpm转速离心10～20分钟，除去红细胞，得到血浆，置于-20～-40℃条件下备用；
（2）发酵液制备：将步骤（1）中的血浆加水溶解，然后加入血浆质量比2%葡萄糖、0.15%(NH4)2SO4、0.10% KH2PO4、0.1%MgSO4，制备液体发酵培养基；在121℃条件下灭菌15min；
（3）好氧发酵：向发酵液中加入发酵液质量比2%的复合微生物，在28～35℃条件下好氧发酵12h；
（4）过滤：发酵结束后过滤除去菌体及不溶性固形物，得免疫球蛋白粗品溶液；
（5）超滤：将免疫球蛋白粗品溶液通过超滤膜浓缩，洗涤除杂，得截留相；
（6）超声提取:将截留相加入到乙醇中超声提取重复2次，合并提取液；
（7）沉淀：将提取液调酸，离心得沉淀；
（8）冷冻干燥：将沉淀冷冻干燥即得。
2.根据权利要求1所述的一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（2）加水比例为血浆：纯净水为1:1。
3.根据权利要求1所述的一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（3）中复合微生物为毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母中的一种或几种混合物。
4.根据权利要求3所述的一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，其特征在于所述毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母接种量比例为2:1:2。
5.根据权利要求3所述的一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，其特征在于所述毕赤酵母、汉逊酵母、假丝酵母的活化方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
6.根据权利要求1所述的一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（5）中超滤膜为截留分子量3000～10000D的多孔纤维超滤膜。
7.根据权利要求1所述的一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（6）中的提取溶剂用量为10-15倍量(V/W)，提取时间为20-30min，室温操作。
8.根据权利要求1所述的一种生物法利用牛血制备免疫球蛋白的工艺，其特征在于所述步骤（7）中的酸为盐酸或硫酸之一，酸化后的pH为7.3-7.7。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20210416 |
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