CN112625004B - 光激活新型有机小分子基质、制备方法及其在maldi质谱检测中的应用 - Google Patents
光激活新型有机小分子基质、制备方法及其在maldi质谱检测中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了光激活新型有机小分子基质、制备方法及其在MALDI质谱检测中的应用,本发明将具有式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ结构的化合物作为MALDI质谱的基质进行使用。在MALDI质谱的正离子检测模式下,该系列基质的有机化合物能够被激活为阳离子自由基,并与卤素离子作用形成能量更稳定的桥键;该过程提高待测分析物分子与钠离子的复合的效率,有利于在电场下飞行进行物质分离;在检测各类小分子的质谱信号具有优异的性能:背景噪音较低、信噪比高。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域,尤其涉及一种光激活新型有机小分子基质、制备方法及其在MALDI质谱检测中的应用。
背景技术
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种基于基质辅助解吸的高通量分析技术,广泛应用于快速分析生物大分子(如核酸、蛋白质、多肽等)。该技术近年来也在小分子检测中有所应用,但是常受限于传统基质的背景噪音干扰。在质谱的正离子检测模式中,主要存在使分析物加H+质子化和分析物加Na+阳离子化的两种电离反应类型,质谱中的电离反应主要与分析物对H+和Na+的亲和能力相关。在质谱检测中,存在大量的在电离过程中难以发生质子化的非极性分析物以及对Na+亲和力大于H+的难电离中性分析物,例如碳水化合物类分子。该类难电离物质在MALDI质谱中比较难以检测,目前应用广泛的商业化基质2,5-二羟基苯甲酸(DHB)和α-氰基-4- 羟基肉桂酸(CHCA)不能满足此类分子的检测和分析。因此,急需要开发一种针对分析物阳离子化的质谱基质来满足该需求。
目前新型基质的开发仍然依靠低效率和大范围的筛选且对电离反应过程无特异性,急需要一种有目标和思路的基质设计方法,加快质谱基质的开发和探索,发现适用于难电离小分子的阳离子化基质材料,从理论和实验上扩大MALDI-TOF MS方法在更多分析物检测和发现中的应用。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种光激活新型有机小分子基质、制备方法及其在MALDI质谱检测中的应用,该应用具有优异的检测效果。
本发明提供了一种光激活新型有机小分子基质在MALDI质谱检测中的应用;
所述光激活新型有机小分子基质选自式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ中任一种:
所述X1、X2和X3独立地选自S或O。
优选地,所述MALDI质谱检测中的分析物选自糖类分子、氨基酸类分子、肽类分子或聚乙二醇分子。
优选地,所述糖类分子选自D-葡萄糖、麦芽二糖、麦芽三糖或麦芽四糖;
所述氨基酸类分子选自L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-酪氨酸、L-缬氨酸或L-谷氨酸;
所述聚乙二醇分子选自分子量200~2000的PEG;
所述肽类分子选自分子量200~1000的线粒体靶向肽分子。
优选地,在质谱检测过程中,所述光激活新型有机小分子基质阳离子化,再与Cl-形成络合物;
分析物分子与Na+结合形成阳离子。
优选地,所述具有式Ⅱ结构的光激活新型有机小分子基质按照以下方法制得:
将具有式a结构的化合物和对溴苯甲酸甲酯反应,得到具有式b结构的中间体;
将氢氧化钠的水溶液加入到所述式b结构的中间体的溶液中,100~110℃下反应11~13h,得到具有式Ⅱ结构的光激活新型有机小分子基质。
优选地,所述具有式Ⅲ结构的光激活新型有机小分子基质按照以下方法制得:
将具有式Ⅰ结构的化合物和N-溴代丁二酰亚胺反应,得到具有式c结构的中间体1;
将所述中间体1和氰基甲酸乙酯反应,得到式d结构的中间体2;
将氢氧化钠的水溶液加入到所述中间体2的溶液中,100~110℃下反应 11~13h,得到具有式Ⅲ结构的光激活新型有机小分子基质;
所述X1选自S或O。
本发明提供了一种光激活新型有机小分子基质,具有式Ⅳ或式Ⅴ结构:
本发明提供了一种上述技术方案所述式Ⅳ结构的光激活新型有机小分子基质的制备方法,包括以下步骤:
将10-苯基-吩噻嗪和N-溴代丁二酰亚胺反应,得到3,7-二溴-10-(4-溴苯基)-10H-吩噻嗪;
将所述3,7-二溴-10-(4-溴苯基)-10H-吩噻嗪和氰基甲酸乙酯反应,得到二乙基10-(4-(乙酯基)苯基)10H-吩噻嗪-3,7-二羧酸;
将所述二乙基10-(4-(乙酯基)苯基)10H-吩噻嗪-3,7-二羧酸和碱酯化反应,得到具有式Ⅳ结构的有机小分子基质。
本发明提供了一种上述技术方案所述具有式Ⅴ结构的光激活新型有机小分子基质的制备方法,包括以下步骤:
将吩噁嗪和对溴苯甲酸甲酯反应,得到甲基4-(10H-吩噁嗪-10-基)苯酸盐,再继续和碱溶液反应,得到式Ⅴ结构的光激活新型有机小分子基质。
本发明将具有式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ结构的化合物作为MALDI质谱的基质进行使用。在MALDI质谱的正离子检测模式下,该系列基质的有机化合物能够被激活为阳离子自由基,并与卤素离子作用形成能量更稳定的桥键;该过程提高待测分析物分子与钠离子的复合的效率,有利于在电场下飞行进行物质分离;在检测各类小分子的质谱信号具有优异的性能:背景噪音较低、信噪比高。
附图说明
图1为PTZ-Ph的合成方法步骤图;
图2为PTZ-Ph(A)的合成方法步骤图;
图3为PTZ(A)2-Ph(A)的合成方法步骤图;
图4为PXZ-Ph的合成方法步骤图;
图5为PXZ-Ph(A)的合成方法步骤图;
图6为PXZ(A)2-Ph(A)的合成方法步骤图;
图7为计算机模拟探究光催化剂PTZ-Ph作为质谱基质的可行性;
图8中(A-B)为 基质材料PTZ-Ph和PXZ-Ph的质谱图和在质谱检测中存在的片段化和碎片化反应过程及(C)为 PTZ-Ph和PXZ-Ph可能发生聚合反应的化学位点;
图9为PTZ-Ph(A)、PTZ(A)2-Ph(A)、PXZ-Ph(A)和PXZ(A)2-Ph(A)的结构式和质谱图;
图10为PTZ(A)2-Ph(A)和PXZ(A)2-Ph(A)作为质谱基质时D-葡萄糖阳离子化反应的DFT理论计算分析;
图11为基质PTZ(A)2-Ph(A)与传统基质的背景峰比较(m/z 0-800);
图12为基质PTZ(A)2-Ph(A)与传统基质检测小分子时的质谱图与信噪比; A中的检测物为D-葡萄糖,B中的检测物为缬氨酸;
图13为化合物PTZ-Ph作为基质分别质谱检测D-葡萄糖(D-Glu)、麦芽二糖(DP-2)、麦芽三糖(DP-3)、麦芽四糖(DP-4)、L-苯丙氨酸(L-Phe)、 L-谷氨酰胺(L-Gln)、L-酪氨酸(L-Tyr)、L-缬氨酸(L-Val)、L-谷氨酸(L-Glu);
图14为化合物PTZ-Ph(A)作为基质分别质谱检测D-葡萄糖、麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L- 谷氨酸;
图15为化合物PTZ(A)2-Ph(A)作为基质分别质谱检测D-葡萄糖、麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-酪氨酸、L-缬氨酸、 L-谷氨酸;
图16为化合物PXZ-Ph作为基质分别质谱检测D-葡萄糖、麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸;
图17为化合物PXZ-Ph(A)作为基质分别质谱检测D-葡萄糖(D-Glu)、麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸;
图18为化合物PXZ(A)2-Ph(A)作为基质分别质谱检测D-葡萄糖、麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-酪氨酸、L-缬氨酸、 L-谷氨酸;
图19中A为PTZ(A)2-Ph(A)基质检测PEG1600的质谱图,B为 PTZ(A)2-Ph(A)基质检测线粒体靶向肽的质谱图;
图20为PTZ(A)2-Ph(A)作基质时尿液环境中D-葡萄糖的标准曲线与特征性质谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种光激活新型有机小分子基质在MALDI质谱检测中的应用;
所述光激活新型有机小分子基质选自式Ⅰ、式Ⅱ或式Ⅲ中任一种:
所述X1、X2和X3独立地选自S或O。
在本发明中,所述MALDI质谱检测中的分析物选自糖类分子、氨基酸类分子、肽类分子或聚乙二醇分子。所述糖类分子选自D-葡萄糖、麦芽二糖、麦芽三糖或麦芽四糖;所述氨基酸类分子选自L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L- 酪氨酸、L-缬氨酸或L-谷氨酸;所述聚乙二醇分子选自分子量200~2000的 PEG;所述肽类分子选自分子量200~1000的线粒体靶向肽分子。具体实施例中,所述聚乙二醇分子为PEG 1600;所述肽类分子为MW=640的线粒体靶向肽分子。
在本发明中,所述式Ⅰ结构的化合物由具有式a结构的化合物和溴苯反应制得;反应在甲苯溶液中进行;反应在叔丁醇钠和催化剂醋酸钯、配体P(tBu)3的存在下进行。
在本发明中,所述具有式Ⅱ结构的光激活新型有机小分子基质按照以下方法制得:
将具有式a结构的化合物和对溴苯甲酸甲酯反应,得到具有式b结构的中间体;
将氢氧化钠的水溶液加入到所述式b结构的中间体的溶液中,100~110℃下反应11~13h,得到具有式Ⅱ结构的光激活新型有机小分子基质。
在本发明中,所述式a结构的化合物为吩噻嗪或吩噁嗪。具有式a结构的化合物和对溴苯甲酸甲酯反应在碳酸铯、催化剂醋酸钯和配体P(tBu)3的存在下进行;反应在溶剂甲苯中进行。循环脱气处理后在氮气下进行反应;所述反应的温度优选为105~115℃,时间为11~13h;具体实施例中,反应的温度为110℃,时间为12h。反应结束后,室温冷却,用二氯甲烷提取反应产物,提取到的有机相收集后用无水MgSO4干燥,粗产物经硅胶柱层析纯化得到樱草黄色固体,即具有式b结构的中间体;具体实施例中,式b结构的中间体为4-(10H-吩噁嗪-10-基)苯酸盐或4-(10H-吩噻嗪-10-基)苯酸盐。
所述氢氧化钠的水溶液加入到所述式b结构的中间体的溶液中, 100~110℃下反应11~13h;式b结构的中间体优选溶解再二恶烷中;具体实施例中,反应的温度为105℃,时间为12h。反应结束后冷却至室温,再将浓缩的盐酸水溶液加入至反应产物中,过滤,得到的沉淀用水和己烷洗涤,得到具有式Ⅱ结构的光激活新型有机小分子基质。所述具有式Ⅱ结构的光激活新型有机小分子基质为4-(10H-吩噻嗪-10-基)苯甲酸或4-(10H-吩噁嗪-10-基) 苯甲酸。
在本发明中,所述具有式Ⅲ结构的光激活新型有机小分子基质按照以下方法制得:
将具有式Ⅰ结构的化合物和N-溴代丁二酰亚胺反应,得到具有式c结构的中间体1;
将所述中间体1和氰基甲酸乙酯反应,得到式d结构的中间体2;
将氢氧化钠的水溶液加入到所述中间体2的溶液中,100~110℃下反应 11~13h,得到具有式Ⅲ结构的光激活新型有机小分子基质;
所述X1选自S或O。
在本发明中,将具有式Ⅰ结构的化合物溶于四氢呋喃中,N-溴代丁二酰亚胺溶解在四氢呋喃中;将N-溴代丁二酰亚胺的四氢呋喃溶液滴加到具有式Ⅰ结构的化合物的溶液中,室温下氩气环境中搅拌3.5~4.5h;反应结束后,用二氯甲烷萃取,得到的复合有机层用水冲洗后再用无水硫酸镁干燥,粗产物用硅胶柱层析进行纯化,得到具有式c结构的中间体1。
所述具有式c结构的中间体1具体为3,7-二溴-10-(4-溴苯基)-10H-吩噻嗪或3,7-二溴-10-(4-溴苯基)-10H-吩噁嗪。
本发明将n-丁基锂溶液缓慢加入到中间体1的上清溶液中,搅拌 55~65min后再加入氰基甲酸乙酯,氩气条件下搅拌,反应过夜,得到的反应产物倒入水中,并用二氯甲烷提取;得到的有机相用水反复洗涤,然后用无水硫酸镁干燥,得到的粗产物经硅胶柱层析纯化,得到式d结构的中间体2。具体实施例中,所述中间体2为二乙基10-(4-(乙酯基)苯基)10H-吩噻嗪 -3,7-二羧酸或二乙基10-(4-(乙酯基)苯基)10H-吩噁嗪-3,7-二羧酸。
本发明将中间体2溶解于二氧己烷中,再加入氢氧化钠水溶液,氩气条件下搅拌,100~110℃下反应11~13h;具体实施例中,105℃下反应12h。反应结束后,冷却至室温,再加入浓缩的盐酸水溶液,过滤,得到的沉淀用水和正己烷洗涤,得到具有式Ⅲ结构的光激活新型有机小分子基质。
本发明提供了一种光激活新型有机小分子基质,具有式Ⅳ或式Ⅴ结构:
在本发明中,所述具有式Ⅳ结构的光激活新型有机小分子基质按照以下方法制得:
将10-苯基-吩噻嗪和N-溴代丁二酰亚胺反应,得到3,7-二溴-10-(4-溴苯基)-10H-吩噻嗪;
将所述3,7-二溴-10-(4-溴苯基)-10H-吩噻嗪和氰基甲酸乙酯反应,得到二乙基10-(4-(乙酯基)苯基)10H-吩噻嗪-3,7-二羧酸;
将所述二乙基10-(4-(乙酯基)苯基)10H-吩噻嗪-3,7-二羧酸和碱酯化反应,得到具有式Ⅳ结构的有机小分子基质。
在本发明中,所述具有Ⅴ结构的光激活新型有机小分子基质按照以下方法制得:
将吩噁嗪和对溴苯甲酸甲酯反应,得到甲基4-(10H-吩噁嗪-10-基)苯酸盐,再继续和碱溶液反应,得到式Ⅴ结构的光激活新型有机小分子基质。
在质谱检测过程中,所述光激活新型有机小分子基质阳离子化,再与Cl-形成络合物;分析物分子与Na+结合形成阳离子。光激活新型有机小分子基质阳离子化,再与Cl-形成络合物这一过程显著降低了待测分析物分子与Na+结合电荷化的能垒,从而提升对分析物进行质谱检测的灵敏性能。例如: [PTZ(A)2-Ph(A)]·+·Cl-络合物。本发明采用正离子模式进行检测。分析物以分析物加钠离子的形式进行检测。
上述有机小分子基质在不同激光条件下对分析物进行检测,激光的能量优选为49~65μJ,更优选为59~62μJ,最优选为61μJ。所述分析物和有机小分子基质的摩尔比优选为1:45~55,更优选为1:48~52,最优选为1:50。
本发明采用上述有机材料作为质谱基质,减少导电纳米材料对检测仪器的损害;针对电离反应机理,特异性检测难电离分析物,检测效果相比传统基质有较高的提升;将光催化剂的自由基化学理论应用到质谱基质中,合成材料目的明确且具有递进的化学合成方案,减少实验原料的使用,降低成本和减少环境污染。
为了进一步说明本发明,下面结合实施例对本发明提供的一种光激活新型有机小分子基质、制备方法及其在MALDI质谱检测中的应用进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
10-苯基-吩噻嗪(PTZ-Ph)的合成方法(见图1)
吩噻嗪、溴苯、叔丁醇钠、催化剂醋酸钯和配体P(tBu)3溶于甲苯溶液中,循环脱气处理后在氮气下110℃加热反应12小时。室温冷却后,用二氯甲烷提取上步的反应混合物,提取的有机相收集后用无水MgSO4干燥,粗产物经硅胶柱层析纯化得到白色固体。
实施例2
4-(10H-吩噻嗪-10-基)苯甲酸(PTZ-Ph(A))的合成方法(见图2)
吩噻嗪、对溴苯甲酸甲酯、碳酸铯、催化剂醋酸钯和配体P(tBu)3溶于甲苯溶液中,循环脱气处理后在氮气下110℃加热反应12小时。室温冷却后,用二氯甲烷提取上步的反应混合物,提取的有机相收集后用无水MgSO4干燥,粗产物经硅胶柱层析纯化得到樱草黄色固体;
氢氧化钠的水溶液加入到甲基4-(10H-吩噻嗪-10-基)苯酸盐的二恶烷溶液中,在105℃的氩气溶液中搅拌12小时。反应结束冷却至室温后,将浓缩的盐酸水溶液(37%,10mL)加入上步混合物中,过滤得到的沉淀用水和己烷洗涤后得到纯的产物。
实施例3
10-(4-羧苯基)-10H-吩噻嗪-3,7-二羧酸(PTZ(A)2-Ph(A))的合成方法(见图3)
1.合成3,7-二溴-10-(4-溴苯基)-10H-吩噻嗪
已经合成的PTZ-Ph溶于20mL四氢呋喃中,10mL N-溴代丁二酰亚胺的四氢呋喃溶液在0℃下逐滴加入到上步的PTZ-Ph溶液中,室温下在氩气环境中搅拌4小时,反应结束后的溶液用二氯甲烷提取三次。得到的复合有机层用水冲洗后用无水硫酸镁干燥,粗产物用硅胶柱层析进行纯化得到终产物。
2.合成二乙基10-(4-(乙酯基)苯基)10H-吩噻嗪-3,7-二羧酸
n-丁基锂溶液缓慢加入到第1步产物的上清溶液中,反应搅拌1小时后加入氰基甲酸乙酯,氩气条件下搅拌,反应过夜。反应结束后将终产物混合液倒入水中并用二氯甲烷进行提取产物。有机相用水进行反复清洗,用无水硫酸镁干燥。粗产物经硅胶柱层析纯化后得到一种的樱草花黄色固体。
3.合成终产物PTZ(A)2-Ph(A)
将第2步产物溶于20mL二氧己烷,10mL的氢氧化钠水溶液加入其中,在氩气条件下搅拌,105℃反应12小时。反应结束冷却至室温后,将浓缩的盐酸水溶液(37%,10ml)加入上步混合物中,过滤得到的沉淀用水和正己烷洗涤后得到纯的产物。
实施例4
10-苯基-吩噁嗪(PXZ-Ph)的合成方法(见图4)
吩噁嗪、溴苯、叔丁醇钠、催化剂醋酸钯和配体P(tBu)3溶于甲苯溶液中,循环脱气处理后在氮气下110℃加热反应12小时。室温冷却后,用二氯甲烷提取上步的反应混合物,提取的有机相收集后用无水MgSO4干燥,粗产物经硅胶柱层析纯化得到白色固体。
实施例5
4-(10H-吩噁嗪-10-基)苯甲酸(PXZ-Ph(A))的合成方法(见图5)
吩噁嗪、对溴苯甲酸甲酯、碳酸铯、催化剂醋酸钯和配体P(tBu)3溶于甲苯溶液中,循环脱气处理后在氮气下110℃加热反应12小时。室温冷却后,用二氯甲烷提取上步的反应混合物,提取的有机相收集后用无水MgSO4干燥,粗产物经硅胶柱层析纯化得到樱草黄色固体。
氢氧化钠的水溶液加入到甲基4-(10H-吩噁嗪-10-基)苯酸盐的二恶烷溶液中,在105℃的氩气溶液中搅拌12小时。反应结束冷却至室温后,将浓缩的盐酸水溶液(37%,10mL)加入上步混合物中,过滤得到的沉淀用水和己烷洗涤后得到纯的产物。
实施例6
10-(4-羧苯基)-10H-吩噁嗪-3,7-二羧酸(PXZ(A)2-Ph(A))的合成方法(见图6)
1.合成3,7-二溴-10-(4-溴苯基)-10H-吩噁嗪
已经合成的PXZ-Ph溶于20mL四氢呋喃中,10mL N-溴代丁二酰亚胺的四氢呋喃溶液在0℃下逐滴加入到上步的PXZ-Ph溶液中,室温下在氩气环境中搅拌4小时,反应结束后的溶液用二氯甲烷提取三次。得到的复合有机层用水冲洗后用无水硫酸镁干燥,粗产物用硅胶柱层析进行纯化得到终产物。
2.合成二乙基10-(4-(乙酯基)苯基)10H-吩噁嗪-3,7-二羧酸
n-丁基锂溶液缓慢加入到第1步产物的上清溶液中,反应搅拌1小时后加入氰基甲酸乙酯,氩气条件下搅拌,反应过夜。反应结束后将终产物混合液倒入水中并用二氯甲烷进行提取产物。有机相用水进行反复清洗,用无水硫酸镁干燥。粗产物经硅胶柱层析纯化后得到一种的樱草花黄色固体。
3.合成终产物PXZ(A)2-Ph(A)
将第2步产物溶于20mL二氧己烷,10mL的氢氧化钠水溶液加入其中,在氩气条件下搅拌,105℃反应12小时。反应结束冷却至室温后,将浓缩的盐酸水溶液(37%,10ml)加入上步混合物中,过滤得到的沉淀用水和正己烷洗涤后得到纯的产物。
本发明首先通过理论计算验证PTZ-Ph在激光下会形成阳离子自由基,比较在不同条件下D-葡萄糖阳离子化反应的热力学焓变(ΔH)和吉布斯自由能的变化(ΔG)可以发现,PTZ-Ph阳离子自由基存在时可以与自然界中存在的 NaCl分子存在相互作用,Cl离子可以与自由基阳离子存在作用,使得D-葡萄糖分子在质谱检测中加Na的阳离子化反应更容易发生。因此可以证明光催化剂作为基质可以辅助分析物的阳离子化的实验是具有可行性的(见图7)。
根据实验流程合成了基质材料PTZ-Ph和PXZ-Ph,通过对质谱检测的图谱分析发现基质材料会在质谱的激光条件下形成阳离子自由基,并且可以在质谱图中观察到形成的加成聚合物分子的特征峰,通过DFT理论计算模拟发现基质分子PTZ-Ph和PXZ-Ph的加成反应最有可能发生在5号、6号和7号位点,形成的聚合物导致基质的背景噪音提高,因此降低基质的检测性能(见图8)。为了降低基质加成反应产生的背景噪声,引入羧基占据可能发生聚合反应的化学位点同时增强基质材料的溶解性,因此合成PTZ-Ph(A)、 PTZ(A)2-Ph(A)和PXZ-Ph(A)、PXZ(A)2-Ph(A)分子,通过质谱检测基质背景发现,在1号化学位点引入羧基后形成的PTZ-Ph(A)和PXZ-Ph(A)在激光下仍然存在聚合反应,在6号化学位点引入羧基后形成的PTZ(A)2-Ph(A)、 PXZ(A)2-Ph(A)在质谱检测中聚合反应消失,只存在基质分子相对分子质量的特征峰,而且PTZ(A)2-Ph(A)表现出更干净的基质背景(见图9)。
本发明采用上述6种有机材料作为基质,对选定的几种分析标准品进行质谱检测发现在6种基质中PTZ(A)2-Ph(A)作为基质时表现出最优的检测性能。为了探究PTZ(A)2-Ph(A)基质在质谱检测时辅助分析物阳离子化的内部机理,本申请通过DFT理论计算的Cl离子与基质分子相互作用时的基质结构构型、离子间的键长、反应的热力学焓变(ΔH)和吉布斯自由能变化(ΔG)可以发现,相比较于PXZ(A)2-Ph(A)基质,PTZ(A)2-Ph(A)在激光照射下首先会失去一个电子,形成活跃态的分子[PTZ(A)2-Ph(A)]·+,在质谱仪器的真空环境中, PTZ(A)2-Ph(A)基质与Cl离子存在更强的相互作用,使得该基质在质谱检测中对表现出更强的对分析物的阳离子能力。通过实验和理论计算相结合的方法,本申请首次将光催化剂的自由基理论应用到质谱检测中,开发出了针对于难电离分析物的阳离子化有机基质PTZ(A)2-Ph(A),且比传统基质DHB和CHCA 有更优异的检测效果(见图10)。现有商业化基质(DHB和CHCA):利用基质对仪器激光的吸收,基质在质谱仪器激光的照射下,基质吸收激光的能量,产生分子量减小的分子碎片(常见MALDI质谱m/z 0~800噪音来源),光热转换及碎片化的基质分子有助于将目标分析物分子脱离靶板并电荷化,从而可以在仪器的电场下飞行,完成检测过程。
通过对六种基质的质谱检测比较,发现基质PTZ(A)2-Ph(A)在辅助分析物阳离子化的过程中具有较高的检测效率,为了比较该阳离子化基质 PTZ(A)2-Ph(A)与传统基质DHB和CHCA在质谱中的检测效率。首先在无基质的条件下检测PTZ(A)2-Ph(A)、DHB和CHCA的背景噪音,通过质谱图发现PTZ(A)2-Ph(A)基质在小分子范围内(m/z 0-800)具有更少的背景干扰峰(见图11)。
为了对PTZ(A)2-Ph(A)基质与传统基质DHB和CHCA检测糖类和氨基酸类分子时的检测效果进行比较,本申请选择了4种糖类和5种小分子氨基酸标准品进行质谱检测,质谱检测时,激光能量为61μJ,分析物和基质的摩尔比为1:50。在用三种基质检测四种小分子糖类时可以发现,所有的糖类分子均以阳离子化的形式被检测到,但是PTZ(A)2-Ph(A)作为基质时的检测效率相比传统基质达到2~29倍,且具有更少的背景干扰峰。在检测5种小分子氨基酸时,PTZ(A)2-Ph(A)作为基质时氨基酸分子以阳离子化的形式被检测到,而传统基质DHB和CHCA检测到的为分析物的质子化形式,从质谱图和信噪比数据上可以看出PTZ(A)2-Ph(A)作为基质时检测小分子氨基酸类具有更高的检测效率。因此,阳离子化基质在检测难电离的小分子时比传统基质有更高的检测效率(见图12、图13、图14、图15、图16、图17和图18)。
图12中,图例背景介绍:第一,图中标有*的为质谱检测的信号特征峰 (即实验中需要检测出来的峰),在阳离子模式下分析物会出现加H离子或者加Na离子使分析物成为带正电的离子,从而在仪器中被检测到。第二,S/N 为信噪比,是被检测分析物的特征参数,在检测中信噪比越高,表示检测的效果越好。图12中A中检测物为D-葡萄糖,从左至右的红色表示基质PTZ(A)2-Ph(A)、蓝色表示传统基质DHB、绿色表示传统基质CHCA作为基质进行质谱检测。带*的峰为检测的特征峰,其他的峰的基质相关的背景干扰峰,从三幅图可以看出:PTZ(A)2-Ph(A)基质的基质相关背景峰最少,可以使检测有更高的信噪比。DHB和CHCA的基质背景干扰峰较多,会干扰检测物的特征峰分辨和信噪比。信噪比S/N是在特别的质谱软件中可以直接读出来的,从图中标注可以看出,在化合物PTZ(A)2-Ph(A)基质的检测D-葡萄糖信噪比为 362,DHB和CHCA检测D-葡萄糖的信噪比分别为48和17。在相同D-葡萄糖浓度和检测条件下,PTZ(A)2-Ph(A)作为基质检测D-葡萄糖时相比传统基质 DHB和CHCA,有更高的检测效率和更少的背景噪音峰的干扰。图12中B 检测物为L-缬氨酸。分析过程与A中检测D-葡萄糖相同,其中区别为使用 PTZ(A)2-Ph(A)作为基质时,分析物L-缬氨酸会形成加Na离子的特征峰被检测到,DHB和CHCA会使分析物形成加H离子的特征峰被仪器检测到,该区别与基质材料的性质有关,实验中同时出现加H和加Na的特征峰,选择检测到的最优信号特征峰来比较。从图12中B中可以看出,PTZ(A)2-Ph(A)作为基质时,相比传统基质有更高的检测效率,最高可达到传统基质的11倍以上。
实施例7
为了验证基质材料PTZ(A)2-Ph(A)在聚合物分子和肽类分子中的检测性能,申请人以聚合物PEG1600(MW=1600)和线粒体靶向肽分子(MW=640) 作为代表性分析物,在质谱条件下进行检测。检测结果如图19所示,图19 中A为PTZ(A)2-Ph(A)基质检测PEG1600的质谱图,B为PTZ(A)2-Ph(A)基质检测线粒体靶向肽的质谱图。表明该基质分子PTZ(A)2-Ph(A)在聚合物分子和肽类分子的检测领域具有较好的应用潜能。
将PTZ(A)2-Ph(A)作为基质应用到人尿液样本中D-葡萄糖的检测
将PTZ(A)2-Ph(A)基质与传统基质检测小分子的比较可以发现,本发明成功制备了一种新型的阳离子化基质PTZ(A)2-Ph(A)用于生物小分子的检测。为了验证该基质在实际检测中的实用性,申请人用人尿液作为缓冲液,外加D- 葡萄糖标准品配置不同浓度梯度的溶液进行实际检测,可以得到尿液环境下 PTZ(A)2-Ph(A)基质检测D-葡萄糖的标准曲线,如图20所示,可以看到该曲线有较好的线性关系(R2>0.993),表明该阳离子基质可以较好的应用于人尿液中D-葡萄糖的实际检测,且在糖尿病人的临床检测中具有很好的应用前景。
由以上实施例可知,本发明将具有式Ⅰ、式Ⅱ和式Ⅲ结构的化合物作为 MALDI质谱的基质进行使用。在MALDI质谱的正离子检测模式下,该系列基质的有机化合物能够被激活为阳离子自由基,并与卤素离子作用形成能量更稳定的桥键;该过程提高待测分析物分子与钠离子的复合的效率,有利于在电场下飞行进行物质分离;在检测各类小分子的质谱信号具有优异的性能:背景噪音较低、信噪比高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述MALDI质谱检测中的分析物选自糖类分子、氨基酸类分子、肽类分子或聚乙二醇分子。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述糖类分子选自D-葡萄糖、麦芽二糖、麦芽三糖或麦芽四糖;
所述氨基酸类分子选自L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-酪氨酸、L-缬氨酸或L-谷氨酸;
所述聚乙二醇分子选自分子量200~2000的PEG;
所述肽类分子选自分子量200~1000的线粒体靶向肽分子。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,在质谱检测过程中,所述光激活有机小分子基质阳离子化,再与Cl-形成络合物;
分析物分子与Na+结合形成阳离子。
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