CN112592870A - 一种凝结芽孢杆菌g4、其发酵液及制备方法和应用 - Google Patents

一种凝结芽孢杆菌g4、其发酵液及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及微生物技术领域，具体公开了一种凝结芽孢杆菌G4、其发酵液及制备方法和应用。本申请提供了保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.21265的凝结芽孢杆菌G4；其具有较好的热稳定性、抑菌性和耐人工胃肠液能力，且凝结芽孢杆菌G4所产的淀粉酶活性高，可达213.99 U/mgprot，凝结芽孢杆菌G4具有降解亚硝酸盐能力。本申请还公开了发酵液，其由凝结芽孢杆菌G4发酵制得，发酵液具有凝结芽孢杆菌G4的特性。

Description

一种凝结芽孢杆菌G4、其发酵液及制备方法和应用
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，更具体地说，它涉及一种凝结芽孢杆菌G4、其发酵液及制备方法和应用。
背景技术
动物饲料中添加抗生素可以大幅降低动物病死率，提高动物生长速度，降低饲料使用量，从而降低肉类的产品价格。但是，肉类被食用的过程中，抗生素可被人体间接吸收，对人体造成极大地伤害。所以，从长远计，我国出台了“禁抗令”。随着“禁抗令”的颁布，饲料市场引起轩然大波，而动物疫病错综复杂，尤其是“非洲猪瘟”常态化的背景下，如何平稳地过渡到“无抗时代”，已成为畜牧行业关注的焦点与挑战。在此情况下，微生物饲料添加剂应运而生。
微生物饲料添加剂是采用农业部认可的有益微生物经发酵制成的生物制剂，是抗生素的最佳替代品。微生物饲料添加剂通过改善动物肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，可提高动物的健康水平、抗病能力和消化能力。
一般微生物饲料添加剂中的有益微生物包括酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌等。其中，乳酸菌作为益生菌株应用于畜禽养殖历史悠久，其中应用较多的为嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌和双岐杆菌等；酵母菌作为益生菌株应用于畜禽养殖，因其产香的特性可增进动物食欲。但是，乳酸菌生物制剂和酵母菌生物制剂的抗逆性差，活菌存活率低，影响其饲喂效果。而现有的芽孢杆菌作为益生菌株应用于畜禽养殖，芽孢杆菌制剂因芽孢抗逆性强，可以直接添加至配合饲料中。但是，芽孢杆菌制剂应用在饲料中时，饲喂效果也比较差。
发明内容
为了提高生物饲料的饲喂效果，本申请提供一种凝结芽孢杆菌G4、其发酵液及制备方法和应用。
第一方面，本申请提供一种凝结芽孢杆菌G4，采用如下的技术方案：
一种凝结芽孢杆菌G4，于2020年11月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.21265，分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
凝结芽孢杆菌G4的生物学特性：革兰氏阳性兼性厌氧杆状菌，菌落呈圆形且边缘整齐，乳白色，中心突起且有光泽。
优选的，所述凝结芽孢杆菌G4的对亚硝酸盐的降解率高达97.5％。
优选的，所述凝结芽孢杆菌G4能分泌有益物质，所述有益物质包括淀粉酶、蛋白酶和乳糖酶中的至少一种；进一步优选，所述凝结芽孢杆菌G4所产淀粉酶的活性高达213.99U/mgprot。
优选的，所述凝结芽孢杆菌G4具有抑菌性，凝结芽孢杆菌G4对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率均大于90％。
优选的，所述凝结芽孢杆菌G4具有有耐酸性，凝结芽孢杆菌G4在pH为2.0的人工胃液和pH为7.6的人工结肠液中，存活率均大于80％。
优选的，所述凝结芽孢杆菌G4具有热稳定性，凝结芽孢杆菌G4在45℃-75℃下存活率为100％；在85℃下存活率高达86.6％；在100℃下存活率高达62.4％。
本申请请求保护的凝结芽孢杆菌G4具有较好的热稳定性、抑菌性和耐人工胃肠液能力；具有分泌蛋白酶、淀粉酶和乳酸酶等的能力，且本申请所得的凝结芽孢杆菌所产的淀粉酶活性较高，可达213.99U/mgprot；本申请所得的凝结芽孢杆菌对亚硝酸盐的降解率达到97.5％。
凝结芽孢杆菌G4的能分泌有益物质，如蛋白酶、淀粉酶和乳酸酶等，可将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，蛋白酶、淀粉酶等可将饲料中的淀粉、蛋白质等肠道不易吸收的营养物质降解为葡萄糖、氨基酸等小分子，从而可增动物强肠道对营养物质的消化吸收能力，提高饲料的利用率。
亚硝酸盐是畜牧水产业较普遍的危害之一，亚硝酸盐可氧化血液中的亚铁血红蛋白，使其变成高铁血红蛋白，亚铁血红蛋白被氧化后会失去携氧能力，各组织出现缺氧现象。过量亚硝酸盐会引起中毒，严重时可致养殖动物死亡。凝结芽孢杆菌G4具对亚硝酸盐的降解率高达97.5％，将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，可降解饲料中的亚硝酸盐；将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于畜牧水产业的饲料中，饲料在为水产动物提供食物来源的同时，可以降低养殖水中的亚硝酸盐，净化养殖环境，从而可促进养殖动物的健康生长。
凝结芽孢杆菌G4对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率均大于90％，说明凝结芽孢杆菌G4具有很好的抑菌性。将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，饲料被动物吞食进入肠道中，能杀死肠胃中的有害细菌，例如金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等，凝结芽孢杆菌G4可降低动物的致病率，有利于动物的健康成长。
凝结芽孢杆菌G4在pH为2.0的人工胃液和pH为7.6的人工结肠液中，存活率均大于80％，也就是说凝结芽孢杆菌G4具有耐酸性，能抗胃酸。将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，饲料进入动物肠胃后，凝结芽孢杆菌不会被胃液杀死，存活率比较高，能发挥其优势。
凝结芽孢杆菌G4在45℃-75℃下存活率为100％；在85℃下存活率高达86.6％；在100℃下存活率高达62.4％。说明其凝结芽孢杆菌G4有热稳定性，将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，在饲料加工过程中，饲料的加工温度(45-100℃)对其影响不大，凝结芽孢杆菌G4在饲料加工后依然能较好地存活。
综上所述，本申请获得的凝结芽孢杆菌G4具有良好的抗胃酸能力、促消化作用、较好的热稳定性和优良的抗菌性能，所以，凝结芽孢杆菌G4作为生物制剂可取代“抗生素”，应用于饲料中，具有良好的饲喂效果。除此之外，本申请获得的凝结芽孢杆菌G4还具有降解亚硝酸盐的能力，当用于饲料时，能降解饲料或水中的亚硝酸盐，有利于动物的健康成长。
本申请提供一种凝结芽孢杆菌G4的分离筛选方法，采用如下的技术方案：
采集断奶仔猪肠道内容物为样品筛选芽孢杆菌，取1g样品于100mL富集培养基中，富集液80℃水浴作用20min，MRS培养基倾注培养，挑取单菌落进行3次平板划线纯化，得到G4菌株。
富集培养基的成分如下：
蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、硫酸镁0.1g/L、醋酸钠5.0g/L、柠檬酸铵2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸锰0.05g/L和吐温801.0g/L。
根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，对分离菌株进行生理生化初步鉴定，生理生化结果见表1。G4菌株的生物学特性：革兰氏阳性兼性厌氧杆状菌，菌落呈圆形且边缘整齐，乳白色，中心突起且有光泽。
采用16S rDNA序列测定的方法对G4菌株测序，将所得序列与Genbank中序列进行Blast分析比较，用Mega6.0软件构建系统发育树。系统发育树的结果显示该菌与NCBI公布的凝结芽孢杆菌的同源性达到100％。
结合系统发育树的结果和生理生化试验结果，进一步将该分离菌鉴定为凝结芽孢杆菌，并于2020年11月30日将获得的凝结芽孢杆菌G4保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.21265，分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
通过上述技术方案，凝结芽孢杆菌G4从肠道内容物中分离提取得到，来源安全可靠，更适合动物肠道消化吸收，有利于应用于畜禽饲料中且具有较好的应用前景。
第二方面，本申请提供一种发酵液，采用如下的技术方案：所述发酵液由上述凝结芽孢杆菌G4发酵得到。
进一步优选，所述发酵液的芽孢成熟率大于90％；再进一步优选，采用MRS培养基平板计数，获得发酵液中菌量为2×108CFU/mL。
通过上述技术方案，发酵液中芽孢的成熟率大于90％，说明凝结芽孢杆菌G4具有很强的抗逆性，所以，可以将凝结芽孢杆菌G4应用于饲料中，可降低动物的致病率。
第三方面，本申请提供一种发酵液的制备方法，采用如下的技术方案：
所述发酵液由凝结芽孢杆菌G4通过以下步骤培养发酵得到：
凝结芽孢杆菌G4单菌落接种于MRS种子培养基中，在37-45℃、150-200r/min下培养32-36小时；然后按1％接种量转接至发酵培养基，在37-45℃、150-200r/min下培养36-48小时，制得发酵液。
进一步优选，凝结芽孢杆菌G4单菌落接种于MRS种子培养基中，在37℃、200r/min下培养36小时；然后按1％接种量转接至发酵培养基，在37℃、200r/min下培养48小时，制得发酵液。对发酵液进行镜检，芽孢成熟率大于90％；采用MRS培养基平板计数，获得发酵液中菌量为2×108CFU/mL。
进一步优选，MRS种子培养基的成分如下：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、硫酸镁0.1g/L、醋酸钠5.0g/L、柠檬酸铵2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸锰0.05g/L和吐温801.0g/L。
进一步优选，发酵培养基的成分如下：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、硫酸镁0.1g/L、醋酸钠5.0g/L、柠檬酸铵2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸锰0.05g/L和吐温801.0g/L。
通过采用上述技术方案制备发酵液，发酵液的制备时间较短；且在较短的时间内，发酵液中芽孢的成熟率大于90％，菌量可达到2×108CFU/mL。由此可见，采用本申请的培养方法培养凝结芽孢杆菌G4(制备发酵液)，培养效率高。
此外，发明人发现，凝结芽孢杆菌G4在发酵过程中，pH由最初的7.0降至4.8，也就是说，凝结芽孢杆菌G4在发酵过程中产酸(乳酸菌)。将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，可以起到抑制致病菌作用，此外，可将凝结芽孢杆菌G4作为工业上产乳酸的出发菌。
第四方面，本申请提供一种生物制剂，采用如下的技术方案：
一种生物制剂，包括凝结芽孢杆菌G4和发酵液中的至少一种；进一步优选，生物制剂包括凝结芽孢杆菌G4、发酵液、和由上述制备方法制得的发酵液中的至少一种。
第五方面，本申请提供凝结芽孢杆菌G4在生物制剂中的应用。本申请提供发酵液在生物制剂中的应用。本申请提供由上述制备方法制得的发酵液在生物制剂中的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请请求保护的凝结芽孢杆菌G4具有较好的热稳定性、抑菌性和耐人工胃肠液能力；
2、本申请请求保护的凝结芽孢杆菌G4具有分泌蛋白酶、淀粉酶和乳酸酶的能力，其中分泌的淀粉酶活性较高，可达213.99U/mgprot；
3、本申请请求保护的凝结芽孢杆菌G4能降解亚硝酸盐，且其对亚硝酸盐的降解能力可达97.5％。
附图说明
图1为本发明菌株G4的16S rDNA系统发育树。
图2为本发明菌株G4的生长曲线及pH曲线。
图3为本发明菌株G4的热稳定性结果图。
图4为本发明菌株G4降解亚硝酸钠的效果图。
具体实施方式
以下结合附图1-4和实施例对本申请作进一步详细说明。予以特别说明的是：以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，以下实施例中所用原料除特殊说明外均可来源于普通市售。
以下实施例中涉及到的培养成分如下：
富集培养基的成分:蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、硫酸镁0.1g/L、醋酸钠5.0g/L、柠檬酸铵2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸锰0.05g/L和吐温801.0g/L。
MRS培养基的成分：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、硫酸镁0.1g/L、醋酸钠5.0g/L、柠檬酸铵2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温801.0g/L和琼脂粉20.0g/L。
MRS种子培养基的成分：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、硫酸镁0.1g/L、醋酸钠5.0g/L、柠檬酸铵2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸锰0.05g/L和吐温801.0g/L。
发酵培养基的成分：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉10.0g/L、酵母粉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、硫酸镁0.1g/L、醋酸钠5.0g/L、柠檬酸铵2.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸锰0.05g/L和吐温801.0g/L。
以下实施例中涉及的指示菌大肠杆菌(型号为ATCC35401)和金黄色葡萄球菌(型号为ATCC29213)来源于普通市售。
以下实施例中涉及的人工胃肠液购于北京雷根生物技术有限公司。
以下实施例中涉及的淀粉酶、乳糖酶检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；蛋白酶检测试剂盒购于上海哈灵生物科技有限公司。
以下实施例中涉及的格里斯试剂A、B的配置如下：
格里斯试剂A：0.5g对氨基苯磺酸溶于50mL 30％冰醋酸；
格里斯试剂B：0.1gα-萘酚加入100mL水中煮沸后，冷却后加入30mL冰醋酸。
实施例1
凝结芽孢杆菌G4的分离筛选
2020年4月，从沈阳法库猪场采集断奶仔猪肠道内容物为样品筛选芽孢菌。取1g样品于100mL富集培养基中，富集液80℃水浴作用20min，MRS培养基倾注培养，挑取单菌落进行3次平板划线纯化，得到G4菌株。
根据《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，对分离菌株进行生理生化初步鉴定，生理生化结果见表1。
表1菌株G4的生理生化特征
项目 结果 项目 结果
革兰氏染色 + D-葡萄糖 +
55℃生长 + D-木糖 d
7％氯化钠生长 - L-阿拉伯糖 d
V-P反应 + D-甘露醇 d
明胶液化 - 柠檬酸盐利用 -
吲哚试验 - 硝酸盐还原 +
溶菌酶生长 - 酪氨酸水解 -
注：“+”表示阳性；“－”表示阴性；“d”表示11％-89％阳性。
菌株G4生物学特性：革兰氏阳性兼性厌氧杆状菌，菌落呈圆形且边缘整齐，乳白色，中心突起且有光泽。
实施例2
凝结芽孢杆菌G416S rDNA序列测定
细菌基因组提取试剂盒提取细菌总DNA，引物16S rDNA通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'进行PCR扩增。16SrDNA的PCR扩增体系(30μL)：Super Mix 15μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板DNA(ng/μL)1μL、ddH2O 12μL。PCR反应程序：96℃预变性5min；96℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃最终延伸10min；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，将有目的条带的PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。
将所得序列与Genbank中序列进行Blast分析比较，用Mega 6.0软件构建系统发育树，如图1。
图1结果显示该菌与NCBI公布的凝结芽孢杆菌的同源性达到100％，结合生理生化试验结果，进一步将该分离菌鉴定为凝结芽孢杆菌。
将凝结芽孢杆菌G4保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCCNo.21265，保藏日期：2020年11月30日，分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
实施例3
凝结芽孢杆菌G4的培养
凝结芽孢杆菌G4单菌落接种于MRS种子培养基中，37℃下200r/min培养36h，按1％接种量转接至发酵培养基，37℃下200r/min培养48h，制得发酵液。
凝结芽孢杆菌G4在培养期间每隔2h取一次样,测定600nm处吸光度值及pH。绘制24h生长曲线及pH曲线，结果如图2。
由图2可知，G4菌株在4h进入对数生长期，14h进入平台期，pH在24h由最初的7.0降至4.8，表明凝结芽孢杆菌G4在发酵过程中产酸。也就是说，凝结芽孢杆菌G4是产芽孢的乳酸菌，发酵过程中产乳酸，将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，可以起到抑制致病菌作用。此外，可以将凝结芽孢杆菌G4作为工业上产乳酸的出发菌株。
对发酵液进行镜检，芽孢成熟率大于90％；采用MRS培养基平板计数，获得发酵液中菌量为2×108CFU/mL。
凝结芽孢杆菌G4在发酵中，芽孢成熟率大于90％，也就是说，凝结芽孢杆菌G4具有很强的抗逆性，所以，将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，可以减少动物的发病率。
实施例4
凝结芽孢杆菌G4的热稳定性试验
凝结芽孢杆菌G4单菌落接种于MRS种子培养基中，37℃下200r/min培养36h，按1％接种量转接至发酵培养基，37℃下200r/min培养48h，制得发酵液。测定发酵液的热稳定性，设置实验组和空白组，具体如下表2：
表2实验组与空白组的具体设置：
Figure BDA0002885187160000071
将温度降至室温的实验组和空白组的各样品，按10倍逐级稀释至所需稀释度，选取2-3个适当稀释度，每个稀释度3个重复，吸取不同稀释度菌悬液1mL，用MRS培养基进行倾注培养，充分混匀后静置冷却凝固，37℃培养48h后计数，选取菌落数在30-300之间的平板进行计数，计算存活率，结果见图3。
存活率(％)＝热处理总菌数/未处理总菌数×100
由图3可知，凝结芽孢杆菌G4在45℃-75℃作用20min后，存活率不受影响，均在100％以上；在85℃下存活率为86.6％，凝在100℃下存活率为62.4％；说明凝结芽孢杆菌G4具有较好的热稳定性，在45-100℃下存活能力强。将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，饲料的加工温度(45-100℃)对其影响不大，适用于饲料领域。
实施例5
凝结芽孢杆菌G4的抑菌性试验
凝结芽孢杆菌G4单菌落接种于MRS种子培养基中，37℃下200r/min培养36h，按1％接种量转接至发酵培养基，37℃下200r/min培养48h，制得发酵液。将发酵液在12000r/min的速率下离心5min，取上清液，用0.45μm滤膜过滤备用。
指示菌液的调整：调整指示菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌浓度吸光值约为0.05，测定600nm处吸光度。
实验组试管：4mL指示菌液+1mL实验菌液；对照组试管：4mL指示菌液+1mL生理盐水。
将实验组试管和对照组试管在37℃200r/min充分振荡共培养3h，然后分别测定各试管液体在600nm处吸光度值，计算抑菌率，结果见表3。
抑菌率(％)＝[(A空-A空0)-(A样-A样0)]/(A空-A空0)×100％
其中，A空：对照组振荡培养3小时后的吸光度；
A空0：对照组初始的吸光度；
A样：实验组振荡培养3小时后的吸光度；
A样0：实验组初始的吸光度。
表3凝结芽孢杆菌G4的抑菌活性
Figure BDA0002885187160000081
根据表3结果显示，G4菌株对共培养的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率分别是91.0％和95.1％，G4菌株对共培养的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率均超过90％以上，说明书凝结芽孢杆菌G4具有较好的抑菌作用。
将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，能杀死肠胃中的有害细菌，例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等等，从而可降低动物的致病率。
实施例6
凝结芽孢杆菌G4的耐人工胃肠液试验
菌种发酵培养结束后，离心去上清收集芽孢，加入pH 2.0人工胃液和pH 7.6人工结肠液中，37℃分别静置培养4h和12h后，按10倍逐级稀释至所需稀释度，MRS培养基倾注平板，检测活菌数量。对照组为生理盐水。结果见表4。
注：由于饲料在动物胃液中存留时间在1-2h内，在肠液中存留时间在6-10h内，所以，检测凝结芽孢杆菌G4的耐人工胃肠液时，在人工胃液培养4h，在人工结肠液中培养12h，用更多的时间来检验其耐受性，可提高实验的准确性。
存活率(％)＝胃肠液处理活菌数/对照组活菌数×100％
表4凝结芽孢杆菌G4人工胃肠液耐受试验结果
Figure BDA0002885187160000091
根据表4的结果可知，凝结芽孢杆菌G4在pH为2.0的人工胃液中，存活率仍在80％以上，说明其对具有很好的耐酸性；凝结芽孢杆菌G4在pH为7.6的人工肠液中，存活率为在98％以上，甚至达到115％，说明凝结芽孢杆菌G4完全耐受人工肠液。
凝结芽孢杆菌G4在人工肠液的菌数有时会大于对照组中的菌数，由此可见，人工肠液可能存在促进凝结芽孢杆菌G4生长的物质，所以，本申请制得的凝结芽孢杆菌G4有很好的胃酸耐受性，很适合应用于饲料领域。
实施例7
凝结芽孢杆菌G4的产酶试验
粗酶液的制备：凝结芽孢杆菌G4单菌落接种于MRS种子培养基中，37℃下200r/min培养36h，按1％接种量转接至发酵培养基，37℃下200r/min培养48h，制得发酵液。发酵液中芽孢形成率达到90％以上，取发酵上清液，10000rpm离心5min，保留上清液；冰浴条件下向粗酶液中加入60％的硫酸铵粉末，4℃条件下沉淀得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用Tris-HCl缓冲液复溶，4℃条件下透析得到浓缩酶液。
淀粉酶(AMS)活力的测定：用淀粉酶试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，货号C016-1-1,碘-淀粉比色法)测定浓缩酶液中的淀粉酶活力，具体操作步骤如淀粉酶试剂盒说明书所示，淀粉酶活力测试结果如下表5所示。
乳糖酶活力的测定：用乳糖酶试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，货号A082-1,测乳糖酶)测定浓缩酶液中的乳糖酶活力，具体操作步骤如淀粉酶试剂盒说明书所示，乳糖酶活力测定结果如下表5所示。
蛋白酶活力的测定：用蛋白酶试剂盒(购自购自上海哈灵生物科技有限公司，货号HL15021.2)测定浓缩酶液中的蛋白酶活力，具体操作步骤如淀粉酶试剂盒说明书所示，蛋白酶活力测定结果如下表5所示。
表5凝结芽孢杆菌G4的产酶能力表
Figure BDA0002885187160000101
U/mgprot代表每毫克组织蛋白每分钟水解10mg淀粉或1nmol乳糖定义为1个酶活单位。U/mg/min代表每单位酶每分钟产生0.01吸光值的升高变化。
由表5可以看出，淀粉酶活力最高，可达213.99U/mgprot，其次是乳糖酶，乳糖酶的活力可达45.98U/mgprot；最少是蛋白酶。由此可知，本申请保护的菌株凝结芽孢杆菌G4能分泌淀粉酶、乳糖酶、蛋白酶，且分泌淀粉酶的能力最强。
将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，蛋白酶、淀粉酶等可将饲料中的淀粉、蛋白质等肠道不易吸收的营养成分降解为葡萄糖、氨基酸等小分子，从而可增动物强肠道的消化吸收能力。
实施例8
凝结芽孢杆菌G4降解硝酸盐试验
标准曲线绘制：配制亚硝酸钠标准溶液10mg/L，分别移取0mL0.025mL、0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL置于10mL比色管中，加蒸馏水至5mL，加入格里斯试剂A、B等体积混合的显色剂0.2mL，混匀，沸水浴加热1min。于524nm波长处测吸光值，空白管调零。
以吸光值为纵坐标，亚硝酸钠浓度为横坐标绘制标准曲线。
降解亚硝酸盐能力测定：发酵培养结束的菌液按1％接种量转接到亚硝酸盐降解培养基中，在0、24、36、48h分别取发酵液1mL，离心。吸取0.4mL上清液至比色管中，加蒸馏水至5mL，加入格里斯试剂A、B等体积混合的显色剂0.2mL，混匀，沸水浴加热1min。于524nm波长处测吸光值，空白管调零。
根据标准曲线计算发酵液中亚硝酸钠的浓度，结果如图4。
由图4可以看出，24h由初始的2.0mg/L降到0.48mg/L，36h降低到0.25mg/L，48h降低到0.05mg/L，降解率达到97.5％。
凝结芽孢杆菌G4具对亚硝酸盐的降解率高达97.5％，将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于畜牧水产业的饲料中，饲料在为水产动物提供食物来源的同时，可以降低养殖水中的亚硝酸盐的含量，有利于动物的健康成长。将凝结芽孢杆菌G4作为益生菌株应用于饲料中，能降低饲料中亚硝酸盐含量，有利于动物的健康成长。
综合上所述，本申请获得的凝结芽孢杆菌G4具有良好的促消化作用、优良的抗菌性能、优良的抗胃酸能力和较好的热稳定性，所以，凝结芽孢杆菌G4作为生物制剂可取代“抗生素”，应用于饲料中，可提高饲料的饲喂效果。除此之外，本申请获得的凝结芽孢杆菌G4还具有降解亚硝酸盐的能力，当用于饲料时，能降解饲料或水中的亚硝酸盐含量，促进动物健康成长，净化养殖环境。
将本申请中得到的凝结芽孢杆菌G4应用于生物制剂(如饲料)的时候，可以将其制成菌株干粉直接添加于生物制剂中，也可以将凝结芽孢杆菌G4按照本申请中提供的发酵方法发酵后得到的发酵液应用在生物制剂中，当然也可以是菌株干粉和发酵液两者结合应用。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种凝结芽孢杆菌G4，其特征在于，菌株为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），命名为凝结芽孢杆菌G4，保藏编号为CGMCC No.21265。
2.一种发酵液，其特征在于，由权利要求1所述的凝结芽孢杆菌G4发酵得到。
3.根据权利要求2所述的发酵液，其特征在于，所述发酵液的芽孢成熟率大于90%。
4.如权利要求1所述的一种发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
凝结芽孢杆菌G4单菌落接种于MRS种子培养基中，在37-45℃、150-200r/min下培养32-36小时；然后按1%接种量转接至发酵培养基，在37-45℃、150-200r/min下培养36-48小时，制得发酵液。
5.根据权利要求4所述的发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
凝结芽孢杆菌G4单菌落接种于MRS种子培养基中，在37℃、200r/min下培养36小时；然后按1%接种量转接至发酵培养基，在37℃、200r/min下培养48小时。
6.一种生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的凝结芽孢杆菌G4和权利要求2所述的发酵液中的至少一种。
7.如权利要求1所述的凝结芽孢杆菌G4在生物制剂中的应用。
8.如权利要求2所述的发酵液在生物制剂中的应用。
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Assignee: Liaoning Shengwei Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: LIAONING POWER LIGHT AGRICULTURE AND ANIMAL HUSBANDRY INDUSTRIAL CO.,LTD.

Contract record no.: X2023210000135

Denomination of invention: A Bacillus coagulans G4, its fermentation broth, preparation method, and application

Granted publication date: 20211214

License type: Common License

Record date: 20230922