CN112587593A - 一种治疗痤疮的组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗痤疮的组合物及其制备方法,该组合物包括隐丹参酮、茶多酚、氢氧化胆碱和水杨酸。多种试验结果证明本发明组合物能够有效地治疗多种发病机制引起的痤疮,并且治疗效果优于单一组分药物,表现明显的协同增效作用。同时,本发明解决了隐丹参酮水溶性差、经皮透过及吸收差等问题,提高了机体中的药物浓度。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域。更具体地,涉及一种治疗痤疮的组合物及其制备方法。
背景技术
痤疮是毛囊皮脂腺单位的一种慢性的炎症性皮肤病,临床表现以好发于面部的粉刺、丘疹、脓疱、结节等多形性皮损为特点,主要多发于青少年,对青少年的心理和社交影响很大。已有研究表明,痤疮的发生主要与雄激素水平异常、皮脂分泌过多、毛囊皮脂腺导管堵塞及细菌感染和炎症反应等因素密切相关。当人体的激素水平失衡时,能够促进皮脂腺发育并产生大量皮脂,同时毛囊皮脂腺导管的角化异常造成导管堵塞,皮脂排出障碍,形成角质栓即微粉刺;毛囊中微生物如痤疮丙酸杆菌大量繁殖,痤疮丙酸杆菌产生的脂肪酶分解皮脂生成游离脂肪酸,同时趋化炎症细胞和介质,最终诱导并加重炎症反应。
迄今为止,已经提出许多组合物和方法用于治疗痤疮,如中国专利申请CN106074578A公开了由积雪草苷、蛇床子素、隐丹参酮、丹皮酚和绿原酸等组分组成的抗痤疮药物组合物,具有抗炎抑菌作用,对毛囊角化异常引起的痤疮有明显改善作用,但是其中的隐丹参酮水溶性和脂溶性极差,只溶于醇类等少数有机溶剂;中国专利申请CN103816165A公开了由水杨酸、戊二醇、癸二醇、吡咯烷酮羧酸锌、尿囊素、金缕梅提取物、积雪草提取物等组分组成的一种治疗痤疮的组合物,有优良的保湿、促渗效果和杀菌能力,能够明显改善毛囊皮脂腺导管上皮和表皮的过度角化,具有治疗痤疮的功能。然而,上述公开的抗痤疮产品或目前市场上的抗痤疮产品主要单方面地针对抗炎、抑菌或改善毛囊角化异常造成的痤疮,功能单一,未综合考虑到痤疮产生的各种因素,痤疮治疗效果有限,仍然无法全面满足消费者的治疗痤疮需求。
因此,迫切需要提供一种于痤疮形成机理出发,从多方面提高治疗痤疮效果的组合物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有产品功能单一、隐丹参酮溶解度差、抗痤疮效果有限的缺陷和不足,旨在提供一种于痤疮形成机理出发,具有抗炎、抗菌、抗脂质作用,从多方面提高抗痤疮效果的治疗痤疮的组合物。
本发明的目的是提供一种治疗痤疮的组合物。
本发明另一目的是提供所述治疗痤疮的组合物的制备方法。
本发明另一目的是提供一种组合物在制备治疗痤疮的药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
所述组合物包括以下组分及其重量份数:隐丹参酮0.01~0.1份,茶多酚0.1~0.9份,离子液体10~15份。
其中,所述离子液体为氢氧化胆碱和水杨酸按质量比1:1.14~2.28组成。
隐丹参酮是从传统中药丹参中提取出的有效成分,具有抗炎、抗菌、抗氧化等多种药理活性,在改善微循环、抑菌消炎、修复皮损等方面均体现出较强的活性;茶多酚是提取自茶叶中的一类天然活性产物,是多种多酚羟基类化合物的总称,具有抗氧化、抗炎、抑菌等多种生物活性以及较好的安全性;水杨酸是一种脂溶性的有机酸,来源广泛,具有软化角质、促进新陈代谢、抗炎、抗菌等作用,临床上常用于治疗痤疮;胆碱是带正电荷的四价碱基,是人类的一种必须营养物,以及生物膜的组成成分和胆碱能神经元中的乙酰胆碱的前体,具有保证信息传递、构成生物膜、促进脂肪代谢、降低血清胆固醇等生理功能;离子液体是一种全部由阴阳离子组成的液体,对许多无机盐和有机物具有特殊的溶解性,可应用作为药物递送载体。
在实际应用中,隐丹参酮的溶解性较低,较难达到有效浓度,并且也较难经过皮肤被机体吸收,造成其生物利用度较低,效果也较差。发明人研究发现,将隐丹参酮溶于胆碱水杨酸离子液体中,可以显著提高隐丹参酮的溶解性,进一步添加茶多酚,可以更加显著地增加隐丹参酮的溶解度,有效促进隐丹参酮经皮肤吸收和滞留,显著提高了隐丹参酮的透过量,同时使药物更好的富集在皮肤表皮和真皮,有利于发挥抗痤疮的作用;通过体外抗痤疮丙酸杆菌活性实验、体外抗炎症实验、体外抗脂质实验研究发现,该发明组合物相比于有效成分单独使用,组合物的抗菌、抗炎、抗脂质效果均具有协同增效作用,且在小鼠痤疮模型上也取得良好的疗效。综上,本发明组合物各组分在抗菌、抗炎、抗脂质方面协同增效,能够有效地针对痤疮的多种主要发病机制进行痤疮治疗,共同达到显著抗痤疮的效果。
优选地,所述组合物包括以下组分及其重量份数:隐丹参酮0.02~0.08份,茶多酚0.2~0.8份,离子液体10~13份。
更优选地,所述组合物包括以下组分及其重量份数:隐丹参酮0.05份,茶多酚0.5份,离子液体10份。
所述组合物的制备方法,包括以下步骤:
S1、离子液体的制备:将水杨酸加入到无水乙醇中,搅拌溶解,缓慢滴加氢氧化胆碱溶液,室温下搅拌,浓缩,干燥,得离子液体;
S2、组合物的制备:将茶多酚加入步骤S1所得离子液体中,溶解,再加入隐丹参酮,完全溶解,即得。
上述步骤S1中,所述水杨酸和无水乙醇的质量体积比为1:0.8~1.5(g/mL)。
上述步骤S1中,所述氢氧化胆碱溶液为质量分数44%的水溶液。
所述药物,是以所述组合物为有效成分。
所述药物为所述组合物中加入药学上可接受的辅料制成。
所述药物可以是为软膏剂、凝胶剂、乳膏剂、贴剂和水剂。
本发明具有以下有益效果:
1、多种试验结果证明,本发明药物组合物可以有效增强隐丹参酮的抗痤疮丙酸杆菌活性、抗炎和抗脂质分泌效果等,且显著优于两种单方制剂和两种药物联合用药,具有优良的协同增效作用,能够有效地针对痤疮的多种主要发病机制进行痤疮治疗。
2、本发明的离子液体进一步加入茶多酚后能显著增加难溶性药物隐丹参酮的溶解度,提高离子液体的可载药物量,同时促进隐丹参酮经皮肤吸收和滞留,可满足较大的给药剂量需求,减少给药次数。
3、本发明将隐丹参酮联合茶多酚制备成特定复方的离子液体,为粘稠液体形式,其可以更好地涂抹在皮肤上,可以达到长时间与皮肤保持密切接触并持续发挥作用。
4、本发明采用的仪器设备简单方便,制备过程高效简洁可控,适合工业化大批量生产。
附图说明
图1为本发明实施例1和对比例1、2、4的体外抑制痤疮丙酸杆菌试验效果图;
图2为本发明不同浓度的实施例1的体外抑制炎症因子IL1β效果图;
图3为本发明实施例1与单一组分药物体外抑制炎症因子IL1β效果图;
图4为本发明不同浓度的实施例1的体外抑制5α还原酶的效果图;
图5为本发明实施例1与单一组分药物的体外抑制胆固醇调节元件结合蛋白1c的效果图;
图6本发明实施例1与单一组分药物的体外抑制脂肪酸合成酶的效果图;
图7为本发明实施例1、实施例2与阿达帕林凝胶在痤疮小鼠模型治疗痤疮的体积变化图;
图8为本发明实施例1、实施例2与阿达帕林凝胶在痤疮小鼠模型的治疗效果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1离子液体载隐丹参酮(0.5%)-茶多酚(5%)复合物的制备
离子液体的制备:将12g水杨酸加入到12mL无水乙醇中,搅拌溶解,将24g氢氧化胆碱溶液(质量分数为44%的水溶液)缓慢滴加到水杨酸乙醇溶液中,室温下搅拌4小时。50℃旋转蒸发除去水和乙醇,最后于50℃的真空干燥箱干燥48小时即得。该溶液为澄清浅黄色粘稠液体。
取上述所得离子液体10g,加入500mg茶多酚,超声0.5小时加速溶解,继续加入50mg隐丹参酮。超声3小时使完全溶解,得到澄清深红色溶液。
实施例2离子液体载隐丹参酮(0.1%)-茶多酚(1%)复合物的制备
离子液体的制备如实施例1。
取上述所得离子液体10g,加入100mg茶多酚,超声0.5小时加速溶解,继续加入10mg隐丹参酮。超声3小时使完全溶解,得到澄清红色溶液。
实施例3离子液体载隐丹参酮(0.1%)-茶多酚(5%)复合物的制备
离子液体的制备如实施例1。
取上述所得离子液体10g,加入500mg茶多酚,超声0.5小时加速溶解,继续加入10mg隐丹参酮。超声3小时使完全溶解,得到澄清红色溶液。
实施例4离子液体载隐丹参酮(0.3%)-茶多酚(5%)复合物的制备
离子液体的制备如实施例1。
取上述所得离子液体10g,加入500mg茶多酚,超声0.5小时加速溶解,继续加入30mg隐丹参酮。超声3小时使完全溶解,得到澄清红色溶液。
实施例5离子液体载隐丹参酮(0.8%)-茶多酚(5%)复合物的制备
离子液体的制备如实施例1。
取上述所得离子液体10g,加入500mg茶多酚,超声0.5小时加速溶解,继续加入80mg隐丹参酮。超声3小时使完全溶解,得到澄清红色溶液。
实施例6离子液体载隐丹参酮(0.5%)-茶多酚(3%)复合物的制备
离子液体的制备如实施例1。
取上述所得离子液体10g,加入300mg茶多酚,超声0.5小时加速溶解,继续加入50mg隐丹参酮。超声3小时使完全溶解,得到澄清红色溶液。
实施例7离子液体载隐丹参酮(0.3%)-茶多酚(3%)复合物的制备
离子液体的制备如实施例1。
取上述所得离子液体10g,加入300mg茶多酚,超声0.5小时加速溶解,继续加入30mg隐丹参酮。超声3小时使完全溶解,得到澄清红色溶液。
实施例8离子液体载隐丹参酮(0.5%)-茶多酚(1%)复合物的制备
离子液体的制备如实施例1。
取上述所得离子液体10g,加入100mg茶多酚,超声0.5小时加速溶解,继续加入50mg隐丹参酮。超声3小时使完全溶解,得到澄清红色溶液。
实施例9离子液体载隐丹参酮(0.8%)-茶多酚(8%)复合物的制备
离子液体的制备如实施例1。
取上述所得离子液体10g,加入800mg茶多酚,超声0.5小时加速溶解,继续加入80mg隐丹参酮。超声3小时使完全溶解,得到澄清红色溶液。
实施例10离子液体载隐丹参酮(0.5%)-茶多酚(8%)复合物的制备离子液体的制备如实施例1。
取上述所得离子液体10g,加入800mg茶多酚,超声0.5小时加速溶解,继续加入50mg隐丹参酮。超声3小时使完全溶解,得到澄清红色溶液。
对比例1离子液体载隐丹参酮(0.5%)的制备
取实施例1所得离子液体10g,加入50mg隐丹参酮。超声0.5小时使完全溶解,得到澄清红色溶液。
对比例2离子液体载茶多酚(5%)的制备
取实施例1所得离子液体10g,加入500mg茶多酚。超声0.5小时使完全溶解,得到澄清棕黄色溶液。
对比例3隐丹参酮饱和水溶液
取10mg隐丹参酮(过量)加入到10mL水溶液中。置于37℃恒温摇床中100r/min振摇48小时,得到浅红色混悬液。
对比例4隐丹参酮-茶多酚水混悬溶液
取500mg茶多酚加入到10mL水溶液中,超声0.5小时使茶多酚完全溶解。再继续加入100mg隐丹参酮(过量),置于37℃恒温摇床中100r/min振摇48小时,得到棕黄色混悬溶液。
实验及结果分析
下面将本发明制备的治疗痤疮疾病的组合物进行以下实验来进一步阐述本发明的优势。
实验例1隐丹参酮饱和溶解度试验
离子液体载隐丹参酮(饱和)的制备:取实施例1所得离子液体10g,加入100mg隐丹参酮(过量),超声0.5小时加速溶解,继续置于37℃恒温摇床中100r/min振摇48小时,过滤得到澄清红色溶液。
离子液体载隐丹参酮-茶多酚(1%)复合物的制备:取实施例1所得离子液体10g,加入100mg茶多酚,超声1时加速溶解,继续加入100mg隐丹参酮(过量)。超声1小时加速溶解,继续置于37℃恒温摇床中100r/min振摇48小时,得到澄清红色溶液。
离子液体载隐丹参酮-茶多酚(5%)复合物的制备:取实施例1所得离子液体10g,加入500mg茶多酚,超声0.5小时加速溶解,继续加入100mg隐丹参酮(过量)。超声1小时加速溶解,继续置于37℃恒温摇床中100r/min振摇48小时。过滤得到澄清红色溶液。
取上述所制备的液体和对比例3所得的液体各1mL,微孔滤膜过滤,用流动相稀释后经高效液相法测定隐丹参酮在不同体系中的饱和溶解度,重复三次。
实验结果见表1。
表1隐丹参酮的饱和溶解度
注:*为与对比例3之间有统计学差异(P<0.05);#为与载隐丹参酮离子液体组之间有统计学差异(P<0.05);&为与离子液体载隐丹参酮-茶多酚(1%)组之间有统计学差异(P<0.05)。
从上表看,隐丹参酮的溶解度在离子液体中得到较大的提高,说明离子液体有利于增溶隐丹参酮。同时,随着茶多酚的加入,隐丹参酮的溶解度进一步提高。
实验例2体外经皮透过试验
(1)皮肤处理:200g左右SD大鼠使用20%乌拉坦进行麻醉,颈椎脱臼处死,剔除大鼠腹部毛发,用手术刀分离出腹部皮肤,将皮下组织、血管和脂肪层去除。用生理盐水彻底清洁皮肤,滤纸吸去皮肤表面多余的水分。最后使用铝箔纸将皮肤包封并在-20℃下保存。在使用皮肤进行透皮实验之前,仔细检查皮肤以保证皮肤的完整性。
(2)体外透皮实验:取一块皮肤置于生理盐水中,在室温下解冻后,用滤纸吸干皮肤表面水分,将皮肤安装在扩散池的供给池和接收池之间,皮肤角质层朝向供给池侧。本实验使用的扩散池有效渗透面积为3.14cm2,接收池体积为7.5mL。首先将接收池灌满7.5mL的接收液——10%羟丙基β环糊精水溶液,在恒温32℃与皮肤保持平衡30min以上。然后,向供给池中分别加入500mg实施例1、对比例1和对比例3所得液体,使用封口膜将供给池上方密封以防止实验过程中药物挥发。设置扩散池的搅拌速度和水浴温度分别为250rpm和32±1℃。透皮实验过程中,使用取样针在预定时间(1、2、4、6、8、12、24h)从接收池中取出1mL接收液,并立即补充等体积的空白接收液,以保持接收池内溶液体积不变。所得样品经0.22μm微孔滤膜过滤后使用高效液相色谱法测定样品中隐丹参酮的含量,按以下公式计算隐丹参酮单位面积累积透过量。
其中Cn表示第n个取样点测得的浓度,Ci表示第i个取样点测得的浓度(i=1、2、4、6、8、10、12、24),V0表示接收池的体积,V表示每次取样的体积,A表示有效渗透面积,Qn(μg/cm2)为单位面积累积透过量。
(3)离体皮肤滞留量实验:透皮实验后,小心取出安装在接收池和供给池中间的皮肤,分别用甲醇和蒸馏水擦洗皮肤三次以除去残留在皮肤表面多余的药液。将皮肤剪成小块,加入2mL甲醇。超声提取30min,室温静置2h。取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤,取续滤液通过高效液相色谱测定样品中隐丹参酮的含量,即为皮肤滞留量。
实验结果见表2。
表2体外透皮结果(n=5)
注:*为与对比例3之间有统计学差异(P<0.05);#为与对比例1之间有统计学差异(P<0.05)。
本实验采用对比例3隐丹参酮水溶液组作对比,结果显示对比例1离子液体组可以很好的增强隐丹参酮的皮肤透过和皮肤滞留情况,同时,本发明实施例1的离子液体载入茶多酚后,提高了隐丹参酮的单位面积皮肤累积透过量和皮肤滞留量,说明本发明实施例1载隐丹参酮-茶多酚离子液体,可以增加隐丹参酮的皮肤透过量,同时使药物更好的富集在皮肤表皮和真皮,有利于皮肤疾病的治疗。
实验例3通过棋盘微量稀释法评价隐丹参酮和茶多酚的协同抗痤疮丙酸杆菌效果
按以下实验方法分别对隐丹参酮和茶多酚的MIC值及对两药联用的MIC值进行比较和判定,说明两药联用在体外抗痤疮丙酸杆菌的优势。
(1)药物浓度的配置:将隐丹参酮用二甲基亚砜配置成浓度为5mg/mL的母液,将茶多酚用无菌水配置成浓度为40mg/mL的母液,然后用脑心液体培养基分别将以上母液倍比稀释,使得隐丹参酮的浓度依次为80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL,茶多酚的浓度依次为3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL。
(2)菌种的制备:痤疮丙酸杆菌(ATCC6919)于2019年08月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:1.243。痤疮丙酸杆菌的菌悬液用浊度仪来读数,用PBS调节菌液浓度约1×106CFU/mL进行接种。
(3)药物MIC的测定:用移液枪分别取隐丹参酮和茶多酚倍比稀释液100μL,依次加入96孔板的每行第1-10列孔中,再加入痤疮丙酸杆菌PBS菌液(1×106CFU/mL)100μL。第11列为阴性对照,加入200μL的脑心液体培养基;第12列为阳性对照,分别加入100μL痤疮丙酸杆菌PBS菌液及100μL液体培养基,37℃恒温培养。3天后判定结果,确定相应的MIC值。所有实验重复3次。
(4)棋盘微量稀释法:采用棋盘微量稀释法,用微量移液枪取50μL倍比稀释的茶多酚溶液(浓度为80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL),由高浓度到低浓度的顺序依次加到96孔板的第2~10列;取50μL倍比稀释的隐丹参酮药液(浓度为3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/mL),由低浓度到高浓度的顺序依次加入96孔板的第B~H行,再加入痤疮丙酸杆菌PBS菌液100μL;其中,第1列和第A行均加上50μL脑心液体培养基,使每个孔中的总液体数均为200μL。而第11列均加入液体培养基100μL及痤疮丙酸杆菌PBS菌液100μL;第12列均加入200μL脑心液体培养基。37℃恒温培养,培养后于第3天判定结果,确定相应的MIC值,按以下计算方式计算抑菌联合指数(FICI),评价隐丹参酮和茶多酚的协同抗痤疮丙酸杆菌效果,所有实验重复3次。
FICI为两种药物FIC之和(FIC=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用)。此处甲药为隐丹参酮,乙药为茶多酚。两药联合作用时,评价方式为:当FICI≤0.5时,两药联合抗菌效应为协同作用;当0.5<FICI≤1时,两药联合抗菌效应为相加作用;当1<FICI≤2时,两药联合抗菌效应为无关;FICI>2时,两药的相互作用为拮抗作用。
实验结果见表3。
表3茶多酚和隐丹参酮对痤疮丙酸杆菌的MIC和FICI
注:CTS表示隐丹参酮,TP表示茶多酚
从上表看,可以看出隐丹参酮和茶多酚对痤疮丙酸杆菌均有一定的抑制作用(如MIC值表示)。此外,隐丹参酮和茶多酚在联合应用给药时,两药联用的MIC远远低于单药的MIC。根据FICI值结果判定,两药联用对痤疮丙酸杆菌表现出明显的协同作用,证实两药联用具有增强抗痤疮丙酸杆菌效果,从而可减少药物用量、缩短疗程。同时由于MIC联用值均比MIC单用值显著降低,对于避免药物的耐药有很好的效果。
实验例4本发明载隐丹参酮和茶多酚离子液体体外抑制痤疮丙酸杆菌效果
按以下方法分别对本发明的空白离子液体、实施例1和对比例1、2、4所得液体进行体外抗痤疮丙酸杆菌试验,说明评价本发明的联合抗菌优势。
本发明的空白离子液体、实施例1和对比例1、2、4所得液体各取1mL,分别加入1mLDMSO配置成母液。然后用脑心液体培养基分别将以上母液稀释,最终稀释1600倍。在96孔板中,各添加100μL上述稀释溶液和100μL痤疮丙酸杆菌PBS菌液(1×106CFU/mL)。设一组只加100μL脑心培养基与100μL痤疮丙酸杆菌PBS菌液作为对照组;另设一组只加100μL脑心培养基与100μL PBS缓冲液作为空白组。分别于1、2、3天后观察有无细菌生长。使用酶标仪在波长600nm处测定每孔的光密度(OD)。每孔细菌存活率用以下公式表示。
细菌存活率%=(A样品–A空白)/(A对照-A空白)x 100%
注:其中,A样品为每个样品孔测定的OD值,A空白和A对照分别为空白组和对照组细菌OD值的平均值。
本实验结果如图1所示,本发明实施例1载隐丹参酮-茶多酚复方离子液体给药2到4天均表现出较强的抗菌作用。同时,本发明实施例1组的抗菌作用明显优于载隐丹参酮离子液体(对比例1)、载茶多酚离子液体(对比例2)、空白离子液体,同时也优于茶多酚-隐丹参酮水混悬液(对比例4),并且实施例1在给药4天后仍然没有检测到细菌生长。说明离子液体与隐丹参酮、茶多酚的复合组合物能显著增强抗菌作用,同时隐丹参酮与茶多酚自身也表现出协同增效的效果。
实验例5.从体外细胞实验评价本发明的抗炎效果
按以下方法建立体外炎症模型和给药方案,考察本发明的体外抗炎活性。
(1)菌种的制备:取对数生长期的痤疮丙酸杆菌适量,用PBS稀释,在麦氏比浊度仪测定最终的细菌浓度为1×109CFU/mL作为母液待用。将所得菌液置于90℃下水浴加热30分钟,以灭活痤疮丙酸杆菌。用1640培养基稀释10倍备用。
(2)药物浓度的配置:用DMSO配置浓度为5mg/mL的隐丹参酮母液和50mg/mL的茶多酚母液。将本发明的空白离子液体、实施例1的载隐丹参酮-茶多酚复合物离子液体、隐丹参酮和茶多酚母液分别用含1×108CFU/mL痤疮丙酸杆菌的1640培养基稀释4000、8000、16000倍,备用。
(3)用灭活痤疮丙酸杆菌刺激产生体外炎症模型,取生长状态良好的Raw264.7细胞,用1640培养基重悬和计数,并用1640完全培养基进行稀释至细胞浓度约为5×105/mL,按照每孔1mL接种到12孔板中,在37℃、5%CO2培养箱中培养12h。移除各孔培养基,向各孔中加入1mL上述各浓度药物溶液,并设置对照组加入不含药物的1640培养基,继续培养24h。去除培养基,并用PBS洗涤两次。提取RNA用于实时荧光定量PCR检测细胞中的IL-1β的基因表达,以β-actin为内参,IL-1β的基因表达量作为评价炎症指标,评价其抗炎效果;并与单独隐丹参酮、单独茶多酚的抗炎效果做比较,评价本发明的联合抗炎优势。
引物序列如下:
β-actin FP 5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'
RP 5'-CGATAGTGATGACCTGACCGT-3'
IL-1βFP 5'-ATTGTGGCTGTGGAGAAG-3'
RP 5'-AAGATGAAGGAAAAGAAGGTG-3'
本实验结果如图2显示,当用本发明实施例1载隐丹参酮-茶多酚复合物离子液体给药后,实施例1(62.5μg/mL)组细胞中IL-1β基因表达与不给药对照组相比明显降低,并且随着药物浓度增大,抗炎症效果越强,差异具有统计学意义。图3显示隐丹参酮、茶多酚均有一定的抗炎效果,与此同时,本发明实施例1载隐丹参酮-茶多酚复合物离子液体组的抑制IL-1β基因表达水平明显优于单一组分药物组。
实验例6从体外细胞实验评价本发明的抑制雄性激素和抗脂质分泌效果
按以下方法建立体外5α还原酶活性增强和脂质过量分泌模型和给药方案,考察本发明载隐丹参酮-茶多酚复合物离子液体的体外抗脂质情况,评价本发明的体外抗脂质情况。
(1)药物浓度的配置:用DMSO配置浓度为8.64mg/mL的睾酮母液,用DMEM培养基稀释至75μM,备用。用DMSO配置浓度为5mg/mL的隐丹参酮母液和50mg/mL的茶多酚母液。将本发明的空白离子液体、实施例1的载隐丹参酮-茶多酚复合物离子液体、隐丹参酮和茶多酚母液分别用含睾酮的DMEM培养基稀释8000、16000、32000倍,备用。
(2)用激素睾酮刺激产生体外5α还原酶活性增强和脂质过量分泌模型,取生长状态良好的HDPC(人毛乳头)细胞,用DMEM培养基重悬和计数,并用DMEM完全培养基进行稀释至细胞浓度约为3×105/mL,按照每孔1mL接种到12孔板中,在37℃,5%CO2培养箱中培养12h。移除各孔培养基,向各孔中加入1mL上述各浓度药物溶液,并设置对照组加入不含药物的DMEM培养基,继续培养24h。去除培养基,并用PBS洗涤两次。提取RNA用于实时荧光定量PCR检测细胞中的5α还原酶、胆固醇调节元件结合蛋白1c和脂肪酸合成酶的基因表达,以GAPDH为内参,胆固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAS)的基因表达量作为评价脂质指标、抗炎效果。引物序列如下:
GAPDH FP 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3'
RP 5'-TGGAAGATGGTGATGGGAT-3'
5α还原酶FP 5'-GCTTCATACCCACTCCCTGT-3'
RP 5'-TGGGTCTTTGTGGCTTCAGA-3'
胆固醇调节元件结合蛋白1c FP 5'-GGAGCCATGGATTGCACTTT-3'
RP 5'-TCAAATAGGCCAGGGAAGTCA-3'
脂肪酸合成酶FP 5'-CAGGCACACACGATGGAC-3'
RP 5'-CGGAGTGAATCTGGGTTGAT-3'
本实验结果见图4、5、6。如图4显示,本发明实施例1载隐丹参酮-茶多酚复合物离子液体给药后,细胞中5α还原酶的基因表达与不给药对照组相比明显降低,并且随着药物浓度增大,抑制效果越强。图5、6显示,本发明实施例1载隐丹参酮-茶多酚复合物离子液体给药后,实施例1组细胞中胆固醇调节元件结合蛋白1c和脂肪酸合成酶的基因表达与不给药对照组相比明显降低。另外,隐丹参酮、茶多酚、空白离子液体均表现出一定的抗脂质分泌作用。同时,本发明实施例1载隐丹参酮-茶多酚复合物离子液体的抑制脂质分泌效果明显优于单一组分药物组,证明本发明具有联合抗脂质优势。
实验例7从体外痤疮动物小鼠模型评价该发明的抗痤疮疗效
按以下方法建立痤疮小鼠模型的和给药方案,考察本发明载隐丹参酮-茶多酚复合物离子液体的抗痤疮活性。
(1)采用BALB/C小鼠(3-5周)作为模型动物,用动物剃毛仪除去小鼠背部毛发并使用脱毛膏进行脱毛处理,脱毛48h后进行动物造模。每只小鼠在背部皮内注射25μL痤疮丙酸杆菌PBS缓冲溶液(1×109CFU/mL),大约两天后可以观察到注射部位皮肤出现明显凸起并且皮肤发红,此时随机分组,并给药。
(2)将12只BALB/C小鼠模型随机分为模型组、阿达帕林凝胶组(对照组)、实施例1组和实施例2。模型组、对照组、实施例1组和实施例2组均于每只BALB/C小鼠背部外涂阿达帕林凝胶50mg、本发明实施例1与实施例2所得液体50mg,模型组不做任何处理。
(3)在实验过程每天量取皮肤凸起体积,第1、5、9天分别对动物皮肤进行拍照。在实验结束后,颈椎脱臼处死小鼠
本实验结果见图7、8,本发明实施例1载隐丹参酮-茶多酚离子液体能够起到治疗痤疮的作用,在给药一周后可以将痤疮抑制至较小水平并且减轻了红肿炎症现象,而不给药组则痤疮体积无明显变化。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种治疗痤疮的组合物,其特征在于:所述组合物包括以下组分及其重量份数:隐丹参酮0.01~0.1份,茶多酚0.1~0.9份,离子液体10~15份;
其中,所述离子液体为氢氧化胆碱和水杨酸按质量比1:1.14~2.28组成。
2.根据权利要求1所述组合物,其特征在于:所述组合物包括以下组分及其重量份数:隐丹参酮0.02~0.08份,茶多酚0.2~0.8份,离子液体10~13份。
3.根据权利要求2所述组合物,其特征在于:所述组合物包括以下组分及其重量份数:隐丹参酮0.05份,茶多酚0.5份,离子液体10份。
4.根据权利要求1~3任一所述组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、离子液体的制备:将水杨酸加入到无水乙醇中,搅拌溶解,缓慢滴加氢氧化胆碱溶液,室温下搅拌,浓缩、干燥,得离子液体;
S2、组合物的制备:将茶多酚加入步骤S1所得离子液体中,溶解,再加入隐丹参酮,完全溶解,即得。
5.根据权利要求4所述制备方法,其特征在于,步骤S1中,所述水杨酸和无水乙醇的质量体积比为1:0.8~1.5(g/mL)。
6.根据权利要求4所述制备方法,其特征在于,步骤S1中,所述氢氧化胆碱溶液为氢氧化胆碱质量分数44%的水溶液。
7.权利要求1~3任一所述组合物在制备治疗痤疮药物中的应用。
8.一种治疗痤疮的药物,其特征在于,以权利要求1~3任一所述组合物为主要成分。
9.根据权利要求8所述药物,其特征在于,所述药物还包括药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求9所述药物,其特征在于,所述药物的剂型包括软膏剂、凝胶剂、乳膏剂、贴剂和水剂。
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