CN110974861B

CN110974861B - 一种艾纳香油脂质体

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Publication number: CN110974861B
Application number: CN201911348113.XA
Authority: CN
Inventors: 康冀川; 陈宝雯; 钱一鑫; 黄昌平; 王鲁; 方隐逸; 文丽
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: CN110974861A

Abstract

本发明涉及医药、日化产品领域，具体涉及一种艾纳香油脂质体。所述艾纳香油脂质体的配方由以下质量份数的物质组成：艾纳香油0.35‑0.65％、卵磷脂1.0‑3.0％、胆固醇0.2‑0.5％、余量为PBS溶液。所述艾纳香油脂质体可与药物、日化领域可接受的辅料搭配，进一步制成凝胶剂、软膏剂、眼膏剂、搽剂、气雾剂、溶液剂、溶胶剂、乳剂、混悬剂等产品。本发明的艾纳香油脂质体具有良好的透皮吸收效果和抗炎、镇痛、皮肤修复活性作用，对皮肤、粘膜无毒性与刺激性。

Description

一种艾纳香油脂质体

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种艾纳香油脂质体。

背景技术

艾纳香是菊科艾纳香属的多年生木质草本植物，别名大风艾、冰片艾，药用部位为其新鲜或干燥的地上部分。在我国南方作为传统民族药物使用历史悠久，具有镇痛、活血、治疗跌打损伤、美体除臭等功效。艾纳香油是艾纳香地上部分的叶片精制而成的精油，含几十种有效成分，如左旋龙脑、β-石竹烯、樟脑、γ-桉叶油醇、1-辛烯-3-醇、反-罗勒烯、1,3,4,5,6,7-六氢-2,5,5-三甲基2,4α-亚甲基以及α-蒎烯、柠檬醇和芳樟醇乙酸龙脑酯等化合物。经药理试验表明，艾纳香油具有良好的生物活性，如抗菌、抗炎、抗病毒、免疫调节、皮肤修复、止血、止痛、止痒等。但是由于艾纳香油在室温非密封条件下易挥发，且气味过于浓厚，不便于直接使用。

脂质体(liposomes)是药物递送的新型载体，以天然或合成的一类固体高熔点类脂为膜材料，包裹药物形成的递药微球，粒径约为50～1000nm。具有靶向性强、生物相容性好、低毒、操作简便、稳定的特点，因此在医药领域有着重要的应用，多集中在肿瘤治疗方面，如紫杉醇脂质体，但皮肤上也有良好应用。

皮肤是人体隔绝外界的第一道屏障，在保护人体的同时会因为自身生理因素或是环境因素出现病症，如炎症、伤口等。在所有的给药方式中，皮肤给药的吸收效果是最差的，是因为皮肤的表皮层是一层致密的角化层，只有少部分粒径很小的脂溶性物质能通过。脂质体通过融合或穿透等机制将药物运载进入表皮，使药物较多的透过角质层，进而到达皮肤深层。

专利号CN201810690985.3公开了医药健康技术领域中的一种具有促进皮肤溃疡创面修复愈合的复方艾纳香生肌凝胶剂，属于医药领域。所述组合由艾纳香(左旋龙脑)、一氧化氮(NO)及适宜辅料制备而成，凝胶由A胶和B胶组成。主要用于治疗糖尿病皮肤溃疡，亦可用于治疗烧伤、创面修复、硬皮病、其他类别的皮肤溃疡等症；该发明制剂易清洗、不污染衣物，水合程度高，易于药物吸收，具有湿润和保护伤口作用，稠度、粘度适宜，易于涂布使用，稳定性好。但该发明对皮肤创面的保护作用主要是通过A胶与B胶作用产生的NO在体内作用达到的，此外还有亚硝酸钠、抗坏血酸素等物质，艾纳香有效物质在该药物中的含量少，且主要作用是作为NO的载体，促进NO透皮吸收。是利用艾纳香的另一种利用形式。

专利号CN201910002070.3公开了一种含有艾纳香提取物的透皮吸收组合物。该透皮吸收组合物包括艾纳香脂质体和肌肤解表素脂质体，所述艾纳香脂质体中包含艾纳香提取物、陈艾叶提取物、干姜提取物，所述肌肤解表素脂质体中包含姜提取物。该发明的组合物通过艾纳香提取物、陈艾叶提取物成分的协同作用达到温经通络，补阳活血的护理效果，同时护肤基质中还包含肌肤解表素脂质体，促进代谢产物及时排出，避免沉积和肌肤损伤，实现了深层护理和代谢物的及时排出，改变了原有的单向作用机理，实现了双向透皮吸收，对麻木、酸软、节疼痛等症状有很好的治疗作用。在此文件中，艾纳香油脂质体的制备采用了高压匀质法，将水相和油相混合后置于高压均质机均质，控制脂质体粒径。但是此方法对仪器的要求较高，在制备过程中脂质体的损耗量较大，循环均质还会造成脂质体包封率下降，脂质体包载的药物变少，进入体内发挥的药效就会随之降低。另外，此文件组合物的药理作用在于负载护肤精华，调节皮脂腺，清洁皮肤，此外没有对其他药理作用进行进一步说明。

因此当前并没有一种简单、稳定、有效的制备艾纳香油脂质体的工艺方法，单纯利用艾纳香油脂质体就能有效治疗多种皮肤疾病的研究。

发明内容

本发明为解决上述技术问题，提供了一种艾纳香油脂质体及其制备方法，以及所述脂质体在药学上的应用。基于皮肤特殊的生理特点和脂质体在应用上的优点，为了更好地发挥艾纳香油的药理活性，治疗皮肤疾病，本申请将利用脂质体技术包裹艾纳香油，并且将脂质体技术与凝胶等制剂相结合，达到进一步增强艾纳香油脂质体的效果。

一种艾纳香油脂质体，所述艾纳香油脂质体的配方由以下质量份数的物质组成：艾纳香油0.35-0.65％、卵磷脂1.0-3.0％、胆固醇0.2-0.5％、余量为PBS溶液。

所述艾纳香油脂质体的配方由以下质量份数的物质组成：艾纳香油0.45-0.55％、卵磷脂1.7-2.7％、胆固醇0.3-0.4％、余量为PBS溶液。

所述艾纳香油脂质体按下述步骤制成：

(1)制备PBS溶液：0.1mol/L的磷酸二氢钾和0.1mol/L的磷酸氢二钠以体积比(9-9.5):1配制，pH值为5.6-5.8；

(2)制备溶解液：称取配方量卵磷脂、胆固醇和艾纳香油加入至体积为PBS溶液1/3-1/4的无水乙醇中，搅拌至卵磷脂、胆固醇、艾纳香油完全溶解，得溶解液；

(3)制备脂质体：将溶解液1.8mL/min-2.2mL/min匀速注入到35-45℃的PBS溶液中，置于35-45℃环境中恒温搅拌使乙醇完全挥发，再经水浴超声处理后，通过微孔滤膜处理即得艾纳香油脂质体溶液；

(4)将艾纳香油脂质体溶液置于低温环境中保存，即得。

所述水浴超声的温度为20-40℃，超声频率为120-150w。

所述艾纳香油脂质体加入药学、日化领域上可接受的辅料或载体，制成所需要的产品，包括药物制剂、化妆品、日化产品、妇科洗液、口腔产品、鼻用产品等。所述艾纳香油脂质体加入药学上、日化领域可接受的辅料或载体，制成所需要的产品，包括药物制剂、化妆品、洗护用品。

所述制成的洗护用品包括：发用产品、口腔产品、鼻用产品、妇科洗液、足部护理产品。

所述产品为凝胶剂、软膏剂、眼膏剂、搽剂、气雾剂、溶液剂、溶胶剂、乳剂、混悬剂。所述产品为凝胶剂、软膏剂、眼膏剂、搽剂、气雾剂、溶液剂、溶胶剂、乳剂、混悬剂。

本发明还公开了所述的艾纳香油脂质体及其产品的应用，所述艾纳香油脂质体及其产品作用于皮肤、粘膜，用于改善各类皮肤或粘膜问题，具体表现在：湿疹、过敏性皮炎、脂溢性皮炎、红肿、口腔溃疡、鼻炎、阴道炎、轻度烧伤、轻度烫伤、脚气、溃烂。

所述的艾纳香油脂质体及其产品可以用于皮肤、口腔、鼻腔、足部或阴道部位。

有益效果：

采用本发明方法制备的艾纳香油脂质体的稳定性优、包封率高，l-龙脑包封率达65％以上，最高可达73.6％，提高了艾纳香油的活性，改善了透皮吸收效果，进而实现了体外皮肤修复的有效应用，并且具有良好的抗炎和镇痛作用，对皮肤无毒性与刺激性。

本发明利用卵磷脂和胆固醇作为膜体材料，不仅使得脂质体具有亲水亲脂两性，还通过用量比的限定，提高了脂质体的抗氧化性及成品稳定性，选择大豆卵磷脂不仅加强了天然安全性，还提高了与艾纳香油中有效成分的相容能力；PBS溶液的使用不仅调节盐平衡、破坏生物蛋白结构，进而使得艾纳香油中有效成分进入蛋白结构中被大量保留，还提高了艾纳香油中有效成分的活性，有助于改善透皮吸收效果。

在确定原料后对处方工艺进行了筛选，首先进行了制备方法的筛选，常用的脂质体制备方法有薄膜超声法、乙醇注入法、逆向蒸发法等，考虑到艾纳香油常温下易挥发的特点，本文件选用了乙醇注入法，优点在于操作简单适合工业生产，但是乙醇注入法具有包封率低，所得脂质体浓度低的缺点。因此，本文件通过首先考察制备过程中可能影响包封率的因素，找出影响最为显著因素，其次运用响应面优化设计的手段辅助寻找提高脂质体包封率的最佳因素的水平，解决了上述问题。本发明利用超声手段，使得物料结构形成多孔，有助于艾纳香油中有效成分的留着，同时利用频率激发了艾纳香油中有效成分的活性。再利用微孔滤膜的过滤作用控制脂质体的粒径，进一步促进艾纳香油脂质体的透皮吸收性。

接着以包封率为指标考察不同因素对艾纳香油包封率的影响，筛选出最适合的原料组成和制备工艺，不仅工艺简单适合工业生产，还能使脂质体拥有良好的外观形态和稳定性，是发挥透皮吸收及其他药理活性的基础。

另外，本文件使用的乙醇注入法中未添加表面活性剂，得到的脂质体溶液实际上是脂质体混悬液，在后续制备凝胶或者进行药理试验时经离心去除上清液可得到高含量的脂质体。得以灵活控制脂质体的含量，有助于制备脂质体复合制剂时对艾纳香油的含量进行调控。

本文件在对艾纳香油脂质体及其复合制剂的药理活性进行考察之后得出结论，艾纳香油脂质体及其复合制剂比艾纳香油原料具有更强的镇痛、抗炎、皮肤修复等活性，并且制备成脂质体复合制剂以后活性进一步得到了增强，说明艾纳香油脂质体及其制成的复合制剂具有良好的药理活性，可用于多种皮肤疾病的治疗。

说明书附图

图1：艾纳香油脂质体在透射电镜下的形态(标尺100nm)；

图2：艾纳香油脂质体粒径分布；

图3：艾纳香油脂质体皮肤修复实验；

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。

实施例1

一种艾纳香油脂质体，所述艾纳香油脂质体的配方由以下质量份数的物质组成：艾纳香油0.538％、大豆卵磷脂2.1％、胆固醇0.304％、余量为PBS溶液；

所述艾纳香油脂质体按下述步骤制成：

(1)制备PBS溶液：0.1mol/L的磷酸二氢钾和0.1mol/L的磷酸氢二钠以体积比9:1配制，pH值为5.6；

(2)制备溶解液：称取配方量卵磷脂、胆固醇和艾纳香油加入至体积为PBS溶液1/3的无水乙醇中，搅拌至卵磷脂、胆固醇、艾纳香油完全溶解，得溶解液；

(3)制备脂质体：将溶解液以2mL/min的速度注入到35-45℃的PBS溶液中，置于40℃环境中恒温搅拌使乙醇完全挥发，再经水浴超声处理10min后，通过0.22μm微孔滤膜处理即得艾纳香油脂质体溶液；

(4)将艾纳香油脂质体溶液置于低温环境中保存；

所述水浴超声的温度为20℃，超声频率为150w。

得到的艾纳香油脂质体的包封率为70.24％。

实施例2

一种艾纳香油脂质体，所述艾纳香油脂质体的配方由以下质量份数的物质组成：艾纳香油0.45％、大豆卵磷脂1.7％、胆固醇0.3％、余量为PBS溶液；

所述艾纳香油脂质体按下述步骤制成：

(1)制备PBS溶液：0.1mol/L的磷酸二氢钾和0.1mol/L的磷酸氢二钠以体积比9:1配制，pH值为5.8；

(2)制备溶解液：称取配方量卵磷脂、胆固醇和艾纳香油加入至体积为PBS溶液1/4的无水乙醇中，搅拌至卵磷脂、胆固醇、艾纳香油完全溶解，得溶解液；

(3)制备脂质体：将溶解液以1.8mL/min的速度注入到35℃的PBS溶液中，置于45℃环境中恒温搅拌使乙醇完全挥发，再经水浴超声处理20min后，通过0.22μm微孔滤膜处理即得艾纳香油脂质体溶液；

(4)将艾纳香油脂质体溶液置于低温环境中保存；

所述水浴超声的温度为40℃，超声频率为120w；

得到的艾纳香油脂质体的包封率为66.88％。

实施例3

一种艾纳香油脂质体，所述艾纳香油脂质体的配方由以下质量份数的物质组成：艾纳香油0.55％、大豆卵磷脂2.7％、胆固醇0.4％、余量为PBS溶液；

所述艾纳香油脂质体按下述步骤制成：

(1)制备PBS溶液：0.1mol/L的磷酸二氢钾和0.1mol/L的磷酸氢二钠以体积比9.2:1配制，pH值为5.7；

(3)制备脂质体：将溶解液以2.2mL/min的速度注入到35℃的PBS溶液中，置于35℃环境中恒温搅拌使乙醇完全挥发，再经水浴超声处理15min后，通过0.22μm微孔滤膜处理即得艾纳香油脂质体溶液；

(4)将艾纳香油脂质体溶液置于低温环境中保存；

所述水浴超声的温度为30℃，超声频率为130w；

所得艾纳香油脂质体的包封率为66.25％。

实施例4

一种艾纳香油脂质体，所述艾纳香油脂质体的配方由以下质量份数的物质组成：艾纳香油0.48％、大豆卵磷脂2.5％、胆固醇0.38％、余量为PBS溶液；

所述艾纳香油脂质体按下述步骤制成：

(1)制备PBS溶液：0.1mol/L的磷酸二氢钾和0.1mol/L的磷酸氢二钠以体积比9.4:1配制，pH值为5.6；

(3)制备脂质体：将溶解液以2.1mL/min的速度注入到42℃的PBS溶液中，置于36℃环境中恒温搅拌使乙醇完全挥发，再经水浴超声处理19min后，通过0.22μm微孔滤膜处理即得艾纳香油脂质体溶液；

(4)将艾纳香油脂质体溶液置于低温环境中保存；

所述水浴超声的温度为12℃，超声频率为110w；

所得艾纳香油脂质体的包封率为67.51％。

实施例5

一种艾纳香油脂质体，所述艾纳香油脂质体的配方由以下质量份数的物质组成：艾纳香油0.5％、大豆卵磷脂2％、胆固醇0.35％、余量为PBS溶液；

所述艾纳香油脂质体按下述步骤制成：

(1)制备PBS溶液：0.1mol/L的磷酸二氢钾和0.1mol/L的磷酸氢二钠以体积比9.3:1配制，pH值为5.7；

(3)制备脂质体：将溶解液以1.9mL/min的速度注入到38℃的PBS溶液中，置于43℃环境中恒温搅拌使乙醇完全挥发，再经水浴超声处理12min后，通过0.22μm微孔滤膜处理即得艾纳香油脂质体溶液；

(4)将艾纳香油脂质体溶液置于低温环境中保存；

所述水浴超声的温度为15℃，超声频率为140w；

所得艾纳香油脂质体的包封率为65.36％。

应用例1艾纳香油脂质体凝胶剂的制备

按照实施例1-5任一方法制备得到脂质体后，10000r/min离心30分钟后弃去上清液。称取凝胶总重0.5％的卡波姆，溶解于凝胶质量50％的纯水中，充分溶胀，得到卡波姆溶液；称取凝胶质量1.5％三乙醇胺、10％甘油和35％的纯水，将三者混匀得混合液；总质量0.1％的羟苯甲酯溶于少量无水乙醇中；向卡波姆溶液中缓慢加入混合液进行混匀，再加入羟苯甲酯的乙醇溶液混匀，最后加入凝胶总重2.9％的艾纳香油脂质体混匀，即得艾纳香油脂质体凝胶。

艾纳香油浓度为0.75-0.89mg/mL。

应用例2艾纳香油脂质体软膏剂的制备

按照实施例1-5的任一方法制备得到脂质体后，10000r/min离心30分钟后弃去上清液。按照下列处方称取辅料：

制备方法：

油相制备：称取处方量的白凡士林、单硬脂酸甘油酯、十六醇至烧杯中，将其置于85℃水浴锅中加热搅拌至油相充分溶解。

水相制备：将处方量的SDS、甘油和纯水加入另一烧杯中，将烧杯置于85℃水浴锅中使其完全溶解，充分搅拌

乳化：将水相缓缓倒入油相中，快速沿同一方向搅拌，至完全乳化。待冷却至40℃左右时，将处方量的羟苯乙酯和艾纳香油的无水乙醇溶液倒入乳膏基质中，搅拌均匀，即得。

艾纳香油浓度为0.75-0.89mg/mL。

应用例3艾纳香油脂质体乳液剂的制备

按照实施例1-5的任一方法制备得到艾纳香油脂质体后，加入脂质体质量5％的吐温80和100％的纯水，沿顺时针方向搅拌均匀即得。

艾纳香油浓度为0.75-0.89mg/mL。

应用例4艾纳香油脂质体喷雾剂的制备

将应用例3得到的艾纳香油脂质体乳液于室温下灌入喷雾机内，再将阀门装上并轧紧，然后通过压装机压入抛射剂即得。

艾纳香油浓度为0.75-0.89mg/mL。

对比例1

按照专利号CN201910002070.3公开的方法制备：

姜提取物5％、艾纳香提取物和陈艾叶提取物18％(艾纳香提取物20份、陈艾叶提取物20份)、脂质体15％、支撑剂1.5％、抗氧化剂0.08％、增溶剂12％和稳定剂10％，余量为水。

S1.将脂质体、支撑剂、增溶剂、抗氧化剂，在55～60℃温度条件下混合并充分搅拌至均匀油相，保温10～15min；

S2.将稳定剂、姜提取物溶于纯水中，升温至50～60℃，搅拌为均匀水相，保温10～15min；

S3.将S1中制备的油相与S2中制备的水相中进行预混合，混合均匀，在50～60℃下保温10～15min，制成初乳液；

S4.将初乳液在40～200MPa压力下进行高压均质循环处理至透明或半透明时取出，自然冷却至室温，得到肌肤解表素脂质体；

S5.根据S1～S4的步骤制备得到艾纳香脂质体；

S6.将肌肤解表素脂质体和艾纳香脂质体混合，沿同一方向缓慢搅拌均匀，得到双向作用的艾纳香提取物的透皮吸收脂质体组合物。

经3次试验后计算所得组合物中艾纳香脂质体的包封率，以l-龙脑计平均为31.16％。

对比例2

艾纳香油溶液样品

称取适量艾纳香油加入PBS溶液中，加入质量份数1％的吐温80，配成艾纳香油浓度为0.75-0.89mg/mL的溶液。

实验部分

实验例1.处方工艺的筛选

脂质体的脂性外壳通常为磷脂材料，但是磷脂缺乏流动性，通常加入少量固醇类物质调节脂质体膜材的流动性。本实验在确定了接受液为PBS溶液后对脂质材料进行筛选。常用的材料为大豆卵磷脂和蛋黄卵磷脂，但是蛋黄卵磷脂单价较高，不利于工业生产及推广，因此选择大豆卵磷脂制备脂质体。在固醇类物质中选择了与人体皮肤相容性好、无毒害作用的胆固醇和β-甾醇进行比较，称取0.1g大豆卵磷脂，按照大豆卵磷脂与固醇质量比为8:1、艾纳香油与总脂质体比例1:8称取固醇和艾纳香油、另取5mL PBS溶液，按照文件中的方法制备艾纳香油脂质体，并加入0.5mL吐温80，比较不同固醇制得的艾纳香油脂质体的稳定性：装入1mL离心管中，3000r/min离心30min，取出后发现固醇为β-甾醇的脂质体稳定性较差，溶液出现分层，猜想可能是由于与艾纳香油的组合使得脂质体的性质不稳定，因此本文件选择了胆固醇。

此外，筛选制备溶解液的工艺，选取处方量的各原料，按照以下两种方法制备溶解液：①大豆卵磷脂、胆固醇、艾纳香油同时加入无水乙醇中搅拌溶解；②大豆卵磷脂、胆固醇加入无水乙醇中搅拌溶解后加入艾纳香油；再继续上文中的剩余工艺操作。重复三次实验考察包封率。结果为按照①的方法制备溶解液得到的脂质体包封率平均值为52.31％，按照②的方法制备溶解液得到的脂质体包封率平均值为70.94％。因此溶解液制备过程中物质的溶解顺序对艾纳香油的包封率有很大影响，其原因可能在于，艾纳香油和无水乙醇同属易挥发物质，而大豆卵磷脂和胆固醇以固体的形式加入无水乙醇中，在搅拌溶解的过程中会使艾纳香油挥发，减少溶解液中艾纳香油的含量，因此包封率降低，而先将大豆卵磷脂和胆固醇溶解后再加入艾纳香油则避免了这个问题。

实验例2.对实验具有显著影响的因素筛选-单因素筛选试验

脂质体的制备过程中受到多种因素的影响，比如在本研究的制备方法里，乙醇注入法中可能影响的因素有：艾纳香油与总脂质的质量之比(总脂质的质量为大豆卵磷脂与胆固醇质量之和)，脂质成分的质量之比(大豆卵磷脂与胆固醇的质量之比)，溶解液注入PBS溶液中的速度，PBS溶液的温度、挥干乙醇的温度、挥干乙醇后超声处理的时间等。以下以脂质体的包封率作为指标，研究不同因素对艾纳香油脂质体包封率的影响。

1)艾纳香油与总脂质的质量之比

比值	1:4	1:6	1:8	1:10	1:12
						包封率	46.46％	60％	50.79％	36.59％	32.43％

2)脂质成分的质量之比(大豆卵磷脂：胆固醇)

比值	4:1	6:1	8:1	10:1	12:1
						包封率	36.675	40.86％	53.13％	39.56％	30.00％

3)溶解液注入PBS溶液中的速度

4)PBS溶液的温度

PBS温度℃	30	35	40	45	50
						包封率	50.02％	50.60％	59.09％	52.38％	50.48％

5)超声处理的时间

由上述结果可得知，在这些因素里，艾纳香油与总脂质的质量之比、脂质成分的质量之比和溶解液注入PBS溶液中的速度这三个因素的变化对艾纳香油脂质体的包封率的影响是最大的，因此把它们作为主要因素进行处方的进一步的正交优化设计筛选。其他因素的值在此得以确定，PBS溶液的温度为35-45℃，超声处理的时间为10-20min。

实验例3.艾纳香油脂质体配方组成的确定-响应面正交设计优化

由单因素试验的分析结果可得知，艾纳香油与总脂质部分的质量之比、脂质成分的质量之比和溶解液注入PBS溶液中的速度是影响艾纳香油脂质体包封率最大的因素，并根据单因素实验选取了各因素水平，利用响应面正交设计优化研究不同的因素和水平间的交互作用对纳香油脂质体包封率的影响，并得出具体的因素水平值范围。

脂质成分的质量之比(A)、艾纳香油与总脂质的质量之比(B)和溶解液注入PBS溶液中的速度(C)的交互作用对艾纳香油脂质体包封率的影响部分结果如表1：

表1.艾纳香油脂质体制备影响因素的响应面优化设计

利用Design Expert 8.0.6软件对艾纳香油脂质体制备影响因素的响应面优化设计结果进行多元线性回归拟合，对模型进行方差分析，拟合模型P<0.01，表示模型极显著，说明模型成立，本实验方法可靠。

由响应面优化设计实验的结果确定最终的处方工艺，即艾纳香油0.35-0.65％、卵磷脂1.0-3.0％、胆固醇0.2-0.5％、余量为PBS溶液，溶解液注入PBS溶液中的速度为1.8mL/min-2.2mL/min。

实验例4.艾纳香油脂质体的稳定性实验

对艾纳香油脂质体进行稳定性考察，实施例1-5制备的艾纳香油脂质体溶液置于4℃冰箱中，一个月内每10天取样一次，检测不同批次艾纳香油脂质体的包封率。

结果表明在一个月内检测到的3次实施例1-5的包封率分别为65.36％-70.24％，65.09％-69.92％，64.51％-69.46％。一个月后艾纳香油脂质体的包封率为制备时的98％以上，可以得出结论：本方法提供的艾纳香油脂质体在一个月内有良好的稳定性。

在确定了处方工艺及艾纳香油脂质体的稳定性考察之后，本文件继续研究艾纳香油脂质体的药理作用，同时以应用例1制备的艾纳香油脂质体凝胶为例，研究艾纳香油脂质体制备成其它形式的复合制剂后的药理作用，如透皮吸收特性、抗炎活性、镇痛活性等。

实验例5.艾纳香油脂质体的透皮吸收试验

本实验采用小鼠离体皮肤，在透皮吸收仪中进行，分为以下几个步骤：

1.小鼠离体皮肤制备

SPF级小鼠用veet脱毛膏除去背部毛，用水洗净，24h后断颈处死，立即剥离背部皮肤，去除脂肪及皮下组织，用生理盐水洗净，-80℃冻存备用；

2.艾纳香油皮肤给药制剂体外透皮吸收实验方法

2.1小鼠皮肤处理：小鼠背部皮肤脱毛，1h后选择无皮肤破损或过敏的小鼠处死，分离出小鼠背部皮肤，生理盐水洗净后于-80℃冻存。临用前置于37℃生理盐水中解冻，剪成半径为1cm的圆形备用。

2.2试验药品准备：试验药品为分别按照实施例1-5的方法制备的艾纳香油脂质体，按照应用例1-4方法制备得到的艾纳香油脂质体复合制剂和按照对比例1-2方法制备得到的样品；接收液为pH5.6-5.8的PBS溶液。

2.3 Franz扩散池搭建：Franz扩散池由上到下依次为供给池、小鼠皮肤、接收池。在接收池中放入磁石、加满接收液，再将小鼠皮肤覆盖于接收池上方，皮肤的角质层背对接收池，再将供给池置于小鼠皮肤上方，使用固定夹固定供给池、小鼠皮肤和接收池，于供给池中加入各试验药品；其中半固体样品的加入量为2g，液体样品的加入量为2mL。

2.4试验方法：于水浴温度37℃，磁力搅拌速度为300r/min下，分别在第2、4、6、8、10、24h时取出各组2mL接收液同时补加等体积新的接收液。使用GC法测定脂质体中l-龙脑的含量，计算累积透过量(Qn，ug/cm²)；

Qn为累积透过量，Cn为接收池中l-龙脑最终浓度μg/mL，Ci为某一时间点接收池中l-龙脑浓度μg/mL，V为接收池体积，Vi为取样体积mL，A为扩散池面积；

实验结果如下：

表2.艾纳香油皮肤给药制剂体外透皮吸收试验24h内累积渗透量Qn/ug/cm²(n＝3)

由数据处理结果可知，相较于艾纳香油，艾纳香油脂质体和艾纳香油脂质体复合制剂的透皮吸收性能更好，具有极显著性差异(P<0.01)。并且对比例2的透皮吸收性能与艾纳香油相似。

实验例6.镇痛作用评价

本实验选取了小鼠的甲醛致痛模型，比较本申请文件提供的不同样品的镇痛效果，市面常用的镇痛药双氯芬酸钠凝胶(购自先声药业有限公司，批号：35-180621，质量分数为1％)为阳性药。样品为实施例1-5制备的艾纳香油脂质体，应用例1-4得到的艾纳香油脂质体复合制剂和对比例1-2的样品。

试验方法：

阴性组给予PBS溶液0.5mL，阳性药物组给予双氯芬酸钠凝胶0.5g，其它样品组，半固体样品组给药0.5g，液体样品组给药0.5mL，模型对照组不处理；

每组10只小鼠，在小鼠右侧足底及两侧涂抹给药，每天给药一次，连续给药3天，最后一次给药1h后在右足底外侧皮下注射5％甲醛溶液50μL，立即将小鼠放到玻璃箱中，分别记录小鼠在注射甲醛溶液后0～10min，10～60min2个时相内的舔足次数；实验结果如表3：

表3：小鼠的甲醛致痛试验结果

以给药后小鼠的舔足次数为评价指标，相同时间内，小鼠舔足次数越多，代表痛感越明显，次数越少说明镇痛效果越好。由实验结果可以看出，对比例1和2组与阳性药物的镇痛效果相当，而实施例1-5和应用例1-4组的镇痛效果显著优于阳性药物组(P<0.05)。可以得出结论，本发明提供的艾纳香油脂质体和艾纳香油脂质体复合制剂具有良好的镇痛效果。

实验例7.抗炎效果评价

炎症反应是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。本实验采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀的炎症模型验证本文件样品：实施例1-5制备的艾纳香油脂质体、应用例1-4得到的艾纳香油脂质体复合制剂和对比例1-2的样品的抗炎效果。

1.实验方法

1.1.动物分组

KM小鼠，雌雄各半，随机分组，每组10只，分组情况为：模型对照组，阴性对照组(给予PBS溶液)，氢化可的松组(阳性对照组，商品名为丁酸氢化可的松乳膏，湖南迪诺制药有限公司，批号：180826，质量份数为1％)，及各样品组；

1.2.实验方法

吸取0.03mL二甲苯，于各组小鼠左耳正反面均匀涂抹，右耳不涂作为对照。30min后在致炎处涂抹给药，阴性组给予PBS溶液0.2mL，氢化可的松组给予氢化可的松乳膏0.2g，样品组中，半固体样品组给药0.2g，液体样品组给药0.2mL，模型组不处理。给药1小时后颈椎脱臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，用直径为6mm的打孔器分别在每只小鼠两耳同一部位打下圆耳片，称重，以左右耳质量之差表示肿胀程度，计算小鼠耳肿胀度和抑制率；

结果计算方法

剂量资料数据用mean±SD表示，组间比较采用t检验，数据经SPSS处理，当P<0.05时表示差异有统计学意义；试验结果见表4.

表4.二甲苯致小鼠耳廓肿胀试验结果

由实验结果可知，实施例1-5与应用例1-4都具有良好的抗炎效果，对比例1艾纳香油也具有良好的抗炎作用(P<0.01)，对比例1与对比例2也具有抗炎作用(P<0.05)。由实验结果可得出结论，本发明提供的艾纳香油脂质体的抗炎效果优于艾纳香油，并且制成复合制剂后，艾纳香油脂质体的抗炎效果增强。同时对比例1艾纳香油也具有良好的抗炎效果，但不及本发明方法制备的艾纳香油脂质体及其复合制剂。

实验例8.皮肤修复效果评价

本实验采用豚鼠背部皮肤划伤模型研究本文件提供的样品：实施例1-5制备的艾纳香油脂质体，应用例1-4的艾纳香油脂质体复合制剂，以及对比例1-2得到的样品对破损皮肤的修复效果。

实验方法：

1.实验动物

豚鼠体重200～300g，雌雄各半，随机分组，每组4只；

3.实验方法

在豚鼠的背部左右两侧分别脱毛出3×3cm的试验区，脱毛后24小时观察脱毛部位无破损、过敏等反应方可进行下一步实验操作。破损皮肤组需在豚鼠脱毛区划“井”字伤口，以微微渗血为宜；

给药方式为：同体左右两侧自身对照法，在豚鼠背部皮肤左侧分别给予样品，其中半固体样品组给药1g，液体样品组给药1mL。因此豚鼠右侧皮肤作为对照给予等量的凝胶基质。给药后用纱布固定，8小时后取下并进行换药处理，3次换药之后用温水除去残留受试物，在去除药物后4天内每日按时观察豚鼠的皮肤恢复情况并记录。

4.实验结果

实验结果显示，对照组的豚鼠破损皮肤康复缓慢，即使到了第4天仍旧有清晰可见的泛红伤口。对比例2和对比例1组在实验的第4天伤口完全结痂，红色伤口不可见；实施例1-5和应用例1-4在第4天破损皮肤的结痂已褪去，基本痊愈。由此皮肤修复实验可得出结论：艾纳香油具有一定皮肤修复作用，而艾纳香油脂质体及其复合制剂能使破损皮肤快速结痂痊愈，具有更好的皮肤修复作用。

例如图3所示，第一行为对比例1组，第二行为对照组，第三行为应用例3组，可以看出，对照组的豚鼠破损皮肤康复缓慢，即使到了第4天仍旧有清晰可见的泛红伤口，而含有艾纳香油的两组都具有不同程度的修复效果。其中，对比例1组在第4天伤口已完全结痂，红色伤口不可见；而应用例1组在第4天破损皮肤的结痂已褪去，基本痊愈。

综上药理作用的研究，可以得出结论，艾纳香油脂质体及其复合制剂具有良好的透皮吸收、镇痛、抗炎、皮肤修复作用。

同时，经过本实验部分与对比例1的比较，可以看出，专利CN201910002070.3提供的含有艾纳香提取物的组合物具有一定的透皮吸收、镇痛、抗炎、皮肤修复的药理活性，但是该组合物中艾纳香脂质体的包封率低，导致不能很好的发挥出艾纳香提取物的作用，所以对比例1的药理效果弱于本文件提供的艾纳香油脂质体及其制剂。本研究也同时针对口腔、鼻两部位的粘膜，进行了粘膜修复、镇痛作用实验，结果表明，艾纳香油脂质体及其复合制剂具有良好的粘膜修复、抗炎、镇痛作用，效果好于现有专利技术和普通艾纳香油溶液。

实验例9.皮肤急性毒性实验

1.实验动物

豚鼠雌雄各半，体重200～300g，随机分组，每组4只，样品为按照实施例1-5制备的艾纳香油脂质体，按照应用例1-4制备的艾纳香油脂质体复合制剂。各设完整皮肤组和破损皮肤组。

2.实验方法

给药方式为：同体左右两侧自身对照法，在豚鼠背部皮肤左侧分别给予样品，其中半固体样品组给药2g，液体样品组给药2mL。因此豚鼠右侧皮肤作为对照给予等量的PBS溶液。给药后用纱布固定，24小时后取下，用温水除去残留受试物，在去除药物后7天内每日按时观察豚鼠的全身中毒表现和死亡情况，包括动物体重、皮肤、毛发、眼睛、粘膜、呼吸、循环、中枢神经系统、四肢活动等的变化，连续观察7天。若有动物死亡则需进行尸检和肉眼观察。当有肉眼可见病变时，则需进行病理学检查。

3.实验结果

如表5所示，豚鼠分别给予实施例1-5和应用例1-4的样品，均未见全身中毒和死亡情况，动物体重增加，对呼吸循环、中枢神经系统、四肢活动等无影响。对正常和破损皮肤组个别动物有轻微红斑但无水肿，停药后24h即消失，无其它残留斑点。表明艾纳香油脂质体对正常皮肤和破损皮肤都无刺激性。

表5.皮肤急性毒性试验结果

结果显示，实施例1-5和应用例1-4样品对豚鼠的完整皮肤和破损皮肤都不具有毒性，豚鼠各项生命活动均无异常。说明本文件提供的艾纳香油脂质体及其复合制剂不具有皮肤毒性。

同样，本研究随机选择进行口腔粘膜急性毒性实验，结果显示本文件提供的艾纳香油脂质体及其复合制剂均不具有粘膜毒性。

实验例10.皮肤、粘膜刺激性评价

1.实验分组

选用豚鼠雌雄各半，每组4只，给药部位为背部左右皮肤脱毛区，脱毛区面积为3×3cm；实施例1-5和应用例1-4样品各设完整皮肤组和破损皮肤组。

2.实验方法

按照《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中的有关要求，采用同体左右侧自身对照的方法进行实验。给药前24h，剪去豚鼠背部脊柱两侧毛，后用Veet脱毛膏进行脱毛处理，脱毛范围为3×3cm。次日检查脱毛区皮肤是否完好，是否出现红肿反应。选取健康皮肤的豚鼠进行实验，给药量为半固体样品组给药1g，液体样品组给药1mL，给药后用纱布固定，使药物和豚鼠皮肤接触10h，连续给药3天。每天观察豚鼠背部给药区皮肤的局部反应，末次给药后用温水洗去残留受试物，在去除受试物的第1，24，48，72h观察豚鼠背部给药区皮肤是否出现红斑和水肿等情况，若有还需记录上述变化的恢复情况和时间。

观察并记录每只受试动物的实验结果，按照《皮肤刺激性反应评分标准》进行刺激性反应评分，计算出平均分值，对药物的刺激性做出评价；结果见表6：

表6.皮肤刺激性实验结果

由此结果可得知，本文件提供的艾纳香油脂质体及其复合制剂均不具有皮肤刺激性。同样，随机选择进行口腔粘膜实验，结果显示本文件提供的艾纳香油脂质体及其复合制剂均不具有粘膜刺激性。

由本实验部分可知，本文件参数范围内制备的艾纳香油脂质体包封率在65％以上，粒径小，中位数为169nm，外观圆整且具有良好的稳定性，透皮吸收效果良好，同时具有镇痛、抗炎、皮肤及粘膜修复的药理活性。将艾纳香油脂质体进一步与其他辅料混合制成复合制剂后继续考察药理活性，以艾纳香油脂质体凝胶为例，结果显示仍然具有良好的透皮吸收、镇痛、抗炎、皮肤及粘膜修复活性，且抗炎和镇痛的效果优于艾纳香油脂质体。说明在制备成复合制剂之后对艾纳香油脂质体的药理活性具有促进作用。

综上，可得知本文件提供的艾纳香油脂质体及其复合制剂具有良好的透皮吸收性质，并且能有效镇痛、抗炎、修复破损皮肤及粘膜，因此可以用于过敏性皮炎、脂溢性皮炎、湿疹、轻度烧伤、烫伤等皮肤问题，以及口腔溃疡、鼻炎、鼻粘膜和阴道粘膜受损等问题。

Claims

1.一种艾纳香油脂质体，其特征在于，所述艾纳香油脂质体的配方由以下质量份数的物质组成：艾纳香油0.35-0.65％、卵磷脂1.0-3.0％、胆固醇0.2-0.5％、余量为PBS溶液；

所述艾纳香油脂质体按下述步骤制成：

(3)制备脂质体：将溶解液以1.8mL/min-2.2mL/min匀速注入到35-45℃的PBS溶液中，置于35-45℃环境中恒温搅拌使乙醇完全挥发，再经水浴超声处理10-20min后，通过微孔滤膜处理即得艾纳香油脂质体溶液；

(4)将艾纳香油脂质体溶液置于低温环境中保存，即得。

2.如权利要求1所述的艾纳香油脂质体，其特征在于，所述艾纳香油脂质体的配方由以下质量份数的物质组成：艾纳香油0.45-0.55％、卵磷脂1.7-2.7％、胆固醇0.3-0.4％、余量为PBS溶液。

3.如权利要求1或2所述的艾纳香油脂质体，其特征在于，所述艾纳香油脂质体加入药学上可接受的辅料或载体，制成所需要的产品，所述产品包括药物制剂。

4.如权利要求3所述的艾纳香油脂质体，其特征在于，所述产品为凝胶剂、软膏剂、眼膏剂、搽剂、气雾剂、溶液剂、溶胶剂、乳剂、混悬剂。

5.如权利要求4所述的艾纳香油脂质体，其特征在于，所述艾纳香油脂质体及其产品用于皮肤、口腔、鼻腔、足部或阴道部位。

6.如权利要求1-5任一项所述的艾纳香油脂质体以及与辅料混合制成复合药物制剂在制备抗炎、镇痛、皮肤修复的药物中的应用。