CN112553199A - 一种snhg17-KO基因敲除小鼠模型的构建方法和应用 - Google Patents

一种snhg17-KO基因敲除小鼠模型的构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种snhg17‑KO基因敲除小鼠模型的构建方法和应用，涉及基因工程技术领域。该gRNA分子的靶点序列选自snhg17基因的外显子1～外显子6中的至少一个外显子，该gRNA能够用于有效切割敲除小鼠基因组中的snhg17基因，为snhg17在肿瘤中的作用机制的研究提供可靠的动物模型。

Description

一种snhg17-KO基因敲除小鼠模型的构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种snhg17-KO基因敲除小鼠模型的构建方法和应用。
背景技术
LncRNA(Long non-coding RNA，lnc RNA)是一类长度大于200个核苷酸，在细胞内不能翻译蛋白的RNA；大多数lncRNA本身能够被5‘端加帽、剪接及3‘端进行聚腺苷酸化而缺乏开放性阅读框，同时能够被RNA聚合酶II转录。LncRNA被认为是分子支架、结构性RNA或调节分子参与细胞的遗传、剪接、mRNA的稳定性以及调控小RNA(miRNA)的“分子海绵”。
小核RNA(Small nucleolar RNA，snRNA)是一类主要在细胞核内表达的小分子RNA，长度约为60-300个核苷酸。SnRNA宿主基因为lncRNA，在肿瘤中起到抑制或促进癌细胞存活的功能。
人类小核RNA宿主基因17(Small nucleolar RNA host gene 17，SNHG17)是一种重要的lncRNA，然而，其具体的分子机制尚不明确。
因此，深入研究SNHG17(snhg17)在肿瘤中的作用机制，开发新型靶点药物对临床肿瘤治疗提供一种探索性科学理论依据。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种snhg17-KO基因敲除小鼠模型的构建方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种gRNA分子，所述gRNA分子的靶点序列选自snhg17基因的外显子1～外显子6中的至少一个外显子。
优选地，所述gRNA分子包括：如SEQ ID No.1～4所示序列中的至少一条。
优选地，所述gRNA的靶点序列为外显子1～外显子3中的至少一个外显子。
优选地，所述gRNA包括如SEQ ID No.3～4所示的序列中的至少一条。
第二方面，本发明实施例提供了一种重组载体，其含有如前述任一实施方式所述的gRNA分子的碱基序列。
优选地，所述重组载体为表达载体。
优选地，所述重组载体上包含有Cas9蛋白的核酸序列。
第三方面，本发明实施例提供了如前述任一实施方式所述的重组载体在制备用于敲除snhg17基因的试剂中的应用。
第四方面，本发明实施例提供了一种用于敲除snhg17-KO基因的试剂盒，其包括如前述任一实施方式所述的gRNA分子或如前述任一实施方式所述的重组载体。
第五方面，本发明实施例提供了一种snhg17-KO基因敲除小鼠模型的构建方法，其包括：采用如前述任一实施方式所述的gRNA分子或如前述任一实施方式所述的重组载体，敲除小鼠基因组中的snhg17基因。
优选地，所述构建方法包括将所述gRNA分子或所述重组载体导入小鼠的受精卵中。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种gRNA分子，所述gRNA分子的靶点序列选自snhg17基因的外显子1～外显子6中的至少一个外显子，该gRNA能够用于有效切割敲除小鼠基因组中的snhg17基因，为snhg17在肿瘤中的作用机制的研究提供可靠的动物模型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中gRNA的设计策略图；
图2为实施例1中gRNA1～4的质粒图谱；
图3为实施例1的F1代snhg17杂合子小鼠的繁殖及鉴定的引物设计策略图；
图4为实施例1的F1代snhg17杂合子小鼠的繁殖及鉴定中PCR1的电泳实验结果图；
图5为实施例1的F1代snhg17杂合子小鼠的繁殖及鉴定中PCR2的电泳实验结果图；
图6为实施例1的F1代snhg17杂合子小鼠的繁殖及鉴定中目的基因打靶效果的检测结果图；
图7为实施例1的F1代snhg17纯合子小鼠的繁殖及鉴定的引物设计策略图；
图8为实施例1的F1代snhg17纯合子小鼠的繁殖及鉴定中PCR Region1的电泳实验结果图；
图9为实施例1的F1代snhg17纯合子小鼠的繁殖及鉴定中PCR region2的电泳实验结果图；
图10为实施例1的F1代snhg17纯合子小鼠的繁殖及鉴定中PCR region3的电泳实验结果图；
图11为实施例1的F1代snhg17纯合子小鼠的繁殖及鉴定中PCR region4的电泳实验结果图；
图12为实施例1的F1代snhg17纯合子小鼠的繁殖及鉴定中目的基因打靶效果的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
名词定义
本文中的“gRNA”，英文为guide RNA，又称向导RNA，在CRISPR-Cas9基因编辑中，gRNA能与Cas9蛋白结合形成复合物，该复合物通过gRNA来识别目标序列(靶点序列)，gRNA识别后，由Cas9蛋白对目标序列进行切割。
技术方案
人类小核RNA宿主基因17(Small nucleolar RNA host gene 17，SNHG17)是一种重要的lncRNA，已被证实在非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌中发挥促癌作用，然而，具体分子机制尚不明确。SNHG17是这些宿主基因中的一员。SNHG17基因定位于20号染色体p12上，ensemble数据库显示SNHG17基因有9条转录本，主要定位在细胞核内。SNHG亚型众多，通过人胃癌组织转录组测序发现，肿瘤组织中SNHG2与SNHG5表达降低，而SNHG17转录水平升高，说明SNHG17跟胃癌发生发展相关。此外，有研究证明lncRNA与乳腺癌亚型和分级以及临床预后显著相关，其中就包含SNHG17，研究表明乳腺癌患者肿瘤组织中SNHG17低表达能够延长患者存活时间，然而具体作用机制尚未明确。
本发明实施例提供了一种gRNA分子，所述gRNA分子的靶点序列选自snhg17基因的外显子1～外显子6中的至少一个外显子。
该gRNA分子能够作用识别snhg17基因，对并该基因外显子1～外显子6中的至少一个外显子的部分序列或全部序列进行切割，以达到有效抑制snhg17基因表达的技术效果。
本发明对gRNA分子的条数不作限制，可以为1条或多条的组合。
优选地，所述gRNA分子包括：如SEQ ID No.1～4所示序列中的至少一条。
优选地，所述gRNA的靶点序列为外显子1(exon1)～外显子3(exon3)中的至少一个外显子。选择exon1～exon3作为靶点序列进行切割，切割后能够更有效地达到抑制snhg17基因表达的技术效果，若将exon1～exon3以外的外显子作为靶点进行gRNA的设计，可能导致gRNA在切割exon1～exon3的同时，切割到其他的基因，且无法有效地抑制snhg17基因表达。
优选地，所述gRNA包括如SEQ ID No.3～4所示的序列中的至少一条。采用SEQ IDNo.3～4所示的序列的gRNA的切割效果更优，能够在避免切割到其他基因的同时，完成对目的基因表达量的有效抑制。
本发明实施例还提供了一种重组载体，其含有如前述任一实施方式提供的gRNA分子的碱基序列。
优选地，所述重组载体为表达载体。
优选地，所述重组载体上包含有Cas9蛋白的核酸序列。优选地，所述重组载体上包含有hCas9蛋白的核酸序列。
本发明实施例还提供了如前述任一实施方式所述的重组载体在制备用于敲除snhg17基因的试剂中的应用。
本发明实施例还提供了一种用于敲除snhg17-KO基因的试剂盒，其包括如前述任一实施方式所述的gRNA分子或如前述任一实施方式所述的重组载体。
优选地，所述试剂盒还可以包括用于表达Cas9蛋白的表达载体。
本发明实施例还提供了一种snhg17-KO基因敲除小鼠模型的构建方法，其包括：采用如前述任一实施方式所述的gRNA分子或如前述任一实施方式所述的重组载体，敲除小鼠基因组中的snhg17基因。
优选地，所述构建方法包括将所述gRNA分子或所述重组载体导入小鼠的受精卵中。
上述构建方法采用CRISPR-Cas9的基因编辑技术进行snhg17基因的敲除，对CRISPR-Cas9的基因编辑技术的具体步骤不再赘述，可参照现有的CRISPR-Cas9的基因编辑技术的过程进行。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
1、载体设计及构建
1.1、gRNA的选择：小鼠snhg17基因(Gene ID：68108)，位于小鼠2号染色体，已确定有6个外显子(exeon)，见图1，靶点序列选自exon1～exon6。
选择exon1-exon6为靶点，设计了gRNA1和gRNA2；选择exon1-exon3作为靶点，设计gRNA3和gRNA4，具体见表1和图1中B。
表1靶序列
序列 SEQ ID No.
gRNA1 GGTTAAGGGAATCGTCCCATCGG 1
gRNA2 ATCACCGGACTGGGTGTTAGAGG 2
gRNA3 GTAGTGGGGCTGTATAGACTAGG 3
gRNA4 AGTCTTCCGAGCTCTCCTTAAGG 4
选取gRNA3和gRNA4，通过VectorBuilder构建带有Cas9质粒的融合质粒(带Ampicilin抗性)，将gRNA1～4分别构建至pRP[CRISPR]-hCas9-U6载体中，进行质粒构建。gRNA1～4的质粒图谱如图2所示。
1.2、质粒的大肠杆菌(E.coli)转化：取DH5α置于冰浴中(100μL)，取1.5mL EP管加100μL灭菌ddH2O包含0.1μL的质粒(1μg/μL)震荡混匀。再从混匀液体中取1μL加入到DH5α中，轻轻旋转EP管混匀，冰浴静置30min。将EP管置于42℃水浴中放置60-90s，快速移置冰浴中，使DH5α冷却2-3min，该过程不要摇动EP管。取50mL离心管，加入900μL无菌LB液体培养基(无Ampicillin)，混匀后置于37℃摇床震荡培养45min(150r/min)，此目的是让质粒相关抗性基因表达，使菌体复苏。
种板：每个10cm2培养皿涂10μL-30μL菌体。倒置于37℃培养箱培养12-16h。次日观察菌落生长情况。10μL移液器枪头单克隆菌落，4ml LB中加4μL 100μg/ml Amp(用15mL离心管)。封口后将培养皿放置于37℃，200r/min过夜培养(12-16h)。500mL三角瓶，加100mL LB(含有Ampicillin)和4mL菌液。37℃，200r/min摇菌，10h后将装有菌液的三角瓶放置4℃中贮存，次日提取质粒。
1.3、质粒的提取：使用Omega试剂盒进行质粒提取。使用之前，把试剂盒中所带有的RNase A加入到相应溶液中，4℃贮存。加80mL 96％-100％乙醇到DNA Wash BufferConcentrate中，室温保存；ETR Solution置于4℃保存。提取过程均在室温进行。首先，在10-20mL试管或烧瓶中，将携带有所需质粒的E.coli接种到5mL LB培养基上(含Ampicillin50μg/mL)，37℃振荡培养12-16h(300rpm)。1.5-5mL菌液室温10000×g离心1min。去上清，加250μL溶液I(含RNase A)，涡漩振荡器震荡(或上下吹吸)至菌体完全悬浮。加入250μL溶液II，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。加入125μL用冰预冷的Buffer N3，颠倒混匀离心管直到出现白色絮状沉淀，12000×g 4℃离心10min。移至洁净的容积1.5mL离心管中，加入0.1倍Volume的ETR Solution至澄清裂解液中，颠倒混匀7-10次，冰上孵育10min，孵育期间颠倒混匀离心管几次。注意：加入ETR Solution后，裂解液应出现浑浊，但在冰上孵育后应变澄清。42℃孵育裂解液5min，裂解液应再次变浑浊，12000×g 25℃离心3min，ETRSolution会在柱子底部形成一层蓝色。将上清转移至新的1.5mL EP管中并加入0.5倍volume100％乙醇，颠倒混匀离心管6-7次进行温和混合，室温孵育1-2min。将混合物700μL转移至2mL吸收柱中，室温10000×g离心1min，使裂解物通过吸收住。弃滤过液，将剩余混合物加入吸收住，10000×g离心1min。弃滤过液，再次利用吸收柱。500μL Buffer HB，10000×g离心1min。清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。弃滤过液，再用100％乙醇稀释的700μL Wash Buffer清洗吸收柱，室温10000×g离心1min。再加700μL Wash Buffer清洗吸收柱。弃滤过液，以最大速度(>13000×g)离心空柱子2min，将吸收柱放入干净1.5mL离心管，加30-50μL无菌水或去内毒素Elution Buffer在滤膜上1-2min，13000×g离心1min(可进行再洗脱，但会降低DNA浓度)。DNA检测：分光光度计检测，OD 260/280＝1.8(>1.9表明有RNA污染；<1.6表明有蛋白质，酚污染)。
1.4、体外转录模板的扩增：化学合成用于体外转录的模板扩增引物，见表2，表2中下划线碱基序列表示T7启动子区域。由于质粒载体比较稳定，若直接注射质粒载体到受精卵中，则会在小鼠受精卵至胚胎时期存在较长时间，这样会导致在不同时期切割而产生嵌合体，不利于后期基因分型，另外质粒还有可能随机整合在基因组中。而注射转录后产物较不稳定，会在受精卵时期逐步降解，减少嵌合体的产生，方便后期后期基因分型，因此，选择体外转录后注射。
表2用于体外转录模板扩增的引物序列
Figure BDA0002806800520000081
Figure BDA0002806800520000091
PCR反应体系如表3所示，反应条件如表4所示，所有操作均在冰上进行。
表3反应体系
无酶双纯水 加至50μL
包含Mg<sup>2+</sup>的10×扩增缓冲液 25μL
dNTP(10mM) 1μL
上游引物(10μM) 2μL
下游引物(10μM) 2μL
高保真DNA聚合酶 1μL
pRP[CRISPR]-hCas9-U6质粒 10pg-30ng
表4反应条件
Figure BDA0002806800520000092
1.5、体外转录：PCR反应后，得到的PCR产物于4℃存放，用于后续的体外转录。所有试剂室温融化：RNA聚合酶放置于冰上；涡旋混合10×Transcription Buffer和dNTP使其融化，融化后dNTP冰上放置，10×Transcription Buffer室温放置。室温制备转录表5所示的反应液，轻弹EP管液体或用枪头轻柔混合，轻离心收集液体。
表5反应液
成分 体积
无核酸酶水 至20μL
DNA template 1μL
10×转录缓冲液 2μL
10mM ATP 1μL
10mM CTP 1μL
10mM GTP 1μL
10mM UTP 1μL
T7 Enzyme Mix 2μL
备注：DNA template为体外转录模版扩增阶段获得的PCR产物。
将混合后的产物37℃孵育1h，反应完毕后向混合液中加入1μL TURBO DNase，混合后37℃孵育30min；向混合液中加入1μL 0.5M EDTA。反应结束后对体外转录进行产物纯化，得到分离的gRNA3，gRNA4和Cas9蛋白的mRNA。
2、显微注射
2.1、取受精卵：C57BL/6小鼠购买于北京维通利华实验动物技术公司，所有小鼠饲养在清洁级(SPF)动物房内，温度25℃，湿度50％-60％；选取10-14周龄雌鼠诱导排卵，腹腔注射促行线激素(PMSG)120U/kg，前一天下午4-6时与同周龄雄鼠合笼交配，次日上午8点观察是否有阴道栓形成确认交配成功；下午6点人道地颈椎脱臼处死雌鼠，剪下输卵管，将全部卵群转移至培养皿中，加入500U/mL透明质酸没消化颗粒细胞，1min后吹打卵群，用M2培养基进行清洗，清洗后置于新培养皿中，在显微镜下，将输卵管壶腹部去除，收集受精卵，放置于37℃，5％CO2，M16培养基中培养(培养基购买于德国MERCH公司)。
2.2、显微注射：收集和培养C57BL/6小鼠卵后进行显微注射。将1大滴M16培养基滴在培养皿中，上面覆盖矿物油。将注射槽放置在显微镜台上，用低倍目镜聚焦液滴底部，将持卵管从左侧插入液滴并调整好角度。转移数个卵至注射槽，原核可见；将注射针吸入gRNA3/Cas9的体外转录产物和gRNA4/Cas9体外转录产物，约0.5μL。将注射针与注射泵连接后接在右侧操作臂上；最后将注射针插入至卵核仁内进行注射。
2.3、植入代孕鼠：将显微注射后的C57BL/6小鼠受精卵植入代孕小鼠生殖系统，繁育即为F0代小鼠，筛选。
3、F1代snhg17杂合子小鼠的繁殖及鉴定
3.1、PCR引物设计：
引物设计策略如图3，在gRNA3和gRNA4区域两侧设计两对引物，用于检测小鼠的基因型，具体如下。
PCR1(退火温度60℃)：
Primer-F:CACTATACTTGGCTGAGGGCAGTTTG；
Primer-R:GGAAGCAGCCACCGTCTGAGCT；
Mutant allele(等位基因突变):650bp；
Wildtype allele(野生型):4850bp；
PCR 2(退火温度60.0℃)：
Primer-F:CACTATACTTGGCTGAGGGCAGTTTG；
Primer-R:GGAAGCAGCCACCGTCTGAGCT；
Primer-Wt/He-R:AGGAGGTGAAGGTAGTTGATAGGAAGG；
Heterozygote(杂合子)：650bp和437bp；
Wildtype(野生型)：437bp。
转染gRNA3和gRNA4的受精卵小鼠出生成熟后，与野生型(WT)小鼠交配后提取小鼠鼠尾基因组DNA，PCR进行扩增目的片段，PCR电泳检测目的条带。
3.2、DNA提取：
获取鼠尾消化液：50mM KCL，10mM Tris-HCL，0.1％Triton X-100，0.4mg/mLProteinase K。
使用TaKaRa MiniBEST全基因组DNA提取试剂盒(Ver.5.0_Code No.9765)进行DNA提取：剪鼠尾，破碎组织，在组织中加入180μL Buffer GL，20μL蛋白酶K和10μL RNase A，混合后56℃孵育过夜；次日，12000rpm离心1min，去除沉淀杂质；加200μL Buffer GB和200μL无水乙醇，充分混合；将离心柱放置于EP管内，加入样品混合液，12000rpm离心2min，丢弃穿流液；离心柱内加500μL Buffer WA，12000rpm离心1min，丢弃穿流液；加入700μL BufferWB，12000rpm离心1min，丢弃穿流液；重复一次；空柱12000rpm离心1min；在离心柱中加入50-200μL DEPC水进行DNA洗脱；12000rpm离心1min，可重复一次。
3.3、PCR条件：
PCR混合液1(对应PCR1)见表6，PCR混合液2(对应PCR2)见表7，扩增条件见表8。
表6 PCR混合液1
总体积 30μL
鼠尾基因组DNA 1.5μL
上游引物(10μM) 1μL
下游引物(10μM) 1μL
dNTPs(2.5mM) 1.5μL
10×PCR缓冲液(Mg<sup>2+</sup>Plus) 3μL
TaKaRa Taq HS(5U/μL) 0.2μL
ddH<sub>2</sub>O 21.8μL
表7 PCR混合液2
Figure BDA0002806800520000121
Figure BDA0002806800520000131
表8扩增条件
Figure BDA0002806800520000132
图4表明snhg17 gRNA是否打靶成功，如图所示，图中3,6,7,8,9，17,18,19号小鼠均打靶成功，敲除了目的片段。图5表明snhg17 gRNA打靶成功，图中3,6,7,8,9,17,18,19号小鼠的电泳结果中显示出2条带，分别为650bp和437bp，表明杂合子敲除小鼠打靶成功，WT野生型小鼠仅有437bp处的一条带。图6表明敲除小鼠中有4202bp的基因被敲除，符合预期gRNA3和gRNA4的敲除条带大小。
4、F1代snhg17纯合子小鼠的繁殖及鉴定
为验证基因敲除效果，设计验证引物策略如图7，设计4对引物用于验证小鼠的基因型，具体序列如下。由F1代中鉴定为杂合子的基因敲除小鼠，雌雄相互交配后提取小鼠鼠尾基因组DNA，PCR进行扩增目的片段，PCR电泳检测目的条带。
4.1、PCR引物设计：
PCR region 1(退火温度60.0℃)：
Primer-F:CACTATACTTGGCTGAGGGCAGTTTG；
Primer-R:GGAAGCAGCCACCGTCTGAGCT；
Mutant allele(等位基因突变):650bp；
Wildtype allele(野生型):4850bp。
PCR region 2(退火温度60.0℃)：
Primer-F:CACTATACTTGGCTGAGGGCAGTTTG；
Primer-R:GGAAGCAGCCACCGTCTGAGCT；
Primer-He/Wt-F:AGTTGTCTCCGTCTTGCTACATCGACA；
Heterozygote(杂合子):650bp和840bp；
Homozygous(纯合子):650bp；
Wildtype(野生型):840bp。
PCR region 3(退火温度60.0℃)：
Primer-F:CACTATACTTGGCTGAGGGCAGTTTG
Primer-R:GGAAGCAGCCACCGTCTGAGCT
Primer-He/Wt-R:AGGAGGTGAAGGTAGTTGATAGGAAGG
Heterozygote(杂合子):650bp和437bp
Homozygous(纯合子):650bp；
Wildtype(野生型):437bp。
PCR region 4(退火温度60.0℃)：
Primer-F1:CTTTCTTTTAATGCTATGCCTGCGAGTG；
Primer-R1:GAGGAAACTGTCTCTCGTTTGCCG；
Heterozygote(杂合子):694bp；
Homozygous(纯合子):0bp；
Wildtype(野生型):694bp。
图8表明snhg17 gRNA是否打靶成功，如图所示，图中8号小鼠打靶成功，敲除了目的片段。图9表明snhg17 gRNA打靶成功，图中8号小鼠的电泳结果中显示仅有650bp处有1条带，表明纯合子敲除小鼠打靶成功，而杂合子小鼠在840bp处和650bp处各有一条带，WT野生型小鼠在840bp处有一条带。图10中8号小鼠的电泳结果中显示仅有650bp处有1条带，表明纯合子敲除小鼠打靶成功，而杂合子小鼠在437bp处和650bp处各有一条带，WT野生型小鼠在437bp处有一条带。图11中8号小鼠在694bp处没有条带，表明纯合子敲除小鼠打靶成功，而在694bp处有条带的小鼠则为杂合子或野生型小鼠。图12表明敲除小鼠中有4202bp的基因被敲除，符合预期gRNA3和gRNA4的敲除条带大小。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市人民医院
<120> 一种snhg17-KO基因敲除小鼠模型的构建方法和应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggttaaggga atcgtcccat cgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcaccggac tgggtgttag agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtagtggggc tgtatagact agg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agtcttccga gctctcctta agg 23

Claims (10)

1.一种gRNA分子，其特征在于，所述gRNA分子的靶点序列选自snhg17基因的外显子1～外显子6中的至少一个外显子。
2.根据权利要求1所述的gRNA分子，其特征在于，所述gRNA分子包括：如SEQ ID No.1～4所示序列中的至少一条。
3.根据权利要求1所述的gRNA分子，其特征在于，所述gRNA的靶点序列为外显子1～外显子3中的至少一个外显子。
4.根据权利要求3所述的gRNA分子，其特征在于，所述gRNA分子包括如SEQ ID No.3～4所示的序列中的至少一条。
5.一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求1～4任一项所述的gRNA分子的碱基序列；
优选地，所述重组载体为表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体上包含有Cas9蛋白的核酸序列。
7.如权利要求5或6所述的重组载体在制备用于敲除snhg17基因的试剂中的应用。
8.一种用于敲除snhg17-KO基因的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1～4任一项所述的gRNA分子或如权利要求5或6所述的重组载体。
9.一种snhg17-KO基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，其包括：采用如权利要求1～4任一项所述的gRNA分子或如权利要求5或6所述的重组载体，敲除小鼠基因组中的snhg17基因。
10.根据权利要求9所述的snhg17-KO基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括将所述gRNA分子或所述重组载体导入小鼠的受精卵中。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180305689A1 (en) * 2015-04-22 2018-10-25 Mina Therapeutics Limited Sarna compositions and methods of use
CN110029107A (zh) * 2019-04-22 2019-07-19 深圳市人民医院 靶向snhg17治疗乳腺癌的寡核苷酸
CN110257435A (zh) * 2019-07-03 2019-09-20 上海市第一人民医院 一种prom1-ko小鼠模型的构建方法及其应用
CN111996215A (zh) * 2020-08-25 2020-11-27 山西医科大学 一种全身性Plin1基因敲除动物模型构建及鉴定方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180305689A1 (en) * 2015-04-22 2018-10-25 Mina Therapeutics Limited Sarna compositions and methods of use
CN110029107A (zh) * 2019-04-22 2019-07-19 深圳市人民医院 靶向snhg17治疗乳腺癌的寡核苷酸
CN110257435A (zh) * 2019-07-03 2019-09-20 上海市第一人民医院 一种prom1-ko小鼠模型的构建方法及其应用
CN111996215A (zh) * 2020-08-25 2020-11-27 山西医科大学 一种全身性Plin1基因敲除动物模型构建及鉴定方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TSUI-TING HO 等: "，Targeting non-coding RNAs with the CRISPR/Cas9 system in human cell lines", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
竟晓慧: "NONO与SNHG17的结合及其作用机制的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

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