CN112451536A - 一种松柏苷的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种松柏苷的应用。本发明将松柏苷用于过敏性疾病的治疗,具有药效好、副作用小的优点,弥补了现行抗过敏药物的不足,也填补了松柏苷在治疗过敏性疾病这一领域的空白。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的应用,具体涉及松柏苷的应用。
背景技术
近年来,随着工业化进程的推进、社会经济的发展和生活环境的改变,过 敏性疾病的发病率呈迅速增长的态势,已经成为世界卫生组织公布的全球第 六大慢性疾病,此类疾病严重影响患者的日常生活,并对国家造成了较高的卫 生经济负担。
过敏反应是机体受到抗原性刺激引起组织损伤或功能紊乱的病理性免疫 反应,临床常见呼吸道、皮肤、消化道和全身性过敏反应。反应过程包括致敏、 激发和效应3个阶段,具有发作迅速、反应强烈但消退较快的特点,一般情况 下不会破坏组织细胞,严重的过敏反应也可导致组织损伤,存在明显的遗传倾 向和个体差异。过敏性疾病是涵盖了过敏性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、 过敏性结膜炎、食物过敏、药物过敏等的一大类疾病,是一种常见病、多发病、 有潜在死亡风险疾病。然而,与过敏性疾病不断升高的发病率所对应的却是整 体控制率极低,且目前现代医学尚无根治之法。
由此观之,社会亟需重视过敏性疾病的预防、诊断、治疗和控制,更好地 改善患者的生活质量并减少疾病导致的严重经济损失。
目前临床应用的抗过敏药物主要包括:(1)抗组胺药物,如第1、2和3 代抗组胺药物;(2)过敏反应介质阻断剂,如色甘酸钠和甲派噻庚酮;(3) 钙剂,如葡萄糖酸钙和氯化钙;(4)免疫抑制剂,如皮质类固醇。这些药物 针对过敏反应的不同环节,疗效明确,起效迅速,属于对症治疗,但存在停药 后复发率高,同时不良反应较多,如嗜睡、口干、头晕等。相比过敏性疾病的 高发率,现有抗过敏药物尚不能满足临床需求,因此有必要发现和研制新型抗 过敏药物。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种松柏苷的应用,所述松柏苷用 于制备治疗免疫球蛋白E介导疾病的药物。
进一步地,所述疾病为过敏性疾病。
进一步地,所述松柏苷制备的药物适于通过口服途径递送。
进一步地,所述松柏苷制备的药物为片剂、口服液或胶囊。
进一步地,所述松柏苷制备的药物中松柏苷的用量大于10mg/kg。
进一步地,所述松柏苷制备的药物可抑制细胞外Ca2+进入细胞。
进一步地,所述松柏苷所制备的药物可阻止体内过敏介质组胺的释放。
进一步地,所述过敏性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、 湿疹、食物过敏、药物过敏中的一种或多种。
进一步地,所述松柏苷制备的药物中所述松柏苷的浓度为1μg/mL时, 对抗原引起的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒产生的抑制率为40-45%。
进一步地,所述松柏苷制备的药物中所述松柏苷的浓度为10μg/mL时, 对抗原引起的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒产生的抑制率为60-66%。
本发明的松柏苷的应用,首次公开利用松柏苷用于治疗免疫球蛋白E(IgE) 介导的疾病的药物,尤其是松柏苷用于治疗过敏性疾病的药物上的应用,为过 敏性疾病的治疗提供了一种新的药物。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述,并且,部分地从说 明书中变得显而易见,或者通过实施本发明而了解。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明 实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例是本发明 的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例,本 领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都 属于本发明保护的范围。
本发明提供一种松柏苷的应用,所述松柏苷用于制备治疗免疫球蛋白 E(IgE)介导的疾病的药物。
具体地,所述疾病为过敏性疾病。所述过敏性疾病包括过敏性哮喘、过敏 性鼻炎、过敏性皮炎、湿疹、食物过敏、药物过敏或严重过敏反应等中的一种 或多种。
本发明将松柏苷用于制备治疗过敏性疾病的药物,具有药效好、副作用小 的优点,而且,松柏苷来源广泛,可从杜仲、人参茎、白附子、柑橘果皮、蛇 菰、铁皮石斛、云南沉香果壳、细柱五加茎等植物中提取。该新的应用方向弥 补了现行抗过敏药物的不足,也填补了松柏苷在制备治疗过敏性疾病药物这 一领域的空白。
具体地,所述松柏苷制备的药物,适于通过口服途径递送。通过口服后, 相应病情,即免疫球蛋白E介导的疾病,尤其是过敏性疾病的症状具有明显 的改善效果。
本发明的另一实施例中,所述松柏苷制备的药物中松柏苷的用量大于10 mg/kg。通过口服递送10mg/kg的松柏苷制备的药物,对大鼠PCA有一定抑 制作用;随着松柏苷含量的增加,对所述大鼠PCA的抑制作用更加明显。
本发明的另一实施例中,所述松柏苷制备的药物为片剂、口服液或胶囊。 无论通过片剂、口服液还是胶囊均对所述过敏疾病具有良好的治疗效果。
本发明的另一实施例中,所述松柏苷制备的药物可抑制细胞外Ca2+进入 细胞。
本发明的另一实施例中,所述松柏苷所制备的药物可阻止体内过敏介质 组胺的释放,从而抑制过敏性疾病。
本发明的另一实施例中,所述松柏苷制备的药物中所述松柏苷的浓度为1 μg/mL时,对抗原引起的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒产生的抑制率为40-45%。
通过多次试验证明,采用不同制备方法得到的松柏苷(分别从杜仲、人参 茎、铁皮石斛中提取分离得到),其当所述松柏苷制备的药物中所述松柏苷的 浓度为1μg/mL时,对抗原引起的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒产生的抑制率分 别为40.0%,45.0%以及42.4%。
本发明的另一实施例中,所述松柏苷制备的药物中所述松柏苷的浓度为 10μg/mL时,对抗原引起的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒产生的抑制率为60-66%。
通过多次试验证明,采用不同制备方法得到的松柏苷(分别从白附子、柑 橘果皮、云南沉香果壳中提取分离得到),其当所述松柏苷制备的药物中所述 松柏苷的浓度为10μg/mL时,对抗原引起的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒产生的 抑制率分别为60.0%,66.0%以及62.8%。
本发明的另一实施例中,所述松柏苷为对思茅蛇菰进行提纯分离得到。
当然,所述松柏苷来源广泛,也可从杜仲、人参茎、白附子、柑橘果皮、 蛇菰、铁皮石斛、云南沉香果壳、细柱五加茎等植物中提取,提取方法与思茅 蛇菰相似。
具体地,所述对思茅蛇菰进行提纯分离包括:将所述思茅蛇菰进行回流提 取,得到第一浸膏;将所述第一浸膏进行萃取,得到第二浸膏;将所述第二浸 膏进行色谱分离及洗脱,得到所述松柏苷。
具体地,将所述思茅蛇菰进行粉碎;利用95%醇类对所述粉碎的思茅蛇 菰进行回流提取,减压浓缩得到醇类浸膏;加水分散所述乙醇浸膏,以正丁醇 萃取所述乙醇浸膏,减压回收溶剂得正丁醇浸膏;将所述正丁醇浸膏经硅胶柱 色谱分离,利用氯仿-甲醇洗脱及葡聚糖凝胶LH-20分离,利用甲醇-水洗脱, 得到所述松柏苷。
所述醇类为乙醇或者甲醇;所述洗脱剂还可以为氯仿-甲醇-甲酸。
本发明的另一实施例中,所述回流提取包括多次,每次时间为30-100分 钟。通过多次提取,可以充分提取原料,多次提取后进行混合后再进行下一 步骤。
本发明的另一实施例中,所述提取次数大于等于2。
为了对上述多个方案进行详细的描述,通过下述具体实施例进行说明。
实施例
(1)松柏苷的制备
取思茅蛇菰干燥全草(10kg)进行粉碎,利用95%乙醇回流提取2次, 每次1h,合并所述两次得到的提取液,减压浓缩得乙醇浸膏(1.4kg);加水 分散,以正丁醇萃取,减压回收溶剂得正丁醇浸膏(400g);取正丁醇浸膏 经反复硅胶柱色谱分离,用不同比例的氯仿-甲醇洗脱及Pharmadex(葡聚糖 凝胶)LH-20分离,用甲醇-水洗脱,得松柏苷单品。
(2)治疗效果测试
(一)被动皮肤过敏试验(PCA)
致敏:提供SD大鼠,其体重200~220g,雌雄兼有,由济南西岭角生物 科技有限公司提供,以下实验中涉及的大鼠均为该SD大鼠。以4%的氢氧化 铝凝胶佐剂与卵白蛋白20mg/只混匀,制得致敏物。取所述SD大鼠4只,每 只大鼠经腹腔注射上述制备所得的致敏物1mL,并且隔日注射1次,共注射 3次。末次致敏后第10天,各组大鼠腹腔注射50mg/kg戊巴比妥钠,麻醉后 腹主动脉取血,静置凝固30min,2500r/min离心10min,分离抗血清原液,将动物的抗血清混合,-4℃保存备用。
被动致敏:另取正常大鼠50只,随机均分为对照组、模型组、松柏苷10 mg/Kg组、松柏苷20mg/Kg组、松柏苷50mg/Kg组。各组大鼠背部脊柱两 侧进行脱毛备皮,脱毛区域约5cm×6cm。除对照组外,其余各组大鼠用0.9% 氯化钠注射液稀释所述制备好的致敏血清,稀释度分别为1:2、1:8。每鼠背部 皮内注射两种稀释度的抗血清各两点,每点间隔约2~3cm,每点注射0.1mL。 被动致敏48h后,松柏苷组以不同剂量(10mg/Kg、20mg/Kg及50mg/Kg) 的松柏苷灌胃,模型组以等容积生理盐水灌胃。30min后,各组尾静脉注射与 致敏剂量相同的激发抗原,给予0.5mL抗原加0.5mL 0.5%伊文思蓝混合后 共1mL的混合液。抗原激发约30min后,CO2麻醉处死动物,剪取背部皮 肤,采用直接测量法测量皮肤内侧蓝斑的长径和短径,不规则斑点的直径为长 径与短径的平均值。蓝斑直径在5mm以上者判定为阳性,同时阴性对照组在 该稀释度下无蓝斑。
结果如表1所示,(以下所有表中n均为每组动物的数量)松柏苷以10 mg/kg口服给药时,对大鼠PCA有一定的抑制作用,松柏苷以20mg/kg口服 给药时,对大鼠PCA有显著抑制作用(P<0.05),以50mg/kg口服给药时,对 大鼠PCA的抑制作用进一步增强(P<0.01)。
表1松柏苷对大鼠PCA的抑制作用
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
(二)血清组胺水平
上述大鼠致敏加药后,取大鼠腹部动脉血,所获血液在室温下自然凝固30 min后,2500r/min离心10min,收集上清,使用ELISA检测试剂盒检测血清 中组胺含量。
血清中组胺结果见表2,相比于模型组,松柏苷10mg/kg组血清中组胺 含量稍有降低,而松柏苷20mg/kg组的血清中组胺含量有明显降低,松柏苷 50mg/kg组则是显著降低。该结果表明松柏苷可以抑制致敏大鼠中过敏介质 组胺的释放。
表2松柏苷对大鼠血清组胺水平的影响
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
(三)血清IgE水平
上述大鼠致敏加药后,取大鼠腹部动脉血,所获血液在室温下自然凝固30 min后,2500r/min离心10min,收集上清,使用ELISA检测试剂盒检测血清 中IgE含量。
血清中IgE结果显示(表3),相比于模型组,松柏苷10mg/kg一定程度 降低了致敏大鼠血清中IgE的含量,松柏苷(20-50mg/kg)则显著降低了致 敏大鼠血清中IgE的含量。
表3松柏苷对大鼠血清IgE水平的影响
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
(四)大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒试验
致敏大鼠方法同前。致敏大鼠14天后放血处死,每只大鼠腹腔注射10 mL PBS,轻揉腹部3min,使肥大细胞充分落入PBS溶液中。打开腹腔,将 腹腔冲洗液吸取到15mL离心管中,1500r/min离心10min,弃去上清液,将 沉淀物重新混悬在1mL的1640培养基中,并将其缓慢加入4mL密度比为 30%:80%的Percoll梯度分离液中,1500r/min离心10min,收集30%和 80%Percoll截面处细胞,用PBS洗两次(1500r/min,10min),置于培养基 中进行培养。将细胞接种于96孔板中,并设为对照组、模型组、松柏苷1μ g/mL组、松柏苷10μg/mL组。松柏苷组分别加入0.1mL的2μg/mL、20 μg/mL松柏苷,置于5%的CO2培养箱中孵育10min后,分别加入0.1mL 的20μg/mL C48/80溶液,模型组加入0.2mL的20μg/mL C48/80溶液, 对照组加入0.2mL的生理盐水。培养箱中孵育1h后,吸取细胞培养上清液, 用PBS对96孔板冲洗2次后,加入100μL的PBS溶液,每孔滴入10μL 的1%甲苯胺蓝染色液,染色5min,涂片,待自然风干后,用95%酒精脱色 1min,蒸馏水冲洗干净,风干后,在显微镜下观察并拍照记录。随机计数视 野下肥大细胞个数,根据下列公式计算肥大细胞脱颗粒百分率和药物抑制率。
脱颗粒肥大细胞%=脱颗粒肥大细胞/肥大细胞总数×100%
药物抑制率(%)=(模型组脱颗粒率-药物组脱颗粒率)/模型组脱颗粒率×100%
结果见表4,由表4可见,在1μg/mL浓度下,松柏苷对抗原引起的大 鼠腹腔肥大细胞脱颗粒可产生抑制作用,其抑制率为42.4%,与对照组比较具 有显著性差异(P<0.05)。在10μg/mL浓度时抑制作用更加明显,抑制率为 62.8%。
表4松柏苷对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒作用的影响
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
(五)胞内Ca2+抑制试验(细胞实验)
采用RBL-2H3细胞进行体外实验,细胞用DMEM培养基培养(含15% 胎牛血清)。将细胞接种于24孔板中,并分成不同处理组。向各组细胞中加 入0.125μg/mL的抗DNP-IgE致敏过夜,松柏苷组加入不同浓度的松柏苷与 细胞作用3h,之后加入Fluo 3-AM荧光探针(4μmol/L)作用30min,用台 式缓冲液清洗细胞两次后,加入10μL DNP-BSA(0.25μg/mL),作用10min 激发过敏反应,使用荧光倒置显微镜测定荧光强度。胞内钙离子抑制率(%) =(1-药物组荧光强度/模型组荧光强度)ⅹ100%。
胞内Ca2+抑制试验结果表明(参见表5),松柏苷显著抑制了胞内Ca2+浓 度,并且抑制率随松柏苷浓度显著升高,结果表明,松柏苷抑制脱颗粒的机制 可能是Ca2+信号通路。
表5松柏苷对胞内钙离子抑制实验结果
(六)药物剂型对治疗效果的影响
将松柏苷分别制成片剂、口服液以及胶囊,以50mg/kg(松柏苷的有效含 量)口服给药上述致敏大鼠,具体大鼠处理与(一)被动皮肤过敏试验(PCA) 相同。
结果如表6所示,无论是片剂、口服液还是胶囊,对大鼠PCA均有显著 抑制作用(P<0.01)。
表6不同松柏苷剂型对大鼠PCA的抑制作用
注:与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
综合以上实验结果,我们对松柏苷的抗过敏活性进行验证,并取得了显著 效果。实验结果表明,松柏苷通过抑制胞外Ca2+进入细胞,增加了细胞膜的稳 定性,从而阻止了组胺的释放,最终影响了IgE介导的免疫应答。
当然,本申请的松柏苷的制备方法不限于本申请实施例提到的思茅蛇菰 中提取,也可以由其他方法制备,其均不会影响其用于制备治疗过敏性疾病的 药物,且治疗效果不受影响。
虽然本发明所揭露的实施方式如上,但所述的内容仅为便于理解本发明 而采用的实施方式,并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员, 在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下,可以在实施的形式及细节上 进行任何的修改与变化,但本发明的专利保护范围,仍须以所附的权利要求书 所界定的范围为准。
Claims (10)
1.一种松柏苷的应用,其特征在于,所述松柏苷用于制备治疗免疫球蛋白E介导疾病的药物。
2.根据权利要求1所述的松柏苷的应用,所述疾病为过敏性疾病。
3.根据权利要求1所述的松柏苷的应用,其特征在于,所述松柏苷制备的药物适于通过口服途径递送。
4.根据权利要求1所述的松柏苷的应用,其特征在于,所述松柏苷制备的药物为片剂、口服液或胶囊。
5.根据权利要求1所述的松柏苷的应用,其特征在于,所述松柏苷制备的药物中松柏苷的用量大于10mg/kg。
6.根据权利要求1所述的松柏苷的应用,其特征在于,所述松柏苷制备的药物可抑制细胞外Ca2+进入细胞。
7.根据权利要求1所述的松柏苷的应用,其特征在于,所述松柏苷所制备的药物可阻止体内过敏介质组胺的释放。
8.根据权利要求1所述的松柏苷的应用,其特征在于,所述过敏性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、湿疹、食物过敏、药物过敏中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的松柏苷的应用,其特征在于,所述松柏苷制备的药物中所述松柏苷的浓度为1μg/mL时,对抗原引起的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒产生的抑制率为40-45%。
10.根据权利要求1所述的松柏苷的应用,其特征在于,所述松柏苷制备的药物中所述松柏苷的浓度为10μg/mL时,对抗原引起的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒产生的抑制率为60-66%。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210309 |
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