CN111529569B - 一种治疗非酒精性脂肪肝的组合物及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种治疗非酒精性脂肪肝的组合物及用途。本发明提供的治疗非酒精性脂肪肝的组合物,包括以下组分及其重量百分数:50‑80%的青钱柳总黄酮、20‑50%的川陈皮素。本发明提供的治疗非酒精性脂肪肝的组合物,首创性的将青钱柳总黄酮与川陈皮素结合使用,具有降低转氨酶,降血脂,降血糖,降低脂质过氧化,调节胰岛素抵抗等作用,提高单独使用青钱柳黄酮时治疗非酒精性脂肪肝的效果,可以有效用于制备防治非酒精性脂肪肝药物,为实现健康中国提供了极大的助力。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及一种治疗非酒精性脂肪肝的组合物及用途。
背景技术
WHO最新资料显示,在2016年,世界范围内,18岁及以上的成年人中有39%超重(19亿人),且13%为肥胖(6.5亿人),而且有超过3.4亿名5-19岁儿童和青少年超重或肥胖。我国的统计资料显示,在2015年,全国18岁及以上成人超重率为30.1%,肥胖率为11.9%,6-17岁儿童青少年超重率为9.6%,肥胖率为6.4%。身体质量指数升高是罹患非传染性疾病,如心血管疾病,糖尿病,肿瘤等的重大风险因素,体重管理日渐成为社会最为关注的问题。
非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指肝组织病理变化与酒精性肝炎相似,但无明确饮酒史的一类慢性肝炎,源自与胰岛素抵抗(IR)相关的肝脏脂肪过度蓄积,具有肝细胞变性、坏死、炎症侵润等特征,会进一步发展为非酒精性脂肪肝炎、肝硬化乃至肝癌。流行病学调查表明,我国NAFLD发病率约为15%,而欧美地区NAFLD的发病率则在20%以上,肥胖(尤其是向心性肥胖)是NAFLD发生的重要危险因素。研究发现,当体重指数BMI<25时,NAFLD的患病率为16.4%;当BMI>30时,NAFLD的患病率为75.8%;而病态肥胖(BMI>40)的NAFLD患病率高达96%。根据肥胖和NAFLD的发病机制筛选有效药物是当前研究的热点,重点集中于胰岛素增敏剂、抗氧化剂、降脂药物等。
青钱柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja)为胡桃科青钱柳属落叶乔木,树叶味甘甜,具有生津清热,降血压,降血糖,降血脂,延年益寿的功效。《中国中药资源志要》记载青钱柳树叶、树皮具有清热消肿,止痛的功能。青钱柳叶主要含多糖,黄酮,以及三萜类等化学成分。药理活性方面的研究表明:青钱柳中的多糖具有降血糖,降血脂,抗脂质过氧化等药理活性;黄酮能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性,同时具有很强的清除自由基能力。但是青钱柳中的黄酮类物质因其溶解度低,通常为转运蛋白的底物等因素,导致其口服生物利用度较低,这是制约黄酮类药物临床应用的关键问题。因此目前关于青钱柳总黄酮治疗非酒精性脂肪肝的研究尚不充分,在医药及保健领域中开发不足。
所以,亟待研发一种以青钱柳总黄酮为主要原料治疗非酒精性脂肪肝的组合物,能有效促进黄酮类物质的在体内吸收以提高其生物利用度,提高青钱柳黄酮治疗非酒精性脂肪肝的活性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种以青钱柳总黄酮为主要原料,与川陈皮素复配的组合物,以提高青钱柳黄酮治疗非酒精性脂肪肝的活性。
本发明的技术方案是:
一种治疗非酒精性脂肪肝的组合物,包括以下组分及其重量百分数:50-80%的青钱柳总黄酮、20-50%的川陈皮素。
进一步地,所述的治疗非酒精性脂肪肝的组合物,由以下组分及其重量百分数组成:75%的青钱柳总黄酮、25%的川陈皮素。
更进一步地,所述青钱柳总黄酮的制备方法,包括以下步骤:
a.取青钱柳的干燥叶,粉碎后过40-50目筛,得青钱柳粗粉,将青钱柳粗粉置于90%乙醇水溶液中浸泡0.5h,再加热回流提取2h,共提取2次,合并提取液、过滤,经减压浓缩至无醇味,以石油醚萃取3次,弃石油醚层,取水相加入乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯萃取液,减压浓缩干燥,得提取物干膏;
b.取步骤a获得的提取物干膏,用超纯水配成质量浓度1mg/mL的混悬液,加至D101大孔树脂柱,用超纯水洗脱除去杂质,再用80%乙醇水溶液洗脱,得青钱柳总黄酮洗脱液,将青钱柳总黄酮洗脱液进一步减压浓缩、冷冻干燥,即得。
更进一步地,经LC-MS分析,所述青钱柳总黄酮中含有槲皮素,山奈酚,以及山奈酚-3-O-鼠李糖苷,槲皮素-7-O-葡萄糖苷,槲皮素-3-O-鼠李糖苷,山奈酚-4’-O-葡萄糖苷,山奈酚-7-O-葡萄糖苷,槲皮素-7-O-葡萄糖苷,槲皮素-3-O-葡萄糖苷,槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的一种或几种。
本发明提供的治疗非酒精性脂肪肝的组合物可以用于制备治疗非酒精性脂肪肝的药物。
另外,本发明还提供了一种用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂,包括所述的治疗非酒精性脂肪肝的组合物和药学上可接受的辅料。
进一步地,所述药物制剂的剂型包括颗粒剂、片剂、微丸剂、胶囊剂。
更进一步地,所述药物制剂的剂型为胶囊剂。
进一步地,所述药学上可接受的辅料为淀粉、糊精、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁和微粉硅胶中的一种或多种。
进一步地,用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂,所述治疗非酒精性脂肪肝的组合物的添加量为,在100重量份的药物制剂中,含有30-80重量份的治疗非酒精性脂肪肝的组合物。
另外,本发明还提供了一种用于治疗非酒精性脂肪肝的胶囊的制备方法,包括如下步骤:
将30~80重量份的治疗非酒精性脂肪肝的组合物,10~20重量份的微晶纤维素,2~10重量份的的羧甲基淀粉钠,0.2~2重量份的的微粉硅胶,混合均匀后填充胶囊,每粒胶囊重0.3~0.8g。
本发明提供的治疗非酒精性脂肪肝的组合物中,所添加的青钱柳总黄酮是青钱柳的提取物。青钱柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja)为胡桃科青钱柳属落叶乔木,树叶具有生津清热,降血压,降血糖,降血脂,延年益寿的功效。青钱柳叶主要含多糖,黄酮,以及三萜类等化学成分。药理活性方面的研究表明:青钱柳中的多糖具有降血糖,降血脂,抗脂质过氧化等药理活性;黄酮能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性,同时具有很强的清除自由基能力。然而现有技术中青钱柳中的黄酮类物质因其溶解度低,通常为转运蛋白的底物等因素,导致其口服生物利用度较低,这是制约黄酮类药物临床应用的关键问题。
川陈皮素(Nobiletin)主要提取于中药陈皮中,属多甲氧基黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、营养神经、肝脏保护等作用,有研究发现川陈皮素主要是通过抑制肝脏中lncLSTR的上调、进而抑制肝脏Apoc2下调、增加肝脏甘油三酯清除率来实现肝细胞的保护作用。川陈皮素是P-糖蛋白、多药耐药蛋白等的抑制剂,能够显著提高相关转运蛋白底物的跨膜转运率,从而提高该类物质的口服生物利用度。本申请发明人意外的发现,将川陈皮素与青钱柳总黄酮相配合,将能更好的促进黄酮有效成分的在体吸收,更大程度的提高其生物利用度。因此,将青钱柳总黄酮与川陈皮素配合,能够更好地发挥降脂,降低体重和治疗非酒精性脂肪肝炎的作用,具有很好的应用价值和开发前景。
与现有技术相比,本发明提供的治疗非酒精性脂肪肝的组合物具有以下优势:
本发明提供的治疗非酒精性脂肪肝的组合物,首创性的青钱柳总黄酮与川陈皮素结合使用,具有降低转氨酶,降血脂,降血糖,降低脂质过氧化,调节胰岛素抵抗等作用,提高单独使用青钱柳黄酮时的治疗非酒精性脂肪肝的效果,可以有效用于制备防治非酒精性脂肪肝药物,为实现健康中国提供了极大的助力。
附图说明
图1为青钱柳总黄酮以及川陈皮素对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响;
图2为青钱柳总黄酮以及川陈皮素对DPPH清除率的影响;
图3青钱柳总黄酮复配川陈皮素对NAFLD模型小鼠体重、脏器指标及脂肪含量的影响;
图4为青钱柳总黄酮复配川陈皮素对NAFLD模型小鼠生化指标的影响;
图5为青钱柳总黄酮复配川陈皮素对NAFLD模型小鼠肝脏病理改变的影响。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明,但这并非是对本发明的限制,本领域技术人员根据本发明的基本思想,可以做出各种修改或改进,但是只要不脱离本发明的基本思想,均在本发明的保护范围之内。
实施例1 一种治疗非酒精性脂肪肝炎胶囊的制备方法
所述治疗非酒精性脂肪肝炎药物的制备方法为:
1.取青钱柳的干燥叶,粉碎后置于10倍药材质量、体积分数为90%的乙醇溶液中浸泡0.5h,再加热回流提取2次,每次2h,合并提取液、过滤,减压浓缩至无醇味,以石油醚萃取3次,弃石油醚层,取水相加入乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液减压浓缩,干燥后得提取物干膏。提取物用超纯水配成质量浓度1mg/mL的混悬液,加至D101大孔树脂柱,上样量与树脂体积的比例为1∶15,先用20倍柱体积的超纯水洗脱除去杂质,再以15倍柱体积的80%乙醇溶液洗脱,得青钱柳总黄酮洗脱液。所得的青钱柳总黄酮洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥、粉碎,即得青钱柳总黄酮。
2.称取10g的青钱柳总黄酮,4g的川陈皮素,5.1g微晶纤维素,0.8g羧甲基淀粉钠,0.1g微粉硅胶混合均匀,填充胶囊,每粒胶囊重0.4g。
实施例2 一种治疗非酒精性脂肪肝炎胶囊的制备方法
所述治疗非酒精性脂肪肝炎药物的制备方法为:
1.取青钱柳的干燥叶,粉碎后置于12倍药材质量、体积分数为90%的乙醇溶液中浸泡0.5h,再加热回流提取2次,每次2h,合并提取液、过滤,减压浓缩至无醇味,以石油醚萃取3次,弃石油醚层,取水相加入乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液减压浓缩,干燥后得提取物干膏。提取物用超纯水配成质量浓度1mg/mL的混悬液,加至D101大孔树脂柱,上样量与树脂体积的比例为1∶15,先用20倍柱体积的超纯水洗脱除去杂质,再以15倍柱体积的80%乙醇溶液洗脱,得青钱柳总黄酮洗脱液。所得的青钱柳总黄酮洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥、粉碎,即得青钱柳总黄酮。
2.称取12g的青钱柳总黄酮,3g的川陈皮素,4.1g微晶纤维素,0.8g羧甲基淀粉钠,0.1g微粉硅胶混合均匀,填充胶囊,每粒胶囊重0.4g。
实施例3 一种治疗非酒精性脂肪肝炎胶囊的制备方法
所述治疗非酒精性脂肪肝炎药物的制备方法为:
1.取青钱柳的干燥叶,粉碎后置于14倍药材质量、体积分数为90%的乙醇溶液中浸泡0.5h,再加热回流提取2次,每次2h,合并提取液、过滤,减压浓缩至无醇味,以石油醚萃取3次,弃石油醚层,取水相加入乙酸乙酯再萃取3次,合并萃取液减压浓缩,干燥后得提取物干膏。提取物用超纯水配成质量浓度1mg/mL的混悬液,加至D101大孔树脂柱,上样量与树脂体积的比例为1∶15,先用20倍柱体积的超纯水洗脱除去杂质,再以15倍柱体积的80%乙醇溶液洗脱,得青钱柳总黄酮洗脱液。所得的青钱柳总黄酮洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥、粉碎,即得青钱柳总黄酮。
2.称取9g的青钱柳总黄酮,3g的川陈皮素,7g微晶纤维素,0.9g羧甲基淀粉钠,0.1g微粉硅胶混合均匀,填充胶囊,每粒胶囊重0.5g。
实施例4 一种治疗非酒精性脂肪肝炎胶囊的制备方法
所述治疗非酒精性脂肪肝炎药物的制备方法为:
1.取青钱柳的干燥叶,粉碎后置于15倍药材质量、体积分数为90%的乙醇溶液中浸泡0.5h,再加热回流提取2次,每次2h,合并提取液、过滤,减压浓缩至无醇味,以石油醚萃取3次,弃石油醚层,取水相加入乙酸乙酯再萃取3次,合并萃取液减压浓缩,干燥后得提取物干膏。提取物用超纯水配成质量浓度1mg/mL的混悬液,加至D101大孔树脂柱,上样量与树脂体积的比例为1∶15,先用20倍柱体积的超纯水洗脱除去杂质,再以15倍柱体积的80%乙醇溶液洗脱,得青钱柳总黄酮洗脱液。所得的青钱柳总黄酮洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥、粉碎,即得青钱柳总黄酮。
2.称取10g的青钱柳总黄酮,5g的川陈皮素,4.1g微晶纤维素,0.8g羧甲基淀粉钠,0.1g微粉硅胶混合均匀,填充胶囊,每粒胶囊重0.5g。
试验例一、提高胰岛素抵抗HepG2(IR-HepG2)细胞葡萄糖消耗量的协同增效作用
1、试验样品:按实施例3所述的方法制得的治疗非酒精性脂肪肝炎胶囊内容物、青钱柳总黄酮、川陈皮素分别用DMSO溶解,高速离心,过滤,制备储备液,试验时用培养基稀释至相应浓度。
2、试验对象:HepG2细胞。
3、试验试剂与仪器:青钱柳叶,经鉴定为青钱柳干燥叶,购自浙江遂昌;盐酸二甲双胍,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;川陈皮素购自大连美仑生物技术有限公司,葡萄糖测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
4、试验内容:取对数生长期HepG2细胞,以1×105个/孔的细胞密度接种于96孔细胞培养板。将细胞分为对照组、模型组及样品干预组,对照组给予正常培养基,模型组及样品干预组用含1×10-9mol/L胰岛素和3.75×10-6mol/L地塞米松的培养基诱导24h。弃去培养液,用PBS洗涤3次,对照组和模型组换无血清培养基,样品干预组给予无血清的含药培养基,样品终剂量分别为:
单独给药青钱柳总黄酮组(记为CPF组):0.5μg/mL、1.58μg/mL、5μg/mL、15.8μg/mL、50μg/mL、158μg/mL、500μg/mL、1580μg/mL;
单独给药川陈皮素组(记为NOB组):0.158μg/mL、0.5μg/mL、1.58μg/mL、5μg/mL、15.8μg/mL、50μg/mL、158μg/mL、500μg/mL;
阳性对照药为2mmol/L的二甲双胍,样品每个浓度设6个复孔,加药孵育24h后,用葡萄糖测定试剂盒(GOD-POD法)检测细胞培养液中的葡萄糖含量,计算葡萄糖消耗量及药效强度%,评价青钱柳总黄酮复配川陈皮素干预胰岛素抵抗的作用效果。
药效强度%=(给药孔葡萄糖浓度-模型孔葡萄糖浓度)/(阳性对照药孔葡萄糖浓度-模型孔葡萄糖浓度)×100%。(设定阳性对照药的药效强度为100%)。
CPF组和NOB组在IR-HepG2细胞上,提高葡萄糖消耗量的半最大效应浓度(EC50)分别为75.56μg/mL和126.72μg/mL。结果见图1。
分别按照CPF组和NOB组在IR-HepG2细胞上的4×EC50,2×EC50,1×EC50,0.5×EC50,0.25×EC50剂量,设置实验浓度。
单独给药CPF组:302.24μg/mL、151.12μg/mL、75.56μg/mL、37.78μg/mL、18.89μg/mL;
单独给药NOB组:506.88μg/mL、253.44μg/mL、126.72μg/mL、63.36μg/mL、31.68μg/mL;
联合给药组(记为CN组):CPF 302.24μg/mL+NOB 506.88μg/mL、CPF 151.12μg/mL+NOB 253.44μg/mL、CPF 75.56μg/mL+NOB 126.72μg/mL、CPF 37.78μg/mL+NOB 63.36μg/mL、CPF 18.89μg/mL+NOB 31.68μg/mL。
5、试验结果:
在IR-HepG2细胞模型上考察提高葡萄糖消耗量的协同效果。采用CompuSyn软件,按照“Chou-Talalay”方法计算协同指数(当CI<1时表示有协同作用;当CI=1时表示为加和作用;当CI>1时表示有拮抗作用)。计算得青钱柳总黄酮与川陈皮素的协同指数CI=0.6837,表示二者具有协同作用。本试验结果表明青钱柳总黄酮复配川陈皮素后能显著提高胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量,川陈皮素能协同青钱柳黄酮发挥更强的抑制胰岛素抵抗的作用。
试验例二、清除DPPH的协同增效作用
1、试验样品:按实施例3所述的方法制得的治疗非酒精性脂肪肝炎胶囊内容物、青钱柳总黄酮、川陈皮素分别用甲醇溶解,高速离心,过滤,制备储备液,试验时用无水乙醇稀释至相应浓度。
2、试验试剂与仪器:青钱柳叶,经鉴定为青钱柳干燥叶,购自浙江遂昌;盐酸二甲双胍,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;维生素C、川陈皮素购自大连美仑生物技术有限公司,1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)购自默克生命科学(上海)有限公司;Infinite M200 Pro多功能酶标仪(帝肯(上海)贸易有限公司)
3、试验内容:
配制浓度为0.1M的DPPH无水乙醇溶液,取2mL的青钱柳总黄酮(CPF)样品溶液(0.5μg/mL、1.58μg/mL、5μg/mL、15.8μg/mL、50μg/mL、158μg/mL,500μg/mL、1580μg/mL、5000μg/mL),以及川陈皮素(NOB)样品溶液(0.158μg/mL、0.5μg/mL、1.58μg/mL、5μg/mL、15.8μg/mL、50μg/mL、158μg/mL、500μg/mL)于试管中,再向试管中依次加入2mL的DPPH溶液,避光反应30min后,在517nm处测定吸光度(Asample)。以样品溶液加入2mL无水乙醇溶液为样品对照组(Ablank),以维生素C溶液(1500μg/mL)为阳性对照,以DPPH溶液中加入等量的无水乙醇溶液作为空白对照(Acontrol),每组重复3次。按公式DPPH清除率=[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100%,计算DPPH清除率。
通过计算可得CPF和NOB清除DPPH的EC50分别为37.66μg/mL和20.12μg/mL。结果见图2。
分别按照CPF和NOB对DPPH清除率的4×EC50,2×EC50,1×EC50,0.5×EC50,0.25×EC50剂量,设置实验浓度。
单独给药CPF组:150.64μg/mL、75.32μg/mL、37.66μg/mL、18.83μg/mL、9.42μg/mL;
单独给药NOB组:80.48μg/mL、40.24μg/mL、20.12μg/mL、10.06μg/mL、5.03μg/mL;
联合给药CN组:CPF 150.64μg/mL+NOB 80.48μg/mL、CPF 75.32μg/mL+NOB 40.24μg/mL、CPF 37.66μg/mL+NOB 20.12μg/mL、CPF 18.83μg/mL+NOB 10.06μg/mL、CPF 9.42μg/mL+NOB 5.03μg/mL。
4、试验结果:
在IR-HepG2细胞模型上考察提高葡萄糖消耗量的协同效果。采用CompuSyn软件,按照“Chou-Talalay”方法计算协同指数(当CI<1时表示有协同作用;当CI=1时表示为加和作用;当CI>1时表示有拮抗作用)。计算得青钱柳黄酮与川陈皮素的协同指数CI=0.6164,表示二者具有协同作用。
本试验结果表明青钱柳黄酮复配川陈皮素后清除DPPH的作用更强,川陈皮素能协同青钱柳黄酮发挥更显著抗氧化作用。
试验例三、对高脂高胆固醇饲料诱导C57小鼠NAFLD模型的影响
1、试验样品:按实施例3所述的方法制得的治疗非酒精性脂肪肝炎胶囊内容物。
2、试验动物:清洁级C57 BL/6J小鼠(4-6周龄)购于广东省医学实验动物中心,动物许可证号SCXK(粤)2013-0002。实验动物合格证号:44002100016098。实验动物饲养于恒温(20±2)℃、相对湿度50%-70%、12h明暗交替光照环境中,自由饮水、摄食。适应性喂养1周后用于实验。
3、试验试剂与仪器:青钱柳叶,经鉴定为青钱柳干燥叶,购自浙江遂昌;盐酸二甲双胍片,购自中美上海施贵宝制药有限公司;川陈皮素购自大连美仑生物技术有限公司;AST、ALT、TG、TC、MDA、SOD、葡萄糖测定试剂盒、胰岛素测试盒、油红O染液均购自南京建成生物工程研究所;苏木素伊红(H&E)染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;Accu-Chek Active血糖仪购自美国罗氏公司;Leica RM2255-全自动轮转式切片机购自徕卡显微系统(上海)贸易有限公司;HistoStarTM组织包埋机购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;OLYMPUS BX51光学显微镜购自奥林巴斯(中国)有限公司。
4、试验内容:
(1)青钱柳总黄酮复配川陈皮素对高脂饲料诱导NAFLD小鼠模型的协同作用考察
雄性C57小鼠60只,随机分成6组(n=10):空白对照组(CTR),模型对照组(Model),阳性对照二甲双胍组(MET,100mg/kg),青钱柳总黄酮组(CPF,150mg/kg),川陈皮素组(NOB,50mg/kg),按实施例3所述的方法制得的治疗非酒精性脂肪肝炎胶囊内容物组(CN,CPF150mg/kg+NOB 50mg/kg)。模型组及给药组给予高脂高胆固醇饲料,空白对照组给予正常饲料。各组均灌胃给药14周,青钱柳黄酮与川陈皮素用0.5%CMC-Na溶液混悬,模型对照组及空白对照组给予等量生理盐水,每周记录动物体重。
(2)生化指标检测
于第14周末,空腹16h,灌服葡萄糖溶液(2g/kg),分别于0min,30min,60min,90min,120min于尾尖取血测定血糖,小鼠经戊巴比妥钠麻醉后取腹主动脉血,4000rpm离心制备血清,用于测定ALT、AST、TC、TG、以及空腹胰岛素水平,计算血糖曲线下面积(血糖曲线下面积(AUC/(h/mmol/L))=0.25×0h血糖值+0.5×0.5h血糖值+0.75×1h血糖值+0.5×2h血糖值)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR,HOMA-IR=FBG×FINS/22.5)。同时测定肝脏组织中SOD,MDA水平。
(3)脏器指标及肝脏病理检查
取肝脏,肾脏,心脏,脑,脾,睾丸器官,以及肾周脂肪,附睾脂肪,称重,计算脏器指数、体脂含量。并剪取部分肝脏分别冷冻于-80℃冰箱,或固定于4%多聚甲醛中。4%多聚甲醛固定的肝脏样本切片后经H&E染色处理;冰冻肝脏样本切片经油红染色处理,观察肝脏病理变化。
(4)数据统计
数据以Mean±SD表示,数据采用IBM SPSS Statistics 24.0软件进行统计处理。多组样本均数的两两比较采用单因素方差分析,方差齐性采用Dunnett检验,方差不齐采用非参数检验。两组独立样本均数比较采用t Test检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
5、试验结果:
(1)对NAFLD模型小鼠脏器指标的影响
青钱柳总黄酮复配川陈皮素能够显著抑制高脂高胆固醇饲料诱导的C57 BL/6J小鼠体重的上升,同时降低肝脏/体重百分率,表现出保护肝脏的作用。青钱柳总黄酮复配川陈皮素对NAFLD模型小鼠的脑,脾,睾丸等器官也具有保护作用,使这些器官的脏器指标趋向于正常饲喂组。此外,青钱柳总黄酮复配川陈皮素能够减少脂肪在腹部肾脏周围以及附睾处的堆积,降低体脂百分率,具有抑制脂肪形成进而控制体重的作用。在本实验剂量条件下,青钱柳总黄酮复配川陈皮素的效果优于单独给予青钱柳总黄酮或川陈皮素。结果见图3。(其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,VS模型对照组;##P<0.01,###P<0.001,VS空白对照组。)
(2)对NAFLD模型小鼠生化指标的影响
NAFLD模型小鼠的血清转氨酶AST、ALT,血脂指标TG、TC,空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数,以及脂质过氧化指标MDA的水平都显著升高,氧化应激指标SOD水平则显著下降,且口服糖耐量异常。给予青钱柳总黄酮复配川陈皮素干预后,能显著降低NAFLD模型小鼠的转氨酶、空腹血糖、血脂水平,改善氧化应激状态及口服糖耐量,纠正胰岛素抵抗。在本实验剂量条件下,青钱柳总黄酮复配川陈皮素的效果优于单独给予青钱柳总黄酮或川陈皮素。结果见图4。(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,VS模型对照组;##P<0.001,###P<0.001VS空白对照组。)
(3)青钱柳总黄酮复配川陈皮素对NAFLD模型小鼠口服糖耐量的影响
试验结果见表1。
表1 青钱柳总黄酮复配川陈皮素对NAFLD模型小鼠口服糖耐量的影响(Mean±SD,n=10)
*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,VS模型对照组;###P<0.001,VS空白对照组。
(4)对NAFLD模型小鼠肝脏病理改变的影响
肝脏H&E结果显示,空白对照组小鼠肝组织着色均匀,肝细胞索排列规则,肝窦清晰可见;经14周高脂高胆固醇饲料诱导后,模型组小鼠肝组织小叶结构尚完整,肝板排列尚整齐,但肝细胞明显肿胀,有大小混合性肝细胞脂肪变性,充满大量大小不一的脂肪空泡,以汇管区周围明显,并见大量肝细胞体积稍大,核大染色较深;小叶内大量点、灶状坏死;可见大量小胆管增生:汇管区扩大,存在明显淋巴细胞及炎性细胞浸润。经青钱柳总黄酮复配川陈皮素干预后,小鼠肝组织的小叶结构完整,肝板排列整齐,脂肪空泡明显减少或变小,局部区域仍有炎性反应发生,但浸润情况明显好转,结果见图5A。肝脏油红染色结果显示,模型小鼠的肝细胞胞浆内可见大量橘红色的脂肪滴,经青钱柳总黄酮复配川陈皮素干预后,脂肪滴明显减少或变小。结果见图5B。肝脏H&E染色病理评分结果见表2。
表2 肝脏H&E染色病理评分(Mean±SD,n=10)
*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,VS模型对照组;###P<0.001,VS空白对照组。
病理结果显示,在本实验剂量条件下,青钱柳总黄酮复配川陈皮素的效果优于单独使用青钱柳总黄酮或川陈皮素组。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (7)
1.一种治疗非酒精性脂肪肝的组合物,其特征在于,由以下组分及其重量百分数组成:50-80%的青钱柳总黄酮、20-50%的川陈皮素;
所述青钱柳总黄酮的制备方法,包括以下步骤:
a.取青钱柳的干燥叶,粉碎后过40-50目筛,得青钱柳粗粉,将青钱柳粗粉置于90%乙醇水溶液中浸泡0.5h,再加热回流提取2h,共提取2次,合并提取液、过滤,经减压浓缩至无醇味,以石油醚萃取3次,弃石油醚层,取水相加入乙酸乙酯萃取3次,合并乙酸乙酯萃取液,减压浓缩干燥,得提取物干膏;
b.取步骤a获得的提取物干膏,用超纯水配成质量浓度1mg/mL的混悬液,加至D101大孔树脂柱,用超纯水洗脱除去杂质,再用80%乙醇水溶液洗脱,得青钱柳总黄酮洗脱液,将青钱柳总黄酮洗脱液进一步减压浓缩、冷冻干燥,即得。
2.如权利要求1所述的治疗非酒精性脂肪肝的组合物,其特征在于,由以下组分及其重量百分数组成:75%的青钱柳总黄酮、25%的川陈皮素。
3.如权利要求1或2所述的治疗非酒精性脂肪肝的组合物在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的用途。
4.一种用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂,包括权利要求1或2所述的治疗非酒精性脂肪肝的组合物和药学上可接受的辅料。
5.如权利要求4所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂,其特征在于,所述药物制剂的剂型包括颗粒剂、片剂、微丸剂、胶囊剂。
6.如权利要求4所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂,其特征在于,所述药学上可接受的辅料为淀粉、糊精、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁和微粉硅胶中的一种或多种。
7.如权利要求4所述的用于治疗非酒精性脂肪肝的药物制剂,其特征在于,所述治疗非酒精性脂肪肝的组合物的添加量为,在100重量份的药物制剂中,含有30-80重量份的治疗非酒精性脂肪肝的组合物。
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