CN109010422A - 一种青钱柳叶总黄酮的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药领域，具体涉及一种青钱柳叶总黄酮的制备方法及其在制备防治非酒精性脂肪肝炎的药物和保健品中的应用。本发明提供的青钱柳叶总黄酮的制备方法，采用干燥的青钱柳叶，经粉碎、提取、过滤等制得青钱柳叶提取液，利用双水相体系萃取，青钱柳叶总黄酮溶液呈亮黄色，富集在上相中，进一步分离、减压、浓缩、干燥即得。采用本发明制得的青钱柳叶总黄酮萃取率高达80％‑95％。本发明制备的青钱柳叶总黄酮具有降低转氨酶活性，降血糖，降血脂，抑制脂肪累积的作用，保障了青钱柳叶总黄酮在制备治疗非酒精性脂肪肝炎药物中的应用。

Description

一种青钱柳叶总黄酮的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及一种青钱柳叶总黄酮的制备方法及其应用。
背景技术
非酒精性脂肪肝炎(NASH)是指肝组织病理变化与酒精性肝炎相似，但无明确饮酒史的一类慢性肝炎，源自与胰岛素抵抗(IR)相关的肝脏脂肪过度蓄积，具有肝细胞变性、坏死、炎症侵润等特征，会进一步发展为肝硬化、肝癌。NASH的发病率随经济发展而日趋攀升，人群中约30％的肥胖者会发生NASH，而WHO在2016年的统计资料中显示，全球超过6.5亿人处于肥胖状态，NASH已成为威胁人类健康的严峻问题。IR导致的“二次打击”学说是NASH的主要发病机制：第一次打击为IR导致的肝脂肪沉积、肝细胞变性；第二次打击为氧化应激和脂质过氧化损伤，造成肝细胞本身和线粒体的慢性持续损伤和炎症。
根据NASH的发病机制筛选有效药物是当前研究的热点，重点集中于胰岛素增敏剂、抗氧化剂、降脂药物等。中国专利申请CN105592846 A公开了一种治疗有需要的受试对象的脂肪肝疾病或病症的方法，该方法虽然对NASH有一定的抑制作用，但是其受试对象范围较小，治疗周期长，而且所用的药物组合物中包含酰胺及烯酸等物质，具有一定的毒副作用。
青钱柳(Cyclocarya paliurus)为胡桃科青钱柳属落叶乔木，树叶味甘甜，具有生津清热，降血压，降血糖，降血脂，延年益寿的功效。《中国中药资源志要》记载青钱柳树叶、树皮具有清热消肿，止痛的功能。青钱柳叶主要含多糖，黄酮，以及三萜类等化学成分。药理活性方面的研究表明：青钱柳中的多糖具有降血糖，降血脂，抗脂质过氧化等药理活性；黄酮能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性，同时具有很强的清除自由基能力；目前关于青钱柳叶总黄酮治疗NASH的研究尚未发现。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种青钱柳叶总黄酮的制备方法及其应用。为了达到上述目的，本发明提供了一种青钱柳叶总黄酮的制备方法，具体操作步骤如下：
a.取青钱柳的干燥叶，进行粉碎，过40-50目筛，得青钱柳粗粉，将青钱柳粗粉置于乙醇水溶液中浸泡0.5～1.5h，再加热回流提取1～3h，共提取3-5次后进行过滤合并，得青钱柳叶提取液；
b.向聚乙二醇和磷酸盐缓冲液中加入步骤a制得的青钱柳叶提取液，组成双水相体系；
c.调节双水相体系的pH值为6.5-7.5，磁力搅拌10min，然后在25℃条件下静置1-2h，青钱柳叶总黄酮富集在上相中，呈现亮黄色，上层为青钱柳叶总黄酮溶液与聚乙二醇的混合物；
d.移取步骤c获得的上层混合物，上D101大孔树脂柱，用超纯水洗脱除去聚乙二醇，再用乙醇水溶液洗脱，得青钱柳叶总黄酮洗脱液；
e.将步骤d所得的青钱柳叶总黄酮洗脱液进一步减压、浓缩、干燥，即得。
优选地，所述步骤a中的乙醇水溶液的质量为青钱柳粗粉质量的5-15倍，乙醇水溶液的体积分数为55～95％。
优选地，所述步骤b中聚乙二醇的浓度范围为15％-25％；所述的磷酸缓冲液的浓度范围为15％-20％。
优选地，所述步骤c中的青钱柳叶总黄酮溶液的浓度为50mg/mL。
优选地，所述步骤d的D101大孔树脂柱中，上样量与所述D101大孔树脂体积比为1∶15，所述超纯水的体积为所述D101大孔树脂柱体积的20倍，所述乙醇水溶液的浓度为80％，体积为所述D101大孔树脂柱体积的15倍。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供的青钱柳叶总黄酮，制备方法简单，原材料丰富，加热回流提取，增加溶剂穿透力，提取率高，提取时间短，从而实现高效、快速制备青钱柳叶总黄酮的目的；
(2)本发明采用双水相萃取法萃取黄酮，双水相萃取法是高效温和的分离技术，容易放大和保持有效成分的生物活性；
(3)本发明提取的青钱柳叶总黄酮具有降低转氨酶，降血脂，降血糖，降低脂质过氧化，抑制肝细胞纤维化等作用，可以有效用于制备防治非酒精性脂肪肝炎药物的新用途，为实现健康中国提供了极大的助力。
附图说明
图1为青钱柳叶总黄酮对α-葡萄糖苷酶活性的影响；
图2为青钱柳叶总黄酮对NASH模型小鼠脏器指标的影响；
图3为青钱柳叶总黄酮对NASH模型小鼠生化指标的影响；
图4为青钱柳叶总黄酮对NASH模型小鼠肝脏形态的影响；
图5为青钱柳叶总黄酮对NASH模型小鼠肝脏病理的影响。
具体实施方式
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明，但以下实施例并不用于限制本发明，凡是与本发明相近的方法或技术方案均在本发明的保护范围之内。
实施例1一种青钱柳叶总黄酮的制备方法
所述青钱柳叶总黄酮的制备方法为：
a.取青钱柳的干燥叶，进行粉碎，过40目筛，得青钱柳粗粉，将青钱柳粗粉置于青钱柳粗粉质量的5倍、体积分数为55％的乙醇水溶液中浸泡0.5h，再加热回流提取1h，共提取3次，过滤后合并，得青钱柳叶提取液；
b.向聚乙二醇和磷酸盐缓冲液中加入步骤a制得的青钱柳叶提取液，组成双水相体系，其中，聚乙二醇的质量浓度为15％，磷酸盐缓冲液的质量浓度为15％；所述磷酸盐缓冲液由无水磷酸二氢钾(KH2PO4)34.0g及无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)35.5g溶于水，稀释至1000mL制备而成；
c.调节双水相体系的pH值为6.5，磁力搅拌10min，然后在25℃条件下静置1h，青钱柳叶总黄酮富集在上相中，呈现亮黄色，上层得青钱柳叶总黄酮溶液及聚乙二醇的混合物，所述青钱柳叶总黄酮溶液的浓度为50mg/mL；
d.移取步骤c获得的混合物上D101大孔树脂柱，上样量与树脂体积的比例为1∶15，用20倍D101大孔树脂柱体积的超纯水洗脱除去聚乙二醇，再以15倍D101大孔树脂柱体积的80％乙醇水溶液洗脱，得青钱柳叶总黄酮洗脱液；
e.将步骤d所得的青钱柳叶总黄酮洗脱液进一步减压、浓缩、干燥，即得。
所得青钱柳叶总黄酮的萃取率为85％。
实施例2一种青钱柳叶总黄酮的制备方法
所述青钱柳叶总黄酮的制备方法为：
a.取青钱柳的干燥叶，进行粉碎，过50目筛，得青钱柳粗粉，将青钱柳粗粉置于青钱柳粗粉质量的15倍、体积分数为95％的乙醇水溶液中浸泡1.5h，再加热回流提取3h，共提取5次，过滤后合并，得青钱柳叶提取液；
b.向聚乙二醇和磷酸盐缓冲液中加入步骤a制得的青钱柳叶提取液，组成双水相体系，其中，聚乙二醇的质量浓度为25％，磷酸盐缓冲液的质量浓度为20％，所述磷酸盐缓冲液由无水磷酸二氢钾(KH2PO4)34.0g及无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)35.5g溶于水，稀释至1000mL制备而成；
c.调节双水相体系的pH值为7.5，磁力搅拌10min，然后在25℃条件下静置2h，青钱柳叶总黄酮富集在上相中，呈现亮黄色，上层得青钱柳叶总黄酮溶液及聚乙二醇的混合物，所述青钱柳叶总黄酮溶液的浓度为50mg/mL；
d.移取步骤c获得的混合物上D101大孔树脂柱，上样量与树脂体积的比例为1∶15，用20倍D101大孔树脂柱体积的超纯水洗脱除去聚乙二醇，再以15倍D101大孔树脂柱体积的80％乙醇洗脱，得青钱柳叶总黄酮洗脱液；
e.将步骤d所得的青钱柳叶总黄酮洗脱液进一步减压、浓缩、干燥，即得。
所得青钱柳叶总黄酮的提取率为87％。
实施例3一种青钱柳叶总黄酮的制备方法
所述青钱柳叶总黄酮的制备方法为：
a.取青钱柳的干燥叶，进行粉碎，过45目筛，得青钱柳粗粉，将青钱柳粗粉置于青钱柳粗粉质量的10倍、体积分数为75％的乙醇水溶液中浸泡1h，再加热回流提取2h，共提取4次，过滤后合并，得青钱柳叶提取液；
b.向聚乙二醇和磷酸盐缓冲液中加入步骤a制得的青钱柳叶提取液，组成双水相体系，其中，聚乙二醇的浓度为20％，磷酸盐缓冲液的浓度为17％，所述磷酸盐缓冲液由无水磷酸二氢钾(KH2PO4)34.0g及无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)35.5g溶于水，稀释至1000mL制备而成；
c.调节双水相体系的pH值为7.0，磁力搅拌10min，然后在25℃条件下静置1.5h，青钱柳叶总黄酮富集在上相中，呈现亮黄色，上层上层得青钱柳叶总黄酮溶液及聚乙二醇的混合物，所述青钱柳叶总黄酮溶液的浓度为50mg/mL；
d.移取步骤c获得的混合物上D101大孔树脂柱，上样量与树脂体积的比例为1∶15，用20倍D101大孔树脂柱体积的超纯水洗脱除去聚乙二醇和缓冲盐，再以15倍D101大孔树脂柱体积的80％乙醇洗脱，得青钱柳叶总黄酮洗脱液；
e.将步骤d所得的青钱柳叶总黄酮洗脱液进一步减压、浓缩、干燥，即得。
所得青钱柳叶总黄酮的萃取率为95％。
试验例1青钱柳叶总黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制作用
1.试验样品：按实施例3所述的方法制得的青钱柳叶总黄酮。
2.试验方法：在96孔板中，每孔加入20μLα-葡萄糖苷酶溶液(PBS，pH6.8，1U/mL)，50μL阳性对照药阿卡波糖(10，20，40，80，160，320μM)以及不同浓度的青钱柳叶总黄酮(5，10，20，40，80，160，320μg/mL)溶液，37℃孵育15min，然后加入20μLp-NPG(5mM)溶液，37℃孵育20min，加入80μL Na2CO3(0.1M)终止反应，立即用酶标仪于405nm处测定吸光度值，不加青钱柳叶总黄酮的溶液作为空白对照，计算各组分对α-葡萄糖苷酶的抑制率。每个样品设置4个复孔，取平均值，计算青钱柳叶总黄酮对α-葡萄糖苷酶的IC50值。
样品对α-葡萄糖苷酶活性抑制率公式如下：抑制率％＝(A对照-A样品)/(A对照-A空白)×100％。(A空白为空白对照孔的吸光度值；A对照为无抑制剂孔的吸光度值；A样品为样品孔的吸光度值)。
3.试验结果：青钱柳叶总黄酮在20μg/mL-320μg/mL的剂量范围内能够剂量依赖的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，其IC50为151.40±4.92μg/mL，结果见图1。表明青钱柳叶总黄酮可以通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性从而发挥降血糖的作用，因此，对由于高血糖水平导致的非酒精性脂肪肝炎，或是非酒精性脂肪肝炎并发的高血糖都具有很好的干预作用。
试验例2青钱柳叶总黄酮对高脂饲料诱导NASH小鼠模型的影响
1.试验样品：按实施例3所述的方法制得的青钱柳叶总黄酮。
2.试验动物：清洁级C57BL/6小鼠购于广东省医学实验动物中心，动物许可证号SCXK(粤)2013-0002。
3.试验试剂与仪器：青钱柳叶，经鉴定为青钱柳干燥叶，购自浙江遂昌；盐酸二甲双胍片，购自中美上海施贵宝制药有限公司；阿卡波糖片，购自拜耳医药保健有限公司；α-葡萄糖苷酶(罗氏分装)购自大连美仑生物技术有限公司；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；AST、ALT、TG、TC、MDA、SOD、葡萄糖测定试剂盒、胰岛素测试盒、Masson染色试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；IL-6ELISA试剂盒、TNF-αELISA试剂盒均购自eBioscience公司；苏木素伊红(H&E)染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；试剂、 DIRECTTM试剂盒均购自美国Lifetechnology公司；ViiATM7实时荧光定量PCR系统购自美国Applied Biosystems公司； III逆转录酶购自美国Invitrogen公司；Accu-Chek Active血糖仪购自美国罗氏公司；Leica RM2255-全自动轮转式切片机购自徕卡显微系统(上海)贸易有限公司；HistoStarTM组织包埋机购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；OLYMPUS BX51光学显微镜够自奥林巴斯(中国)有限公司。
4.试验方法
(1)高脂饲料诱导非酒精性脂肪肝炎小鼠模型的建立
取雄性C57小鼠，分为6组，空白组(Control组或CTR组)给予普通饲料，造模组给予高脂高胆固醇饲料诱导产生非酒精性脂肪肝炎，造模组又分为模型对照组(Model组)，二甲双胍(150mg/kg)组(MET组)，青钱柳叶总黄酮高(CPF-1)、中(CPF-2)、低(CPF-3)剂量组(500mg/kg，250mg/kg，125mg/kg)，各组均喂养16周，采用灌胃方式给药，空白对照组和模型对照组给予等量生理盐水。
(2)生化指标的测定
于第16周末，采小鼠尾尖血测定空腹血糖，胰岛素含量。小鼠经戊巴比妥钠麻醉后取腹主动脉血，3500rpm离心制备血清，测定AST，ALT，TC，TG，IL-6，TNF-α水平，取肝组织用冰的PBS缓冲液制备成10％的匀浆液，测定SOD，MDA水平。
(3)肝脏病理检查
小鼠经戊巴比妥钠麻醉后取肝脏，肾脏，脑，脾，睾丸，肾周脂肪，附睾脂肪，称重，计算脏器指数。并剪取部分肝脏浸泡于4％多聚甲醛中，经固定、脱水、透明、石蜡包埋和切片，按H&E和Masson染色试剂盒操作说明分别进行H&E和Masson染色，观察肝脏病理变化。
(4)青钱柳叶总黄酮对非酒精性脂肪肝炎mRNA水平的影响
使用试剂抽提样本中的总RNA，经 mRNA DIRECTTM试剂盒纯化mRNA后，再用 III逆转录酶进行逆转录，以ViiATM7实时荧光定量PCR系统检测各组样本中的相关mRNA水平，小鼠RT-PCR基因引物序列见表1，正常动物组织作为阴性对照，Gapdh作为内参，以2^-ΔΔCT法进行相对定量分析。
表1小鼠RT-PCR基因引物序列
(5)统计学方法
数据以Mean±SD表示，数据采用IBM SPSS Statistics 24.0软件进行统计处理。多组样本均数的两两比较采用单因素方差分析，方差齐性采用Dunnett检验，方差不齐采用非参数检验。两组独立样本均数比较采用Independent Sample T Test检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
5.试验结果：
(1)青钱柳叶总黄酮对NASH模型小鼠脏器指标的影响
分别称取C57 BL/6小鼠的体重，肝脏，脑，肾脏，心脏，脾脏，睾丸，附睾脂肪，肾周脂肪的重量，计算脏器指数。由结果可知，青钱柳叶总黄酮具有控制高脂高胆固醇饲料诱导的C57 BL/6小鼠体重上升的作用，同时降低肝脏/体重％率，表现出保护肝脏的作用，并呈现有量效关系。B超结果显示，肝脏及肾脏回声增强，提示脂肪累积，而给予青钱柳叶总黄酮干预后，B超结果趋向于正常值。青钱柳叶总黄酮对非酒精性脂肪肝炎模型小鼠的脑，脾，睾丸等器官也具有保护作用，使这些脏器指标趋向于正常饲喂组。此外，青钱柳叶总黄酮能够减少脂肪在腹部肾脏周围以及附睾处的堆积，具有抑制脂肪形成进而控制体重的作用，并呈现有量效关系。结果见图2。
(2)青钱柳叶总黄酮对非酒精性脂肪肝炎小鼠生化指标的影响
非酒精性脂肪肝炎模型小鼠的血清转氨酶AST、ALT，炎症因子IL-6、TNF-α以及血脂指标TG、TC，脂质过氧化指标MDA的水平都显著升高，氧化应激指标SOD水平则显著下降。给予青钱柳叶总黄酮干预后，能降低转氨酶、炎症因子以及血脂水平，改善脂质过氧化方式，并呈现有量效关系。结果见图3。
(3)青钱柳叶总黄酮对NASH模型小鼠肝脏病理的影响
C57小鼠经16周高脂高胆固醇饲料饲养后，肝脏外观呈现土黄色，相比正常肝脏的鲜红色，差异显著。给予青钱柳叶总黄酮干预的C57 BL/6小鼠肝脏形态和色泽，趋于和正常对照组小鼠肝脏一致，结果见图4A。
H&E结果显示，Control组小鼠肝组织着色均匀，肝细胞索排列规则，肝窦清晰可见，模型组小鼠肝组织小叶结构尚完整，肝板排列尚整齐，肝细胞明显肿胀，有大小泡混合性肝细胞脂肪变性，充满大量大小不一的脂肪空泡，以汇管区周围明显，并见大量肝细胞体积稍大，核大染色较深；小叶内大量点、灶状坏死；可见大量小胆管增生；汇管区扩大，大量淋巴细胞浸润，炎性细胞浸润明显。青钱柳叶总黄酮高、中、低剂量组小鼠肝组织，小叶结构完整，肝板排列整齐，脂肪空泡明显减少，以中央静脉为中心，渐趋好转，索状结构基本存在，汇管区轻度扩大，局部区域仍有炎性反应发生，但浸润情况好转，结果见图4B，肝脏H&E染色病例的每组评分结果见表2。银染、Masson染色结果显示，模型组小鼠肝脏的汇管区纤维化扩大，可见慢性芒状纤维及纤维间隔形成。青钱柳叶总黄酮高、中、低剂量组小鼠肝组织的汇管区纤维化程度减轻，芒状纤维减少，结果见图4C。证明青钱柳叶总黄酮能够通过抑制脂肪在肝脏内堆积，抑制肝细胞纤维化，从而发挥肝脏保护的作用。
表2肝脏H&E染色病例评分
组别 脂肪变性 气球爆破 炎症
Control 0 0 0
Model 2.4±0.52 2.9±0.32 2.7±0.48
MET 1.5±0.53** 2.0±0.47*** 1.7±0.67**
CPF1 2.3±0.48 2.4±0.70 2.4±0.52
CPF2 1.8±0.63* 2.1±0.57** 2.1±0.74*
CPF3 1.7±0.48** 1.8±0.42*** 1.8±0.63**
(4)青钱柳叶总黄酮对NASH模型小鼠脂代谢相关通路的影响
为探讨青钱柳叶总黄酮对肝脏脂质代谢的影响，揭示青钱柳叶总黄酮减轻肝脏脂质沉积的机制，本发明考察了脂质代谢相关基因的表达水平。在NASH模型中，采用RT-PCR检测9种与脂质代谢密切相关的酶。RT-PCR结果显示，与正常小鼠相比，NASH模型的小鼠肝组织中LPL、CYP7A1、CYP27A1、PPARγ、HMGCR、CD36、aP2和FXR的表达均升高，而经青钱柳叶总黄酮治疗后，上述基因表达水平均明显降低，具体结果见图5。推测青钱柳叶总黄酮通过抑制肝脏脂质生成，促进甘油三酯等的代谢来干预NASH的进程。
PPARγ、FXR、LXRα作为肝脏脂质生成的转录因子，HMG-CoA还原酶作为胆固醇合成的限速酶，其mRNA水平显著增加(P＜0.001)，模型组小鼠肝脏组织中与肝脏胆固醇代谢相关的关键脂酶的基因表达水平也显著升高，作为肝脏胆固醇分解代谢和排泄的重要酶，胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)和胆固醇27α羟化酶的mRNA，水平显著升高，甘油三酯水解成脂肪酸的限速酶-脂蛋白脂酶(LPL)mRNA水平也显著升高，而经过青钱柳叶总黄酮干预后，会逆转升高的mRNA水平。
模型组的与脂质和脂蛋白转运相关的脂肪酸转位酶CD36/FAT的基因表达水平明显高于对照组，因此，导致更多的游离脂肪酸和胆甾醇酯(CE)通过CD36/FAT向肝细胞转运，并在肝脏中以脂滴形式积累。
由上述结果可见，青钱柳叶总黄酮通过抑制肝脏脂质生成，促进甘油三酯，抑制肝脏中脂肪积累，促进胆固醇分解代谢和排泄等途径来干预NASH的进程。

Claims (6)

1.一种青钱柳叶总黄酮的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.取青钱柳的干燥叶，进行粉碎，过40-50目筛，得青钱柳粗粉，将青钱柳粗粉置于乙醇水溶液中浸泡0.5～1.5h，再加热回流提取1～3h，共提取3-5次后进行过滤合并，得青钱柳叶提取液；
b.向聚乙二醇和磷酸盐缓冲液中加入步骤a制得的青钱柳叶提取液，组成双水相体系；
c.调节双水相体系的pH值为6.5-7.5，磁力搅拌10min，然后在25℃条件下静置1-2h，青钱柳叶总黄酮富集在上相中，呈现亮黄色，上层为青钱柳叶总黄酮溶液与聚乙二醇的混合物；
d.移取步骤c获得的上层混合物，上D101大孔树脂柱，用超纯水洗脱除去聚乙二醇，再用乙醇水溶液洗脱，得青钱柳叶总黄酮洗脱液；
e.将步骤d所得的青钱柳叶总黄酮洗脱液进一步减压、浓缩、干燥，即得。
2.如权利要求1所述的青钱柳叶总黄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤a中的乙醇水溶液的质量为青钱柳粗粉质量的5-15倍，乙醇水溶液的体积分数为55～95％。
3.如权利要求1所述的青钱柳叶总黄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤b中聚乙二醇的质量浓度范围为15％-25％；所述的磷酸缓冲液的质量浓度范围为15％-20％。
4.如权利要求1所述的青钱柳叶总黄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤c的青钱柳叶总黄酮溶液的浓度为50mg/mL。
5.如权利要求1所述的青钱柳叶总黄酮的制备方法，其特征在于，所述步骤d的D101大孔树脂柱中，上样量与所述D101大孔树脂体积比为1∶15，所述超纯水的体积为所述D101大孔树脂柱体积的20倍，所述乙醇水溶液的体积分数为80％，体积为所述D101大孔树脂柱体积的15倍。
6.根据权利要求1-5任一项所述的青钱柳叶总黄酮的制备方法制得的青钱柳叶总黄酮在制备预防和治疗非酒精性脂肪肝炎的药物或保健品中的应用。
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