CN112424668A - 用于捕捉显微图像的显微镜和方法以及平面反射器的用途 - Google Patents

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CN112424668A CN201980037953.6A CN201980037953A CN112424668A CN 112424668 A CN112424668 A CN 112424668A CN 201980037953 A CN201980037953 A CN 201980037953A CN 112424668 A CN112424668 A CN 112424668A
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Abstract

本发明涉及允许显微样本的透射光亮场或透射光暗场成像或相衬成像的EPI照明。为此目的，使用平坦反射器，该平坦反射器位于观察者侧的对面并引起照明光束的偏转。该平坦反射器具有平面法线和与该平面法线不同的有效垂线，或者该平坦反射器是后向反射器的形式。

Description

用于捕捉显微图像的显微镜和方法以及平面反射器的用途
技术领域
本发明涉及一种用于照亮微观物体的方法、一种显微镜、以及一种片状反射器的用途。
现有技术
从JP 2000019310和JP 2000019309已知菲涅耳棱镜。
从JPH 11344605已知用于照明目的的菲涅耳棱镜。
从WO 2014080910已知具有菲涅耳结构的光调制元件。
从JPH 10288741已知带有棱镜照明束偏转的透射光显微镜。
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/hoffman/hoffmanintro.html中的Abramowitz,M.、Davidson M.W.的“Hoffman ModulationContrast[霍夫曼调制衬度]”已经公开了一种基于霍夫曼调制衬度方法的显微镜。
后向反射器是众所周知的；例如，https://de.wikipedia.org/wiki/Retroreflektor。除了常规的宏观结构的后向反射器，还有以微结构作为反射元件的后向反射器。EP 0200521 A2描述了使用小玻璃珠的后向反射平坦材料，这些玻璃珠嵌入由合成树脂制成的基质中。从US 4957335 A、WO 9822837 A1、WO 03070483 A1和WO 2006085690A1中也已知类似的后向反射器。WO 2006136381 A1、DE 102009060884 A1、DE 29701903 U1和DE 29707066 U1描述了使用微棱镜结构的后向反射平坦材料，微棱镜结构会产生后向反射特性。从US 3689346 A已知后向反射膜。DE 4117911 A1描述了一种后向反射平坦材料，其产生轻微发散的后向反射光。从DE 102005063331 A1和EP 0880716 A1以及WO200223232 A2已知另外的微后向反射器。
AT 508102 A1已经公开了一种用于显微镜的环形照明式照明装置，用于从下方进行暗场照明或用于亮场透射光照明。
US 5285314公开了一种具有多个衍射区的衍射镜。
发明目的
本发明的目的是通过节省空间的落射照明促进样本的透射光记录、亮场记录或暗场记录和/或相衬记录。而且，应该可以扫描多个样本或样本上的多个点。
发明优点
本发明促进显微镜的紧凑照明。照明和观察都可以有利地从下面实施。这允许用于细胞生物学或用作细胞显微镜。本发明还允许以简单的方式用显微镜检查样本中的透明和/或半透明物体。
实现目的
该目的是通过如权利要求书1所述的用途、如权利要求2所述的方法以及如权利要求19或所述的显微镜来实现。
说明书
根据本发明的方法用于记录样本的至少一个显微图像。当意图检查透明和/或半透明物体时，该方法会是特别有利的。这些物体可能存在于液体中，例如水、营养液、油或甲醛中。检查物体可以是例如植物、动物或真核细胞或细胞群、细胞器及其组成部分，例如染色体、病毒、细菌、抗体、花粉、精子、大分子，例如肽、脂质、DNA、RNA、或分子簇。
可以沿z方向引入光轴。可以将x方向和y方向指定为垂直于z，也可以彼此垂直。x、y和z方向可以形成直角坐标系。光轴可以是显微镜物镜的光轴。
在本发明的第一实施例中，提出了以下用于记录显微图像的方法。在该过程中，记录至少一个样本的至少一个区域的图像表示。样本被布置在样本平面上。样本平面可以垂直于光轴，光轴可以被指定为沿z方向。记录是从第一侧实施的。这允许指定观察方向。
此方法包括借助于至少一个光源产生至少一个束。束还可以被称为照明束。有利地，可以设置恰好一个光源。但是，也可以设置多个光源。光源可以发射具有光谱分布的光。举例来说，光可以是红外光、可见光或紫外光。
而且，该方法包括将束引导通过样本平面直至片状反射器。对于片状反射器，可以限定片法线和关于照明束偏离片法线的替代垂线。片法线可以位于光轴方向上，即z方向上。然后，片表面可以位于xy平面上。片可以具有使入射光线围绕替代垂线反射的结构。可以提供恰好一个单独的反射，或者可以提供多个单独的反射。这可能意味着出射光线恰好在一个单独的反射之后或在多个单独的反射之后离开反射器。替代垂线可以被理解为是指入射光线与出射光线之间的角平分线的方向。替代垂线也可以被称为相对于入射光线的有效入射垂线。可以选择入射光束的中心光线作为确定替代垂线的参考光线。替代垂线也可以被理解为归一化出射向量和归一化入射向量的差向量的方向。归一化入射向量或出射向量可以是入射或出射光线的方向向量。例如，如果像后向反射器那样，入射和出射的方向恰好相反，则可以将替代垂线定义为出射向量的方向。在这种情况下，使用术语“替代垂线”来描述本发明的方法或主题可能是多余的。如果后向反射器被用作反射器，则可以省略替代垂线的定义。在优选的实施例中，该方法包括将束引导通过样本平面到达片状反射器，该反射器是后向反射器。
替代垂线可以是固定的，即与入射角无关。为了使束偏转，可以为每条光线在反射表面上提供简单的反射，即恰好一个单独的反射。替代垂线于是可以与相应的光线在反射表面上的入射垂线相同。在这种情况下，替代垂线可以对应于反射表面的表面法线。
但是，替代垂线也可以取决于入射光线的方向。特别地，如果在反射器处的反射包括多个单独的反射，例如两个单独的反射，则可能是这种情况。
而且，该方法包括通过反射器使束偏转。而且，该方法包括用偏转束照亮样本。而且，该方法包括使用图像传感器记录显微图像。显微图像可以是强度衬度图像。有利地，显微图像也可以是但不必是相衬图像。表示相衬图像与强度衬度图像的叠加的显微图像同样会是有利的。
使用至少一个片状反射器来偏转至少一个照明束是有利的。照明束用于照亮至少一个样本。所述用途旨在从第一侧记录样本的至少一个显微图像。使用图像传感器记录图像。片状反射器具有片法线和相对于照明束偏离片法线的替代垂线，并且布置在关于样本与第一侧相反的第二侧上。更准确地说，相对于样本平面可以理解为相反。
样本可以布置在水平样本平面上，例如在xy平面上。可以有利地相对于重力从上方记录显微图像。然后，第一侧可以是样本的上侧。那么，第二侧可以是样本的下侧。即使在落射照明的意义上从同一侧，特别是从第一侧进行照明和图像记录，这也可以使用透射光方法来照亮样本。落射照明应被理解为是指从与观察相同的半空间实施的照明。可以关于样本平面定义此半空间。反射器可以有利地布置在另一个半空间中。
可以相对于重力从下方特别有利地记录显微图像。那么，第一侧可以是样本的下侧。那么，第二侧可以是样本的上侧。
图像可以通过显微镜的物镜被记录。为此，可以将显微镜物镜设置为第一傅里叶透镜。而且，可以存在可以被设置为另外的傅立叶透镜、特别是第二傅立叶透镜的相机镜头。两个傅立叶透镜的布置都可以在传感器上产生样本的图像表示。相机镜头也可以被称为镜筒透镜。但是，不需要一定存在相机镜头。可以设置显微镜物镜本身，以便在图像传感器上对样本进行成像。因此，如果相应地实施显微镜物镜，则也可以在没有相机镜头的情况下实施在图像传感器上成像。束可以有利地被引导穿过显微镜物镜以照亮样本。但是，将照明束引导经过显微镜物镜也是有利的。在后一种情况下，物镜可以做得更小，因为照明束不需要被引导穿过物镜。
照明束可以有利地被引导穿过显微镜物镜，然后通过反射器偏转。
偏转束可以在束方向上以平均仰角β和平均方位角γ照亮样本。束在被偏转之前可以有利地被准直，以便用平行光照亮样本。但是，也可能与平行性有所偏差。然后，可以指定束的平均仰角β和平均方位角γ。
偏转束可以具有中心光线。束的中心光线可以被看作是中心光线。入射束同样可以具有中心光线。此中心光线可以是作为偏转束的中心光线离开反射器的入射束的光线。球面坐标系可以用于指定方位角γ和仰角β，顶点描述可能沿z方向的光轴。可以相对于x方向指定方位角。可以以这样的方式指定x方向，使得具有正x的xz半平面包括偏转光束的中心光线。仰角可以是偏转束的中心光线相对于xy平面的角度。仰角可以被确定为90°减去偏转束的中心光线相对于显微镜物镜的光轴的角度。例如，仰角可以在45°到90°之间，特别有利地在70°到85°之间。仰角可以有利地被选择为小于直角。这可以对应于束在样本上的倾斜入射；这又被称为斜照明。这样，在样本中透明和/或半透明的物体的情况下，可以改善衬度。因此，偏转束的中心光线可以与光轴成角度延伸。
但是，仰角也可以被选择为90°。然后，偏转束的中心光线可以平行于光轴。
如果设置多个束，则这些束可以具有相同的仰角β。这些束可以在方位角方向上均匀分布。举例来说，第一束的方位角可以是0°，而第二束的方位角可以是180°。
光源可以有利地被实施为LED。光源可以布置在光瞳平面(22)上或在与光瞳平面共轭的平面上。光瞳平面可以是光阑所在的平面。光瞳平面可以是显微镜物镜的与样本相对的焦平面。可以忽略LED与光瞳平面的微小偏差。因此，例如可以将LED附接到光阑环上。共轭平面可以被理解为是指通过中继光学单元投射到光瞳平面上的平面。例如，中继光学单元可以被设计为中继透镜或包括两个傅立叶透镜。
光源可以被实施为LED，并且可以具有直接布置在每个光产生表面前面的漫射器。可以设置漫射器以使与方向有关的强度分布均匀化。直接在光产生表面的前面的布置可以引起实施方向均匀化，而不会显着扩大发射表面。
光源的发光表面的直径可以有利地不到显微镜物镜的焦距的30％。光源的发光表面可以是例如圆形、正方形或矩形。举例来说，光源可以是LED芯片或容纳的SMD LED。
光束可以朝第一偏振方向上直线偏振。可替代地，光束可以是非偏振的。
样本可以包括液体样本物质。样本可以位于样本载物台上。关于重力，样本载物台可以在底部，液体样本物质在顶部。这样可以防止样本物质滴落。在这种情况下，从下面照亮和观察样本可能是有利的。为此目的，可以方便地使用透明的样本载物台。在此，第一侧可以是下侧。在这种情况下，反射器可以布置在样本上方。样本可以包括盖，例如盖玻片。
显微镜或显微镜物镜可以具有视场。在预定焦平面的情况下，视场可以是焦平面中可以用图像传感器捕获的区域。焦平面可以是可以在图像传感器上的聚焦成像的平面。焦平面可以垂直于光轴。焦平面可以方便地位于样本中。焦平面可以与样本平面重合。然后，显微镜可以聚焦在样本平面上。以这样的方式设置束路径，使得偏转束完全照亮视场。
束可以与焦平面有交点，然后偏转。交点可以包含视场。然后，可以从两侧照亮样本。这样，可以实现样本的同时入射和透射光照明。使用这种入射和透射光组合照明可以更好地识别样本中的某些图案。
交点同样可以有利地位于视场之外。这可能意味着束在视场外的某个点被引导穿过样本平面。那么，只能使用透射光方法、即从背面照亮样本。背面可以是第二侧。
偏转束也可以与焦平面具有另外的交点，该交点可以被称为由偏转束照亮的样本区。偏转束照亮的样本区可以有利地包含视场。
偏转束可以被设置为平行光线束。为此目的，在反射器处偏转之前，束可以作为平行束存在。但是，使偏转束以会聚或发散的方式指向样本也可能是有利的。当束偏转时，可以保持束的聚散度。设置聚散度和/或漫射器还可以具有如下效果：束的反射对例如样本的倾斜、反射器的不平坦等变得不那么敏感。
反射器可以被实施为菲涅耳棱镜。例如，从JP 2000019310和JP 2000019309已知菲涅耳棱镜。菲涅耳棱镜可以包括具有反射表面法线的多个反射表面。反射表面法线可以相对于片法线倾斜。反射表面法线可以各自是入射光线的入射垂线。入射垂线可以对应于反射器的替代垂线。菲涅耳棱镜处的束偏转可以通过简单的反射来实施。菲涅耳棱镜可以具有周期性结构。在每个周期中可以设置恰好一个反射表面。菲涅耳棱镜的反射表面法线可以平行。
反射器可以一体地被实施为片或膜。膜可以被认为是薄片。反射器可以被实施为载片或载膜上的层。此层或片的表面可以具有台阶结构。反射器可以这样被实施，使得在反射器的不同的反射表面处被偏转的束的多条光线有助于视场的照明。
反射器可以被实施为周期性浮雕结构。周期性结构可以在一个方向上存在，例如在x方向上。但是，也可以使用在两个方向上、例如在x方向和y方向上是周期性的结构。
可能是有利的是在每个周期中有至少两个反射表面。反射器可以通过至少两次连续的单独反射来偏转束的入射光线。有利地，在每个周期中可以设置恰好两个反射表面。在这种情况下，替代垂线可以不同于第一单独反射的入射垂线。同样有利地，可以设置两次以上的反射，例如三次反射。
反射器可以被实施为微棱镜阵列和/或微透镜阵列。
反射器可以被实施为与多个束方向有关的后向反射器。这样的实施例可以具体被实施为猫眼或具有例如三面角反射器的后向反射器。在这种情况下，入射束可以通过三次反射被偏转。
在替代实施例中，反射器可以引起入射束的偏转，该偏转相对于多个束方向偏离后向反射。入射光线与相关联的出射光线之间的角度差可以与特定角度范围内的入射角无关。这可能意味着替代垂线在此角度范围内随入射角而变化。这种反射器可以具有例如具有顶角的V形槽。90°顶角会引起后向反射，而另一个角度(优选地较小)会引起入射束发生偏离后向反射的偏转。由于在V形槽的两侧上有多次单独的反射，因此入射光线和相关联的出射光线之间的角度差可以与特定角度范围内的入射角无关。
入射在样本上的照明束可以在样本中和/或通过在样本背面的折射而被分裂成至少一个第一束和至少一个第二束。举例来讲，在液体样本的情况下，这种分裂可以通过样本内的折射率差、样本内的内部光学界面、弯曲的样本背面和/或新月形结构而引起。第二束可以以与第一束不同的入射角射在反射器上。在这种情况下，将后向反射器用作反射器会是特别有利的。这是因为，通过使用后向反射器，第一束和第二束可以各自反射回自身，从而被反射回到第一束和第二束所源自的样本上的同一点。这样，可以实现样本的特别均匀的照明。自然地，在分裂期间也可以产生多个单独的束。其数量不限于第一束和第二束。第一束和第二束的呈现仅出于说明目的。
当反射器被实施为后向反射器时，相关联的出射光线可以恰好在与入射光线相反的方向上-至少在一定角度范围内被引导。在这种情况下，替代垂线可以是出射光线的方向。在这种情况下，术语“替代垂线”可能是多余的。因此，如果反射器被实施为后向反射器，则可以省略术语“替代垂线”的使用。在另外的实施例中，后向反射器可以以这样的方式被实施，如从DE 4117911已知的那样，其以稍微发散的方式实现光反射。
使用倾斜照明来记录透射光亮场图像和/或透射光暗场图像是特别有利的。
图像的记录可以特别有利地被实施为透射光亮场图像与相衬图像的叠加。图像的记录同样可以有利地被实施为透射光暗场图像与相衬图像的叠加。
在相衬图像的情况下，可以附加地设置至少一个相片。举例来讲，其可以布置在光阑平面上。在这种情况下，通过显微镜物镜的同轴照明可能是有利的。相片可以包括延迟片和中性密度滤波片。相片可以被实施为相环。可以例如通过根据Zernicke的已知方法、根据DE 102012005911的浮雕相衬或根据DE 102007029814的亮度衬度之一使用根据本发明的反射器来记录相衬图像。
也可以记录瓦雷尔(Varel)衬度图像。在后一种情况下，使用瓦雷尔衬度方法，其中使用倾斜亮场照明与相衬的叠加。
也可以用根据US 4062619、US 4200353或US 4200354的霍夫曼调制衬度方法进行记录。在这种情况下，可以优选地在光瞳平面上设置霍夫曼调制器。该调制器可以具有三部分式实施例，存在具有不同的光衰减的三个段。中间段可以相对于光轴居中地或偏心地布置。附加地，可以优选地在与光瞳平面共轭的照明束路径的平面上设置光源光阑。光源光阑可以设计为缝隙光阑。缝隙光阑可以优选地被偏振滤波片部分地覆盖。缝隙可以相对于照明束路径居中地或偏心地布置。附加地，在照明束路径上可以存在另外的偏振滤波片。
但是，在后向反射器的情况下，在入射光线与相关联的出射光线之间会发生束偏移。在具有宏观反射元件的后向反射器的情况下，例如在自行车店的常规反射器(猫眼)，这种束偏移可以达到几毫米。为了保持束偏移尽可能地低，使用微棱镜阵列或封装的微玻璃珠作为后向反射器会是有利的。这样的后向反射器例如可以用作路标的后向反射级RA1、RA2、RA 2/B、RA 2/C和RA3的膜，例如3M Deutschland GmbH公司的根据“技术信息SG103/10.2017”的3MTM工程师级棱镜系列3430膜或微棱镜后向反射片Avery
Figure GDA0002904457530000091
TT7500B。可以被构造为全立方体三元阵列的微立方反射器甚至可以更好地适用于此。作为全立方体反射器的示例，可以使用反射器“3MTM钻石级DG 3反射片”。由三角形反射镜制成的微结构，又称为金字塔形三元组，也可以是合适的。金字塔形三元阵列可以比全立方体阵列更具成本效益。全立方体或金字塔形三元阵列可以例如通过注塑成型工艺生产或压印到塑料基材、玻璃基材或柔性塑料膜中。
照明束可以有利地被引导穿过显微镜物镜到达样本上。这种束引导可能是有利的，特别是在使用后向反射器时。这种束引导可以特别地用于相衬记录。
反射器还会引起光的衍射和干涉。原则上，反射器还可以被实施为反射光栅，优选地被实施为闪耀光栅。但是，这可能具有大面积闪耀光栅目前非常昂贵的缺点。附加地，在光栅中出现的与波长有关的衍射角可能是不利的。因此，最小化衍射效应可能是有利的。举例来讲，反射器的结构宽度可以被选择为如此大以致于反射角至少对应于闪耀光栅的大于十分之一、优选大于三十分之一、特别优选地大于百分之一的衍射级。举例来讲，反射器的周期可以在50微米到5毫米之间，优选在0.1毫米到2毫米之间。然后，由于光源的光谱宽度和/或束在样本位置处的聚散度，可以混合以不同衍射级衍射或被色散分裂的束。因此，当束在反射器处被偏转时，可以避免衍射和色散效应。反射器的周期同样可以有利地在5μm到100μm之间。即使这样的精细结构更难以制造，这也由于束偏移小而可以是有利的。
在另一个实施例中，例如基于反射体积全息图、如从“基于反射体积全息图的适合日光的前投影屏幕[Tageslichttaugliche Aufprojektionsschirme auf Basis vonReflexions-Volumenhologrammen]”von Spiegel,Wolff,Darmstadt(2006),http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000799中已知的前投影屏幕可以用作反射器。
在另外的实施例中，可以使用既具有全息层又具有后向反射层的后向反射器。在US 5656360中描述了这种反射器。
反射器可以有利地被布置成与样本平面相距一定距离，该距离可以沿着光轴、即沿z方向测量并且等于或大于显微镜物镜的焦距的一半，特别有利地大于单个焦距。因此，可以避免由于反射器中的局部缺陷而导致的伪影，这些局部缺陷是例如个别的有缺陷的或被弄脏的微棱镜。此距离可以有利地被选择为小于物镜的焦距的10倍、特别优选地小于5倍。如果距离太大，则棱镜中的角度误差可能另外在例如显微图像中引起伪影。反射器的片法线可以有利地被选择成平行于光轴，即在z方向上。反射器与样本平面之间的距离可以有利地是固定的。可替代地，此距离可以更改，但是这可能更复杂。光源可以用这样的方式有利地被选择，使得其相干长度小于前述距离的两倍。然后可以避免由于透射光照明与反射光照明之间的干涉而引起的伪影。可替代地，可以以这样的方式选择光源，使得其相干长度大于前述距离的两倍。然后，由于透射光照明与反射光照明之间的干涉，样本中的某些物体的衬度可能被增大。
后向反射器可以以这样的方式被实施，使得入射光线与出射光线之间的束偏移最大为小于100μm。由周期小于100μm的微棱镜阵列制成的后向反射器或具有直径小于100μm的微玻璃珠的后向反射器可能适用于此目的。可以有利地选择如下后向反射器：其反向散射光强度的半峰全宽小于5°、特别有利地小于3°、非常特别有利地小于1°。然后可以将入射束尽可能精确地反射回自身。因此，可以在显微图像中获得尽可能高的衬度。反向散射强度的半峰全宽同样可以有利地大于20弧分。于是，可以补偿棱镜角的小角度误差。照明性能级RA3(以前称为“3型”)的后向反射器可能特别有利。在5°的照明角和0.33°的视角下，这种后向反射器的最小反射值可以是或超过300cd/lx/m2。
偏转束可以产生样本的透射光亮场照明或一个透射光暗场照明。
在有利的实施例中，可以记录多个样本和/或一个样本的多个点的多个显微图像。为此目的，可以使用包括图像传感器的显微镜相机。附加地，显微镜相机可以包括相机镜头。在每一种情况下，显微镜相机可以相对于该一个或多个样本从一个图像的记录移动到下一图像的记录。反射器可以相对于该一个或多个样本固定地布置。这可能意味着它不会随相机一起移动。光源可以相对于显微镜相机固定地布置。这可能意味着每种情况下光源都随显微镜相机一起移动。
一种用于在至少一个视场中记录至少一个样本的至少一个透射光亮场图像或透射光暗场图像的显微镜是有利的，所述显微镜包括
·束路径，该束路径包括至少一个照明束路径和至少一个成像束路径，
·至少一个光源，该至少一个光源用于产生至少一个束，
·用于使该束偏转的片状反射器，提供偏转束用于照亮该样本，并且该片状反射器具有片法线和关于照明束偏离该片法线的替代垂线，
·至少一个用于成像束路径的显微镜物镜，
·至少一个图像传感器。
一种用于在至少一个视场中记录至少一个样本的至少一个图像的显微镜会是特别有利的，所述显微镜包括
·束路径，该束路径包括至少一个照明束路径和至少一个成像束路径，
·至少一个光源，该至少一个光源用于产生至少一个照明束，
·用于偏转该照明束的片状反射器，提供偏转的照明束用于照亮该样本，并且该反射器被实施为后向反射器，
·至少一个用于成像束路径的显微镜物镜，
·至少一个图像传感器，
其中，照明束被引导穿过显微镜物镜，然后在反射器处被偏转。因此，这里的显微镜物镜既可以用于照明束路径，又可用于成像束路径。可以同时提供尚未偏转的照明束和偏转的照明束两者，用于照亮样本。
在这种情况下，在落射照明的意义上，光源、显微镜物镜和图像传感器可以布置在样本的一侧，而反射器可以布置在样本的另一侧。在几何上，本发明的这种实施例可以更精确地被描述为光源，显微镜物镜和图像传感器关于样本平面布置在共用半空间中，反射器布置在另一个半空间中。
可以平行于光轴设置照明束路径。这促进具有成本效益的结构。同样可以有利地与光轴成角度地设置照明束路径。这样可以改善记录的衬度。
附加地，显微镜可以包括相机镜头。
有利地，特别是如果一个或多个照明束路径相对于光轴是倾斜的，则除了第一光源之外，还可以存在至少一个第二光源。第二照明束可以通过第二光源产生。第二光源可以独立于第一光源操作。而且，可以设置片状反射器以使第二束偏转。可以提供偏转的第二束以照亮样本。在这里，第二束可以引起与第一照明情况不同的第二照明情况。这种显微镜还可以有利地用于记录上述方法的多个图像。在这种情况下，显微镜可以具有多个、例如两个光源和照明束路径。可以用第一光源照亮第一记录，并且可以用第二光源照亮第二记录。然后可以根据两个图像计算与各个图像相比具有改善的衬度的和图像和/或差异图像。
显微镜可以有利地具有焦平面，该焦平面可以聚焦地成像在图像传感器上。可以在焦平面中设置能够用图像传感器捕捉的视场。照明束可以与焦平面在束路径上具有交点，然后在反射器处偏转。此交点可以包含视场。这样，可以实现样本的入射光照明和透射光照明的组合。如果通过显微镜物镜实施照明，这会是特别有利的。
附图说明
图1示出了第一示例性实施例。
图2示出了第二示例性实施例。
图3示出了第三示例性实施例。
图4示出了第四示例性实施例。
图5示出了第五和第六示例性实施例。
图6示出了第七示例性实施例。
图7在截面平面中示出了照明束路径的第一实施例。
图8在截面平面中示出了照明束路径的第二实施例。
图9示出了光源。
图10示出了第八示例性实施例。
图11示出了第九示例性实施例。
图12示出了第十示例性实施例。
图13示出了在微棱镜阵列的元件处的束偏转。
图14示出了反射器的一部分。
附图标记
1.用于记录至少一个显微图像的设备
2.光轴
3.照明束
a.第一束
b.第二束
c.第三束
4.偏转束
a.第一偏转束
b.第二偏转束
c.第三偏转束
5.偏转束的中心光线
6.来自物体的光线
7.样本
a.第一样本
b.第二样本
c.第三样本
8.样本平面
9.透明和/或半透明物体
10.样本载物台
11.反射器，菲涅尔棱镜
12.片法线
13.反射表面
14.替代垂线
a.第一替代垂线
b.第二替代垂线
c.第三替代垂线
15.反射
a.第一反射
b.第二反射
c.第三反射
16.焦平面
17.光源
a.第一光源
b.第二光源
18.漫射器
19.光源光阑
20.物镜，显微镜物镜
21.光阑，光瞳
22.光瞳平面
23.相机
24.相机镜头
25.图像传感器
26.交点
27.视场
28.偏转束照亮的样本表面
29.周期
30.上升侧面
31.下降侧面
32.顶角
33.扫描仪
34.位移
35.样本背面
36.相片
37.调制器
38.部分透射镜
39.偏振片
40.三面微棱镜
具体实施方式
将参考示例性实施例进一步详细说明本发明。
图1示出了第一示例性实施例。示出了用于记录至少一个显微图像的设备1，该设备又可以被称为显微镜。显微镜物镜的光轴2位于z方向上。具有透明和/或半透明物体9的样本7位于样本载物台10上。显微镜包括具有光轴2的显微镜物镜20。光源17布置在光瞳平面22的稍前方。光瞳平面是xy平面，光阑21(又可以被称为光瞳)位于该平面上。光源的这种布置引起束3略微发散。可替代地，光源可以布置在光瞳平面上，以便产生平行束(未示出)。
平面16是焦平面，在该焦平面中，物体被聚焦地成像在图像传感器25上。焦平面同时是其中布置有样本的样本平面8。
束3被引导穿过样本平面8到达片状反射器11。片状反射器11具有片法线12和关于照明束3偏离片法线的替代垂线14。反射器11被实施为菲涅耳棱镜。菲涅耳棱镜包括具有反射表面法线14的多个反射表面13。反射表面法线相对于片法线12是倾斜的。反射表面法线各自是入射光线的入射垂线。入射垂线对应于反射器的替代垂线。反射器具有在x方向上具有周期29的周期性结构。每个周期29包括一个反射表面。但是，反射表面13之间的陡峭侧面不用于反射。
还示出了反射器11使束3偏转。偏转束4具有中心光线5。用偏转束4照亮样本。
附加地，示出了相机23，该相机包括相机镜头24和图像传感器25。可以用图像传感器25记录样本的一个或多个显微图像。为了阐明成像束路径，在这里示出了来自物体的光线6。
图1所示的照明是亮场透射光照明。在这里，重力方向是z方向。因此，样本从下方被照亮并从下方被观察。
图2示出了第二示例性实施例。在这里，与第一示例性实施例相反，反射器被实施为近似于与束3有关的后向反射器的东西。其特征是入射光线几乎被反射回自己。其他附图标记对应于第一示例性实施例的附图标记。图2所示的照明是反射光与透射光组合暗场照明。
图3示出了第三示例性实施例。与上述示例性实施例相比之下，在这种情况下，照明束3被引导经过物镜20的外部。光源17在这里包括用于产生平行束的专用准直设备(未示出)。在这个示例性实施例的基础上，还示出了束3、即偏转之前的束与焦平面16的交点26，在这种情况下，焦平面也位于样本平面8上。还示出了视场27。在这种情况下，交点26位于视场27的外部。这是透射光暗场照明。反射器以这样的方式被实施，使得在每个周期中存在相对于z方向的上升侧面30和下降侧面31。仅较长的上升侧面用作反射表面13。其他附图标记对应于先前示例性实施例的附图标记。
图4示出了第四示例性实施例。这是透射光亮场照明，照明束3被引导经过物镜20的外部。其他附图标记对应于先前示例性实施例的附图标记。
图5示出了第五和第六示例性实施例。在第五示例性实施例中，设置第一光源17.a以产生第一束3.a。反射器11具有V形槽，在每个周期29中存在相对于z方向上升的侧面30和具有相同长度的下降侧面31。两个侧面均用作反射表面13。所示束3.a的光线在反射表面处通过第一反射15.a被偏转，并在另一个反射表面处通过随后的第二反射15.b被偏转。因此，替代垂线14取决于入射光线的方向。第一替代垂线14.a在这里表示入射束3.a的中心光线的替代垂线。两次单独反射的相互作用形成了第一偏转束4.a，在倾斜的光入射下，用第一偏转束照亮样本。顶角32在这里被选择为小于90°。其他附图标记对应于先前示例性实施例的附图标记。在第六示例性实施例的发展中，设置了三次反射(未示出)以使束偏转。为此目的，反射器可以被实施为微棱镜阵列，例如被实施为全立方体或金字塔形三元微棱镜阵列。
在第六示例性实施例中，附加地设置了第二光源17.b，其可以独立于第一光源17.a操作。在第一光源打开的情况下记录第一图像。然后，关闭第一光源，并打开第二光源。由于替代垂线取决于光的入射方向，因此反射器11现在具有第二替代垂线14.b，并且第二入射束3.b被偏转为第二偏转束4.b并从与第一偏转束4.a不同的方向照亮样本。然后在此照明下记录样本的第二图像。可以根据这两个图像计算差异图像，其中可以改善被观察物体的衬度。
图6示出了第七示例性实施例。在这里记录多个样本7a-c的多个显微图像。为此目的，使用扫描仪单元33，其承载显微镜相机23、物镜20和光源17。该扫描仪单元被布置成在样本下方在xy平面上可移位34。显微镜相机包括图像传感器25和相机镜头24。光源17相对于显微镜相机固定地布置。
从一个图像的记录到下一个图像的记录在每种情况下都设置扫描仪单元33相对于样本7的位移34。反射器11相对于样本固定地布置。
图7在截面平面中示出了照明束路径的第一实施例。在这种情况下，截面平面是焦平面16。在这里示出了入射束与焦平面的交点26，视场27和被偏转束照亮的样本区28。显然，这是入射光和透射光组合照明。在图2的第二示例性实施例中示出了这种照明。
图8在截面平面中示出了照明束路径的第二实施例。在这种情况下，截面平面是焦平面16。此这里示出了入射束与焦平面的交点26位于视场之外，视场27和样本区28被偏转束照亮。显然，这是透射光照明。
图9示出了光源。光源是LED 17。漫射器18和光源光阑19位于发光表面的前面。因此可以在有限的区上实现照明光的均匀定向分布。
图10示出了第八示例性实施例。在这里，反射器11被实施为后向反射器。当样本7被透照时，照明束3被分裂成多个束。这可能是由于样本的折射率差异和/或弯曲的样本背面35的折射率差异引起的。示出了第一束3.a、第二束3.b和第三束3.c。这些从不同的方向入射在后向反射器11上。每个束在后向反射器处逆着入射方向被反射回去；具体地，第一束3.a被反射回成第一偏转束4.a，第二光束3.b被反射回成第二束4.b，并且第三束3.c被反射回成第三偏转束4.c。在这里，可以将替代垂线分配给各个束，这些束的方向对应于相应的出射光线。第一替代垂线14.a对应于第一偏转束4.a，第二替代垂线14.b对应于第二偏转束4.b，并且第三替代垂线14.c对应于第三偏转束4.c。在后向反射器的情况下，通过替代垂线对束路径的描述是多余的，因为通过后向反射器的功能已经清楚地描述了与入射光线相反的偏转光线的方向。束通过多次反射被偏转；通过示例方式给出了第一反射15.a和第二反射15.b。在作为微棱镜阵列的反射器的有利实施例中，设置了三次反射以使每条光线偏转。这可能引起入射光线与出射光线之间的束偏移。最大束偏移越小，则选择的周期29、即后向反射器的结构大小就越小。在这里，在棱镜阵列的情况下棱镜的范围或在嵌入的玻璃珠的情况下玻璃珠的直径可以被认为是结构大小。为了有利地使束偏移最小化，将微棱镜阵列或最小可能的嵌入的玻璃珠用于后向反射器可能是有利的。这是因为偏转束4.a、4.b、4.c分别尽可能地靠近束3.a、3.b和3.c射在样本背面上。然后偏转束可以以与后者相反的方式衍射。这样，可以以与照明3的入射束相同的方式实现平行或发散的透射光照明。该图示出了轴向平行亮场照明，即，照明束3平行于光轴2延伸。在未示出的示例性实施例的发展中，可以设置倾斜的亮场照明。在后者的情况下，照明束3与光轴2成一定角度延伸。在这个示例性实施例中，照明束通过部分透射镜38反射进来。
该图还示出了用于记录霍夫曼调制衬度图像的可选配置。此可选配置包括调制器37。调制器包括光衰减不同的三个段，这些段由不同宽度的虚线指示。通常为观察束路径(未示出)设置此调制器。在这种情况下，照明光也穿过调制器。可选配置还包括缝隙光阑19。所述光阑可以是固定的或可旋转的和/或可移位的。此光阑被偏振片部分覆盖，该偏振片以虚线示出。附加地，可以可选地设置另外的偏振片39，该偏振片作用在所使用的整个照明束上。后者可以是可旋转的。
图11示出了第九示例性实施例。与前述示例性实施例相比之下，在这种情况下设置了倾斜的暗场照明。在此示例中还使用后向反射器11。在此示例性实施例的发展中，设置了第二光源(未示出)，其可以独立于第一光源17操作。然后可以分别在一个光源打开的情况下记录相应的局部图像，并且可以将显微图像创建为两个局部图像的差异图像。
图12示出了第十示例性实施例。在这种情况下，设置了被实施为相环的相片36。示出了从第一点光源17.a发出的第一照明束路径3。附加地，可以指定另外的点光源，例如在所示的截面图像中的第二点光源17.b。在此示例性实施例中，设置了环状照明，该环状照明可以被看作是布置成环形的多个光源。各个光源17.a、17.b可以由单个光源17供给。因此，环状照明可以是相干的，以便实现作为显微图像的相衬记录。在这个示例性实施例中，照明束通过部分透射镜38反射进来。
在此示例性实施例的替代发展中，省略了相片，并且通过倾斜照明来记录样本的一个或多个亮场记录。
图13示出了在微棱镜阵列的元件处的束偏转。每个束分别在微棱镜40的表面之一处通过第一反射15.a、第二反射15.b和第三反射15.c被偏转。
图14示出了反射器的一部分。反射器是后向反射器，其在此示例性实施例中被实施为全立方微棱镜阵列。微棱镜阵列包括许多三面微棱镜40。这样的后向反射器可以用于以上示例性实施例中。

Claims (22)

1.至少一个片状反射器(11)用于使至少一个照明束(3)偏转以照亮至少一个样本(7)从而使用图像传感器从第一侧记录该样本的至少一个显微图像(25)的用途，其中，该片状反射器(11)具有片法线(12)和关于该照明束(3)偏离该片法线的替代垂线(14)，并且该反射器布置在关于该样本与该第一侧相反的第二侧上。
2.一种用于从第一侧记录布置在样本平面(8)上的至少一个样本(7)的至少一个区域的显微图像的方法，该方法包括
·借助于至少一个光源(17)产生至少一个束(3)，
·引导该束(3)穿过该样本平面(8)到达片状反射器(11)，该反射器是后向反射器，
·通过该反射器(11)使该束(3)偏转，
·用偏转束(4)照亮该样本，
·使用图像传感器(25)记录该显微图像。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该样本(7)被布置在水平样本平面(8)上和/或相对于重力从下方记录了该显微图像。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该反射器(11)一体地被实施为片或膜，和/或该反射器(11)被实施为载片或载膜上的层。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，存在焦平面(16)，该焦平面聚焦地成像在该图像传感器(25)上，并且在该焦平面上存在视场(27)，该视场由该图像传感器(25)捕捉，并且该照明束(3)与该焦平面(16)具有交点(26)，然后偏转，并且该交点(26)包含该视场(27)。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该束(3)在位于视场(27)之外的点(18)处被引导穿过该样本平面(8)。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该偏转束(4)实现透射光亮场照明或透射光暗场照明。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该偏转束(4)具有相对于光轴(2)倾斜的中心光线(5)。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该光源(17)是LED。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，记录多个样本(7)和/或一个样本在多个位置的多个显微图像，并且在每种情况下相对于这些样本(7)或该样本将显微镜相机(23)从一个图像的记录移动到下一图像的记录，该显微镜相机包括该图像传感器(25)和该照相机镜头(24)，并且该反射器(11)相对于这些样本或该样本固定地布置，并且该光源(17)相对于该显微镜相机(23)固定地布置。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该反射器(11)被实施为周期性浮雕结构，并且在每个周期(29)中存在至少两个反射表面(13)。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该反射器(11)被实施为微棱镜阵列和/或微透镜阵列。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该反射器(11)被实施为后向反射器，该后向反射器被实施为全立方微棱镜阵列或金字塔形三元微棱镜阵列或包括封装的微玻璃珠。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，入射到该样本上的该照明束(3)在该样本(7)中和/或通过在样本背面(35)处的折射而分裂成至少一个第一束(3.a)和至少一个第二束(3.b)中，该第二束(3.b)以与该第一束(3.a)不同的入射角下射在该反射器(11)上。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该照明束(3)被引导穿过该显微镜物镜(20)到达该样本(7)上。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该反射器(11)通过至少两次相继的单独反射(15.a，15.b)使该束(3)的入射光线(5)偏转。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其特征在于，该显微图像是相衬记录或透射光亮场图像或透射光暗场图像与相衬图像的叠加。
18.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该反射器(11)被实施为菲涅耳棱镜，该菲涅耳棱镜包括具有反射表面法线(14)的若干反射表面(13)，并且这些反射表面法线相对于该片法线(12)是倾斜的。
19.一种用于在至少一个视场(27)中记录至少一个样本(7)的至少一个透射光亮场图像或透射光暗场图像的显微镜(1)，该显微镜包括：
·束路径，该束路径包括至少一个照明束路径(3，4)和至少一个成像束路径(6)，
·至少一个光源(17)，该至少一个光源用于产生至少一个束(3)，
·用于使该束(3)偏转的片状反射器(11)，提供该偏转束(4)用于照亮该样本(7)，并且该片状反射器(11)具有片法线(12)和关于该照明束(3)偏离该片法线的替代垂线(14)，
·至少一个用于该成像束路径的显微镜物镜(20)，
·至少一个图像传感器(25)。
20.一种用于在至少一个视场(27)中记录至少一个样本(7)的至少一个图像的显微镜(1)，该显微镜包括
·束路径，该束路径包括至少一个照明束路径(3，4)和至少一个成像束路径(6)，
·至少一个光源(17)，该至少一个光源用于产生至少一个照明束(3)，
·用于使该照明束(3)偏转的片状反射器(11)，提供该偏转的照明束(4)用于照亮该样本(7)，并且该反射器(11)被实施为后向反射器，
·至少一个用于该成像束路径的显微镜物镜(20)，
·至少一个图像传感器(25)，
其中，该照明束(3)被引导穿过该显微镜物镜(20)，然后在该反射器(11)处被偏转。
21.如权利要求19或20所述的显微镜，其特征在于，除了该第一光源(17.a)之外，还存在至少一个第二光源(17.b)，并且能够使用该第二光源产生第二照明束(3.b)，并且该第二光源能独立于该第一光源操作，并且此外设置该片状反射器(11)用于使该第二束(3.b)偏转，提供该偏转的第二束(4.b)用于照亮该样本(7)。
22.如权利要求19至21所述的显微镜，其特征在于，存在焦平面(16)，该焦平面能够聚焦地成像在该图像传感器(25)上，并且该照明束(3)在该束路径上与该焦平面(16)具有交点(26)，然后在该反射器(11)处偏转，并且该交点(26)包含该视场(27)。
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