CN112402519A - 一种缬草总生物碱提取物及其制备方法 - Google Patents

一种缬草总生物碱提取物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种缬草总生物碱提取物的制备方法，该方法包括将缬草用水和/或含有0.1‑0.5％盐酸的乙醇溶液提取，提取物用有机溶剂萃取，最后将萃取部位进行大孔吸附树脂纯化三个步骤。本发明能从缬草药材中分离纯化得到高浓度的总生物碱提取物，而且所制备的提取物具有很高的药效活性。

Description

一种缬草总生物碱提取物及其制备方法
技术领域
本发明属于制药领域，涉及一种缬草总生物碱提取物及其制备方法。
背景技术
缬草(Valeriana offcinalis L.)为败酱科植物，全世界有广泛分布，多为根及根茎入药。缬草具有解痉、止痛与镇静、安神的功效，对跌打损伤、心神不安、心悸失眠、痛经、经闭、风湿痹痛等症都能起到一定的治疗作用。缬草主要含挥发油、环烯醚萜类、倍半萜类、生物碱类、木脂素类、黄酮类活性成分，是优良的天然药物资源。目前针对缬草化学成分和活性的研究报导不多，主要集中在挥发油、环烯醚萜、倍半萜、木脂素类，而对生物碱的研究少之又少。据个别文献报道，缬草生物碱含量在1-5％之间，主要存在与根茎部，其中有缬草碱A、缬草碱B、缬草胺碱、缬草宁碱、猕猴桃碱等多种成分。缬草总生物碱具有抗菌和抗病毒活性，尤其是对革兰氏阳性细菌和轮状病毒具有较好的体外抑制作用。
目前，针对缬草总生物碱的提取研究尚未见相关文献报导。
发明内容
为了更好地利用缬草生物碱类成分这一宝贵的天然药物资源，申请人使用比较先进和成熟的中药提取纯化技术，并对制备方法和工艺条件进行大量试验摸索，最终得到一种缬草总生物碱提取物的制备方法，使用该方法能够得到含量很高的缬草总生物碱提取物，并且该提取物还具有很高的药效活性。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种缬草总生物碱提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将缬草用水和/或含有0.1-0.5％盐酸的乙醇溶液提取，将乙醇提取液调节pH至7.0-8.0，然后浓缩成稠膏；
(2)将上述稠膏用中等极性的有机溶剂萃取，分离萃取液并浓缩、干燥萃取部位；
(3)将上述萃取部位进行大孔吸附树脂纯化，上柱浓度为3-15mg/mL；上柱量为1-5BV；洗脱剂为50-90％乙醇；洗脱剂流速为0.5-2BV/h，药液上柱后先用水洗脱，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得缬草总生物碱提取物。
优选地，步骤(1)中，将缬草先用水煎煮提取，再用含有0.1-0.5％盐酸的乙醇溶液回流提取，将乙醇提取液调节pH至7.0-8.0，然后与水提取液一起浓缩成稠膏。
优选地，所述乙醇溶液的浓度是60％。
优选地，所述乙醇溶液中含有0.3％的盐酸。
其中，步骤(2)中，所述中等极性的有机溶剂指的是乙酸乙酯、丙酮、正丁醇，优选乙酸乙酯。
其中，步骤(3)中，所述大孔吸附树脂的类型为XAD-2、AB-8或HP-10，优选XAD-2。
优选地，步骤(3)中，所述上柱浓度为5mg/mL。
优选地，步骤(3)中，所述上柱量为3BV。
优选地，步骤(3)中，所述洗脱剂为70％乙醇。
优选地，步骤(3)中，所述洗脱剂流速为1.5BV/h。
根据本发明的具体实施例，得到其中一种效果最佳的制备方法，其步骤如下：
(1)将缬草先用10倍重量水煎煮提取1.5小时，过滤，将水提取液浓缩成稠膏，药渣再用10倍重量60％乙醇(含0.3％盐酸)回流提取1.5小时，过滤，将乙醇提取液加氢氧化钠调节pH至7.5后浓缩至无醇味，然后加入到上述稠膏中，继续浓缩成稠膏；
(2)将上述稠膏用乙酸乙酯萃取，分离萃取液并浓缩、干燥萃取部位；
(3)将上述萃取部位进行大孔吸附树脂纯化，选择树脂类型为XAD-2，上柱浓度为5mg/mL；上柱量为3BV；洗脱剂为70％乙醇；洗脱剂流速为1.5BV/h，药液上柱后先用水洗脱，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得缬草总生物碱提取物。
本发明中所涉及的百分比浓度均为体积浓度，如0.3％盐酸指的是每100ml乙醇溶液中含有0.3ml的盐酸；60％乙醇指的是每100ml乙醇水溶液中含有60ml的乙醇。
使用以上方法所制备得到的缬草总生物碱提取物，该提取物也在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果是：
(1)本发明能从缬草药材中分离纯化得到高浓度的总生物碱提取物，总生物碱含量最高可达25％左右，同时还能保证较高的产物收率。
(2)本发明所制备的缬草总生物碱提取物具有很高的药效活性，尤其是在抑制马拉色菌方面的药效活性很高，在治疗花斑癣、毛囊炎、脂溢性皮炎等与马拉色菌相关疾病方面具有很好的应用前景。
更为具体的技术方案详见具体实施方式。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。需要强调的是，所述的具体实施例仅用以解释本发明而不是用于对保护范围进行限定，在以下实施例基础上所作出的任何改进或等同替换都在本发明的保护范围内。此外，本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
以下实施例中总生物碱的含量测定使用的是本领域所熟知的紫外分光光度法，用盐酸小檗碱标准品制备标准曲线，检测波长410nm。
以下实施例中的抑菌试验使用本领域所熟知的牛津杯抑菌圈法：将糠秕马拉色菌活化培养并用液体培养基配制成浓度为106cfu/ml的菌悬液，吸取0.5ml菌悬液于灭菌后的营养琼脂培养基中，放置牛津杯；将各待测物用水稀释到相同的浓度(0.01g/ml)，然后注入牛津杯，注入体积为0.2ml，37℃静置培养24h后测量抑菌圈直径，蒸馏水为空白对照，计算抑菌率。
实施例1提取工艺研究
(1)取缬草，用10倍重量水煎煮提取2次，每次1.5小时，合并二次提取液，浓缩，干燥。
(2)取缬草，用10倍重量40％乙醇(含0.3％盐酸)回流提取2次，每次1.5小时，合并二次提取液，加氢氧化钠调节pH至7.5，浓缩，干燥。
(3)取缬草，用10倍重量60％乙醇(含0.3％盐酸)回流提取2次，每次1.5小时，合并二次提取液，加氢氧化钠调节pH至7.5，浓缩，干燥。
(4)取缬草，用10倍重量80％乙醇(含0.3％盐酸)回流提取2次，每次1.5小时，合并二次提取液，加氢氧化钠调节pH至7.5，浓缩，干燥。
检测干膏中的总生物碱含量，并根据干膏和药材重量计算提取物收率，结果见表1。
从表1中可以看出，采用水煎煮提取时，提取物收率很高但总生物碱含量偏低；采用乙醇回流提取时，总生物碱含量很高但提取物收率偏低。同时还能看出，从含量和收率综合评价，60％乙醇的提取效果要优于40％和80％乙醇。
为了在提高总生物碱含量的同时尽可能增加产量，我们使用了水煎+乙醇回流联合提取的方式，具体方法如下：
取缬草，先用10倍重量水煎煮提取1.5小时，过滤，将提取液浓缩成稠膏，药渣再用10倍重量60％乙醇(含0.3％盐酸)回流提取1.5小时，过滤，将提取液加氢氧化钠调节pH至7.5后浓缩至无醇味，然后加入到上述稠膏中，继续浓缩，干燥。从表1的数据中可以看出，联合提取后总生物碱含量和提取物收率都处于较高水平，综合效果要明显优于单一提取方式。
表1不同提取方式的提取物收率和总生物碱含量比较
总生物碱含量(％) 提取物收率(％)
水煎煮提取 1.78 21.7
40％乙醇(0.3％盐酸)提取 3.14 16.5
60％乙醇(0.3％盐酸)提取 4.55 13.6
80％乙醇(0.3％盐酸)提取 4.71 9.7
水煎+乙醇提取 4.33 19.9
实施例2萃取工艺研究
取缬草，先用10倍重量水煎煮提取1.5小时，过滤，将提取液浓缩成稠膏，药渣再用10倍重量60％乙醇(含0.3％盐酸)回流提取1.5小时，过滤，将提取液加氢氧化钠调节pH至7.5后浓缩至无醇味，然后加入到上述稠膏中混合。
向混合后的稠膏中分别加入石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇进行萃取，萃取后分别得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇萃取部位，回收有机溶剂并浓缩、干燥，检测干膏中的总生物碱含量并测定对马拉色菌的抑制率，结果见表2。
表2不同萃取部位的总生物碱含量和马拉色菌抑制率比较
总生物碱含量(％) 马拉色菌抑制率(％)
石油醚 0.79 8.4
氯仿 2.54 12.0
乙酸乙酯 5.34 56.6
丙酮 6.67 34.9
正丁醇 6.28 21.7
乙酸乙酯、丙酮、正丁醇萃取后的产物中总生物碱含量相较表1中的萃取前均有所升高，而石油醚和氯仿萃取出的总生物碱很少，可能是由于二者的极性太小所致，随着极性增加，萃取出的总生物碱也随之增加，但极性过大时也会导致总生物碱含量降低。在抑菌效果方面，乙酸乙酯部位对马拉色菌的抑制率明显高于其它部位，其抑制率达到了56.6％，而石油醚、氯仿、正丁醇等部位的抑制率较低，有的几乎没有抑制活性。该结果表明，缬草总生物碱的乙酸乙酯部位是抑制马拉色菌的活性部位。
实施例3纯化工艺研究
为进一步提高提取物的药效活性，采用大孔树脂纯化方法对上述产物中的总生物碱进行纯化，具体如下：
3.1树脂种类的筛选
树脂种类：D101、D201、AB-8、HP-10、XAD-2、ADS-8、HPD-100。
树脂预处理：将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用清水冲洗至无醇味。
树脂再生：先将树脂用5％盐酸浸泡1-3小时并用纯水洗淋至中性，然后用4％氢氧化钠浸泡1-3小时，用纯水洗淋至中性。
(1)取10g乙酸乙酯部位粗提取物，加水溶解，配制成浓度为10mg/mL的粗提取液。
(2)分别称取以上7种大孔树脂各2g，加入到100mL锥形瓶中，再加入50mL粗提取液，27℃、150r/min恒温振荡吸附12h，吸附结束后，取1mL上清液检测总生物碱含量并计算吸附率。
吸附率＝[(C0-C1)/C0]×100％，C0为粗提取液中的总生物碱含量，C1为上清液中的总生物碱含量。
(3)将所用树脂过滤，用蒸馏水洗去表面残余物质并吸干表面水分，然后加入到100mL锥形瓶中，加入50mL 70％乙醇，27℃、150r/min恒温振荡解吸附12h，解吸附结束后，取1mL解吸液检测总生物碱含量并计算解吸率。
解吸附＝[C2V2/(C0-C1)V1]×100％，C2为解吸液中的总生物碱含量，V2为解吸液体积，V1为粗提取液体积。
(4)结果分析：见表3。
表3不同种类树脂的吸附率和解吸率
吸附率 解吸率
D101 75.6 64.3
D201 70.9 75.7
AB-8 81.0 73.3
HP-10 69.5 88.5
XAD-2 79.3 85.5
ADS-8 56.6 69.8
HPD-100 65.4 72.1
根据以上结果，XAD-2型大孔树脂对缬草总生物碱具有更好的吸附率和解吸率，AB-8和HP-10也有不错的效果，以下试验选择XAD-2型大孔树脂对纯化工艺做进一步研究。
3.2纯化工艺优化
预试验中发现，粗提取液的浓度和上柱量、洗脱剂浓度和流速对纯化效果有较大影响，因此使用正交试验对以上工艺参数进行优化，各因素水平见表4。
表4大孔树脂纯化正交试验因素水平表
Figure BDA0002835399160000061
按L9(34)正交表进行试验，具体方法是，将同一批乙酸乙酯部位粗提取物平均分为9份，按表5中的条件安排试验，药液上柱后先用水洗脱至无色，然后再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，检测干膏中的总生物碱含量，结果见表5。
表5大孔树脂纯化正交试验表
Figure BDA0002835399160000062
Figure BDA0002835399160000071
对正交试验结果进行方差分析，结果见表6。
表6以总生物碱含量为指标的方差分析表
方差来源 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性
A 1.696 2 1.000 19.000
B 15.136 2 8.925 19.000
C 37.376 2 22.038 19.000 *
D 8.136 2 4.797 19.000
误差 1.70 2
注：F0.05(2，2)＝19.0，F0.01(2，2)＝99.0
从正交试验结果可以看出，四个因素对总生物碱含量的影响程度是C>B>D>A，依次为洗脱剂浓度、上柱量、洗脱剂流速、药液浓度，其中因素C即洗脱剂浓度对结果具有显著性影响(P<0.05)，从试验结果来看，应选择A1B2C2D3，即药液浓度为5mg/mL；上柱量为3BV；洗脱剂浓度为70％乙醇；洗脱剂流速为1.5BV/h。
使用上述优选的参数条件对乙酸乙酯部位粗提取物进行了三次验证，具体方法如下：取实施例2得到的乙酸乙酯萃取部位，加水溶解后配制成浓度为5mg/mL的药液，然后上XAD-2型大孔吸附树脂，上柱量为3倍柱体积，上柱后先用水洗脱，再用70％乙醇洗脱，洗脱流速为1.5倍柱体积/h，洗脱至流出液中无生物碱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得。
表7工艺验证试验结果
Figure BDA0002835399160000081
经大孔树脂纯化后，总生物碱含量达到24.5％，较纯化前的5.34％提高了3.6倍，该提取物对马拉色菌的抑制率可达77.1％，较纯化前的56.6％提高了36.2％。
实施例4
(1)将缬草先用6倍重量水煎煮提取1小时，过滤，将水提取液浓缩成稠膏，药渣再用12倍重量60％乙醇(含0.1％盐酸)回流提取2小时，过滤，将乙醇提取液加氢氧化钠调节pH至7.0后浓缩至无醇味，然后加入到上述稠膏中，继续浓缩成稠膏；
(2)将上述稠膏用乙酸乙酯萃取，分离萃取液并浓缩、干燥萃取部位；
(3)将上述萃取部位进行大孔吸附树脂纯化，选择树脂类型为XAD-2，上柱浓度为5mg/mL；上柱量为3BV；洗脱剂为70％乙醇；洗脱剂流速为1.5BV/h，药液上柱后先用水洗脱，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得缬草总生物碱提取物，总生物碱含量22.7％。
实施例5
(1)将缬草先用15倍重量水煎煮提取3小时，过滤，将水提取液浓缩成稠膏，药渣再用8倍重量60％乙醇(含0.5％盐酸)回流提取1小时，过滤，将乙醇提取液加氢氧化钠调节pH至8.0后浓缩至无醇味，然后加入到上述稠膏中，继续浓缩成稠膏；
(2)将上述稠膏用乙酸乙酯萃取，分离萃取液并浓缩、干燥萃取部位；
(3)将上述萃取部位进行大孔吸附树脂纯化，选择树脂类型为XAD-2，上柱浓度为5mg/mL；上柱量为3BV；洗脱剂为70％乙醇；洗脱剂流速为1.5BV/h，药液上柱后先用水洗脱，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得缬草总生物碱提取物，总生物碱含量23.3％。

Claims (10)

1.一种缬草总生物碱提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将缬草用水和/或含有0.1-0.5％盐酸的乙醇溶液提取，将乙醇提取液调节pH至7.0-8.0，然后浓缩成稠膏；
(2)将上述稠膏用中等极性的有机溶剂萃取，分离萃取液并浓缩、干燥萃取部位；
(3)将上述萃取部位进行大孔吸附树脂纯化，上柱浓度为3-15mg/mL；上柱量为1-5BV；洗脱剂为50-90％乙醇；洗脱剂流速为0.5-2BV/h，药液上柱后先用水洗脱，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩，干燥，即得缬草总生物碱提取物。
2.如权利要求1所述缬草总生物碱提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，将缬草先用水煎煮提取，再用含有0.1-0.5％盐酸的乙醇溶液回流提取，将乙醇提取液调节pH至7.0-8.0，然后与水提取液一起浓缩成稠膏。
3.如权利要求1所述缬草总生物碱提取物的制备方法，其特征在于：所述乙醇溶液的浓度是60％。
4.如权利要求1所述缬草总生物碱提取物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述中等极性的有机溶剂指的是乙酸乙酯、丙酮、正丁醇，优选乙酸乙酯。
5.如权利要求1所述缬草总生物碱提取物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述大孔吸附树脂的类型为XAD-2、AB-8或HP-10，优选XAD-2。
6.如权利要求1所述缬草总生物碱提取物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述上柱浓度为5mg/mL。
7.如权利要求1所述缬草总生物碱提取物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述上柱量为3BV。
8.如权利要求1所述缬草总生物碱提取物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述洗脱剂为70％乙醇。
9.如权利要求1所述缬草总生物碱提取物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述洗脱剂流速为1.5BV/h。
10.一种缬草总生物碱提取物，其特征在于：该提取物是按权利要求1-9任何一项所述的方法制备。
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