CN112359012A

CN112359012A - 诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法及其应用

Info

Publication number: CN112359012A
Application number: CN202011138257.5A
Authority: CN
Inventors: 孙玉华; 程麟茜; 董念国
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS; Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS; Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2021-02-12
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: CN112359012B

Abstract

本发明公开了一种诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法及其应用，该方法首先将多能干细胞平铺种植在基质胶包被的培养皿中用Essencial 8培养使其贴壁；将多能干细胞细胞置于含有Wnt3a和骨形态发生蛋白4的分化培养基Essencial 6中培养，再置于含有表皮生长因子和骨形态发生蛋白4分化培养基Essencial 6中培养，将心脏中胚层细胞消化，再将上述培养皿中心脏中胚层细胞置于含有骨形态发生蛋白4、转化生长因子和内皮生长因子的分化培养基Essencial 6中连续培养；得到心脏瓣膜内皮细胞；本发明的方法分化效率高，在不经过流式分选的情况下，能够得到80％以上的瓣膜内皮细胞，因而可以保证充足的种子细胞来源。

Description

诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法及其应用

技术领域

本发明涉及干细胞分化领域，具体涉及一种诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法及其应用。

背景技术

在心脏搏动期间，血流从低压力的心房流到高压力的心室,并最终供应到全身的主要动脉。心脏瓣膜在其中起到单向阀门的作用，维持血液的单向流动。当心脏收缩时，连结左心房和左心室的二尖瓣和连结右心房和右心室的三尖瓣可防止血液从心室回流到心房；当心脏舒张时，连结左心室和主动脉的主动脉瓣、连结右心室和肺动脉的肺动脉瓣可防止血液从动脉向心室的逆流。从而保证心跳的正常进行。

当阀门无法正常打开(狭窄)或未完全关闭(回流)时，就会发生阀门故障，造成心脏瓣膜疾病，如：瓣膜狭窄，瓣膜关闭不全等。根据报导，狭窄的瓣膜会影响瓣膜周边力学环境，产生涡流，使血液无法正常流动，血细胞在此不均匀附着，易产生血栓，同时破坏了瓣膜的表面结构；而瓣膜关闭不全，会导致血液大量高速的反流，冲击和破坏瓣叶，从而加剧瓣膜疾病(施德昆，2014)。

心脏瓣膜疾病是全球疾病和死亡的重要原因。根据2010年美国心血管协会发布的数据，每年由于瓣膜疾病引起的死亡人数大约为 20000，美国主动脉瓣疾病的患病率达到了2.5％，在美国每年大约有82000例瓣膜置换手术(Association.，2004)。目前我国尚缺少系统的心脏瓣膜疾病流行性分析的数据，但根据聂静雨等人的调查报告，在我国35岁以上的人群随机抽样中(共28909人)，18.3％患有二尖瓣返流，0.3％患有二尖瓣狭窄，16.4％患有主动脉返流，1.4％患有主动脉狭窄(聂静雨，2017)。目前在国内心脏病患者中心脏瓣膜病患者约占30％，每年有大量的患者要进行心脏瓣膜置换手术(崔永春et al.，2016)。

常用于手术的人工瓣膜主要是机械瓣和生物瓣，但目前没有任何瓣膜替代物具有重塑，再生和生长天然结构的潜力(MacGrogan D et al.，2014)。机械瓣耐久性强，但其具有以下缺陷：

(1)组织相容性与抗感染能力均不理想，较易造成血细胞破坏，甚至血栓栓塞等；

(2)术后需长期抗凝治疗，而长期应用抗凝剂又容易造成出血并发症；生物瓣置换术后不需抗凝治疗并且血流动力学比机械瓣要好，相对不容易形成血栓，但同样存在缺陷：

(1)生物瓣容易衰败，寿命短；

(2)容易发生钙化，因而生物瓣膜常因毁损面临再次手术(傅杰et al.，2011)。

理想的解决方案是用细胞包裹组织工程材料，使之既具备生物瓣的优点，同时具备重塑，生长等潜力，从而解决其易衰败，寿命短等问题。目前市面上已经有多种支架材料用于瓣膜置换手术，但没有可用的种子细胞进行移植，使组织工程瓣的发展受到掣肘。

造成种子细胞缺乏的原因很多，第一是因为心脏瓣膜细胞较难分离，且难以在体外长期培养，因而细胞数目极为有限，难以达到种子细胞种植的数目要求。第二是因为之前对人心脏瓣膜的研究比较少，因而很难得到心脏瓣膜内皮细胞的类似物。

由于干细胞具有分化成为任意细胞的潜能，使得模拟体内心脏瓣膜发育过程，用干细胞分化得到与心脏瓣膜细胞高度相似的细胞成为可能。加上近两年发表的关于人类早期胚胎心脏的单细胞测序等文章 (Yueli Cui，2019)，使得我们对早期心脏瓣膜细胞有更多的了解，使得诱导干细胞分化得到心脏瓣膜细胞类似物成为可能。

之前很多的尝试都旨在获得内皮细胞，但都存在不同的缺陷：

(1)分化效率低下，得到的真正的内皮细胞数目很少；

(2)之前的研究大多旨在得到血管内皮细胞，这样的细胞由于存在组织差异，很难用于种植组织工程心脏瓣膜；

(3)人的心脏瓣膜心脏主动脉瓣瓣膜内部包含致密的细胞外基质，在不同层的细胞外基质中都有瓣膜间充质细胞(VIC)存在，在整个瓣膜的最外侧被瓣膜内皮细胞(VEC)所覆盖。单纯的分化得到内皮细胞，不能满足心脏瓣膜种子细胞的要求；

(4)真实的瓣膜间充质细胞来源于瓣膜内皮细胞发生内皮间充质转化，而这些内皮细胞未经历内皮-间充质转化试验，难以保证其具备该功能；

(5)瓣膜间充质细胞会分泌细胞外基质，组织工程心脏瓣膜上种植的内皮细胞应该一部分维持其内皮性质，另一部分转化为间充质细胞，并分泌细胞外基质，起到加强和稳定组织工程瓣的作用，目前分化得到的内皮细胞都未能做到这一点。

Tui Neri等人开发了一种方法，能够得到瓣膜细胞，但仍存在缺陷：

(1)该方法过程十分繁琐，需要对每一步得到的细胞进行流式分选，在得到中胚层细胞后，需要对MESP1阳性细胞进行分选，诱导后的细胞还需要用CD31磁珠分选；

(2)中胚层分选后的细胞需要铺在纤连蛋白包被的平板中的小鼠胚胎成纤维细胞上，然后再进行诱导，操作很复杂，且耗时较长；

(3)得到的瓣膜细胞并不是纯的瓣膜内皮细胞或者瓣膜间充质细胞，而是二者及其它细胞的混合物，必须先分选后才能进行种植等后续工作。说明分化效率并不高，同时会造成工作量的增多。在流式分选过程中还会损耗大量的细胞。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，通过研究早期心脏发育以及近期的人早期心脏瓣膜数据，开发了一种诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法，通过比对人的心脏瓣膜细胞，得到了接近于人心脏瓣膜内皮细胞的种子细胞。可用于进一步制备组织工程心脏瓣膜，也可用于心脏瓣膜疾病模型研究。

为实现上述目的，本发明所设计一种诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法，包括以下步骤：

1)将多能干细胞平铺种植在基质胶包被的培养皿中，用 Essencial 8培养使其贴壁；其中，多能干细胞平铺密度为2～4万个 /cm²；

2)将多能干细胞细胞置于含有Wnt3a和骨形态发生蛋白4 (BMP4)的分化培养基Essencial 6(Gibco公司)中培养0.5～2天，再置于含有表皮生长因子(bFGF)和骨形态发生蛋白4(BMP4) 分化培养基Essencial 6(Gibco公司)中培养1～3天，得到心脏中胚层细胞(LPM)；其中，含有Wnt3a和BMP4的分化培养基Essencial 6中，Wnt3a终浓度为20～30ng/mL和BMP4浓度为10ng/mL；含有表皮生长因子(bFGF)和骨形态发生蛋白4(BMP4)分化培养基Essencial 6(Gibco)中，表皮生长因子浓度为20～25ng/mL和骨形态发生蛋白4浓度为50ng/mL；

3)将心脏中胚层细胞(LPM)消化，再将消化后的心脏中胚层细胞(LPM)平铺种植在基质胶(geltrex或matrigel)包被的培养皿中，使其贴壁；其中，消化后的心脏中胚层细胞(LPM)平铺密度为1～3万个/cm²；

4)再将上述培养皿中心脏中胚层细胞(LPM)置于含有骨形态发生蛋白4(BMP4)、转化生长因子(TGFβ1)和内皮生长因子 (VEGF)的分化培养基Essencial 6(Gibco公司)中连续培养4～8 天；得到心脏瓣膜内皮细胞；其中，含有骨形态发生蛋白4(BMP4)、转化生长因子(TGFβ1)和内皮生长因子(VEGF)的分化培养基 Essencial 6中，骨形态发生蛋白4终浓度为5～15ng/mL，转化生长因子终浓度为5～15ng/mL，内皮生长因子浓度为90～120ng/mL。

进一步地，所述步骤1)中，基质胶为geltrex基质胶或matrigel 基质胶；多能干细胞平铺密度为3万个/cm²

再进一步地，所述步骤2)中，含有Wnt3a和BMP4的分化培养基Essencial 6中，Wnt3a终浓度为25ng/mL和BMP4浓度为 10ng/mL；培养时间为1天。

再进一步地，所述步骤2)中，含有表皮生长因子(bFGF)和骨形态发生蛋白4(BMP4)分化培养基Essencial 6(Gibco)中，表皮生长因子浓度为20ng/mL和骨形态发生蛋白4浓度为 50ng/mL，培养时间2天。

再进一步地，所述步骤3)中，基质胶为geltrex基质胶或matrigel 基质胶；心脏中胚层细胞(LPM)平铺密度为3万个/cm²。

再进一步地，所述步骤4)中，含有骨形态发生蛋白4(BMP4)、转化生长因子(TGFβ1)和内皮生长因子(VEGF)的分化培养基 Essencial 6中，骨形态发生蛋白4终浓度为10ng/mL，转化生长因子终浓度为10ng/mL，内皮生长因子浓度为100ng/mL，培养时间为6天。

本发明还提供了一种上述方法制备的心脏瓣膜内皮细胞在制备心脏瓣膜细胞中的应用。

作为优选方案，所述应用的方法，包括以下步骤：

将心脏瓣膜内皮细胞置于含有表皮生长因子(bFGF)和转化生长因子TGFβ1的Essential 6培养基培养，培养过程中部分心脏瓣膜内皮细胞会发生内皮间充质转化，转化为瓣膜间充质细胞，呈现纤维状的形态；培养3天后，得到心脏瓣膜细胞，其中，

所述心脏瓣膜细胞由瓣膜间充质细胞和心脏瓣膜内皮细胞组成；含有表皮生长因子(bFGF)和转化生长因子TGFβ1的Essential 6培养基，表皮生长因子(bFGF)终浓度为10ng/mL和转化生长因子TGFβ1终浓度为10ng/mL。

本发明还提供了一种上述方法制备得到心脏瓣膜内皮细胞在制作人工心脏瓣膜中的应用。

本发明还提供了一种上述方法制备得到心脏瓣膜细胞在制作人工心脏瓣膜中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明不需要额外准备滋养层细胞，也不需要经历分选过程。分化操作简单，耗时短；

(2)本发明的方法分化效率高，在不经过流式分选的情况下，能够得到90％以上的瓣膜内皮细胞，因而可以保证充足的种子细胞来源；

(3)本发明的方法分化得到的内皮细胞除了具有内皮细胞的基本功能外，还具有转化为瓣膜间充质细胞的功能。转化得到的瓣膜间充质细胞能够分泌细胞外基质，因此，本发明得到的有功能的瓣膜内皮细胞，保证了其作为种子细胞可行性；

(4)本发明针对目前缺乏胚胎心脏瓣膜研究报道，而本发明拿到了早期胚胎心脏瓣膜和成年心脏瓣膜单细胞测序数据，更了解心脏瓣膜特性。本发明能够得到对应于心脏瓣膜发育较早期的细胞和较晚期的细胞；

(5)本发明能够成功种植到去细胞支架材料上，生长和增殖。为下一步研究组织工程瓣提供可能。

附图说明

图1为不同的因子处理对多能干细胞向原条期细胞分化的影响效果图；其中，横坐标表示处理时间，单位为天；纵坐标表示相对于多能干细胞，各个时间点的细胞的BRACHYURY基因的相对表达量；

图2A为通过诱导多能干细胞向心脏中胚层细胞分化时间折线图；

其中，横坐标表示处理时间，单位为天；图2A和图2B纵坐标分别表示相对于多能干细胞，各个时间点的细胞的KDR,ISL1基因的相对表达量图；

图3为通过免疫印迹检测心脏中胚层蛋白ISL1表达的图，

图4为通过流式分析检测心脏中胚层蛋白KDR阳性率的图；

图5为不同的因子处理对心脏中胚层细胞向心脏瓣膜内皮细胞分化的影响效果图；

其中，横坐标为内皮细胞的标志基因；纵坐标表示相对于心脏中胚层细胞，基因的相对表达量；

图6为分离的人心脏瓣膜内皮细胞与本发明诱导H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞形态对比图；

图7为通过免疫印迹检测内皮细胞蛋白VE-Cad和CD31表达的图；

图8为通过流式分选，检测内皮标志物VE-Cad的双阳性率的图；

图9为通过流式分选，检测VE-Cad和心脏瓣膜内皮标志物 NFATc1的双阳性率的图。

图10为实时荧光定量PCR检测H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞， VEC，以及HAEC，HUVEC的心脏瓣膜内皮标志物CDH11，DKK2， TGFB2，GJA4表达情况的图；

图11为对H9和H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞低密度脂蛋白摄取的荧光染色图；

图12为H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞在体外形成血管结构的图像；

图13为实时荧光定量PCR检测H9衍生的间充质细胞H9-VIC 和正常的人心脏瓣膜间充质细胞VIC(F.M)的间充质基因VIMENTIN(左)，α-SMA(中)，FSP1(右)表达情况的图；

图14为流式分析检测H9衍生的间充质细胞的FSA阳性率的图；

图15为实时荧光定量PCR检测细胞外基质基因COL1A1(左)， COL3A1(右)表达情况的图；

图16为免疫荧光检测H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞在去细胞瓣膜上的增值情况的图；左边为免疫荧光染色图，右边为EdU阳性核的数量；

图17为H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞种植到去细胞瓣膜后的免疫组织化学(IHC)染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

本发明的诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法，包括以下步骤：

1)将多能干细胞平铺种植在基质胶包被的培养皿中使其贴壁；其中，多能干细胞平铺密度为2～4万个/cm²；

2)将多能干细胞细胞置于含有Wnt3a和骨形态发生蛋白4的分化培养基Essencial6中培养一天，再置于含有表皮生长因子和骨形态发生蛋白4分化培养基Essencial 6中培养2天，得到心脏中胚层细胞；其中，含有Wnt3a和BMP4的分化培养基Essencial 6中， Wnt3a终浓度为20～30ng/mL和BMP4浓度为10ng/mL；含有表皮生长因子和骨形态发生蛋白4分化培养基Essencial 6中，表皮生长因子浓度为20～25ng/mL和骨形态发生蛋白4浓度为50ng/mL；

3)将心脏中胚层细胞消化，再将消化后的心脏中胚层细胞平铺种植在基质胶包被的培养皿中，使其贴壁；其中，消化后的心脏中胚层细胞平铺密度为1～3万个/cm²；

4)再将上述培养皿中心脏中胚层细胞置于含有骨形态发生蛋白4、转化生长因子和内皮生长因子的分化培养基Essencial 6中连续培养6天；得到心脏瓣膜内皮细胞；其中，含有骨形态发生蛋白 4、转化生长因子和内皮生长因子的分化培养基Essencial 6中，骨形态发生蛋白4终浓度为5～15ng/mL，转化生长因子终浓度为5～15ng/mL，内皮生长因子浓度为90～120ng/mL。

本发明的参数选择的理论基础：

1.诱导多能干细胞向原条期细胞分化的方法及时间

1.1材料

①基质胶包被的培养皿制备：matrigel或geltrex包被的培养皿可由公知的方法制备，按照matrigel或者geltrex产品说明书中所述方法制备，其中，matrigel购自美国Corning公司，geltrex购自美国赛默飞世尔科技公司；

②培养皿购自美国Corning公司，高糖DMEM-F12购于BI公司；

③分化所需因子wnt3a，骨形态发生蛋白4(BMP4)购自美国 R&D公司，

④干细胞培养基Essential 8和分化培养基Essential 6均购自美国赛默飞世尔科技公司；

⑤RNA提取采用试剂盒Total RNA KitⅠ，购自美国OMEGA 公司，方法参照OMEGA产品说明书R6834-02。

⑥反转录使用试剂盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA synthesisSupermix，购自全式金公司，方法参照全式金产品说明书 AT341。

⑦荧光定量PCR使用试剂盒Hieff qPCR SYBR Green Master Mix，购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2细胞和细胞

培养人胚胎干细胞系H9，来自美国Wicell实验室；

干细胞培养条件：对数生长期的H9细胞，接种于matrigel或 geltrex包被的6孔板，每孔3×10⁵个细胞，37℃，5％CO₂细胞培养箱，Essential 8培养基培养1天，使细胞贴壁，记为第0天。设置3个实验组，分别加入2mL含有25ng/mL wnt3a的Essential 6 培养基或含10ng/mL BMP4的Essential 6培养基或含25ng/mL wnt3a和10ng/mL BMP4的Essential 6培养基，置于细胞培养箱中，培养1～3天，每24小时更换一次培养基。

1.3实验方法

在第0～3天分别收集细胞：吸去培养液，DPBS洗涤细胞2次(400xg，室温离心4min，)，每管收集1个孔的细胞；分别提取 RNA，反转录然后进行荧光定量PCR。以第0天为对照组，检测3 个实验组在不同的因子处理条件下，从第1～3天原条期的标志物 BRACHYURY的mRNA表达水平，以BRACHYURY的表达上调作为分化得到原条期细胞的标志；1.4、实验结果

原条期标志基因BRACHYURY的表达在分化第一天就达到最高水平，并且同时添加wnt3a与BMP4，BRACHYURY的表达量明显要比单独添加二者时高出很多，随后随着时间的延长，表达量相对降低。因此优选用wnt3a与BMP4处理一天，诱导分化得到原条期细胞(图1)。

2.诱导原条期细胞向心脏中胚层细胞转化的最佳诱导时间试验

2.1材料

①分化所需因子分化所需因子wnt3a，骨形态发生蛋白4 (BMP4)均购自美国R&D公司，表皮生长因子(bFGF)和分化培养基Essential 6以及干细胞培养基Essential 8均购自美国赛默飞世尔科技公司。

②RNA提取采用试剂盒Total RNA KitⅠ，购自美国OMEGA 公司，方法参照OMEGA产品说明书R6834-02。

③反转录使用试剂盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA synthesisSupermix，购自全式金公司，方法参照全式金产品说明书 AT341；

④荧光定量PCR使用试剂盒Hieff qPCR SYBR Green Master Mix，购自上海翊圣生物科技有限公司。

2.2细胞和细胞培养

人胚胎干细胞系H9，来自美国Wicell实验室；

干细胞培养条件：对数生长期的H9细胞，接种于matrigel或geltrex 包被的6孔板，每孔3×10⁵个细胞，37℃，5％CO₂细胞培养箱， Essential 8培养基培养1天，使细胞贴壁，记为第0天。吸弃培养基，加入2mL含25ng/mL wnt3a和10ng/mL BMP4的Essential 6 培养基，经过1天分化得到原条期细胞，记为第1天。吸弃培养基，加入2mL含有20ng/mL bFGF和50ng/mL BMP4的Essential 6，培养1～5天，记为第2～6天，每24小时更换一次培养基。

2.3、实验方法

在第0～6天分别收集细胞：吸去培养液，DPBS洗涤细胞2次 (400xg，室温离心4min，)，每管收集1个孔的细胞；分别提取 RNA，反转录然后进行荧光定量PCR。以第0天为对照组，检测从第0～6天心脏中胚层的标志物KDR和ISL1的mRNA表达水平，以上述两个基因的mRNA表达相对于第0天上调作为分化得到心脏中胚层细胞的标志。

2.4实验结果

KDR在第1天起，达到较高水平，并在随后的分化过程中一直处于稳定状态；ISL1表达量随着分化时间的延长逐渐增高，在第 4天达到最高水平，之后开始下降，尽管ISL1在第4天时表达量最高，但其在第3天的表达量与第4天无显著差异。因此，优选分化第3天作为细胞作为心脏中胚层细胞进行下一步试验(图2)。

实施例1

诱导人胚胎干细胞系H9分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法，包括以下步骤：

1)将人胚胎干细胞系H9平铺种植在基质胶包被的培养皿中使其贴壁；其中，多能干细胞平铺密度为3万个/cm²；人胚胎干细胞系H9来自美国Wicell实验室；

2)将多能干细胞细胞置于含有Wnt3a和骨形态发生蛋白4 (BMP4)的分化培养基Essencial 6(Gibco公司)中培养1天，再置于含有表皮生长因子(bFGF)和骨形态发生蛋白4(BMP4)分化培养基Essencial 6中培养2天，得到心脏中胚层细胞(LPM)；其中，含有Wnt3a和BMP4的分化培养基Essencial 6中，Wnt3a 终浓度为25ng/mL和BMP4浓度为10ng/mL；含有表皮生长因子 (bFGF)和骨形态发生蛋白4(BMP4)分化培养基Essencial 6 (Gibco)中，表皮生长因子浓度为20ng/mL和骨形态发生蛋白4 浓度为50ng/mL；

3)将心脏中胚层细胞(LPM)消化，再将消化后的心脏中胚层细胞(LPM)平铺种植在基质胶(geltrex或matrigel)包被的培养皿中，使其贴壁；其中，消化后的心脏中胚层细胞(LPM)平铺密度为2万个/cm²；

4)再将上述培养皿中心脏中胚层细胞(LPM)置于含有骨形态发生蛋白4(BMP4)、转化生长因子(TGFβ1)和内皮生长因子 (VEGF)的分化培养基Essencial 6(Gibco公司)中连续培养6天；得到H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞(VEL)；其中，含有骨形态发生蛋白4(BMP4)、转化生长因子(TGFβ1)和内皮生长因子(VEGF) 的分化培养基Essencial 6中，骨形态发生蛋白4终浓度为10ng/mL，转化生长因子终浓度为10ng/mL，内皮生长因子浓度为100ng/mL。

基于上述方法得到心脏瓣膜内皮细胞的相关实验：

1、心脏中胚层细胞鉴定

1.1材料

①Western blot主要试剂：蛋白分子量Marker购于上海翊圣生物科技有限公司；

聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购于美国Millipore公司；

牛血清蛋白(BSA)购于北京鼎国昌盛生物科技有限公司；

BCA蛋白定量试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所；

蛋白酶抑制剂购于德国Roche公司；

化学发光剂(ECL)购自美国advansta公司；

辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗体购自ImmunoReagents公司和美国CellSignaling公司；

磷酸酶抑制剂购和一抗GAPDH购自美国Santa Cruz公司；

一抗ISL1购自英国abcam公司；

30％聚丙烯酰胺购自武汉博士德生物工程有限公司；

10％十二烷基磺酸钠(10％SDS)和1mol/L Tris-HCl(Ph 6.8) 购自武汉博士德生物工程有限公司；

甘油购于国药集团化学试剂有限公司；

β-巯基乙醇购自北京索莱宝科技有限公司；

10％SDS-PAGE胶由PAGE凝胶快速制备试剂盒制备，购自上海雅酶生物科技公司，制备方法参考货号PG112说明书。

②SDS蛋白裂解液配方如下：

1mol/L Tris-HCl，Ph 6.8 6.3μL；50％甘油20μL；β-巯基乙醇5μL；10％十二烷基磺酸钠35μL；蛋白酶抑制剂×1；磷酸酶抑制剂×1；水补足至100μL。

③流式分析主要试剂：小鼠IgG和KDR抗体，购自美国R&D 公司。

其它试剂：生理盐水(DPBS)购自BI公司、胎牛血清(Fatal Bovine Serum，FBS)购于美国Gibco公司；细胞培养皿，流式过滤管购自于美国Corning公司。

1.2细胞和细胞培养

多能干细胞H9，来自美国Wicell实验室；实施例1中所述分化第 3天心脏中胚层细胞；

1.3实验方法

流式分析主要方法：

收集H9和实施例1中所述分化第3天心脏中胚层细胞，消化、收集细胞，用含0.5％BSA的PBS(0.5％PBSA)终止消化，然后 400g离心5min；用0.5％PBSA洗细胞一次，离心；用0.5％PBSA 重悬细胞，过流式过滤管，使细胞呈单细胞状态；将过滤后的细胞平均分为两份，一份作为对照组，一份作为实验组；实验组抗体用检测的蛋白抗体(KDR)，对照组抗体用产生一抗的物种的IgG(小鼠IgG)来处理；将细胞经抗体室温孵育30分钟；400×g离心5min，弃废液；0.5％PBSA重悬，400g离心5min，弃废液；用400μL 0.5％ PBSA重悬，经流式细胞仪进行分析。

1.4、实验结果

在胚胎发育过程中，ISL1和KDR在人的心脏中胚层中表达。在本实验中，干细胞H9不表达ISL1蛋白，但分化的第三天的心脏中胚层细胞可检测到该蛋白的表达，说明本实验通过3天的诱导，实现干细胞向心脏中胚层细胞的分化。通过流式分析，分化第三天的心脏中胚层细胞中，KDR阳性细胞所占的比例高达77.7％(图3～4)。

2、心脏中胚层细胞向心脏瓣膜内皮细胞分化所需因子检测

2.1材料

matrigel和培养皿购自美国Corning公司；高糖DMEM-F12购于BI公司；

骨形态发生蛋白4(BMP4)购自美国R&D公司；

内皮生长因子VEGF 121和转化生长因子TGFβ1购自美国 PeproTech公司；

表皮生长因子bFGF和分化培养基Essential 6购自美国赛默飞世尔科技公司。RNA提取采用试剂盒Total RNA KitⅠ，购自美国 OMEGA公司。

反转录使用试剂盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA synthesisSupermix，购自全式金公司；

荧光定量PCR使用试剂盒Hieff qPCR SYBR Green Master Mix，购自上海翊圣生物科技有限公司。

2.2、细胞和细胞培养

实施例1中所述心脏中胚层细胞：接种于6孔板，每孔3×10⁵个细胞，37℃，5％CO₂细胞培养箱。设置4个平行组，第1组用含有100ng/mL的内皮生长因子VEGF 121的Essential 6培养基培养；第2组用含有100ng/mL的VEGF 121和10ng/mL的BMP4的 Essential 6培养基培养；第3组用含有100ng/mL的VEGF 121和 10ng/mL的TGFβ1的Essential 6培养基培养；第4组用含有 100ng/mL的VEGF 121，10ng/mL的BMP4和10ng/mL的TGFβ1 的Essential 6培养基培养。培养6天，每24小时更换一次培养基，得到心脏瓣膜内皮细胞。

2.3实验方法

收集心脏中胚层细胞和心脏瓣膜内皮细胞：每管收集1个孔的细胞；分别提取RNA，反转录然后进行实时荧光定量PCR。以心脏中胚层细胞为对照组，检测4个实验组在不同的因子处理条件下，内皮细胞的标志基因CDH5，NFATc1，NOTCH4，NPR3，JAG1相对于心脏中胚层细胞的表达量，其中NFATc1是心脏瓣膜内皮的标志基因。

2.4实验结果

同时添加VEGF，BMP4和TGFβ1，上述的内皮标志基因的表达量明显高于其它实验组。因此优选同时添加VEGF，BMP4和TGFβ1作为诱导心脏中胚层细胞向心脏瓣膜内皮细胞分化的方法 (图5)。

实施例2

上述实施例1中H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞形态、分子验证

1.细胞及培养条件

选自实施例1得到的H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞(VEL)；

脐静脉内皮细胞(HUVEC)，购自美国典型培养物保藏中心 (Rockville，MD，USA)；

人主动脉内皮细胞系(HAEC)购自中国科学院上海细胞库；

分离的人心脏瓣膜内皮细胞(VEC)，来自武汉协和医院；

分离人心脏瓣膜内皮细胞培养条件：37℃，5％CO₂细胞培养箱，EGM-2BulletKit培养，EGM-2BulletKit购自美国Lonza公司。

2.实验方法

2.1贴壁的分离人心脏瓣膜内皮细胞，以及H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞，使用显微镜拍照记录形态。

2.2Western blot主要方法：

a.收集H9细胞和实施例1中所述分化第3天心脏中胚层细胞，消化、收集细胞，加入SDS蛋白裂解液，冰上孵育30min，4℃ 15000×g，离心10min；

b.取上清用BCA法测定蛋白浓度；以50μg蛋白/泳道上样， 10％的SDS-PAGE胶电泳分离，电泳结束后将PAGE胶上蛋白电转移至PVDF膜上；于5％的脱脂奶粉中室温振荡封闭2小时；

c.分别按比例加入一抗于杂交袋中4℃孵育过夜；次日用 TBST洗膜15min/次×3次；室温孵育二抗(1：5000)1小时；TBST 洗膜10min/次×3次；之后采用增强化学发光(ECL)法进行显色、曝光。用图像分析软件LAS4000 mini luminescent image analyzer采集图像和进行灰度分析；

2.3实时荧光定量PCR的方法：

a.收集H9，H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞，HAEC，HUVEC 以及分离的人心脏瓣膜内皮细胞：每管收集1个孔的细胞；

b.分别提取RNA，反转录然后进行实时荧光定量PCR；

c.以H9对照组，检测上述不同细胞心脏瓣膜内皮细胞的标志基因CDH5，NFATc1，NOTCH4，NPR3，JAG1相对于H9的表达量；

2.4间标抗体流式分析主要方法：

a.收集H9(负对照)和H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞，消化、收集细胞，用含0.5％BSA的PBS(0.5％PBSA)终止消化，然后 400g离心5min；用0.5％PBSA洗细胞一次，离心；

b.用0.5％PBSA重悬细胞，过流式过滤管，使细胞呈单细胞状态；加1mL 4％PFA室温固定10min；400g离心5min，弃上清；加1mL 90％冰上预冷的甲醇，室温放置15min；400g离心5min，弃上清；用0.5％PBSA洗两次，400g离心5min，弃上清；

c.将细胞平均分为两份，一份作为对照组，一份作为实验组；实验组抗体用检测的蛋白抗体，对照组抗体用产生一抗的物种的二抗来处理；将细胞经抗体室温孵育15分钟；400×g离心5min，弃废液；二抗避光室温孵育15分钟；400×g离心5min，弃废液；0.5％ PBSA重悬，400g离心5min，弃废液；用400μL 0.5％PBSA重悬，经流式细胞仪进行分析。

3.实验结果

H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞与分离的人的心脏瓣膜内皮细胞具有相似的形态(图6)。通过免疫印迹实验，H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞表达相应的内皮蛋白VE-Cad，CD31(图7)。同时，通过流式分选，通过本发明提供的方法，可产生96％的内皮细胞(图 8)。其中，有81％的细胞为NFATc1，VE-Cad双阳性细胞，可认为是产生了81％的心脏瓣膜内皮细胞(图9)。H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞和分离的人心脏瓣膜内皮细胞有相似的基因表达，而与HAEC和HUVEC有明显的差异。

实施例3

上述实施例1中H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞功能验证

1.材料

matrigel和所有培养皿购自美国Corning公司；乙酰化低密度脂蛋白荧光染料Alexa Fluor 594AcLDL购自美国Invitrogen公司；细胞核染料DAPI购自美国sigma公司；生理盐水DPBS购于BI 公司；EBM-2BulletKit购自美国Lonza公司；胰酶购自BI公司。

2.细胞

人胚胎干细胞系H9，来自美国Wicell实验室；实施例1制备的心脏瓣膜内皮细胞。

3.实验方法

3.1体外低密度脂蛋白摄取实验方法：

将H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞和H9(作为阴性对照)培养至 30-40％的融合度。细胞血清饥饿12小时后，将细胞以终浓度15ng /ml的Alexa Fluor 594AcLDL，在37℃温育4小时。将细胞用DPBS 冲洗两次，并在室温下用4％PFA固定10分钟。细胞核用DAPI(1： 1000)染色。图像由Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜(德国韦茨拉尔)拍摄。

3.2体外血管形成实验方法：

将H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞在细胞感染后，铺2×105个细胞于6孔板中，用EBM-2kit培养；待贴壁后，DPBS洗涤2遍，换无血清培养基培养24h。提前一天将matrigel从-20℃中取出，4℃放置过夜融化，并将实验用96孔板及枪头-20℃预冷；

待matrigel融化充分后，于预冷的96孔板中铺matrigel，每孔 70μL，37℃凝固30min，备用。用胰酶消化贴壁的H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞，用无血清培养基洗细胞2-3次，用EBM-2培养基重悬为3×10⁴细胞/100μL，每孔100μL加到铺有matrigel的96孔板中，37℃培养12h后，荧光显微镜下观察拍照。

4.实验结果

内皮细胞具有在体外形成血管结构和摄取低密度脂蛋白的功能。通过本发明提供的方法，H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞不同于 H9，H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞具有摄取低密度脂蛋白以及在体外形成血管结构的功能(图11～12)。

实施例4

上述实施例1中H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞向间充质细胞转化

1.材料

a.gelatin购自美国GIBCO公司；所有培养皿购自美国Corning 公司；生理盐水DPBS购于BI公司；胰酶购自BI公司；表皮生长因子bFGF和分化培养基Essential 6购自美国赛默飞世尔科技公司；转化生长因子TGFβ1购自美国PeproTech公司。

b.流式分析所用一抗均来自英国abcam公司，二抗均来自美国赛默飞世尔科技公司。RNA提取采用试剂盒Total RNA KitⅠ，购自美国OMEGA公司，方法参照OMEGA产品说明书R6834-02。

c.反转录使用试剂盒TransScript All-in-One First-Strand cDNA synthesisSupermix，购自全式金公司，方法参照全式金产品说明书 AT341。荧光定量PCR使用试剂盒Hieff qPCR SYBR Green Master Mix，购自上海翊圣生物科技有限公司。

2.细胞及培养条件

培养条件：取H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞，接种于gelatin包被的6孔板，每孔3×10⁵个细胞，37℃，5％CO₂细胞培养箱，用含有10ng/mL的bFGF和10ng/mL的TGFβ1的Essential6培养基培养3天，每24小时更换一次培养基；得到H9衍生的间充质细胞。分离的人心脏瓣膜间充质细胞VIC(F.M)，来自武汉协和医院。

3.实验方法

a.提取H9，H9衍生的间充质细胞H9-VIC以及VIC(F.M)的 RNA，反转录然后进行荧光定量PCR。以H9为对照组，检测间充质细胞标志物VIMENTIN，α-SMA，FSP1的mRNA表达水平。

b.流式分析主要方法：同实施例3。

4.实验结果

H9衍生的间充质细胞H9-VIC比正常的人心脏瓣膜间充质细胞VIC(F.M)表达更高水平的VIMENTIN，相似水平的α-SMA和 FSP1。通过流式分析，H9衍生的间充质细胞有97％的阳性率，说明通过本发明提供的方法产生的心脏瓣膜内皮细胞可以转化为心脏间充质细胞，并产生97％的间充质细胞(图13～14)。

实施例5

上述实施例得到的心脏瓣膜间充质细胞功能验证

1.材料

b.RNA提取采用试剂盒Total RNA KitⅠ，购自美国OMEGA 公司，方法参照OMEGA产品说明书R6834-02。

2.细胞

人胚胎干细胞系H9，来自美国Wicell实验室；H9衍生的心脏瓣膜细胞内皮细胞(VEL)；H9衍生的瓣膜间充质细胞(H9-VIC)；分离的人心脏瓣膜间充质细胞VIC(F.M)，来自武汉协和医院。

3.实验方法

上述细胞，提取RNA，反转录然后进行荧光定量PCR；以H9 为对照组，检测细胞外基质基因COL1A1，COL3A1的表达水平。4、实验结果相较于H9或者H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞，H9衍生的间充质细胞与正常的人心脏瓣膜间充质细胞VIC(F.M)都表达极高水平的COL1A1，COL3A1。说明H9衍生的间充质细胞与正常的人心脏瓣膜间充质细胞一致，具有与合成并分泌细胞外基质蛋白的功能(图15)。

实施例6

实施例1制备得到H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞与基质材料结合

1.材料

去细胞猪瓣膜，来自武汉协和医院。EdU增殖实验用Cell-Light EdU Apollo567体外试剂盒，购自中国Ribobio公司。免疫组化一抗体购自英国abcam公司，二抗购自ImmunoReagents公司。

2.细胞

实施例1制备得到H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞(VEL)。

3.实验方法

将H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞VEL按大约5x 10⁵个种植到去细胞猪瓣膜表面，在EBM-2培养基中加入5-乙炔基-2-脱氧尿苷 (EdU)。铺板后分别在72h和96h固定细胞，并使用Cell-Light EdU Apollo567体外试剂盒进行免疫荧光处理。捕获图像，并使用 Image-Pro Plus软件手动计数EdU阳性核的数量。免疫组化的方法可由abcam公司的免疫组化(IHC)：完整指南得到。

4.实验结果

图16显示H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞种植到猪去细胞瓣膜后，96h的EdU阳性核的数目明显高于72h，说明H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞能够在去细胞瓣上正常的生长和增殖。图17显示 CD31在去细胞瓣的表面有丰富的表达，说明H9衍生的心脏瓣膜内皮细胞种植到猪去细胞瓣膜后，保持内皮细胞的性质，并生长在去细胞瓣膜的表面。

实施例7

心脏瓣膜细胞的制备方法，包括以下步骤：

将心脏瓣膜内皮细胞置于含有表皮生长因子(bFGF)和转化生长因子TGFβ1的Essential 6培养基培养，培养过程中部分心脏瓣膜内皮细胞会发生内皮间充质转化，转化为瓣膜间充质细胞，呈现纤维状的形态；培养3天后，得到心脏瓣膜细胞，其中，心脏瓣膜细胞由瓣膜间充质细胞和心脏瓣膜内皮细胞组成；含有表皮生长因子(bFGF)和转化生长因子TGFβ1的Essential 6培养基，表皮生长因子(bFGF)终浓度为10ng/mL和转化生长因子TGFβ1终浓度为10ng/mL。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.一种诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法，包括以下步骤：

1)将多能干细胞平铺种植在基质胶包被的培养皿中用Essencial 8培养使其贴壁；其中，多能干细胞平铺密度为2～4万个/cm²；

2)将多能干细胞细胞置于含有Wnt3a和骨形态发生蛋白4的分化培养基Essencial 6中培养0.5～2天，再置于含有表皮生长因子和骨形态发生蛋白4分化培养基Essencial 6中培养1～3天，得到心脏中胚层细胞；其中，含有Wnt3a和BMP4的分化培养基Essencial 6中，Wnt3a终浓度为20～30ng/mL和BMP4浓度为10ng/mL；含有表皮生长因子和骨形态发生蛋白4分化培养基Essencial 6中，表皮生长因子浓度为20～25ng/mL和骨形态发生蛋白4浓度为50ng/mL；

4)再将上述培养皿中心脏中胚层细胞置于含有骨形态发生蛋白4、转化生长因子和内皮生长因子的分化培养基Essencial 6中连续培养4～8天；得到心脏瓣膜内皮细胞；其中，含有骨形态发生蛋白4、转化生长因子和内皮生长因子的分化培养基Essencial 6中，骨形态发生蛋白4终浓度为5～15ng/mL，转化生长因子终浓度为5～15ng/mL，内皮生长因子浓度为90～120ng/mL。

2.根据权利要求1所述诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法，其特征在于：所述步骤1)中，基质胶为geltrex基质胶或matrigel基质胶；多能干细胞平铺密度为3万个/cm²。

3.根据权利要求1所述诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法，其特征在于：所述步骤2)中，含有Wnt3a和BMP4的分化培养基Essencial 6中，Wnt3a终浓度为25ng/mL和BMP4浓度为10ng/mL；培养时间为1天。

4.根据权利要求3所述诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法，其特征在于：所述步骤2)中，含有表皮生长因子和骨形态发生蛋白4分化培养基Essencial 6中，表皮生长因子浓度为20ng/mL和骨形态发生蛋白4浓度为50ng/mL，培养时间2天。

5.根据权利要求1所述诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法，其特征在于：所述步骤3)中，基质胶为geltrex基质胶或matrigel基质胶；心脏中胚层细胞平铺密度为3万个/cm²。

6.根据权利要求1所述诱导多能干细胞分化制备心脏瓣膜内皮细胞的方法，其特征在于：所述步骤4)中，

含有骨形态发生蛋白4、转化生长因子和内皮生长因子的分化培养基Essencial 6中，骨形态发生蛋白4终浓度为10ng/mL，转化生长因子终浓度为10ng/mL，内皮生长因子浓度为100ng/mL，培养时间为6天。

7.一种权利要求1所述方法制备的心脏瓣膜内皮细胞在制备心脏瓣膜细胞中的应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用的方法，包括以下步骤：

将心脏瓣膜内皮细胞置于含有表皮生长因子和转化生长因子TGFβ1的Essential 6培养基培养，培养过程中部分心脏瓣膜内皮细胞会发生内皮间充质转化，转化为瓣膜间充质细胞，呈现纤维状的形态；培养3天后，得到心脏瓣膜细胞，其中，

所述心脏瓣膜细胞由瓣膜间充质细胞和心脏瓣膜内皮细胞组成；含有表皮生长因子和转化生长因子TGFβ1的Essential 6培养基，表皮生长因子终浓度为10ng/mL和转化生长因子TGFβ1终浓度为10ng/mL。

9.一种权利要求1所述方法制备得到心脏瓣膜内皮细胞在制作人工心脏瓣膜中的应用。

10.一种权利要求8所述方法制备得到心脏瓣膜细胞在制作人工心脏瓣膜中的应用。