CN112305103A - 山莴苣苦素和山莴苣素的提取和测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了山莴苣苦素和山莴苣素的提取和测定方法，包括如下步骤：(1)采用冷冻干燥机将生菜鲜样干燥，粉碎成粉末；(2)将上述粉末转入试管中，加入甲醇提取液，之后在45℃超声提取20‑70min，得到提取的山莴苣素和山莴苣苦素的提取液；(3)将提取的所述提取液纯化处理，离心机8000转/分钟离心10min，得到上清液；(4)将上述上清液进行氮吹浓缩，得到浓缩液转移至上样小瓶进行HPLC测定；(5)上样，对上样瓶进行HPLC‑DAD检测，检测后得到生菜山莴苣苦素和山莴苣素的测定结果。本发明为生菜中山莴苣苦素、山莴苣素的提取提供了一种环保、高效的提取和测定方法，能在一天内准确测定生菜山莴苣苦素和山莴苣素的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种山莴苣苦素和山莴苣素的提取和测定方法。
背景技术
生菜为菊科莴苣属一年生或二年生草本作物，具有很好的药用和食用价值，是类胡萝卜素、维生素、矿质元素等健康促进成分的重要膳食来源。已有研究报道生菜还含有一般蔬菜没有的苦味物质,如莴苣素、8-去氧山莴苣素和山莴苣苦素，其中山莴苣苦素含量高且苦味阀值低是苦味产生的主要原因，这些苦味物质具有良好的保肝和抗肿瘤活性。目前，可采用浸提法或热回流法对山莴苣苦素、山莴苣素进行提取。
现有的山莴苣苦素和山莴苣素提取方法中，Franziska等采用浸提法进行提取，将冻干生菜粉末加入甲醇/水(85:15v/v，1.5L)提取液在4℃下浸提24h，再用正己烷、二氯甲烷和正丁醇进行连续萃取，该方法耗时长，溶剂消耗量大，过夜提取影响测定结果。Myeong等采用热回流法进行提取：将冻干生菜粉末加入100ml甲醇，采用热回流法在65℃下提取1.5小时，再用20ml氯仿提取，该方法会影响受热不稳定的成分，造成样品损失，从而影响测定结果。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种山莴苣苦素和山莴苣素的提取和测定方法，为生菜中山莴苣苦素、山莴苣素的提取提供了一种环保、高效的提取和测定方法，能在一天内准确测定生菜山莴苣苦素和山莴苣素的含量。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种山莴苣苦素和山莴苣素的提取和测定方法，包括如下步骤：
(1)采用冷冻干燥机将生菜鲜样干燥，粉碎成粉末；
(2)将上述粉末转入试管中，加入甲醇提取液，之后在40-60℃超声提取20-70min，得到提取的山莴苣素和山莴苣苦素的提取液；
(3)将提取的所述提取液纯化处理，离心机8000转/分钟离心10min，得到上清液；
(4)将上述上清液进行氮吹浓缩，得到浓缩液转移至上样小瓶进行HPLC测定；
(5)上样，对上样瓶进行HPLC-DAD检测，检测后得到生菜山莴苣苦素和山莴苣素的测定结果。
作为一种进一步的技术方案，步骤(2)中超声提取时间为50min。
作为一种进一步的技术方案，步骤(2)中超声提取温度为45℃。
作为一种进一步的技术方案，步骤(5)中所述HPLC-DAD检测的检测条件如下：
色谱柱：Zorbax eclipse XDB C8 4.6mm×150mm,5μm；柱温30℃；流速1ml/min；进样量20ul；流动相A为0.1％乙酸水；流动相B为乙腈；流动梯度为0min，10％B；30min，25％B；60min，80％B；平衡柱子10min；平衡60.01min，10％B；70min，10％B；检测波长245nm。
采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
1.采用超声波提取，耗时短，不足1小时，不会出现样品过夜提取从而影响测定结果的问题；超声提取温度在40-60℃范围内，提取温度低，可有效保护对热不稳成分的降解。
2.采用甲醇进行提取，用量少，可有效减少试剂的浪费使用，操作方便。
3.HPLC方法可同时测定出山莴苣苦素和山莴苣素含量，且分离效果好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例一提供的标准品山莴苣苦素、山莴苣素色谱图；
图2为本发明实施例一提供的山莴苣苦素的标准曲线；
图3为本发明实施例一提供的山莴苣素的标准曲线；
图4为本发明实施例一提供的北紫生3号山莴苣苦素、山莴苣素色谱图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例一
1、样品预处理：
采集新鲜北紫生3号生菜叶片后，置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥至恒重。将叶片取出后粉碎，精密称取5g生菜粉末于试管中，加入甲醇100ml，密封。放入超声波处理40min(功率100％，温度40℃)，倒出上清液，再加入甲醇50ml超声处理40mim，倒出上清液，重复上一步操作，合并上清液，倒入离心管在8000转/分钟，离心10min，得到上清液用氮吹仪进行氮吹浓缩，所得浓缩液过0.22um微孔滤膜转移到上样小瓶中。
2、标准曲线的绘制：
分别精密称取山莴苣苦素、山莴苣素标准品5mg，加入甲醇5ml，制成1mg/ml的山莴苣素和山莴苣苦素标准储备液。分别取5ul、50ul、100ul、200ul、300ul山莴苣苦素标准储备液，加甲醇定容至1ml，配制成浓度分别为5、50、100、200、300ug/ml的系列标准溶液，分别取2.5ul、25ul、75ul、150ul、300ul山莴苣素标准储备液，加甲醇定容至1ml，配制成浓度分别为2.5、25、75、150、300ug/ml的系列标准溶液。
3、色谱条件：
色谱柱：Zorbax eclipse XDB C8(150mm×4.6mm)，流动相：乙腈(B)-0.1％乙酸(D)，梯度洗脱：0min,10％B；30min,25％B；60min,80％B；60.1min,10％B；70min,10％B，流速：1.0ml/min，柱温30℃，检测波长245nm，进样量：20ul。
4、测定结果
标准品色谱图为图1，山莴苣苦素、山莴苣素标准曲线分别为图2和图3；北紫生3号山莴苣苦素、山莴苣素色谱图为图4。
北紫生3号中山莴苣苦素、山莴苣素含量如表1所示：
表1北紫生3号山莴苣苦素、山莴苣素含量
实施例二
1、样品预处理：
采集新鲜的北紫生3号生菜叶片后，置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥至恒重。将叶片取出后粉碎，精密称取1g生菜粉末于试管中，加入甲醇15ml，密封。用超声波进行预处理，超声温度为45℃，超声功率为100％，分别在20min、35min、50min，70min的超声时间下进行提取，倒出上层提取液，离心机在8000转/分钟离心10min，得到上清液用氮吹仪进行氮吹浓缩，所得浓缩液通过0.22um微孔滤膜即得样品溶液。
2、标准曲线的绘制：
分别精密称取山莴苣苦素、山莴苣素标准品5mg，加入甲醇5ml，制成1mg/ml的山莴苣素和山莴苣苦素标准储备液。分别取5ul、50ul、100ul、200ul、300ul山莴苣苦素标准储备液，加甲醇定容至1ml，配制成浓度分别为5、50、100、200、300ug/ml的系列标准溶液，分别取2.5ul、25ul、75ul、150ul、300ul山莴苣素标准储备液，加甲醇定容至1ml，配制成浓度分别为2.5、25、75、150、300ug/ml的系列标准溶液。
3、色谱条件：
色谱柱：Zorbax eclipse XDB C8(150mm×4.6mm)，流动相：乙腈(B)-0.1％乙酸(D)，梯度洗脱：0min,10％B；30min,25％B；60min,80％B；60.1min,10％B；70min,10％B，流速：1.0ml/min，柱温30℃，检测波长245nm，进样量：20ul。
不同超声时间对北紫生3号山莴苣苦素和山莴苣素的含量的影响如表2所示：
表2不同超声时间下北紫生3号山莴苣苦素和山莴苣素的含量
从表2可知，在固溶比(1g:15ml)一定的情况下，随着超声时间的增加，有助于生菜中山莴苣苦素和山莴苣素的提取，50min以后山莴苣苦素和山莴苣素含量降低，超声时间为50min时，生菜中山莴苣苦素、山莴苣素提取含量达到最高值，为最佳提取时间。
通过本发明提供的山莴苣苦素和山莴苣素提取方法，能够达到如下效果：
1.采用超声波提取，耗时短，不足1小时，不会出现样品过夜提取从而影响测定结果的问题；超声提取温度在40-60℃范围内，提取温度低，可有效保护对热不稳成分的降解。
2.采用甲醇进行提取，用量少，可有效减少试剂的浪费使用，操作方便。
3.HPLC方法可同时测定出山莴苣苦素和山莴苣素含量，且分离效果好。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (4)
1.山莴苣苦素和山莴苣素的提取和测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用冷冻干燥机将生菜鲜样干燥，粉碎成粉末；
(2)将上述粉末转入试管中，加入甲醇提取液，之后在40-60℃超声提取20-70min，得到提取的山莴苣素和山莴苣苦素的提取液；
(3)将提取的所述提取液纯化处理，离心机8000转/分钟离心10min，得到上清液；
(4)将上述上清液进行氮吹浓缩，得到浓缩液转移至上样小瓶进行HPLC测定；
(5)上样，对上样瓶进行HPLC-DAD检测，检测后得到生菜山莴苣苦素和山莴苣素的测定结果。
2.根据权利要求1所述的山莴苣苦素和山莴苣素的提取和测定方法，其特征在于，步骤(2)中超声提取时间为50min。
3.根据权利要求1所述的山莴苣苦素和山莴苣素的提取和测定方法，其特征在于，步骤(2)中超声提取温度为45℃。
4.根据权利要求1所述的山莴苣苦素和山莴苣素的提取和测定方法，其特征在于，步骤(5)中所述HPLC-DAD检测的检测条件如下：
色谱柱：Zorbax eclipse XDB C8 4.6mm×150mm,5μm；柱温30℃；流速1ml/min；进样量20ul；流动相A为0.1％乙酸水；流动相B为乙腈；流动梯度为0min，10％B；30min，25％B；60min，80％B；平衡柱子10min；平衡60.01min，10％B；70min，10％B；检测波长245nm。
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Cited By (2)
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| CN112915078A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-06-08 | 中国人民解放军空军军医大学 | 山莴苣苦素在制备治疗代谢综合征药物中的应用 |
| CN112915078B (zh) * | 2021-03-15 | 2022-10-18 | 中国人民解放军空军军医大学 | 山莴苣苦素在制备治疗代谢综合征药物中的应用 |
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