CN112300970A - 松鼠葡萄球菌cy1-78及其在发酵制备溶纤酶中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种松鼠葡萄球菌CY1‑78及其在发酵制备溶纤酶中的应用，将松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)CY1‑78菌株接种入产酶培养基，于30–35℃、200–250r/min发酵24–32h，得发酵液，发酵液经过离心后去除菌体，得到溶纤酶粗酶液，再经过盐析、透析和冷冻干燥后，得到溶纤酶冻干粉；本发明提供的产溶纤酶的松鼠葡萄球菌CY1‑78菌株，生长快、易培养，发酵周期短；松鼠葡萄球菌CY1‑78菌株产溶纤酶活性高，在优选的条件下，摇瓶发酵的酶活可达1553U/mL；溶纤酶的分离纯化工艺简单，经盐析和透析脱盐后，溶纤酶的冻干粉活力达到4030U/mg。

Description

松鼠葡萄球菌CY1-78及其在发酵制备溶纤酶中的应用

(一)技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)及其在发酵制备溶纤酶中的应用。

(二)背景技术

血栓性疾病严重危害人类的健康，其特征是血液中有形成分在血管内形成血栓，造成血管部分或完全堵塞，从而引起相应组织或器官缺氧、缺血及坏死。常见的血栓性疾病主要包括心肌梗塞、心绞痛、脑血栓中风、肺梗塞等。血栓性疾病不仅死亡率高且致残率高，发病率远高于癌症。随着人们饮食习惯的改变和寿命的延长，血栓性疾病的发病率也正在逐年提高。据世界卫生组织统计，世界每年约2600万人死于心脑血栓疾病，血栓性疾病已成为全球人口死亡第一病因。

治疗血栓性疾病的药物有溶栓药物、抗血小板药物和抗凝剂，最为有效且可靠的方法是溶栓药物治疗，目前使用的溶栓药物主要是溶纤酶类。溶纤酶是能够水解血液中纤维蛋白一类蛋白酶的总称，包括组织溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶、蚓激酶和纳豆激酶等。目前临床上使用溶纤酶药物均存在一些不足，如易导致出血、半衰期短、口服无效、价格高等。因此仍需寻找半衰期长、无毒副作用、适用口服、成本低的新来源溶纤酶。

动物、植物和微生物都可以产生溶纤酶，如来自蚯蚓的蚓激酶、来自中药蒲黄的溶纤酶；来自溶血性链球菌的链激酶，来自纳豆枯草杆菌的纳豆激酶。相比之下，微生物因其种类多、产酶活性高、生长快、生产成本低，是溶纤酶最佳来源。

家蚕的蚕蛾出茧时，口腔吐出含有溶茧酶的弱碱性液体，水解粘着茧丝的丝胶及部分丝素，使蚕茧结构变为疏松，然后用胸足拨开已松解的茧丝，形成一个孔，再从孔中钻出。溶茧酶成分来源于蚕蛾的下腭和中肠，不同来源的酶协同作用水解茧层。来自下腭的溶茧酶成分由蚕蛾自己分泌，而来自中肠的溶茧酶可能由肠道中的微生物产生。蚕蛹在羽化过程中，肠道微生物生长非常旺盛，产生大量的蛋白酶，这些蛋白酶不仅具有水解丝胶丝素的活性，而且可能还具有其他蛋白的活性，如溶纤酶活性。

为了获得活力高、生产成本低、溶纤专一性强的溶纤酶，本发明从羽化前的蚕蛹肠道中分离产溶纤酶的微生物，经过诱变和筛选，优化产酶发酵工艺，开发一种新的微生物来源的溶纤酶及其生产工艺。

(三)发明内容

本发明提供一株新的溶纤酶产生菌—松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)CY1-78菌株，及其在制备溶纤酶中的应用，利用该菌株发酵制备溶纤酶，具有发酵酶活单位高、周期短、分离纯化工艺简单的特点，制备的溶纤酶具有成本低、活性高的优点。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供一株新的溶纤酶产生菌—松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)CY1-78菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61273，保藏日期2020年11月5日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。

本发明所述松鼠葡萄球菌CY1-78菌株是从羽化前的家蚕蚕蛹肠道中分离，并经过紫外线诱变，从突变株中筛选获得。所述松鼠葡萄球菌CY1-78菌株的培养特征如下：该菌株接种于LB平板培养基上，37℃下培养24h后，可见乳白色菌落，菌落不透明，边缘整齐，表面光滑(菌落照片见附图1)。将所述松鼠葡萄球菌CY1-78菌株接种在脱脂牛奶平板培养基上，37℃培养24h后，在菌落周围形成较大的透明圈(菌落照片见附图2)。

本发明所述松鼠葡萄球菌CY1-78菌株的菌体特征如下：革兰氏阳性，球状，直径0.8–1.2μm。菌体常呈单个或成无规则团状分布(革兰氏染色后的光学显微镜照片见附图3)。所述松鼠葡萄球菌CY1-78菌株的16S rDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及所述松鼠葡萄球菌CY1-78在发酵制备溶纤酶中的应用，所述的应用是将松鼠葡萄球菌CY1-78菌株接种入产酶培养基，于30–35℃、200–250r/min发酵24–32h，得干菌体浓度为2.45–3.66g/L，溶纤酶活力为1138–1553U/mL的发酵液，发酵液经过离心后去除菌体，得到溶纤酶粗酶液，再经过盐析、透析和冷冻干燥后，得到溶纤酶冻干粉；所述产酶培养基终浓度组成为：蛋白胨10–20g/L，麦芽浸粉5–10g/L，酵母浸出粉5–10g/L，NaCl10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4。

进一步，所述松鼠葡萄球菌CY1-78菌株在产酶培养前，通常需要先经活化培养，然后经种子培养、获得种子液再接入产酶培养基发酵，具体步骤如下：

(1)活化培养：将松鼠葡萄球菌CY1-78菌株接种于LB斜面培养基，于37℃培养24–36h，得到活化后的斜面菌体；所述的LB斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4；

(2)种子培养：接种环挑取步骤(1)活化后的斜面菌体2–3环，接种至LB液体培养基中，于35℃、200–250r/min振荡条件下培养20–24h，得到干菌体浓度为1.43–1.58g/L种子液；所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4；

(3)产酶发酵：将步骤(2)种子液以体积浓度2％–3％的接种量，移种到产酶培养基中，于32–35℃、200–250r/min振荡条件下培养24–32h，得到含溶纤酶的发酵液。

进一步，优选所述的产酶培养基组成为：蛋白胨20g/L，麦芽浸粉10g/L，酵母浸出粉10g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，溶剂为水，初始pH为7.2。

进一步，本发明从松鼠葡萄球菌CY1-78菌株发酵液中分离纯化获得溶纤酶冻干粉的步骤为：

(1)松鼠葡萄球菌CY1-78菌株产酶培养的发酵液，于4℃、5000r/min离心10min，分离除去菌体，得澄清的溶纤酶粗酶液；

(2)往溶纤酶粗酶液中加入硫酸铵，使其饱和度达到30％–35％，4℃沉淀12–24h，之后于4℃、8000r/min条件下离心10min，去除沉淀，保留上清液；

(3)往步骤(2)所得的上清液中再次加入硫酸铵，使其饱和度达到65％–70％，4℃沉淀12–24h，之后于4℃、8000r/min条件下离心10min，弃去上清液，沉淀物用原粗酶液体积4％–5％的Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH 8.0)溶解，得到溶纤酶浓缩液；

(4)将步骤(3)所得溶纤酶浓缩液装入截留分子量为14kDa的透析袋中，以去离子水为透析液透析除盐后，取截留液于–40℃、真空度≤30Pa条件下冷冻干燥，即得到溶纤酶冻干粉。

与现有技术相比，本发明获得了一种新微生物来源的溶纤酶，有益效果主要体现在：(1)本发明提供了产溶纤酶的松鼠葡萄球菌CY1-78菌株，生长快、易培养，发酵周期短；(2)松鼠葡萄球菌CY1-78菌株产溶纤酶活性高，在优选的条件下，摇瓶发酵的酶活可达1553U/mL；(3)溶纤酶的分离纯化工艺简单，经盐析和透析脱盐后，溶纤酶的冻干粉活力达到4030U/mg。

(四)附图说明

图1、LB平板培养基上CY1-78菌株的菌落形态照片。

图2、脱脂牛奶平板培养基上CY1-78菌株的菌落形态照片。

图3、光学显微镜下CY1-78菌株的菌体形态照片。

图4、血纤维蛋白平板法测定溶纤酶活力的尿激酶标准曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：产溶纤酶菌株的分离与筛选

所述的松鼠葡萄球菌CY1-78菌株的野生菌株分离和筛选方法如下：

(1)平板分离：1只蚕茧剪破，取出蚕蛹，于体积浓度75％的乙醇水溶液中室温(25℃左右)浸泡1min后取出，剪去头部，剖开腹腔取出中肠；将中肠于无菌研钵，加入1mL无菌生理盐水研磨至匀浆；将匀浆液用无菌生理水梯度稀释至1×10⁴–1×10⁶倍。吸取0.1mL的1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷倍的3个稀释度溶液，涂布到脱脂牛奶平板培养基上，37℃恒温箱培养至菌落数不再增加。挑取周围有透明圈的菌落，划线接种于新鲜的LB平板培养基上，37℃培养至长出单菌落，再挑取单菌落接种于LB斜面培养基。共获得5个菌落周围有透明圈的菌株，分别编号(见表1)。

(2)摇瓶筛选：挑取上述5个菌株的斜面培养的菌体2–3环，接入50mL的初始产酶培养基中，于35℃、200r/min摇床中发酵培养24h，将发酵液5000r/min离心10min，上清液即为粗酶液。测定粗酶液的溶纤酶活力，不同菌株产溶纤酶的活力及干菌体浓度见表1，可见活力最高的菌株为CY1菌株，溶纤酶的活力为866U/mL。

表1不同菌株产溶纤酶的活力比较

所述的蚕茧为杭州地区饲养的春蚕结茧后14天的蚕茧。

所述脱脂牛奶平板培养基配制方法为：首先配制2倍浓度的LB培养基，即蛋白胨20g/L，酵母浸出粉10g/L，NaCl 20g/L，琼脂粉40g/L，溶剂为水，pH 7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。灭菌结束后冷却至50℃，加入等体积的50℃保温的无菌脱脂牛奶，混合均匀倒入无菌培养皿，冷却后备用。

所述LB斜面培养基和LB平板培养基组成相同，终浓度组成及配制方法为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 7.2。培养基加热至琼脂溶化后分装试管或三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后搁置斜面或倒入无菌培养皿。

所述初始产酶培养基终浓度组成及配制方法为：蛋白胨10g/L，麦芽浸粉5g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，溶剂为水，初始pH为7.2。250-mL三角瓶装50mL，8层纱布扎口，121℃高压蒸汽灭菌20min。

所述的溶纤酶活力，采用血纤维蛋白平板法测定，具体方法为：

55℃预热、浓度为15g/L琼脂糖水溶液10mL，与10mL已37℃预热、2.5g/L的牛血纤维蛋白原水溶液混合，再加入40U的凝血酶水溶液，混匀后迅速取5mL注入直径60mm的平皿中，室温下放置1h至凝固，得血纤维平板。用直径2mm的打孔器在血纤维蛋白平板上打孔，然后吸取5μL待测酶液加入至孔里，于37℃保温18h，游标卡尺测量透明圈两垂直直径，依据尿激酶的纤溶活性标准曲线(附图4)，由测得的两直径乘积(cm²)计算测定酶的纤溶活性。

尿激酶的纤溶活性标准曲线的制作：用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液将尿激酶标准品依次稀释为250、500、750、1000、1250U/mL，分别吸取5μL上述尿激酶溶液加入至血纤维平板的孔中，于37℃保温18h，游标卡尺测量透明圈两垂直直径，以尿激酶的活力为横坐标，两直径乘积(cm²)为纵坐标，绘制尿激酶的纤溶活性标准曲线(附图4)。

所述的15g/L琼脂糖水溶液、2.5g/L纤维蛋白原水溶液和凝血酶水溶液，均用生理盐水配制(0.85％NaCl水溶液)。

所述的Tris-HCl缓冲液配制方法为：500mL的0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与292mL的0.1mol/L盐酸(HCl)混合后，加水定容至1000mL。

实施例2：产酶菌株的分类鉴定

CY1菌株的培养特征如下：该菌株接种在LB平板上，37℃下培养24h后，可见乳白色菌落，菌落不透明，边缘整齐，表面光滑(菌落照片见附图1)。将CY1菌株接种在脱脂牛奶平板培养基上，37℃培养24h后，在菌落周围形成较大的透明圈(菌落照片见附图2)。

所述CY1菌株的菌体特征如下：革兰氏阳性，球状，直径0.8–1.2μm。菌体常呈单个或成无规则团状分布，革兰氏染色后的光学显微镜照片见附图3。

提取CY1菌株的总DNA，利用细菌通用16S rDNA引物进行PCR扩增，获得该菌株的16S rDNA片段，经测序，片段的序列大小为1128bp，具体序列见SEQ ID NO.1。

将SEQ ID NO.1序列在NCBI(National Center for Biotechnology InformationUSA，NCBI)上进行BLAST比对，与6株松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)典型菌株有99％以上的同源性，但没有与CY1菌株同源性达100％的菌株。CY1菌株的菌体形态也符合松鼠葡萄球菌特征，所以可以确定该菌株为一株松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)。

实施例3松鼠葡萄球菌的诱变选育

对松鼠葡萄球菌CY1菌株进行紫外诱变，筛选获得松鼠葡萄球菌CY1-78菌株。

(1)菌体制备：20mL的LB液体培养基中，接入松鼠葡萄球菌CY1菌株斜面菌体，于37℃、200r/min振荡条件培养12h。取1mL菌液于离心管中，5000r/min离心5min，弃上清液，加入1mL无菌生理盐水重悬菌体，再次离心收集菌体，如此重复洗涤菌体2次后，用20mL无菌生理盐水重悬菌体于100mL三角瓶备用。所述的LB液体培养基组成和制备方法同实施例1。

(2)紫外诱变：取直径6cm无菌培养皿6副，分别加入上述菌悬液1mL。打开培养皿盖，在30W紫外灯下距离30cm处边搅拌边照射，分别照射0、30、60、90、120、150s。完毕后将各菌液用无菌生理盐水以10倍梯度稀释1×10⁴–1×10⁷倍，取0.1mL稀释菌液涂布LB平板培养基，黑布包裹平板于37℃下培养24h。所述的LB平板培养基组成和制备方法同实施例1。

(3)摇瓶筛选：从紫外线照射时间长、菌落数量少的平板中，挑取单菌落转接LB斜面培养基，37℃培养36h后，再挑取菌体接种初始产酶培养基，于35℃，200r/min的摇床中培养24h，按实施例1方法测定溶纤酶活力，从初筛的菌株中选取酶活提高20％的9个突变菌株进行复筛(每个菌株做3个重复样)，复筛的10个菌株溶纤酶的活力见表2。

表2经紫外线诱变的突变菌株复筛时产酶活力

经过复筛后，编号为CY1-78菌株的产酶活力提高幅度较大，较出发菌株提高了32.8％。用LB斜面培养基接种传代5次，每代的产酶活力见表3。

表3不同传代次数的ZW-95菌株产溶纤酶的活力

从表3数据可以看出，诱变获得的CY1-78产溶纤酶活力稳定。将该菌株，即为松鼠葡萄球菌CY1-78(Staphylococcus sciuri CY1-78)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61273，保藏日期2020年11月5日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。

实施例4：松鼠葡萄球菌CY1-78摇瓶发酵制备溶纤酶的方法1

以松鼠葡萄球菌CY1-78菌株为产溶纤酶的菌种，在发酵工艺未优化的条件下，发酵制备溶纤酶粗酶液的具体步骤如下：

(1)将CY1-78菌株接种于LB斜面培养基，于37℃培养24h，得到活化后的CY1-78菌株斜面；所述的LB斜面培养基组成和制备方法同实施例1；

(2)接种环挑取步骤(1)活化后的斜面菌体2环，接种至50mL的LB液体培养基中，于35℃、200r/min振荡条件下培养24h，得到菌体干重浓度为1.58g/L的种子液。所述LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，pH 7.2。250-mL的三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min；；

(3)将步骤(2)种子液以体积浓度2％的接种量，移种到初始产酶培养基中，于35℃、200r/min振荡条件下培养24h，得干菌体浓度为2.45g/L的发酵液；所述初始产酶培养基组成为：蛋白胨10g/L，麦芽浸粉5g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，溶剂为水，初始pH为7.4。250-mL的三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min；

(4)将步骤(3)含溶纤酶的发酵液于4℃条件下5000r/min离心10min，分离除去菌体，得澄清的溶纤酶粗酶液。

按实施例1步骤检测，所得粗酶液的溶纤酶活力为1138U/mL。

实施例5：松鼠葡萄球菌CY1-78摇瓶发酵制备溶纤酶的方法2

以松鼠葡萄球菌CY1-78菌株为产溶纤酶的菌种，在优选条件下，发酵制备溶纤酶粗酶液的具体步骤如下：

(1)将CY1-78菌株接种于LB斜面培养基，于37℃培养24h，得到CY1-78菌株的活化斜面；所述的LB斜面培养基组成和制备方法同实施例1；

(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后的斜面菌体3环，接种至50mL的LB液体培养基中，于35℃、250r/min振荡条件下培养20h，得到干菌体浓度为1.43g/L的种子液。所述LB液体培养基组成和制备方法同实施例4；

(3)将步骤(2)种子液以体积浓度3％的接种量，移种到产酶培养基中，于35℃、250r/min振荡条件下培养32h，得干菌体浓度为3.66g/L的发酵液；所述产酶培养基组成为：蛋白胨20g/L，麦芽浸粉10g/L，酵母浸出粉10g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，溶剂为水，初始pH为7.2。250-mL的三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min；

(4)将步骤(3)含溶纤酶的发酵液于4℃条件下5000r/min离心10min，分离除去菌体，得澄清的溶纤酶粗酶液。

按实施例1步骤检测，所得粗酶液的溶纤酶活力为1553U/mL。

实施例6：溶纤酶的分离纯化

将实施例5方法制备的溶纤酶粗酶液，经过硫酸铵沉淀、透析除盐和冷冻干燥，得溶纤酶冻干粉。

(1)按实施例5方法，制备500mL的溶纤酶粗酶液；

(2)往500mL的溶纤酶粗酶液中，边搅拌边加入88.0g硫酸铵，使其饱和度至30％(按25℃条件计算)，4℃沉淀12h，之后将上述溶液于4℃、8000r/min条件下离心10min，弃去沉淀，得上清液535mL；

(3)继续往步骤(1)中所得的上清液中加入133g硫酸铵，使其饱和度达到70％(按0℃条件计算)，4℃沉淀12h，之后将上述溶液于4℃、8000r/min条件下离心10min，弃去上清液，用20mL的pH 8.0Tris-HCl缓冲液将沉淀溶解，此时得到溶纤酶粗品的浓缩液约35mL；

(3)将步骤(2)所得浓缩液，装入截留分子量为14kDa的透析袋中，用去离子水作为透析液，透析18h除盐，取截留液，即为溶纤酶浓缩液；

(4)将步骤(3)透析除盐的溶纤酶浓缩液转入洁净培养皿中，于–40℃、真空度≤30Pa条件下冷冻干燥，得到148mg溶纤酶冻干粉，此冻干粉的酶活力4030U/mg，溶纤酶的纯化收率为76.3％。

序列表

<110> 浙江树人学院（浙江树人大学）

<120> 松鼠葡萄球菌CY1-78及其在发酵制备溶纤酶中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1128

<212> DNA

<213> 松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)

<400> 1

cactctcggt ccaccctttc gacgggctag ctcctaaaag gttactccac cggcttcggg 60

tgttacaaac tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag acccgggaac gtattcaccg 120

tagcatgctg atctacgatt actagcgatt ccagcttcat gtagtcgagt tgcagactac 180

aatccgaact gagaataatt ttatgggatt tgcttggcct cgcggattcg ctgccctttg 240

tattatccat tgtagcacgt gtgtagccca aatcataagg ggcatgatga tttgacgtca 300

tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtcaacctag agtgcccaac ttaatgatgg 360

caactaagct taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc 420

tgacgacaac catgcaccac ctgtcacttt gtcccccgaa ggggaagact ctatctctag 480

agcggtcaaa ggatgtcaag atttggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca 540

tgctccaccg cttgtgcggg tccccgtcaa ttcctttgag tttcaacctt gcggtcgtac 600

tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca 660

cttagcactc atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgatccccac 720

gctttcgcac atcagcgtca gttacagacc agagagccgc cttcgccact ggtgttcctc 780

catatctctg cgcatttcac cgctacacat ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag 840

tttcccagtt tccaatgacc ctccacggtt gagccgtggg ctttcacatc agacttaaga 900

aaccgcctac gcgcgcttta cgcccaataa ttccggataa cgcttgccac ctacgtatta 960

ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aagacttgtt 1020

cagttactaa caaatttgtt cttccctaac acagagtttt acgatccgaa gaccttcatc 1080

actcacgcgg cgttgctccg gtcaggcttt cgcccaattg ccggagat 1128

Claims (6)

1.一种松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)CY1-78菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61273，保藏日期2020年11月5日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。

2.一种权利要求1所述松鼠葡萄球菌CY1-78在发酵制备溶纤酶中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是将松鼠葡萄球菌CY1-78菌株接种入产酶培养基，于30–35℃、200–250r/min发酵24–32h，得发酵液，发酵液经过离心后去除菌体，得到溶纤酶粗酶液，再经过盐析、透析和冷冻干燥后，获得溶纤酶冻干粉；所述产酶培养基终浓度组成为：蛋白胨10–20g/L，麦芽浸粉5–10g/L，酵母浸出粉5–10g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述松鼠葡萄球菌CY1-78菌株在产酶培养前，先经活化培养，再经种子培养，将种子液以体积浓度2％–3％的接种量接入产酶培养基，所述斜面活化培养和种子培养方法为：

(1)活化培养：将松鼠葡萄球菌CY1-78菌株接种于LB斜面培养基，于37℃培养24–36h，得到活化后的斜面菌体；所述的LB斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4；

(2)种子培养：接种环挑取步骤(1)活化后的斜面菌体2–3环，接种至LB液体培养基中，于35℃、200–250r/min振荡条件下培养20–24h，得到种子液；所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的产酶培养基组成为：蛋白胨20g/L，麦芽浸粉10g/L，酵母浸出粉10g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，溶剂为水，初始pH为7.2。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述溶纤酶冻干粉按如下步骤制备：

(1)将发酵液于4℃、5000r/min离心10min，分离除去菌体，得澄清的溶纤酶粗酶液；

(2)往溶纤酶粗酶液中加入硫酸铵，使其饱和度达到30％–35％，4℃沉淀12–24h，之后于4℃、8000r/min条件下离心10min，去除沉淀，保留上清液；

(3)往步骤(2)所得的上清液中再次加入硫酸铵，使其饱和度达到65％–70％，4℃沉淀12–24h，之后于4℃、8000r/min条件下离心10min，弃去上清液，沉淀物用原溶纤酶粗酶液体积4％–5％的50mmol/L、pH 8.0Tris-HCl缓冲液溶解，得到溶纤酶浓缩液；

(4)将步骤(3)所得溶纤酶浓缩液装入截留分子量为14kDa的透析袋中，以去离子水为透析液透析除盐后，取截留液于–40℃、真空度≤30Pa条件下冷冻干燥，得到溶纤酶冻干粉。

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