CN1122913A - 微粒免疫测定剂、灵敏且特异的免疫测定剂和使用这些免疫测定剂的免疫测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于免疫测定的具有一定直径和驻留面积的致敏的羧化物修饰的乳液微粒以及灵敏且特异的不需要样品预处理的免疫测定试剂。

Description

微粒免疫测定剂、灵敏且特异的免疫 测定剂和使用这些免疫测定剂的免疫测定法
本发明涉及微粒免疫测定剂。更具体地，本发明涉及免疫反应物灵敏化的羧化物修饰的乳液微粒，该微粒具有高的灵敏度和好的分散性。本发明的微粒试剂在所有基于颗粒的免疫反应物测定和检测系统中是有用的。
本发明也涉及高灵敏的和特异的免疫反应物测定剂。更具体地来说，本发明涉及测定剂和测定系统，其中提供一种灵敏化的固体试剂，该试剂与特定的缓冲剂结合来减少非特异的抗原—抗体反应。本发明的测定试剂被设计为不需要进行样品预处理并与常用于临床化学领域的市售自动分析仪相容的试剂。
基于颗粒的免疫测定是公知的，而且它们构成了一个免疫测定领域的重要部分。这是由于基于颗粒的免疫测定具有高度的通用性，而且它们可用于仅要求简单凭视力检测的试验中和基于仪器分析法的定量试验中。例如，载片乳液凝集法是已知的，其中抗体或抗原与乳液颗粒结合而且分别用于抗原或抗体的检测。在任一情形中，抗体或抗原与乳液颗粒的结合通常都是通过被动吸附或共价偶合来完成的。
颗粒凝集法可用于直接检测抗原或抗体(后者间接表明抗原的存在)。肉眼或用仪器来检测终点，并依据被试验的特异分析物来选择或者凝集或者凝集抑制状态。使用乳液凝集法的载片试验通常用于阳性/阴性定性形式且通常用于感染疾病的测定。用免疫反应物(即，抗原或抗体)灵敏化的微粒也已发现用于放射免疫测定、酶连接的免疫吸附剂测定(ELISA)以及膜或颗粒俘获型测定。
尽管肉眼检测(凝集、颜色变化等)对于常规的普查或者是/非定性检查是符合要求的，但某些分析物要求定量测定(药物、半抗原等)。而且，当基于颗粒的测定用于大体积普查时(如，爱滋病、肝炎等)，需要完全自动化的方法。当前，正开发基于颗粒的仪器测定法来满足这种需要。为了直接检测免疫反应物(具有或不具有多个表位)或作为如半抗原(与一个大分子结合的小分子，如药物—蛋白质共轭物)的抑制法，建立了这些仪器及其附加的方法。
已经开发了一些仪器和方法，它们通过由灵敏化的颗粒与免疫反应物的特异性反应而引起的光散射的改变，定量未知样品的免疫反应物浓度。由于颗粒悬浮液的巨大表面积和光散射的物理原理，此方法和测试设备能容易地区分2-3％相互变化的信号，而上面描述的半定量肉眼评估法区分30-40％的差别却有困难。
在下列文献中解释了类似于上述的那些免疫测定法和设备：Handbook of Experimental Immunology，1-4卷，BlackwellScientific 1987，(引入本文供参考)；美国专利3088875、3857931、3992517、4080264、4174952、4203724、4480042、4590156、4690906、4716123、4772550、4851329、4960692和5100805；以及Grange，J.等，J.Immuno.Meth.，18，365，1977，Hechemy，K.等，Lab Management，27，6/7月，1984，Looney，C.，J.Clin.Immunoassay，7，(1)，90，1984，VonSchulthes，G.等，Mol.Immunol，1，81，1980，Craine，J.，Am.Biotech，Lab.，34，5-6月，1987，Heveran，J.，J.Forensic Sci.，470，1977和Kimura，H.，J.Immuno.Meth.，38，353，1980，全部引入本文供参考。
虽然基于颗粒的免疫测定和敏感化(即，免疫反应物包被的或修饰的)的微粒试剂是已知的，但现有的微粒缺乏理想的高灵敏度、好分散性和稳定性的特点。
地高辛是目前指定用于控制充血性心衰和某些心律失常的常规强心甙。因地高辛影响心肌收缩力的作用而导致的心输出的增加改善了心衰(如静脉性充血、水肿、呼吸困难、端坐呼吸和哮喘)的紊乱特性。地高辛也降低室率并因此而改善血液动力学。缓解了心悸、心前区痛苦或衰弱并改善了伴发的充血性衰竭。地高辛也减慢心跳并减少规律的窦性心率。不管地高辛是否用于控制/抑制心衰、心房纤颤或心房扑动，通常推荐在临床事件发生后继续给予地高辛。
地高辛的治疗指数非常低，治疗剂量和毒性剂量之间仅有很小的差别。由于口服剂量的吸收和代谢(Variation)和非肾排泄的变化，使预测病人体内的地高辛水平常常很困难。因此，监测血清地高辛水平是有价值的、降低病人毒性危险和检测洋地黄化不足必需的工具。这是非常确切的，因为血清地高辛水平分别为1.1和4.4mg/ml时，毒性的发生率从5％增加到71％。
目前的地高辛免疫测定技术包括放射免疫测定(RIA)系统、酶联免疫吸附测定(ELISA)和EMIT测定。在放射免疫测定系统中，通常将地高辛用放射性碘标记并用γ-射线记数仪来测量与抗体结合的标记的地高辛的量。此RIA系统存在一些缺陷，如使用放射性元素、样品的不稳定性、重要的试剂制备、昂贵的测量仪器等。
ELISA和EMIT测定也需要标记地高辛(虽然是用酶来标记)并需要随后监测酶-底物的反应。这些测定系统(如RIA测定)需要制备重要的试剂等。而且，目前的测定系统通常包括血清预处理的步骤，以便破坏产生非特异(即血清干扰的地高辛抗体)反应并导致假阳性结果的干扰蛋白质。例如，当进行EMIT地高辛测定时，将血清或血浆与氢氧化钠混合来破坏干扰蛋白质。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于定性和定量免疫测定的、具有高灵敏度、特异性和稳定性的新的免疫反应物包被的乳液微粒试剂。
本发明的另一目的是提供一种用于诊断试验，特别是毒性药物检测(TDM)领域的和用于乳液凝集抑制测定中的乳液微粒免疫测定试剂。
本发明的另一目的是提供一种用于检测强心甙尤其是检测地高辛和毛地黄毒甙的基于乳液的微粒试剂。
本发明的另一目的是提供一种新的灵敏的、特异性、稳定的和可靠的且克服现有技术测定缺陷的测定系统。
本发明的另一目的是提供一种高度灵敏的和特异性的地高辛测定系统。
本发明的另一目的是提供一种高度灵敏和特异性的测定系统和药盒，它可用于目前临床化学领域使用的市售自动分析仪。
本发明的另一目的是提供一种高度灵敏和特异性的强心甙测定系统，它可在未对样品进行预处理的情况下操作，而且它可以简单有效地用于可靠地确定病人的血清地高辛水平。
本发明更全面的评价及其按相同方法容易获得的许多附加优点，通过参考下列结合有附图的详细说明而变得更好理解，其中：
图1显示本发明乳液微粒试剂与地高辛—人血清白蛋白(HSA)共轭物偶合的标准曲线。
图2a-d显示本发明用地高辛—HSA共轭物或地高辛—牛血清白蛋白(BSA)共轭物致敏的基于乳液的微粒试剂之间的比较。
图3a和b显示用地高辛—HSA共轭物致敏的用和未用甘氨酸后处理的本发明乳液微粒试剂的免疫测定结果。
图4a-d显示用本发明地高辛测定系统所获得的结果(Y轴)作为用Abbot TDx法所获得结果(X轴)的函数。
图5显示本发明地高辛致敏的微粒试剂和抗体缓冲试剂的长期稳定性。
图6a和b显示用LPIA-100系统使用0.296μm颗粒(图6a)和0.434μm颗粒(图6b)的地高辛测定结果。
图7a和b显示在本发明地高辛测定系统中氯化钠浓度对本发明缓冲试剂的影响。
图8a和8b显示氯化胆碱浓度对本发明地高辛测定的影响。
图9a-d显示不含脂肪酸的人血清白蛋白(HSA)对本发明地高辛测定系统的影响。
本发明基于乳液的微粒试剂含有任何基于乳液的颗粒，它的表面被羧化物修饰并且它已经共价吸附着能与互补(complimentary)免疫反应物特异性反应的免疫反应物。优选地，本发明基于乳液的颗粒的总体直径为0.020至0.96μm、优选为0.05-0.75μm、更优选0.10-0.60μm、最优选0.18-0.5μm，并且羧化物的表面驻留面积(Surface Parking area)为4-40、优选8-35、最优选10-30平方埃。本文中所用的术语“表面驻留面积”是指以平方埃测量的基于乳液的微粒的表面积除以微粒表面羧酸(-COOH)和羧化物(-COO-)官能基的总数。“羧化物”指COOH和COO-官能团。另外，本发明羧化物修饰的基于乳液的颗粒优选具有1.00至1.10范围的密度，更优选1.02-1.06。
本发明基于乳液的颗粒是任何羧化物修饰的聚合的或共聚的颗粒，而且可通过任何通常在本技术领域中已知的技术来制备，包括乳液聚合、接种乳液聚合和优选的，混悬液聚合。颗粒的制造可使用或可不使用交联剂，并且可包括核—壳型颗粒。本发明可使用任何具有足够的表面羧化物基团的聚合颗粒。
特别适用的核颗粒包括由已被羧化物修饰的C1-C8-、优选C1-C2-(甲基)丙烯酸盐(或酯)、羧化物修饰的聚苯乙烯和丙烯酸与苯乙烯单体的混合物制备的那些。
用于制备适用于本发明的羧化物修饰的乳液微粒的方法在本领域中是已知的，且描述在例如，美国专利5015695，4988770，4978719，4962154，这些专利一并引入本文供参考。
如上所述，本发明基于乳液的微粒试剂具有优选的直径和优选的羧化物表面驻留面积。虽然本发明颗粒的总体直径可在0.20-0.96μm内变化，但优选的直径为0.1-0.6μm，更优选0.18-0.5μm。特别适用的直径包括0.20、0.25、0.27、0.30、0.35、0.37、0.40、0.45和0.47μm。进一步，本发明微粒试剂基本上为球体是优选的，优选完全为球体，而且优选所说微粒群体的大小基本上相同。
本发明微粒试剂是被羧化物修饰的并因此而在其表面具有游离的羧酸和/或羧酸基部分，这依据他们所接触的或已接触过的介质的酸性而定。这些酸和羧酸残基的密度被称作表面驻留面积，并以平方埃为单位来测量。本发明微粒试剂的优选羧酸残基驻留面积为1-35，优选2-30，更优选6-20平方埃。有用的驻留面积包括5、7、10、12、15、18、20、22、25、28、30、32和35平方埃，而且总的来说，8-35平方埃的驻留面积产生了很好的结果。本发明微粒试剂的表面驻留面积是通过总体直径和如通过滴定测定的酸基数目来计算的，而本发明微粒试剂的总体直径是通过光散射技术、电子显微镜等来测量的。
用于致敏本发明乳液微粒试剂的免疫反应物是任何已知的能共价结合到其表面羧化物基团的免疫反应物。如果需要，可使用免疫反应物的混合物。包括半抗原—载体共轭物如药物—蛋白质共轭物等。通常，适用于本发明的免疫反应物是那些在包括直接和竞争测定、介于二者之间(Sandwich)测定等的任何已知的免疫测定系统中能够与互补免疫反应物进行特异性反应的免疫反应物。
在本发明中，术语免疫反应物意指以共价等形式连结到其它分子如蛋白质或合成的或天然的聚合物等上的任何抗原或抗体，而互补免疫反应物意指以共价等形式连结到其它分子如合成或天然聚合物等上的、能特异性地结合到免疫反应物上的任何抗体或抗原。在本文中，所用免疫反应物是共价结合到颗粒上的物质，而互补免疫反应物是特异性地与免疫反应物结合的物质。然而，某些免疫测定等可以不需要这样的安排。
本发明中所用的免疫反应物和互补免疫反应物的实例包括下列物质：
AFP              α-胎儿球蛋白
β-2-微球蛋白((Beta-2-microglogulin)
CEA              癌胚胎抗原
铁蛋白
CA19-9           糖类抗原19-9
PAP              前列腺酸磷酸酯酶
PSA              前列腺特异性抗原
CRP              C-反应蛋白
Mb               肌红蛋白
RF               类风湿病因子
ASO              抗链球菌溶血素-O
FDP              纤维蛋白原降解产物
抗凝血酶-III
纤维蛋白溶酶原
α-2-纤维蛋白溶酶抑制剂
D-dimer          纤维蛋白原降解产物D-片段
                 二聚物
IgG              免疫球蛋白G
IgA              免疫球蛋白A
IgM              免疫球蛋白M
IgE              免疫球蛋白E
C3              补体3C4          补体4尿白蛋白hcG          人绒毛膜促性腺激素hpL          人胎盘催乳素胰岛素HBs抗原      肝炎-B表面抗原HBs抗体      抗肝炎-B核心抗原抗体HBc抗体      抗肝炎-B核心抗原抗体HCV抗体      抗肝炎-C病毒抗体Treponema    抗梅毒螺旋体抗体TSH          促甲状腺激素LH           黄体生成激素FSH          促卵泡成熟激素地高辛洋地黄毒甙奎尼丁普鲁卡因酰胺NAPA         N-乙酰普鲁卡因酰胺茶碱苯妥英苯巴比妥卡马西平2-n-丙基戊酸乙琥胺(Ethosuccimide)庆大霉素妥布霉素丁胺卡那霉素万古霉素环胞霉素-AB12          维生素B12叶酸T3           三碘甲状腺氨酸T4           甲状腺素雌激素
所有以上列出的物质均可依据在进行免疫测定中所起的作用或被称为免疫反应物或被称为互补的免疫反应物。配对是重要的，而名称并不重要，本文的免疫反应物指任何以上的物质，而且也指类似的已知物质。本发明免疫反应物中自然包括与上面所列免疫反应物互补的所有免疫反应物。在Pierce ImmunotechnologyCatalog and handbook，Pierce Chemical Co.，1992中描述了本发明适用的其它免疫反应物，该文献引入本文供参考。如上所述，本发明免疫反应物中包括了蛋白质共轭物如半抗原的HSA和BSA共轭物。此载体一半抗原共轭物的具体例子包括地高辛-HSA和地高辛-BSA。在Erlanger，B.，Meth.of Enzym，70，85，1980和Bauminger等，Meth.in Enzym，70，151，1980中解释了制备这些共轭物的方法，两篇文献都引入本文供参考。
在本发明中，免疫反应物被共价结合到羧化物修饰的微粒上。一旦免疫反应物与微粒结合，该微粒就被称作致敏的。
本发明的免疫反应物包被的微粒试剂(致敏的微粒试剂)是通过将免疫反应物共价结合到羧化物修饰的乳液微粒上来制备的。可使用在现有技术中已知的将免疫反应物共价结合到羧化物基团上的任何方法。在下列文献中描述了本发明适用的将免疫反应物固定在固体支持物上的某些技术：G.T.Hermanson等，Immobilized Affinity Ligand Techniques，1992，美国专利4045384，4140662和4680338，Quasla，G.等，J.Immuno.Meth.，Vol.22，165，1978，Srere，P.等，Meth.Enzym.，44，11，1976，Nustad，K.等，Devel.Biol.Stds.，57，321，1984，Bahadur，A.等，Makromol.Chem.，186，1387，1985，Margel.S.等，J.Immuno.Meth.28，341，1979，和Suen，C.等，Makromol.Chem.186，255，1985，所有这些文献引入本文供参考。可使用键合分子。
将本发明免疫反应物共价结合到本发明基于乳液的颗粒上的优选方法是通过使用碳化二亚胺偶联剂。使用碳化二亚胺偶联剂来实现羧酸功能基与胺的缩合在现有技术中是公知的，并且描述在下列文献中：Sheehan，J.C.，等，Organic Chemistry，Streitweiser和Heathcock，MacMillan，1976；Thomas，J.O.，等，J.Amer.Chem.Soc.95，875(1973)；Packer，L.，等，J.Mol.Biol.，123，149(1978)；FEBS LETT，108，243(1979)；Anal.Biochem.，63，485(1975)；Plant Physiol.，53，619(1974)；和J.Org.Chem.，21，439(1956)，上述文献均引入本文供参考。
用于将表面羧化物基团与免疫反应物缩合的特别优选的碳化二亚胺偶联剂包括二环己基碳化二亚胺(DCC)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳化二亚胺(CMC)。EDC是特别优选的，这是由于它的高溶解性、温和条件下的效力和易于控制反应。共价结合到本发明颗粒上的免疫反应物的量依据颗粒的特性和免疫反应物而变化。通常，50-10,000，优选200-2000免疫反应物分子被结合到典型的本发明微粒上。然而，依据测定技术、所需的反应速度等，这个范围可以变化。
典型地，用于进行偶联的碳化二亚胺的量为颗粒重量的0.01至5％，优选0.05到2％，或者相当于乳液表面羧化物基团的2-5倍。参见引入本文的美国专利4181636和4045384。
碳化二亚胺催化的羧基与氨基的偶联可产生不需要的能提供非特异性反应的反应位点的副产物。为了制止此副产物的形成，在偶联反应充分进行后，可加入过量的胺，而且任何碳化二亚胺修饰的表面羧化物残基可使用氨基酸使之转化为酸或羧化物功能基。在该方法中，本发明微粒试剂的表面电荷保持相对不变并且可控制。适用于终止碳化二亚胺偶联反应的优选胺包括乙醇胺、1，2-乙二胺、葡糖胺、甘氨酸和赖氨酸。甘氨酸和赖氨酸是优选的，且甘氨酸是特别优选的。
在免疫反应物与颗粒进行偶联之前，例如通过将颗粒通过离子交换树脂如Bio-Rad混合的层状树脂AG 501-X8来纯化微粒是优选的。
当按本发明生产本发明乳液微粒试剂时，得到了高灵敏度和好的分散性。特别是，适当的颗粒大小和较小的表面羧化物驻留面积结合提供的试剂颗粒灵敏性足以定量低于1ng/ml的分析物。这样的灵敏度范围对于某些药物的检测应用来说是必要的。包括地高辛的测定。再者，本发明致敏试剂微粒在含水溶剂中具有极好的分散性并因此而提供了一种使基于颗粒的免疫测定产生再现性结果的和具有极好贮藏稳定性的均匀试剂。本发明特定的表面羧化物驻留面积、颗粒大小等均使本发明试剂减少了受血清材料影响的敏感性并因此改善了试剂的特异性。
显而易见，在以上的技术范围内对本发明进行各种修饰和改变是可能的。所以可以理解，在所附的权利要求范围之内，本发明可以不按本文具体描述的方法来操作。
更进一步，本发明揭示一种能够测定样品中所需物质存在和含量的免疫测定系统和免疫测定试剂。这些试剂包括以上所述的基于乳液的微粒和缓冲试剂，该缓冲试剂包括缓冲成分、氯化钠、氯化胆碱、无脂肪酸血清白蛋白、象硫酸葡聚糖钠或甲基纤维素的多糖、可有可无的互补免疫反应物和可有可无的仲胺或叔胺非特异性反应抑制剂。本发明也提供了具有两个容器的试剂盒，一个装有上述的乳液微粒而另一个装有缓冲成分。可使用任何容器，包括小瓶、罐、瓶、箔包装盒等。可使用能除去密封和未密封的容器。容器和密封材料可由例如玻璃、塑料、金属、复合材料等任何材料来制造。
本发明的试剂可用于任何使用已被免疫反应物和缓冲试剂致敏的上述乳液微粒的免疫测定系统或方法中。在下列文献中描述和解释了可以使用本发明试剂的一些免疫测定法和自动的和半自动的装置：Handbook of Experimental Immunology，1-4卷，Blackwell Scientific 1987，美国专利3088875，3857931，3992517，4080264，4174952，4203724，4480042，4590156，4690906，4716123，4772550，4851329，4960692和5100805，以及Grange，J.等，J.Immuno.Meth，18，365，1977，Hechemy，K.等，Lab Management，27，6/7月，1984，Looney，C.，J.Clin.Immunoassay，7，(1)，90，1984，VonSchulthes，G.等，Mol Immunol，1，81，1980，Craine，J.，Am.Biotech，lab.，34，5-6月，1987，Heveran，J.，J.Forensic Sci.，470，1977和Kimura，H.J.Immuno.Meth.，38，353，1980，上述文献均引入本文供参考。包括竞争和非竞争法。
优选地，本发明免疫测定试剂用于基于颗粒的免疫测定系统，最优选的是基于乳液凝集或乳液凝集抑制的免疫测定系统(参见美国专利4203724和5100805和J.Clin.Chem.38(b)，1012(1992)，三篇文献引入本文供参考)。使用本发明试剂和方法进行免疫测定所适用的分析仪器包括日本Mitsubishi Kasei Corporation的LPIA-100全自动乳液免疫测定系统，Roche Diagnostic Systems，Inc.的COBAS FARA和COBAS MIRA系统，以及Hitachi 704分析仪。
当使用乳液颗粒凝集法或凝集抑制法时，任何能将样品和可有可无的抗体试剂分散到小杯中进行预保温、再将致敏的固体试剂分散到小杯中并能光学检测随后进行的反应的任何定量的光学仪器都是优选的。当然，可使用能通过例如光散射技术等测量凝集或凝集抑制的任何仪器，并且可以通过手动或半自动的方法进行样品的添加、试剂的添加等。
本发明的缓冲试剂包含缓冲剂、氯化钠、氯化胆碱、如硫酸葡聚糖钠和甲基纤维素之一或两者的多糖化合物、可有可无的与本发明致敏支持物特异性反应的互补免疫反应物、无脂肪酸的血清白蛋白和可有可无的仲胺或叔胺非特异性反应抑制剂。
本发明抗体缓冲试剂优选以水为基质，且pH为4.5到10，优选5.5-9.5。缓冲试剂中氯化钠的含量可为1.0到5，优选1.5到4.5，最优选2.0-4.0％(重量)。本发明缓冲试剂中氯化胆碱的含量为1到15％，优选2-12％，最优选4-8％(重量)。本发明抗体缓冲试剂中使用常规的pH缓冲剂(术语“缓冲剂”意指那些在加入酸或碱时阻止氢离子浓度变化的单一物质或几种物质的组合物)。其实例包括三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐缓冲剂、在Pierce ImmunotechnologyCatalogue and Handbook，等中所列出的那些。上下文中的重量百分数以缓冲试剂的总重量计。
本发明缓冲试剂也包括至少一种象硫酸葡聚糖钠、甲基纤维素等的多糖。其它实例包括羧甲基纤维素、葡聚糖等。多糖使缓冲试剂增稠到适宜的粘度。典型地，本发明缓冲试剂中所适用的硫酸葡聚糖钠的含量为0.2-3.0％，优选0.6-2.0％，最优选1.0-1.8％(重量)。本发明缓冲试剂中所适用的甲基纤维素的含量为0.05-1.0％，优选0.1-0.4％，最优选0.15-0.3％(重量)。
适用于本发明的无脂肪酸血清白蛋白的特征在于基本上不含脂肪酸。该材料可按Chen，R.J.，J.Biol.Chem.，242，173(1967)的方法来制备(该文献引入本文供参考)，而且可以从Sigma和Miles处购得不同种类和级别的该材料。可使用人、牛、兔、羊等的血清白蛋白。本发明缓冲试剂中所适用的无脂肪酸血清白蛋白的含量为5-100，优选7.5-60，最优选10-40mg/ml缓冲试剂。无脂肪酸人血清白蛋白是最优选的。无脂肪酸和无球蛋白的材料也是优选的。
本发明缓冲试剂中所适用的可有可无的互补免疫反应物是任何与致敏上述乳液微粒所用的免疫反应物特异性反应的互补免疫反应物。该物质是可有可无的，因为例如，在直接免疫测定中，被检测或定量样品中的该物质直接与乳液微粒反应，溶液中不含有互补免疫反应物是必需的。当使用互补免疫反应物时，优选的互补免疫反应物为与致敏微粒所用的免疫反应物特异性反应的单克隆抗体。抗地高辛单克隆抗体是尤其优选的。生产单克隆抗体的方法在现有技术中是公知的，并在下列文献中描述：D.E.Yelton等，Annu.Rev.Biochem，50，657，1981，Milstein，C，Sci.American，243(4)，66，1980；Kennett，R.H.等，Monoclonal Antibodies，plenum Press，New York，1980和Kohler，G.等，Nature，256，495(1975)，上述文献均引入本文供参考。
如上所述，本发明缓冲试剂的一种可有可无成分是一种或多种仲胺或叔胺，它通过显著减少或消除非特异性的相互作用来提高本发明免疫测定试剂和方法的准确度和可靠性。可单一或混合使用这些仲胺和叔胺，并在共同未决申请USSN 08/194,475中进行了描述(引入本文供参考)。本发明中所适用的仲胺和叔胺非特异性反应抑制剂为下式所示的那些化合物及其酸加成盐，特别是盐酸盐、磷酸盐和硫酸盐：其中X是-NH-(CO)-NH-、-NH-(CS)-NH-、 或-N＝C＝N-，R1和R2(可以相同或不同)为C1-C5直链或支链烷基，或者R1和R2与氮原子一起为
Figure A9510652000223
或其N-甲-对一甲苯磺酸盐，
Y可以相同或不同，为H、OH和卤素(Br、Cl、F)中的任何一种，
R3为-NR1R2、-NH2、-CHY、环己基或H，
m为0到5的整数，
p为0到5的整数，和
n为0或1，
条件是当n等于1时，m和p至少有一个为至少1，而且当m＝n＝p＝0时，R3为H或-CH2Y。优选的抑制剂为当n＝1时，m至少为1。
这些仲胺和叔胺可由H、OH和卤素的任何组合来取代任意的或所有的m和p亚甲基，包括m＝n＝p＝0且R3为如H或甲基的化合物，其中m、可有可无的n和可有可无的p不为0且R3为H或-CH2Y的化合物等。
某些上述化合物为制备肽中使用的碳化二亚胺的水解产物。参见Sheehan，J.C.等，J.Org.Chem.，26，2525，1961和Staros，J.V.，等，Anal.Biochem.，156，220，1986，两篇文献引入本文供参考。一个特别优选的非特异性反应抑制剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)脲(EDU)，即R1＝R2＝甲基、Y＝H、m＝3、n＝1、p＝1且R3＝甲基的上式化合物。另一个是1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳化二亚胺N-甲-对苯磺酸盐(CMC)。这些化合物及其水解产物在免疫测定、特别是在免疫反应物被共价结合或通过吸附结合到微粒上的免疫测定中适用于抑制非特异性反应。
本发明非特异性反应抑制剂通常可购得，也可通过现有技术中普通技术人员公知的和在下列文献中描述的简单有机反应来制备，如，Introduction to Organic Chemistry，A.Streitwieser和C.Heathcock，MacMillan，1976；Reagentsfor Organic Synthesis，Feiser和Fieser，John Wileyand sons，1967和续卷； Survey of Organic Syntheses，John Wiley andSons，Vols I和II，1970；和Advanced Organic Chemistry，March，Wiley，1985，上述文献均引入本文供参考。例如，脲化合物(-NH-CO-NH-)可通过碳化二亚胺(-N＝C＝N-)化合物水解来制备。
由上式所述的本发明的非特异性反应抑制剂可单一使用或组合使用，并且可以加到本发明缓冲试剂中或在致敏前或致敏后吸附到以上所述的乳液微粒上。进一步，非特异性反应抑制剂可与常规的非特异性反应抑制剂联合使用。
本发明特别优选的实施方案是在系统中使用上式化合物来抑制非特异性免疫测定反应，在该系统中，使用碳化二亚胺如：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)或CMC将免疫反应物首先结合到固体底物上。本发明进一步优选的实施方案是使用的非特异性反应抑制剂为碳化二亚胺的水解产物，该碳化二亚胺用于将免疫反应物结合到微粒上。
大范围的抑制剂浓度是有效的。通常，本发明适用于抑制非特异性免疫测定反应的非特异性反应抑制剂的用量为0.1到300mM，优选0.5到50mM，更优选1.25到25mM，以免疫测定溶液总体积、缓冲液总体积、被测定样品的溶液体积为基础计算，或以用悬浮在溶剂中的免疫反应物致敏的微粒的溶液体积为基础计算。
本发明致敏的微粒和缓冲试剂可进行高度灵敏的和特异性的免疫测定。在直接测量(即非抑制模型)测定中使用时，本发明缓冲组合物中省去了互补的免疫反应物，仅使用氯化钠、氯化胆碱、多糖、无脂肪酸的血清白蛋白和可有可无的一种或多种仲胺或叔胺非特异性反应抑制剂与常规的缓冲组分。当使用基于抑制的测定时，在本发明缓冲试剂中含有互补的免疫反应物，并且将被测定样品与缓冲试剂混合并保温1-20分钟。完成保温后，将致敏的微粒加到混合物中以结合未占用的互补免疫反应物结合点，结合速率与血清样品中免疫反应物的浓度成反比。
含有上述成分的本发明免疫测定剂、免疫测定系统及方法能高度灵敏和特异性地测定样品，特别是病人血清样品中物质的浓度。例如，基于乳液凝集抑制和使用优选的本发明乳液地高辛—HSA致敏的微粒试剂和含有氯化钠、氯化胆碱、硫酸葡聚糖钠或甲基纤维素、抗地高辛单克隆抗体、无脂肪酸血清白蛋白和如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-脲的抗体缓冲试剂的免疫测定系统提供一种精确且可靠的测定病人血清中地高辛含量的测定系统。当使用的血清或血浆样品的体积低于免疫测定系统总体积的4％时，对于所有本发明试剂和优选的试剂都是特别可靠的，而且不需要进行任何特殊样品的预处理如除蛋白、树脂处理、超滤等。
当用购得的且能将样品和缓冲液(可含有也可不含有互补免疫反应物)都分散到小杯中并能将固体致敏的试剂分散到盛有混合物的小杯中的自动(如光度学法)仪器使用本发明的试剂时，在短时间内可以以极好的可靠性和灵敏度对大量病人样品中的血清免疫反应物进行定量。
通过本发明试剂和使用它们的免疫测定系统和方法(一般的和优选的实施例)得到的优良结果是从以上所述本发明的几方面产生的，包括在缓冲试剂中使用无脂肪酸血清白蛋白(和/或如果需要，预先施于致敏的微粒上)和在缓冲试剂中可使用也可不使用仲胺或叔胺非特异性反应抑制剂(和/或如果需要，吸附在致敏的微粒上)。由于本发明试剂和使用这些试剂的方法的灵敏度，在保证准确度和可靠性的同时，可使用小量的样品。当样品减少时，常规的免疫测定试剂和方法失去了灵敏度：本发明试剂和使用这些试剂的免疫测定甚至在低的样品体积时保持高的灵敏度。
下列实施例进一步描述本发明，但不限制本发明。
实施例制备乳液微粒
在装有冷凝器和搅拌器的10加仑玻璃衬里的反应器中加入83g碳酸氢钠，14000g去离子水和表面活性剂(224g MA-80)。将该混合物加热到160°F并用氩气净化10分钟。将208g的丙烯酸和11200g苯乙烯混合在一起，用氩气净化并装入水相的顶部。将所得的乳液平衡10分钟。
将33.6g过硫酸钾溶于2000g去离子水中，用氩气净化并加到玻璃衬里的反应器中以起动聚合作用。8小时后，将反应器冷却并倒出混合物，获得28000g的40％(重量)0.138μm羧化物修饰的微粒的混悬物。进行等容(iometric)滴定显示每克弱酸0.931毫当量。制备地高辛试剂
1.共轭物的制备
按Smith，T.W.，等，Biochemistry，9.331(1970)和Bulter，U.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.，57，71，1967的改良法制备地高辛-HSA共轭物，两篇文献均引入本文供参考。代表性的方案如下：
室温搅拌下，将20ml 0.1M的偏高碘酸钠滴加到混悬在20ml无水乙醇中的0.5g地高辛(从Sigma得到)中。25分钟后，加入0.6ml1M乙二醇。5分钟后，搅拌下将反应混合物滴加到含0.6g人血清白蛋白(从Sigma获得)的20ml pH9.5的水(用K2CO3调节)中。通过滴加5％K2CO3保持水溶液的pH在9.0-9.5的范围内。45分钟后，pH稳定并加入新溶于20ml水的0.3g氢硼化钠。3小时后，加入7.6ml 1M甲酸使pH降低到6.5，1小时后，加入NH4OH使pH升至8.5。然后将全部反应混合物用冷的流动的自来水透析4天，最后用含0.05％NaN3的0.1M NaHCO3进行透析。将溶液置于冰箱中。
2.致敏的微粒试剂的制备
A)离子交换处理乳液颗粒：
室温缓慢搅拌下，用2小时将20g混合层状离子交换树脂(BioRad AG 501-×8)加到100ml羧化物修饰的乳液颗粒混悬液(10％固形物；0.292μm直径；0.31毫克当量羧化物/g，10.5平方埃驻留面积，由Seradyn，Inc.制造的颗粒)中。然后用玻璃纤维滤器过滤混悬液以除去树脂，该乳液准备用于偶合。
B)乳液颗粒与地高辛-HSA共轭物的偶合反应：
将15ml 0.1M碳酸氢盐缓冲剂(pH8.0)和5ml以上纯化的10％固体乳液混悬液加到50ml聚碳酸酯离心管中，搅拌下在37℃保温10分钟后进行反应。将5ml 88mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC；新溶于水中)加到混合物中来激活乳液表面的羧基10分钟。激活后，在剧烈搅拌下加入2.5ml 10mg/ml的上述地高辛-HSA共轭物并保温10分钟。加入5ml 500mM甘氨酸缓冲液(pH8.5)终止反应。再保温10分钟以保证完全终止。
C)洗涤偶合了(即致敏)乳液试剂的共轭物：
以26,000×g的转速，将偶合了乳液颗粒的地高辛-HSA共轭物离心20分钟。弃去上清液并将25ml水加到沉淀块中。然后通过剧烈搅拌再悬浮沉淀块，并重复洗涤4次；然而，在最后的再悬浮中，用0.05％叠氮化钠溶液作为贮存基质。最后，将乳液混悬液进行声处理并稀释到备用浓度(通常为0.1-0.4％固形物)。
3.抗体试剂组合物(实施例1～4)：
通过将下列材料溶在水中并用盐酸调节pH来制备抗体试剂。优选地，最后加入抗体。
3.7％NaCl
200mM三-(羟甲基)-氨基甲烷，pH8.0
1.2％硫酸葡聚糖钠
1mg/ml HSA
0.05％叠氮化钠
1∶60,000稀释的抗-地高辛小鼠单克隆抗体(从Beekman获得)。
4.制备抗地高辛抗体缓冲试剂组合物(实施例5～10)
通过将下列材料溶解在水中并用盐酸调节pH来制备地高辛抗体试剂。最后加入抗体。
4.375％      NaCl
250mM        Bis-Tris，pH6.5
6.4％        氯化胆碱
1.25-1.75％  硫酸葡聚糖钠
2.0％        无脂肪酸人血清白蛋白(FAF-HSA)
25mM         1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-脲
0.1％        叠氮化钠
0.01％       消泡剂1410(Dow Corning)
1∶86,000-120,000稀释的抗地高辛单克隆抗体。地高辛抑制测定条件和操作方案(实施例1～4)
1.仪器
使用LPIA-100(Mitsubishi Kasei Corporation)来测定。
2.测定条件：
10μl样品
50μl推进(Pushing)缓冲剂，0.9％NaCl，0.05％NaN3
200μl抗体试剂
40μl微料试剂
650或950nm波长
3.测定过程：
使用的地高辛测定基于抑制抗体和抗原包被的乳液颗粒之间的凝集反应。将含地高辛的血清样品与测定缓冲剂稀释的抗地高辛抗体在37℃下保温10分钟。完成保温后，加入地高辛包被的微粒试剂以结合未占用的抗体结合位点，并通过10分钟内650或950nm处吸光度的增加来测量凝集的速率。吸光度增加的速率与血清样品中地高辛的浓度成反比。化学分析仪的测定参数(实施例5～10)仪器名称       COBAS    COBAS    HITACHI704    LPIA100
           FARA     MIRA波长           750nm    600nm       700nm     650或950nm温度           37℃     37℃        37℃        37℃样品体积       6μl     6μl        15μl       10μl抗体试剂       120μl   120μl      220μl      200μl乳液试剂       25μl    20μl       160μl      40μl
                               (3倍稀释)推进水/缓冲剂  20μl    35μl          -        50μl样品/抗体      10分钟   7分钟        5分钟      10分钟预先保温读数时间       5分钟    4分钟        5分钟      10分钟实施例1
1.地高辛试剂的标定曲线
除上述0.292μm直径的颗粒试剂之外，用相同颗粒但使用较低的EDC浓度(11mg/ml)来制造另外一种颗粒试剂，并按照上面的实施方案采用88ng/ml的EDC来制备具有0.184μm直径的试剂，通过测量其地高辛的标定曲线来评估所有的三种试剂。图1显示用具有已知地高辛浓度的样品同时用LPIA-100系统测量650nm处吸光度的增长速率制备的标定曲线。该曲线表示：具有较大粒度的试剂具有较高的灵敏度(速率的绝对值较高)，而且就地高辛的治疗范围(0.5-2.0ng/ml)而言，所有的三条标定曲线都是令人满意的。
2.0.184μm直径颗粒试剂的精确度
根据图1，0.184μm致敏的颗粒试剂是最不灵敏的。然而，如表1所示，该试剂仍有极好的性能，并具有极好的精确度。表1.用0.184μm颗粒试剂研究的精确度地高辛校准物浓度(ng/ml)n＝10              0.0    0.5    1.0    2.0    3.0    5.0速率(mA/分钟)平均值             257.4  228.0  200.1  148.9  116.0  66.0S.D，             4.3    3.8    4.0    4.3    3.6    4.3C.V.％            1.7    1.7    2.0    2.9    3.1    6.5校准浓度平均值             0.12   0.56   0.98   2.13   3.10   5.43S.D               0.06   0.06   0.07   0.12   0.15   0.20C.V.％              -     10.0   7.5    5.6    4.8    3.7
表中n为试验样品数，S.D.为标准偏差而C.V.％为变异系数。校准浓度是指预先准备好的地高辛校准物浓度(digoxincalibrator set)(Roche Diagnostic Systems，Inc.)。实施例2
比较了14个不同的致敏的羧化物修饰的乳液颗粒在上述地高辛抑制测定中的分散性和反应性。按实施例1的相同制备方案来制备微粒试剂。用Ong/ml血清校准物(calibrator)作为样品来测量反应性。
表2显示了所得到的结果，该结果证明了适当驻留对提供反应性和可分散性微粒试剂的重要性。
表2.14个不同的致敏微粒地高辛试剂的评价样品      直径     驻留面积       分散性       反应速率
     (μn)        (2)                      (mA/min)
                       在共轭中    在测定中650nm处；抗体1∶400,000：1         0.184      18.8    极好        极好    259.62         0.203      51.9    凝集        凝集    62.13         0.210      56.8    结块        结块    0.24         0.215      150.6   结块        结块    -0.45         0.264      34.2    中等(fair)  凝集    61.16       0.283    119.7   凝集       凝集    78.67       0.284    16.1    极好       好      1319.08       0.285    69.5    中等(fair) 凝集    70.19       0.292    10.5    极好       极好    1104.210      0.296    12.0    极好       极好    1314.4950nm处；抗体1∶120,000：9       0.292    10.5    极好       极好    248.311      0.400    58.8    凝集       凝集    78.412      0.406    4.02    极好       极好    79.413      0.434    25.9    中等(fair) 好      763.414      0.490    2.56    极好       极好    41.8实施例3
如上所述，按Smith(同上文)的方法用牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)来制备两种地高辛共轭物。如上致敏颗粒并用LPIA系统和50个TDx(Abbot)预先评价的血清样品进行比较。按以上的实施方案用0.184μm颗粒来制备致敏的乳液颗粒，并用两种不同量的抗地高辛单克隆抗体来证实所得结果是由于致敏的颗粒而不是由于特定批号的抗体。
图2a和2c显示用地高辛-BSA共轭物致敏的乳液试剂所产生的结果(黑点)，在2a和2c中使用不同抗体份数所获得的结果，以及图2b和2d显示使用不同量抗体的用地高辛-HSA致敏的颗粒的结果(黑点)。
在所有图2a-2d中的三角是通过LPIA-100系统使用地高辛校准物获得的结果。
如图2a、b、c、d所示，抗体份数的差异对试验产生微小(如果有的话)的影响，地高辛-HSA致敏的微粒比地高辛-BSA致敏的颗粒产生更好的数据分布。实施例4
使用0.184μm的用地高辛-HSA致敏的颗粒来进行以上所述的地高辛测定，该地高辛-HSA是在碳化二亚胺缩合反应之后用或不用甘氨酸处理来制备的。在测定中，以LPIA-100系统测量了5个校准物，然后在LPIA-100仪器中试验经TDx法预先评价的35个血清样品。在图3a(未用甘氨酸后处理)和3b(用甘氨酸后处理)中的结果显示了数据分布图与标定曲线。
如图3a和3b所示，甘氨酸处理略减小反应性(即降低速率值)，但使样品的分布更紧密，因此提高了试剂的准确性。
本发明微粒免疫测定剂可在其表面上吸附，或者可以以含有非特异性反应抑制剂的水溶液形式存在，在共同未决美国专利申请08/194，475中描述了该非特异性反应抑制剂，该文献引入本文供参考。优选地，也可以提供含有两个分别盛装的组合物的试剂盒，一个组合物含有本发明的微粒试剂，另一个组合物含有美国专利申请08/194,475的非特异性反应抑制剂。实施例5
在使用上述4种仪器的乳液凝集抑制测定中，用以上微粒试剂和缓冲试剂检验用TDx(Abbot)预先评价地高辛浓度的病人血清样品。将用4种上述仪器得到的数据对由TDx法获得的结果制图并分析。图4a显示用COBAS FARA器获得的结果。图4b显示用COBASMIRA仪器获得的结果。图4c显示用Hitachi 704仪器得到的结果。图4d显示用LPIA-100仪器得到的结果。
如图4a-d所示，用本发明试剂进行的乳液凝集抑制测定产生了极好的结果。显然，用本发明试剂获得的结果与TDx系统获得的结果一样好，或者比后者更好。实施例6
采用上述同样的系统，用BioRad优质对照血清或Roche校准物进行精密度研究。如表1中的数据所示，本发明试剂取得了远好于目前公认的1ng/ml浓度标准10％变异系数(C.V.)的精密度。
表3.10天的研究
(3个浓度值，n＝10测定/值/天)组另别        0.5ng/ml    2.0ng/ml     4.0ng/ml(Run-to-Run)：X   CV％    X    CV％    X    CV％第1天      0.546  7.38  1.968  4.14  3.985  2.16第2天      0.542  5.97  1.939  2.95  3.973  1.54第3天      0.515  4.54  1.868  2.68  3.973  1.76第4天      0.493  6.01  1.869  3.25  4.038  2.53第5天    0.491  8.16  1.934  3.61  4.103  1.14第6天    0.559  5.78  2.017  3.48  4.228  2.08第7天    0.581  5.18  1.957  3.89  4.034  1.19第8天    0.635  6.94  2.012  1.83  4.152  3.08第9天    0.634  6.71  1.987  2.89  4.092  1.04第10天   0.633  6.88  1.992  3.84  4.216  1.98每天(10天)   0.563  9.5   1.963  3.37  4.079  2.22实施例7
使用Seradyn′s LPIA-100系统评价本发明试剂的长期稳定性。所有的试剂和校准物都在4℃下贮存。如下进行测量：在37℃下，将血清样品和含缓冲剂的抗地高辛抗体保温10分钟。完成保温后，加入共轭乳液试剂的地高辛以结合未占用的抗体结合位点。通过950nm波长处吸收度的增加测量凝集反应的速率，并绘制5分钟吸光度测量(V20)期内的反应速率对时间(按天数)的曲线(图5)。如图5结果所示，该试剂至少在9个月内是稳定的。实施例8
按上述方案制备具有0.296μm和0.434μm直径的地高辛乳液微粒试剂。在使用LPIA-100系统的乳液凝集抑制测定中测量35个预先经TDx评价地高辛浓度的病人样品。图6a-6d显示了该结果，其中图6a和6b指0.296μm颗粒而图6c和6d指0.434μm颗粒。
图6a和6c是LPIA-100速率值对经DuPont ACA测定的地高辛浓度的曲线；图6b和6d是相同样品通过LPIA-100系统测得的样品地高辛浓度(Y轴)对按DuPont ACA测得的样品地高辛浓度的曲线。实施例9
按上述方案制备地高辛微粒试剂，不同的是直径为0.184μm。使用具有20μm样品体积的LPIA-100仪器和下列抗体缓冲系统：
0.9或3.5％       氯化钠
0或4％           氯化胆碱
200mM            三-(羟甲基)氨基甲烷，pH7.5
1.2-1.3％        硫酸葡聚糖钠
1mg/ml           牛血清白蛋白
0.05％           叠氮化钠
1∶40,000        稀释的抗地高辛单克隆抗体评价30个病人样品的地高辛浓度。图7a和7b分别显示用0.9和3.5％氯化钠(使用0％氯化胆碱)获得的结果，图8a和8b分别显示用0和4％氯化胆碱、使用3.5％氯化钠所获得的结果。实施例10
接上面方案制备地高辛致敏的微粒试剂，不同的是直径为0.292μm，并用LPIA-100系统以10μl样品体积评价35个病人样品。使用的抗体缓冲剂组合物如下：
3.5％           氯化钠
250mM醋酸钠，   pH5.5-7.5
0.16％           甲基纤维素
0.1-4％          无脂肪酸HSA
250mM            1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-脲
0.05％           叠氮化钠
1∶60,000稀释的抗地高辛单克隆抗体
结果显示在图9a-d中，其中图9a为使用1.25mg/ml FAF-HSA的对照，图9b、9c和9d分别使用10、20和40mg/ml的FAF-HSA。

Claims (21)

1.一种致敏的微粒，该微粒含有羧化物修饰的乳液颗粒和与所述颗粒共价结合的免疫反应物，其中所述颗粒具有0.1-0.6μm的总体直径并具有8-35平方埃的表面羧化物驻留面积。
2.权利要求1的微粒，其中所述颗粒具有0.18-0.5μm的直径。
3.权利要求2的微粒，其中所述颗粒具有10-30平方埃的驻留面积。
4.权利要求1的微粒，其中所述免疫反应物为半抗原-蛋白质共轭物。
5.权利要求4的微粒，其中所述免疫反应物为地高辛-蛋白质共轭物。
6.权利要求3的微粒，其中所述免疫反应物为地高辛-人血清白蛋白共轭物。
7.权利要求1的微粒，其中所述免疫反应物在碳化二亚胺存在下的缩合反应中共价结合到所述羧化物修饰的乳液颗粒上。
8.权利要求7的微粒，其中所述碳化二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐。
9.权利要求7的微粒，其中所述缩合反应用选自乙醇胺、1，2-乙二胺、葡糖胺、甘氨酸和赖氨酸的化合物来终止。
10.权利要求7的微粒，其中所述缩合反应用甘氨酸来终止。
11.一种基于颗粒的免疫测定方法，包括将权利要求1的致敏微粒与互补的免疫反应物接触。
12.一种试剂盒，包含两种成分A和B，成分A含有权利要求1的微粒，成分B含有缓冲组合物，该缓冲组合物含有缓冲剂、氯化钠、氯化胆碱、多糖和无脂肪酸血清白蛋白。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述缓冲组合物还含有下式所示的非特异性反应抑制剂及其酸加成盐：其中X为-NH-(CO)-NH-、-NH-(CS)-NH-、 或-N＝C＝N-，R1和R2可以相同或不同，为C1-C5直链或支链烷基，或者R1和R2与氮一起为 或其N-甲-对-甲苯磺酸盐，
Y可以相同或不同，为H、OH和卤素中的任何一种，
R3为-NR1R2、-NH2、-CHY、环己基或H，
m为0到5的整数，
p为0到5的整数，和
n为0或1，
条件是当n为1时，m和p至少一个至少为1，和当m＝n＝p＝0时，R3为H或-CH2Y。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述非特异性反应抑制剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-脲。
15.权利要求12的试剂盒，其中所述缓冲组合物还含有水，1.0-5.0％(重量)氯化钠、1-15％(重量)氯化胆碱、0.2-0.3％(重量)硫酸葡聚糖钠或0.05-1.0％(重量)甲基纤维素(所说重量百分数以缓冲组合物总重量为基础计算)，和以缓冲组合物总体积为基础计算为5-100mg/ml无脂肪酸人血清白蛋白。
16.权利要求15的试剂盒，其中所述缓冲剂还含有互补的免疫反应物。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述互补的免疫反应物为抗地高辛单克隆抗体。
18.一种免疫测定法，包含下列步骤：
将含有被检测分析物的样品与缓冲组合物混合以产生缓冲样品混合物，该缓冲组合物含有水、缓冲剂、氯化钠、氯化胆碱、多糖、无脂肪酸血清白蛋白，以及可有可无的下式所示的非特异性反应抑制剂及其酸加成盐：
Figure A9510652000041
其中X为-NH-(CO)-NH-、-NH-(CS)-NH-、
Figure A9510652000042
或-N＝C＝N-，R1和R2可以相同或不同，为C1-C5直链或支链烷基，或者R1和R2与氮一起为
Figure A9510652000043
或其N-甲-对-甲苯磺酸盐，
Y可以相同或不同，为H、OH和卤素中的任何一种，
R3为-NR1R2、-NH2、-CHY、环己基或H，
m为0到5的整数，
p为0到5的整数，和
n为0或1，
条件是当n为1时，m和p至少一个至少为1，和当m＝n＝p＝0时，R3为H或-CH2Y，和
将所述缓冲样品混合物与权利要求1的微粒相接触。
19.权利要求18的方法，其中所述缓冲组合物还含有互补的免疫反应物。
20.权利要求18的方法，其中所述缓冲组合物含有1.0-5.0％(重量)氯化钠、1-15％(重量)氯化胆碱、0.2-3.0％(重量)硫酸葡聚糖钠或0.05-1.0％(重量)甲基纤维素(所述重量百分数是以缓冲组合物总重量为基础计算的)，和以缓冲组合物总体积为基础计算的5-100mg/ml无脂肪酸人血清白蛋白。
21.权利要求19的方法，其中所述缓冲组合物含有1.5-4.5％(重量)氯化钠、2-12％(重量)氯化胆碱、0.6-2.0％(重量)硫酸葡聚糖钠或0.1-0.4％(重量)甲基纤维素(所说重量百分是以缓冲组合物总重量为基础计算的)，和60-75mg/ml无脂肪酸人血清白蛋白。
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