CN1111016A

CN1111016A - 非特异性反应抑制剂

Info

Publication number: CN1111016A
Application number: CN95102794A
Authority: CN
Inventors: 伊藤道雄; 须川聪; 柳田厚司
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1994-02-09
Filing date: 1995-02-08
Publication date: 1995-11-01
Also published as: DE69526875T2; US5506151A; JP3284016B2; EP0667529B1; DE69526875D1; EP0667529A3; JPH07253430A; EP0667529A2

Abstract

一种用于免疫测定的非特异性反应抑制剂，具有下面的通式：

其中R₁、R₂、Y、X和R₃在说明书中作出了详细说明。

Description

本发明涉及一种用于免疫测定的非特异性反应抑制剂。具体而言，本发明涉及仲胺和叔胺，所述胺在免疫测定中加入时，可通过明显减少或消除非特异性相互作用，改善互补的免疫反应体相互作用程度的定量测定的准确度和可靠度。

免疫测定是抗原、抗体等的检测和定量技术，并且是一种已知技术。在《免疫学实验手册》第1至4卷（Blackwell Scientific）描述了免疫测定，在此作为参考。叙述了免疫测定的美国专利包括4，203，724、4，590，156、4，716，123、4，772，550、4，851，329、4，960，692和5，100，805一并在此作为参考。

非标记的免疫测定由于为了其检测必须形成大量的抗原-抗体复合物，所以其灵敏度是有限的。非标记的试剂测定的例子包括免疫沉淀法、凝集法和光散射技术。标记的试剂免疫测定包括用放射性同位素，荧光团等标记的试剂。

免疫测定大致分为两种：观测试剂的和观测分析物的（见Ekins，R.，《八十年代的免疫测定》，University Press，Baltimore.MD，1981，在此作为参考）。在观测试剂的免疫测定中，过量存在的待测分析物与辅助性免疫活性物放在一起。实例包括夹层分析等。在观测分析物的免疫测定中，待测分析物被标记并呈现过量。放射免疫分析（RIA）是这类测定的一种，其分析物被一种放射性同位素标记。

酶免疫测定（EIA_s）用酶反应测定来检测互补免疫反应体（即抗原-抗体）的反应。近来EIA_s在医学实验室中的使用迅速增长，部分原因是不需要放射性同位素。现在EIA方法包含无分离步骤的同种测定方法（因为随着互补免疫反应体的反应产生了信号调制）。

当免疫测定被一般地分类，基于这种分类，免疫反应体（抗原或抗体）被测定，反应物被使用竞争性或非竞争性方法标记、结合的或自由的反应体（如果有任何的）的分离方法被使用时，所有免疫测定最终依赖于至少一个互补免疫反应体的免疫反应体复合物的形成。

免疫测定被设计为检测、监测和/或定量这种复合物的形成，较好地是提供一个测定在样品中靶物质（target species）的量的方法。为了引起复合物的形成，通常使免疫反应体结合在小球、盘等的表面，然后，这一表面与互补的免疫反应体溶液相接触。免疫反应体在固体载体上的固定是公知的。并在例如《固定的亲合性配位技术》（G.T.Hermanson.et.al，1992）和美国专利4，203，724、4，716，123、4，772，550、4，851，329、4，960，692和5，100，805中均有叙述，在此一并作为参考。

虽然免疫测定法的灵敏度使其成为测定分析物的普遍技术，但是，免疫测定以及如上所述的所期望的互补免疫反应体的免疫反应体反应经历非特异性反应，但所述非特异性反应干扰测定分析物的存在和/或浓度的测定。这种非特异反应是已知的。如在，L.M.Boscato，et.al，clin.chem，32/8，1986，H.C.Vaidya et.al clin.chem.，38/9，1992，C.Chang et.al.Clin.Chem.，33/6，1987中均有阐述，在此都作为参考。非特异反应可能是由在被测样品中存在的非分析物抗体结合物质、标记的或非标记的分析物与固体免疫反应体载体的相互作用等产生的。在过去，牛血清清蛋白等已用于使非特异性相互作用减至最低程度，然而非特异性反应仍然是免疫测定技术中的问题。

本发明的一个目的是提供一种抑制和消除在免疫测定中发生的非特异性反应的方法。

本发明的另一个目的是提供一种含有非特异性免疫反应抑制剂的分析物溶液。

本发明的另一个目的是提供一种包含溶液、非特异反应抑制剂和附着有免疫反应体的固体载体的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种表面被免疫反应体和非特异性反应抑制剂包裹的固体载体。

本发明的另一个目的是提供包含非特异性反应抑制剂和免疫反应体的诊断试剂盒。

当充分理解了下面的详细阐述后，就会获得本发明、其目的和其带来的许多进步的更完整的评价。

图1：显示了用凝集免疫测定法在不使用非特异反应抑制剂的情况下测定地高新的结果。

图2：显示了用凝集免疫测定法在使用本发明所述的一种非特异性反应抑制剂的情况下测定地高新的数据分布，所使用的地高新样品与测定图1时使用的样品一样。

图3：显示了本发明所述的一种非特异性反应抑制剂对表现非特异性反应的肝炎-b样品的影响。

图4：显示了在使用包裹有微盘的人血清清蛋白的免疫测定中利用本发明所述的一种非特异性反应抑制剂致使非特异性反应减少。

图5：显示了在实施例4中用来确定非特异性反应抑制能力的11种化合物的结构式。

本发明所述的仲胺和叔胺非特异性反应抑制剂的通式为：

其中X是-NH-（CO）-NH-，-NH-（CS）-NH-，

-或-N＝C＝N-，

R₁，R₂可以相同或不同;是C₁-C₅直链或支链烷基，或R₁与R₂同氮原子一起为

或其N-甲-对-甲苯磺酸盐：

Y可以相同或不同，是H，OH和卤素（Br、Cl、F）中任意一个，

R₃是-NR₁R₂，-NH₂、-CHY、环己基或H，

m是0到5的整数;

p是0到5的整数;

n是0或1;

假如n＝1，m和p中至少一个为至少1，和

假如m＝n＝p＝0时，R₃是H或-CH₂Y，和其酸加成盐，特别是其盐酸盐、磷酸盐和硫酸盐。

这些仲胺和叔胺可以在任何位被取代或所有与H、OH和卤素任意组合的m和p亚甲基可以被取代，包括m＝n＝p＝O和R₃是例如H或甲基的化合物、m不是o、n和p可是可不是o和R₃是H或-CH₂Y等的化合物。

上述化合物中的几个是在制备肽中有用的碳化二亚胺的水解产物。参见J.C.，et.al，J.Org.Chem.，26，2525，1961和Staros，J.V.et.al，Anal.Biochem.，156，220，1986。两者一并在此作为参考。一种特别优选的非特异性反应抑制剂是1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）尿素（EDU），即按前面的通式R₁＝R₂＝甲基，Y＝H，m＝3，n＝1，p＝1和R₃＝甲基的一种化合物。另一种是1-环己基-3-（2-吗啉代乙基）碳化二亚胺N-甲-对-甲苯磺酸盐（CMC）。这些化合物和它们的水解产物在免疫测定中对抑制非特异性反应，尤其是在免疫反应体与固体载体共价结合或吸附的免疫测定中是有用的。

本发明的非特异性反应抑制剂可通过一般商业渠道获得，可用本专业普通技术人员熟知的简单有机化学反应制得。在例如《有机化学入门》（A.Streitwieser and C.Heathcock，Macmillan，1976）、《有机合成试剂》（Feiser and Fieser，John Wiley and Sons，1967和以后的各卷;Survey of Orgamc Syntheses，John Wiley and Sons，第一卷和第二卷，1970）和《高等有机化学》（March，Wiley，1985）中有说明，所有这些在此都作为参考。例如尿素化合物（-NH-CO-NH-）可由水解碳化二亚胺（-N＝C＝N-）化合物来制备。

本发明所述的在前文中以通式表达的非特异性反应抑制剂可以单独或联合使用，也可加入到被测样品（即分析物）中或加入到以吸附或共价结合在固体载体上的或未结合在其上的已知免疫反应物中使用。并且该非特异性反应抑制剂可与普通的非特异性反应抑制剂如牛血清蛋白联合使用。

本发明特别优选的一个实施方案是这样一种实施方案，其中一种按照前文中通式的化合物用于抑制非特异性免疫测定反应，在该非特异性免疫测定反应中，免疫反应物首先结合到使用碳化二亚胺试剂如1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）-碳化二亚胺盐酸化物（EDC）或CMC的基质上。本发明另一个优选实施方案是这样一种实施方案，其中使用的非特异性反应抑制剂是用于免疫反应体与固体载体结合的碳化二亚胺的水解产物。

根据本发明，用于有效抑制非特异性免疫测定反应的非特异性反应抑制剂的量是从0.1至300mM，优选的是0.5至50mM，更优选的是1.25至25mM，上述量以总的免疫测定溶液体积、被测样品溶液体积或悬浮在溶剂中的由免疫反应体活化的固体支持物的溶液体积为基础。

本发明的非特异性反应抑制剂在复合物形成之前加入到免疫反应体和待测分析物两者或两者之一中，当加入到吸附或共价结合于固体载体上的免疫反应体中时，在影响免疫反应之前最好使其反应1-20分钟。

在本发明中免疫反应体是指以共价等结合或未结合在其它诸如蛋白质、合成或天然聚合物等的分子上的任何抗原或抗体，互补免疫反应体是指以共价等结合或未结合在其它诸如合成或天然聚合物等的分子上并能特异地结合到免疫反应体上的任何抗体或抗原。通常免疫反应体是被检出或被定量的物质，互补免疫反应体是已知的用来检出或定量免疫反应体的物质。但某些免疫测定等可能不要求这种安排。然而，免疫反应体与互补免疫反应体的例子包括如下一些：

AFP α-胎蛋白

β-2-小球蛋白

CEA 癌胚抗原

铁蛋白

CA19-9 糖类抗原19-9

PAP 前列腺酸性磷酯酶

PSA 前列腺特异性抗原

CRP C-反应性蛋白质

Mb 肌红蛋白

RF 类风湿病因子

ASO 抗链球菌溶血素-O

FDP 血纤维蛋白降解产物

抗凝血酶-Ⅲ

血浆酶

α-2-血浆酶抑制剂

D-二聚体血纤维蛋白降解产物D-片段二聚体

I_gG 免疫球蛋白G

I_gA 免疫球蛋白A

I_gM 免疫球蛋白M

I_gE 免疫球蛋白E

C3 补体3

C4 补体4

尿白蛋白

hCG 人绒毛膜促性腺激素

hPL 人胎盘催乳激素

胰岛素

HB_s抗原肝炎-B表面抗原

HB_s抗体抗-肝炎-B核心抗原抗体

HB_c抗体抗-肝炎-B核心抗原抗体

HCV抗体抗-肝炎-C病毒抗体

密螺旋体抗-梅素螺旋体抗体

TSH 甲状腺促进激素

LH 促黄体激素

FSH 滤泡兴奋激素

地高新异羟基毛地黄毒苷

毛地黄毒苷

奎尼丁

普鲁卡因酰胺

NAPA N-乙酰基普鲁卡因酰胺

茶碱

苯妥英

苯巴比妥

酰胺咪嗪

2-丙基戊酸

乙基琥珀酰亚胺

庆大霉素

托普霉素

氨基羟丁基卡那霉素A

万古霉素

环孢菌素-A

B12 维生素B12

叶酸

T3 三碘甲状腺原氨酸

T4 甲状腺素

雌激素

免疫反应体、互补免疫反应体两者之一或两者均可以被吸附或共价结合到或者两均可以不结合到固体载体上，实际上，所有上述物质都可以根据它在免疫反应中起的作用被称为免疫反应体或互补的免疫反应体。配对是重要的，而名字并不重要。这里仅指本文提到的上述物质和类似的已知物质。自然，所有对上述列举的那些互补的免疫反应体也包括在本发明中。表面附着免疫反应体等的固体载体等叫做活化的固体载体。如果不用固体载体，含有已知免疫反应体的溶液叫做活化的溶液。

当前已知的所有免疫测定都可使用以上描述的非特异性反应抑制剂而得到改进。尤其是诸如血凝反应或胶乳凝集反应试验的免疫凝集反应测试，固相吸附免疫测试法或标记抗原/抗体固相免疫测试，如放射免疫测定（RIA_s）、酶免疫测定（EIA_s）和荧光免疫测定（FIA_s）等均可通过使用本发明的非特异性反应抑制剂得到改进。对其它有用的免疫测定包括化学发光试验、免疫色谱法、免疫指示法和免疫绕射光栅法等。

下述实施例说明本发明，但应明确这些实施例不以任何方式限制本发明。

实施例1

地高新微粒试剂的制备

用.T.W.Smith et.al，在《生物化学》9，331（1970）记载的方法（在此一并作为参考）由地高新-人血清清蛋白（地高新-HSA）共轭物制备地高新颗粒试剂。地高新试剂与直径为0.292μm的羧基改性胶乳微粒结合，首先令胶乳微粒在混合床离子交换树脂（Bio Rad AG 501-X8）中进行离子交换，室温搅拌2小时。离子交换后，胶乳微粒过滤，准备用于结合。

于50ml聚碳酸酯离心管中加入50ml 0.1M碳酸氢盐缓冲液（pH8.0），和5ml 10wt.%的上述微粒的胶乳微粒悬浮液。反应前，微粒在37℃搅拌保温10分钟。其次在混合物中加入5ml 88mg/ml的新溶于水的1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）-碳化二亚胺盐酸化物（EDC），静置10分钟。然后在剧烈搅拌中加入2.5ml 10mg/ml的地高新-HSA共轭物并保温10分钟。加入5ml 500mM的氨基乙酸缓冲液pH8.5来停止结合。再经10分钟保温以确保反应完全终止。

结合地高新-HSA共轭物的胶乳在26000×g条件下离心20分钟。弃去上层清液，微粒中加入25ml水。微粒在剧烈搅拌下再悬浮。洗涤重复4次，在最后的再悬浮液洗涤步骤用0.05%钠叠氮化物溶液作为储存介质。最后胶乳悬浮液用声处理并稀释至所需要浓度（一般为0.1-0.4wt.%）。

抗地高新抗体缓冲试剂的组成

EDU溶液由溶解2M的EDC于水中，水解并在水解完全后按下述剂量加入所述试剂来制备。

抗地高新抗体试剂为溶解下列物质于水中并用盐酸调节pH值来制备。

3.68% N_aCl

200mM 三-（羟基）-氨基甲烷，pH7.5

1.2% 葡聚糖硫酸钠

8.0% 胆碱盐酸盐

25mM EDU

1mg/ml HSA（人血清清蛋白）

0.05% 钠叠氮化物

1∶120000 稀释抗地高新单克隆抗体（由Beckman得到，最好最后加入）

样品测定的试验条件

用LPIA-100仪器（测定浊度作为时间的函数的免疫测定分析仪器，由Mitsubishi Kasei公司制造）在下述条件下进行试验。首先用含有0，1，2，3和5ng/ml地高新的校准样品建立标准曲线（Roche特征系统）。然后用LPIA-100仪器测定已用放射免疫测定法（RIA.Din-abbott公司，日本）估测并已确定浓度大约从0至3ng/ml的200地高新血清样品，从LPIA仪器得到的刻度数据对含和不含EDU（25mM）的已知地高新溶液的浓度（RIA测定）绘图，并将该图与标准曲线比较。

波长 650nm

样品体积 10μl

推进缓冲剂 50μl

抗体试剂 200μl

胶乳试剂 40μl

测定结果

如图1a-e和图2a-e所示，比较1a与2a，1b与2b等，加入EDU的结果是显著改进了LPIA-100数据分布;在EDU存在的情况下样品数据的分布变得更为精确和可靠。尤其是消除了严重的偏移并提高了样品测定结果的精确度和可信度。五张图a-e用来代表200个点-每图40个点-每个点随机分布，以便更好显示所有数据并避免重叠。

实施例2

为了说明本发明所述的非特异性反应抑制剂在消除或减少非特异性反应时对特异性互补免疫反应体的免疫反应体反应不影响或只产生微小影响，下面的实验将对此做出验证。

制备抗-HB_s抗体F（ab′）₂包裹的胶乳微粒试剂

用胃蛋白酶水解抗肝炎-B表面抗原抗体的免疫球蛋白成分，然后用Sephacryl

S-200凝胶过滤柱色谱纯化，可得抗体的F（ab′）₂碎片。

该F（ab′）₂与聚苯乙烯胶乳微粒在0.1M缓血酸胺缓冲液pH8中混合，然后对该混合物进行离心处理，用牛血清清蛋白更换上层清液以使微粒稳定。

经过数次离心循环洗涤，微粒颗粒最后在储存介质中再悬浮和声处理，然后可用作抗-HB_s抗体胶乳微粒试剂。

样品测定的试验条件

上述微粒用实施例1所用的LPIA-100仪器进行如下测定试验，只是用缓血酸胺-盐水缓冲液（pH8.2）代替抗体试剂并且波长改为950nm。

试验

1.筛选非特异性凝集样品

一些已被单独用RIA证实同HB_s抗原在一起时为阴性的普通血清样品在不加EDU时用LPIA测试表现出有非特异性反应的样品（即样品呈现假性阳性结果;样品2，8，11和14）被选择出来。

这些被选择的假性阳性的样品（即有非特异性反应的样品）在0.50，100mM EDU存在条件下反应后，再用LPIA分析核对。结果如图3所示。

最后，EDU对免疫测定反应性的影响与HB_s表面抗原校准物核对，用以确定EDU是否特异性抑制非特异性反应或是否简单降低试剂反应性。

测定含已知总量的HB_s表面抗原和不同浓度EDU的样品，并与无EDU的标准曲线对照。即使在有100mM EDU的情况下，只看到反应性下降15%。

基于上述试验可表明EDU对非特异性凝集有强的防止作用，并且对特异性互补免疫反应体的免疫反应体相互作用不影响或只产生很小影响。

实施例3

人血清清蛋白（HSA）包裹的微盘的制备

以本领域已知的方法，使用EDC用HSA使经羧化物改良的微盘（Sumitomo Bakelite）活化。

估价加入EDU的影响的试验系统

在实施例1中描述的六个从地高新非特异性反应筛选（未加EDU）中筛选的表现非特异性反应的偏离样品（样品5，7，18，38，46，65）和两个普通（非分离物）样品（NC1和NC2）进行如下测定：

30倍稀释的血清样品与微盘反应60分钟，经数次洗涤后盘与3000倍稀释的家兔抗人免疫球蛋白抗体反应60分钟。盘再经数次洗涤，然后与碱性磷酸酯酶标记的山羊抗家兔免疫球蛋白反应60分钟。

在最后洗涤之后，将可产生碱性磷酸酯酶的底物的颜色溶液加入盘中，通过测定颜色的强度来测定人球蛋白的存在及其总量。用含50mM EDU的稀释剂稀释的样品测定加入EUD产生的影响。

结论

如图4所示，EDU的加入明显降低了相应的高免疫球蛋白在分离物样品（非特异性反应样品）存在时对微盘的附着。普通样品在无EDU时表现出的对免疫球蛋白结合的降低程度与有EDU存在时并无什么大变化。这样EDU的存在明显降低了免疫球蛋白在固体盘状载体上的非特异结合，减少了假性阳性结果。如此便论证了本发明所述的物质对诸如微盘酶免疫试验等的影响。

实施例4

图5所示的11种化合物加入到3种表现出非特异性反应的样品（HR1，HR2，HR3）（即实施例1中的分离物样品）中，如实施例1那样在LPIA-100系统上测定。结果见表1。表中的数字用%值表示相对的反应性，其中100%相应于以图1和图2的标准曲线为基准的预期的反应性。

表1的结果可表明本发明所述的仲胺和叔胺可减少非特异性反应而伯胺的效果则差得很远。

表1

表1（续）

很明显，基于上述技术的启发，本发明还可能有很多改变和变化。应当认识到在所附权利要求的范围里本发明可以通过除在此特别阐述的方法以外的形式得以实施。

Claims

1、一种组合物，包括一种用免疫反应体活化的固体载体和一种用下面通式表达的非特异性反应抑制剂，

其中X是-NH-(CO)-NH-，-NH-(CS)-NH-，

或-N=C=N-，

R₁与R₂可以相同，也可不同，

R₁与R₂是C₁-C₅的直链或支链烷基，或R₁与R₂与氮原子一起为

或是其N-甲基-对-甲苯磺酸盐，

Y可以相同或不同，是H、OH和卤素中任意一个，

R₃是-NR₁R₂、-NH₂，-CHY，环己基或H，

m是0至5的整数，

p是0至5的整数，

n是0或1

假如当n=1，m与p中至少有一个是至少1或假如m=n=p=0时，R₃是H或-CH₂Y和其酸加成盐。

2、如权利要求1所述的组合物，其特征在于：还包括一含水溶剂。

3、如权利要求1所述的组合物，其特征在于：还包括与所述免疫反应体特异性结合的互补免疫反应体。

4、如权利要求2所述的组合物，其特征在于：所述的非特异性反应抑制剂的含量以含水溶剂的体积为基础，从0.1至300mM。

5、如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的固体载体是一种胶乳微粒，所述的免疫反应体与所述的胶乳颗粒靠1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳化二亚胺连结，所述的非特异性反应抑制剂是1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）尿素。

6、如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述的非特异性反应抑制剂是1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）尿素或1-环己基-3-3（2-吗啉代乙基）尿素N-甲-对-甲苯磺酸盐

7、如权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述非特异性反应抑制剂从下列化合物中选择：

二甲胺、二乙胺、二丙胺、N-N-二甲乙胺、3-二甲氨基丙胺、3-二乙氨基丙胺、二甲氨基氯化丙烷和1，3-双（二甲氨基）-2-丙醇

8、一种试剂盒，包括第一和第二试剂包，所述第一试剂包包括一种由免疫反应体活化的固体载体，所述第二试剂包包括一种具有下列通式的非特异性反应抑制剂，

其中X是-NH-（CO）-NH-，-NH-（CS）-NH-，

N＝C＝N 或-N＝C＝N-

R₁与R₂可以相同，也可以不同

R₁与R₂是C₁-C₅的直链或支链烷基，或R₁与R₂与氮原子一起是

或是其N-甲基-对-甲苯磺酸盐

Y可以相同或不同，是H、OH和卤素中任意一个

R₃是-NR₁R₂，-NH₂，-CHY，环己基或H

m是0至5的整数

p是0至5的整数

n是0或1

假如n＝1，m与p中至少有一个是至少1和假如m＝n＝p＝0时，R₃是H或-CH₂Y和其酸加成盐。

9、一种免疫测定方法，包括加入一种非特异性反应抑制剂到待测的样品，到以免疫反应体活化的固体载体，或到待测的样品和以免疫反应体活化的固体载体两者中的步骤，该非特异性反应抑制剂的通式为：

其中X是-NH-（CO）-NH-，-NH-（CS）-NH-，

N＝C＝N

或-N＝C＝N-;

R₁与R₂可以相同，也可以不同

或是其N-甲基-对-甲苯磺酸盐

Y可以相同或不同，是H，OH和卤素（Br，Cl，F）中任意一个

R₃是-NR₁R₂，-NH₂，-CHY，环己基或H

m是0至5的整数

p是0至5的整数

n是0或1

假如n＝1，m与p至少有一个是至少1和假如m＝n＝p＝0时，R₃是H或-CH₂Y，和其酸加成盐。

10、权利要求9所述的方法，其特征在于：所述免疫测定方法为凝聚测定法。

11、权利要求10所述的方法，其特征在于：所述非特异性反应抑制到是1-乙基-3-（3-二甲氨丙基尿素）。

12、权利要求9所述的方法、其特征在于非特异性反应抑制剂选自如下化合物：

二甲胺、二乙胺、二丙胺、N，N-二甲乙胺、3-二甲氨基丙胺，3-二乙氨基丙胺、二甲氨基氯代丙烷、1，3-双（二甲氨基）-2-丙醇。