CN112220049A - 蚯蚓蛋白肽锌螯合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蚯蚓蛋白肽锌螯合物，包括蚯蚓肽粉和硫酸锌，所述蚯蚓肽粉包括以下原料：蚯蚓、碱性蛋白酶、NaOH和HCl，蚯蚓蛋白肽锌螯合物的制备方法，包括以下步骤：S1、蚯蚓肽粉的制备:将蚯蚓烘干，研末成干粉，配成溶液，采用碱性蛋白酶进行水解不同时间，酶与底物浓度比均为2%，同时调节溶液pH值、温度至各酶最适条件，反应过程中不断加入1 M的NaOH，使pH值保持恒定，记录耗碱量，用于计算水解度，待水解结束后水浴使酶灭活，然后用1M的HCl将水解液pH值调整为7.0，真空冷冻干燥水解液，将冻干样品密封于4℃下保存。本发明蚯蚓蛋白肽锌螯合物的制备提高一等皮出皮率10%、提高群平均产仔数1‑2。
Description
技术领域
本发明涉及功能性营养强化剂技术领域，尤其涉及蚯蚓蛋白肽锌螯合物。
背景技术
锌作为人体必需的微量元素之一， 是具有重要生理功能的营养元素， 在机体新陈代谢中具有重要作用， 与生长发育、 生殖、 消化、 免疫、 视觉、 衰老等生理功能都有极密切的关系。儿童营养状况调查结果表明， 我国约有26%～27% 的儿童缺锌，有些地区成年人及老年人也有缺锌症状。 儿童缺锌会影响其智力发展及生长发育， 成人及老年人缺锌则影响正常代谢， 从而导致免疫力降低， 引发多种疾病。 因此， 通过营养强化剂或者膳食补锌具有重要意义。 我国经全国食品添加剂标准化技术委员会审定、 卫生部公布列入使用卫生标准的锌营养强化剂有:氯化锌、 硫酸锌、 氧化锌、 葡萄糖酶锌、 乳酸锌、 乙酸锌(醋酸锌) 、柠檬酸锌(枸橼酸锌)和甘氨酸锌。 其中， 无机锌3种， 有机锌5种。主要应用于乳制品、 婴幼儿食品、 饮液及乳饮料、 谷类及其制品、 食盐等食品中。 目前补锌制剂的研发已经历了四代：最早使用的补锌剂为无机锌， 如硫酸锌、 氯化锌、 氧化锌等,这类锌剂对肠胃有刺激性，生物学效价低,因此使用逐步减少。第二代为有机锌，如葡萄糖酸锌、醋酸锌、 乳酸锌、 柠檬酸锌(枸橼酸锌)等。 因这类锌强化剂在口味、利用率和被人体的吸收性等方面有较大的改善,而被广泛应用。第三代氨基酸螯合锌，它具有良好的生物化学稳定性，易为动物体所吸收， 其生物学效价明显优于有机锌。第四代为生物活性锌，这一类补锌剂多籍助肽的生物活性功能， 可进一步提高锌的吸收率和生物学效价，是新型补锌剂的研究开发重点。如高素蕴等（2003） 研究了大豆分离蛋白水解物中分子量小于10 kDa的混合肽制备螯合锌的方法。邱冬玲等（2008） 研究了以丝素蛋白水解物中的多肽为原料与锌离子合成多肽锌螯合物的方法。刘成梅等（2008） 研究了以罗非鱼皮胶原多肽(TSP-I)为配位体，采用水合体系法与硫酸锌螯合，制备可用于补锌剂的多肽螯合锌技术。
酪蛋白磷酸肽(CaseinPhosphopep-tides，CPPs)是以牛乳酪蛋白为原料， 经单一酶或复合酶系水解， 再经分离纯化而得到的一类含有磷酸丝氨酸簇的天然生理活性短肽。研究表明：CPPs是一种良好的金属结合肽， 在动物小肠环境中能与钙、 铁、 锌二价矿物质离子结合， 防止产生磷酸盐沉淀， 增强肠内可溶性矿物质的浓度， 从而促进吸收利用。如Matsui等(1994)在低钙日粮中添加0.5％CPPs， 大鼠碱性磷酸酶活性高于对照组， 说明CPPs能够提高锌的利用率。Hansen等(1997)和Ashida等(1996)实验表明CPPs具有促进动物对Ca、Zn、Fe吸收的功能。目前，国内外仅有酪蛋白磷酸肽制备方面的文献报道，如ReynoldsEric等（2001） 报道了一种生产酪蛋白磷酸肽的方法， 在蛋白酶水解酪蛋白后的溶液中加入氯化钙，使酪蛋白磷酸肽聚集，再通过过滤器分离出酪蛋白磷酸肽。曹庸（2010）等报道了用胰蛋白酶酶解干酪素， 再采用超滤膜分离， 得到酪蛋白磷酸肽溶液的一种酪蛋白磷酸肽的制备工艺，但是蚯蚓蛋白肽锌螯合物以及制备工艺，并没有被广泛关注，蚯蚓蛋白肽锌螯合物一等皮出皮率并不理想，而且群平均产仔数也是一般水平。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的蚯蚓蛋白肽锌螯合物。
蚯蚓蛋白肽锌螯合物，包括蚯蚓肽粉和硫酸锌，所述蚯蚓肽粉包括以下原料：蚯蚓、碱性蛋白酶、NaOH和HCl 。
蚯蚓蛋白肽锌螯合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、蚯蚓肽粉的制备:将蚯蚓烘干，研末成干粉，配成溶液，采用碱性蛋白酶进行水解不同时间，酶与底物浓度比均为2%，同时调节溶液pH值、温度至各酶最适条件，反应过程中不断加入1 M的NaOH，使pH值保持恒定，记录耗碱量，用于计算水解度，待水解结束后水浴使酶灭活，然后用1M的HCl 将水解液pH值调整为7.0，真空冷冻干燥水解液，将冻干样品密封于4℃下保存；
S2、相对分子质量分布分析：采用SEC-HPLC研究蚯蚓分离肽的分子量分布，使用了Agilent高效液相系统和选择TSK G2000SW柱子以及Agilent紫外检测器，流动相为50mmol/L，pH 7.0的磷酸盐缓冲液，流速1 mL/min，压强为0.3 MPa，测定波长为280 nm，柱温为25 ℃，上样浓度为10 mg/ mL，进样量为1 mL。将样品液在10000 g，离心10 min，进样前经过0.22 µm滤膜处理；
S3、蚯蚓肽锌螯合物的制备：称取一定质量的蚯蚓肽粉和硫酸锌，分别用少量蒸馏水溶解后定容，得到一定浓度的蚯蚓肽溶液和硫酸锌溶液，分别量取一定体积的两种溶液，混合均匀，并置于一定温度下反应至所需时间，冷却后，加入一定体积的无水乙醇，在7500 r/min的转速下离心15 min，除去上清液，并用无水乙醇洗涤离心1~2次。将沉淀物置于45 ℃电热鼓风干燥箱中烘干，得蚯蚓肽锌螯合物。
进一步的，所述S1中的溶液的底物浓度为4% w/w。
进一步的，所述S1中的水浴温度为90℃，时间为5min。
进一步的，所述S2中的标准分子量蛋白如下：肌球蛋白，分子量为200 KDa；β-半乳糖苷酶、大肠杆菌，分子量为116 KDa；磷酸酶b，分子量为97.2 KDa；牛血清白蛋白，分子量为66.4 KDa；卵清蛋白，分子量为44.3 KDa；碳酸苷酶。
进一步的，所述肌球蛋白采用的是猪的肌球蛋白，所述磷酸酶b采用是兔子肌肉，所述卵清蛋白采用的是鸡蛋白，所述碳酸苷酶采用的是牛的碳酸苷酶。
进一步，所述标准分子量蛋白用于校正标准曲线。
本发明提供制备的蚯蚓蛋白肽锌螯合物可用于食品、药品、保健品、能有效促进人体对钙、铁、锌等二价矿物营养素的吸收和利用，而蚯蚓蛋白肽锌螯合物的制备方法可以提高一等皮出皮率10%、提高群平均产仔数1-2。
附图说明
图1为蚯蚓肽与硫酸锌质量比对螯合反应的影响。
图2为蚯蚓肽浓度对螯合反应的影响。
图3为温度对螯合反应的影响。
图4为pH对螯合反应的影响。
图5为时间对螯合反应的影响。
图6为沉淀剂乙醇用量对螯合反应的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
本发明提出的蚯蚓蛋白肽锌螯合物，蚯蚓蛋白肽锌螯合物，包括蚯蚓肽粉和硫酸锌，所述蚯蚓肽粉包括以下原料：蚯蚓、碱性蛋白酶、NaOH和HCl ，蚯蚓蛋白肽锌螯合物的制备方法，包括以下步骤：S1、蚯蚓肽粉的制备:将蚯蚓烘干，研末成干粉，配成溶液，采用碱性蛋白酶进行水解不同时间，酶与底物浓度比均为2%，同时调节溶液pH值、温度至各酶最适条件，反应过程中不断加入1 M的NaOH，使pH值保持恒定，记录耗碱量，用于计算水解度，待水解结束后水浴使酶灭活，然后用1M的HCl 将水解液pH值调整为7.0，真空冷冻干燥水解液，将冻干样品密封于4℃下保存；S2、相对分子质量分布分析：采用SEC-HPLC研究蚯蚓分离肽的分子量分布，使用了Agilent高效液相系统和选择TSK G2000SW柱子以及Agilent紫外检测器，流动相为50 mmol/L，pH 7.0的磷酸盐缓冲液，流速1 mL/min，压强为0.3 MPa，测定波长为280 nm，柱温为25 ℃，上样浓度为10 mg/ mL，进样量为1 mL。将样品液在10000 g，离心10 min，进样前经过0.22 µm滤膜处理；S3、蚯蚓肽锌螯合物的制备：称取一定质量的蚯蚓肽粉和硫酸锌，分别用少量蒸馏水溶解后定容，得到一定浓度的蚯蚓肽溶液和硫酸锌溶液，分别量取一定体积的两种溶液，混合均匀，并置于一定温度下反应至所需时间，冷却后，加入一定体积的无水乙醇，在7500 r/min的转速下离心15 min，除去上清液，并用无水乙醇洗涤离心1~2次。将沉淀物置于45 ℃电热鼓风干燥箱中烘干，得蚯蚓肽锌螯合物。
S1中的溶液的底物浓度为4% w/w，S1中的水浴温度为90℃，时间为5min，S2中的标准分子量蛋白如下：肌球蛋白，分子量为200 KDa；β-半乳糖苷酶、大肠杆菌，分子量为116KDa；磷酸酶b，分子量为97.2 KDa；牛血清白蛋白，分子量为66.4 KDa；卵清蛋白，分子量为44.3 KDa；碳酸苷酶，肌球蛋白采用的是猪的肌球蛋白，所述磷酸酶b采用是兔子肌肉，所述卵清蛋白采用的是鸡蛋白，所述碳酸苷酶采用的是牛的碳酸苷酶，标准分子量蛋白用于校正标准曲线。
实施例：
每组设置3个平行组，测定锌的螯合率及螯合物得率：
锌的螯合率及螯合物得率的测定计算：首先测定蚯蚓肽锌螯合物中锌的质量，称取0.03~0.1 g蚯蚓肽锌螯合物，置于50 mL锥形瓶中，加少量水润湿，滴加2滴50%（V/V）硫酸溶液溶解，加10 mL水、2 mL氟化氨饱和溶液、0.5 mL硫脲溶液（200 g/L）和0.04 g抗坏血酸，摇匀溶解后加入3 mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH5～6）和2滴二甲酚橙指示液（2 g/L），用乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液滴定由紫红色变为亮黄色为终点，同时做空白实验；
试样中锌质量X（g）按下式计算：X=（V1-V2）×C×0.001×65.39
式中：V1—滴定试样溶液所消耗的乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液体积，mL；V2—滴定空白溶液所消耗的乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液体积，mL；C—乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；65.39—锌的相对分子质量。
锌的螯合率及螯合物得率按照以下公式计算。
锌的螯合率（%）=W1/W0×100式中：W0—反应体系中锌的总质量，g；W1—螯合物中锌的总质量，g。
螯合物得率（%）=W3/W2×100式中：W2—初始反应物的总质量，g；W3—反应后蚯蚓肽锌螯合物的总质量，g。
单因素实验及正交实验：实验中对蚯蚓肽与硫酸锌质量比、蚯蚓肽浓度、反应温度、反应pH、反应时间、沉淀剂乙醇用量进行单因素实验；
蚯蚓肽与硫酸锌质量比对螯合反应的影响实验：质量比分别为1:1、4:1、8:1、12:1、16:1、20:1、24:1、28:1、32:1，肽质量浓度0.04 g/mL，温度60 ℃，pH 5.33，反应时间60 min，沉淀剂为反应液体积的1倍，结果见图1；
蚯蚓肽浓度对螯合反应的影响实验：肽质量浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL，肽与硫酸锌质量比为20∶1，温度60 ℃，pH 5.33，反应时间60 min，沉淀剂为反应液体积的1倍，结果见图2；
温度对螯合反应的影响实验：反应温度分别为30、40、50、60、70 ℃，肽与硫酸锌质量比为20:1，肽质量浓度0.04 g/mL，pH 5.33，反应时间60 min，沉淀剂为反应液体积的1倍，结果见图3；
pH对螯合反应的影响实验：反应pH分别为5.33、5、4、3，肽与硫酸锌质量比为20:1，肽质量浓度0.04 g/mL，温度50 ℃，反应时间60 min，沉淀剂为反应液体积的1倍，结果见图4；
时间对螯合反应的影响实验：反应时间分别为20、40、60、80 min，肽与硫酸锌质量比为20:1，肽质量浓度0.04 g/mL，温度50 ℃，pH5.33，沉淀剂为反应液体积的1倍，结果见图5；
沉淀剂乙醇用量对螯合反应的影响实验：乙醇用量分别为反应液体积的0、1、2、3、4、5、6倍，肽与硫酸锌质量比为20:1，肽质量浓度0.04 g/mL，温度50 ℃，pH 5.33，反应时间60min，结果见图6。
在单因素实验基础上确定正交实验的因素及水平，选用L9（34）正交表进行正交实验，实验设计见表1，确定最佳的螯合制备工艺。
表1 正交试验设计表
Table 1 Design of the orthogonal experiment
统计分析：每个试验重复三次，结果表示为平均数±SD。数据统计分析采用Statistix8.1 (分析软件, St Paul, MN) 软件包中Linear Models程序进行，差异显著性(P <0.05)分析使用Tukey HSD程序，采用sigmaplot 11.0 软件作图。
蚯蚓肽相对分子质量分布情况
表2 蚯蚓肽相对分子质量分布情况
Table 1 Relative molecular weight distribution of earthworm peptide
| 相对分子质量（u） | 峰面积百分比（%） | 相对分子质量（u） | 峰面积百分比（%） |
| 10000以上 | 0.00 | 500-1000 | 19.87 |
| 5000-10000 | 0.35 | 140-500 | 60.13 |
| 3000-5000 | 0.72 | 140以下 | 10.72 |
| 1000-3000 | 8.21 |
蚯蚓肽锌制备正交实验
表3 正交实验结果
Table 3 Result of the orthogonal experiment
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.蚯蚓蛋白肽锌螯合物，其特征在于，包括蚯蚓肽粉和硫酸锌，所述蚯蚓肽粉包括以下原料：蚯蚓、碱性蛋白酶、NaOH和HCl 。
2.蚯蚓蛋白肽锌螯合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、蚯蚓肽粉的制备:将蚯蚓烘干，研末成干粉，配成溶液，采用碱性蛋白酶进行水解不同时间，酶与底物浓度比均为2%，同时调节溶液pH值、温度至各酶最适条件，反应过程中不断加入1 M的NaOH，使pH值保持恒定，记录耗碱量，用于计算水解度，待水解结束后水浴使酶灭活，然后用1M的HCl 将水解液pH值调整为7.0，真空冷冻干燥水解液，将冻干样品密封于4℃下保存；
S2、相对分子质量分布分析：采用SEC-HPLC研究蚯蚓分离肽的分子量分布，使用了Agilent高效液相系统和选择TSK G2000SW柱子以及Agilent紫外检测器，流动相为50mmol/L，pH 7.0的磷酸盐缓冲液，流速1 mL/min，压强为0.3 MPa，测定波长为280 nm，柱温为25 ℃，上样浓度为10 mg/ mL，进样量为1 mL；
将样品液在10000 g，离心10 min，进样前经过0.22 µm滤膜处理；
S3、蚯蚓肽锌螯合物的制备：称取一定质量的蚯蚓肽粉和硫酸锌，分别用少量蒸馏水溶解后定容，得到一定浓度的蚯蚓肽溶液和硫酸锌溶液，分别量取一定体积的两种溶液，混合均匀，并置于一定温度下反应至所需时间，冷却后，加入一定体积的无水乙醇，在7500 r/min的转速下离心15 min，除去上清液，并用无水乙醇洗涤离心1~2次；
将沉淀物置于45 ℃电热鼓风干燥箱中烘干，得蚯蚓肽锌螯合物。
3.根据权利要求2所述的蚯蚓蛋白肽锌螯合物的制备方法，其特征在于，所述S1中的溶液的底物浓度为4% w/w。
4.根据权利要求2所述的蚯蚓蛋白肽锌螯合物的制备方法，其特征在于，所述S1中的水浴温度为90℃，时间为5min。
5.根据权利要求2所述的蚯蚓蛋白肽锌螯合物的制备方法，其特征在于，所述S2中的标准分子量蛋白如下：肌球蛋白，分子量为200 KDa；β-半乳糖苷酶、大肠杆菌，分子量为116KDa；磷酸酶b，分子量为97.2 KDa；牛血清白蛋白，分子量为66.4 KDa；卵清蛋白，分子量为44.3 KDa；碳酸苷酶。
6.根据权利要求5所述的蚯蚓蛋白肽锌螯合物，其特征在于，所述肌球蛋白采用的是猪的肌球蛋白，所述磷酸酶b采用是兔子肌肉，所述卵清蛋白采用的是鸡蛋白，所述碳酸苷酶采用的是牛的碳酸苷酶。
7.根据权利要求2所述的蚯蚓蛋白肽锌螯合物的制备方法，其特征在于，所述标准分子量蛋白用于校正标准曲线。
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