JP6219966B2 - 家畜飼料における酵素複合体の使用 - Google Patents
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Description
本発明の技術分野は、動物栄養の技術分野である。
ストレプトマイセス・フラジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）菌株は、Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶにより知られる少なくとも５種類のプロテアーゼおよび２つのペプチダーゼを生成できることが知られている（特許ＧＢ−１１３３５７９）。
特許出願ＷＯ８７／０７９０５において、出願者らは、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ型プロテアーゼのみから成り、ＩＩ型プロテアーゼが優位であるタンパク質分解複合体を得るための方法を記載している。この複合体は、発酵、濾過による複合体の抽出、次いで２，０００から１２，０００の分子量に相当するカットオフレベルを有する膜での限外濾過および最後に微粒化により、ストレプトマイセス・フラジエＷＡＫＳＭＡＮ ３５３５菌株から得られる。こうして粉末形態で得られた該複合体は、タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも２，０００アンソン単位の力価を有する。
この出願において、ＩＩ型プロテアーゼは、１８ｋＤａに近い分子量および９．０に近い等電点を特徴とする。
動物飼料において使用されたこの複合体は、高い粗タンパク質含量を含む飼料を動物が容易に吸収できるようにし、これにより動物の成長を促進する。さらに、妊娠している雌ブタに使用されたこの複合体は、出生時体重の増加のほか、摂食量の低下および健康の全体的な改善を促進する。
しかし、この方法は、さらなる汚染副生成物を効果的に取り除くことができない。
特許出願ＷＯ ９７／３７６８１において、タンパク質１ｍｇ当たり少なくとも４，０００アンソン単位の力価を含む生成物を治療的用途に使用できるように改善される。したがって、主要なプロテイナーゼは、タンパク質１ｍｇ当たり１００，０００アンソン単位を上回る比活性を有し、３０から３６ｋＤａの分子量および７．０に近い等電点を有する。
この後の分析は、該プロテアーゼの分子量が１８−２０ｋＤａであることを示した。
記載された治療的用途は、特定の病気に特徴的な粘液の分泌の低下、感染症との戦いにおける腸管吸収の改善および血流またはその他における改善のプラスの作用から本質的に成る。さらに、該組成物は、腸管内壁の萎縮したまたは損傷した絨毛の再生を促進することができると記載されている。
ストレプトマイセス・フラジエ培養物から抽出された酵素複合体の重要な治療特性を考えると、酵素複合体の活性を妨げ得る生物学的不純物がより完全に除去された酵素複合体を使用することが重要である。
したがって、本発明の目的は、前述の酵素複合体を改善すること、すなわち、農場における育種条件および動物の健康を増進するために前述の酵素複合体を改善することである。
したがって、本発明は、家畜飼料を補うための、ストレプトマイセス・フラジエ菌株を培養して得られたプロテアーゼの混合物を含む酵素複合体の使用であって、プロテアーゼのこの混合物のうち、プロテアーゼの１つが７．０付近の等電点を有し、もう１つが８．０付近の等電点を有することを特徴とする、使用に関する。
前記複合体は、これらの２種類のプロテアーゼを主に含有し、換言すると、これらの２つのプロテアーゼの割合は、前記混合物の活性の８０％を超える。
本発明の１つの特徴によれば、等電点が７．０付近であるプロテアーゼは、タンパク質１ｍｇ当たり約１５０，０００アンソン単位の比活性を有する。
本発明の１つの特徴によれば、等電点が８．０付近であるプロテアーゼは、タンパク質１ｍｇ当たり約３８，０００アンソン単位の比活性を有する。
本発明の別の特徴によれば、酵素複合体は、農場動物の全身状態を改善するために、飼料組成物との混合に適した粉末、液体または任意の他の形態で飼料サプリメントとして使用される。
本発明の別の特徴によれば、粉末形態の酵素複合体は、均一化されるまで回転ドラム中で飼料組成物と乾燥混合される。
本発明の別の特徴によれば、液体形態の酵素複合体は、流動床中で飼料組成物に噴霧され、次いで顆粒化される。
本発明の別の特徴によれば、酵素複合体は家禽用飼料において使用される。
本発明の別の特徴によれば、酵素複合体はブタ用飼料において使用される。
本発明の別の特徴によれば、酵素複合体は魚用飼料において使用される。
本発明はまた、本発明による酵素複合体を含み、場合により栄養分のための賦形剤もしくはビヒクル、または他の添加剤を含む、家畜用飼料組成物にも関する。
本発明は最後に、本発明による酵素複合体の製造方法であって、ストレプトマイセス・フラジエ菌株を培養すること、発酵ブロスを濾過すること、この後に酵素複合体を、限外濾過およびイオン交換クロマトグラフィーとこれに続く等電点電気泳動により抽出すること、ならびに最後に、こうして得られた複合体が凍結乾燥することを特徴とする、方法に関する。
本発明は、特徴が厳密に定義されている飼料サプリメントを提供する。
本発明は第一に、必要とされた治療効果を得るために飼料組成物中に投与される用量を正確に適合させることができる。
本発明はまた、農場における動物の健康を改善する利点も有する。
さらに、本発明はまた、農場における動物の全身状態も改善させ、このような施設の利益性を強化する。
本発明はさらに、摂食量の低下を伴う動物の成長を改善することができる。
本発明の他の特徴、事項および利点は、例として示された種々の実施形態および腸絨毛を図示する図に関する以下に示されたさらなる記載からより明らかとなる。
Ｐａｎｓｔｉｍａｓｅ（Ｒ）（ＰＡＮｃｒｅａｔｉｃ ＳＴＩＭｕｌａｔｉｎｇ ｄｉａｓｔＡＳＥ）の下に商品化されている酵素混合物は、ストレプトマイセス・フラジエの発酵により得られた酵素複合体であることが知られている。この複合体は、３つのプロテアーゼを本質的に含有し、これらの幾つかは菌核タンパク質（ｓｃｌｅｒｏｔｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）（コラーゲン、エラスチンおよびケラチン）に特異的に作用するが、コレラ菌（ｃｈｏｌｅｒａｉｃ ｖｉｂｒｉｏ）または特定の病原性エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株により放出されたタンパク質性の特定の毒素にも作用すると記載されている。
畜産の分野において、技術的に定義され、完全に一定した、したがって特性が明白に定義された生産品を有することが重要である。
本発明による酵素複合体を得るために、ストレプトマイセス・フラジエ菌株が培養され、得られた発酵ブロスが濾過される。この後、酵素複合体が抽出され、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動により特徴付けされる。最後に、得られた複合体が凍結乾燥される。
ストレプトマイセス・フラジエ培養のために、遺伝的に改善することができる、すなわちタンパク質分解活性の増加または抗生物質のいずれかの分泌の抑制を得ることができるタイプＷＡＫＳＭＡＮ ３５３の菌株が例えば使用される。
培養は、大規模発酵槽において適切な生育培地中で行われる。この生育培地は、例えば、大豆ミール：１５ｇ／ｌ、グルコース：３０ｇ／ｌ、リン酸二カリウム（ｂｉｐｏｔａｓｓｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：１ｇ／ｌ、炭酸カルシウム：１０ｇ／ｌに基づいてもよい。
反応は、１分間当たり培地１容量に対し無菌空気０．３容量の通気により、７．０から７．５のｐＨ、約２８℃の発酵温度で起こる。
培養が完了すると、菌糸体が、清澄剤を用いた発酵ブロスの濾過により取り除かれる。
酵素複合体の抽出は、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび等電点電気泳動を含む幾つかの手法の実施を必要とした。
限外濾過
濾液の限外濾過は、５０ｋＤａのカットオフレベルを有する膜を用いて行われる。
濾液の限外濾過は、５０ｋＤａのカットオフレベルを有する膜を用いて行われる。
濾過の３時間後、濾液（最初の容量の７１％）は、ゼラチン膜アッセイにより明らかにされたタンパク質分解活性を有する。このアッセイは、硬い枠の上に配置されたシルバーゼラチンの膜の劣化にある。
イオン交換クロマトグラフィーアッセイ
適切な大きさのＣｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ−５００カルボキシメチルゲル（Ａｍｉｃｏｎ）のカラムを用いて作製されたカチオン交換クロマトグラフィーを使用した。
適切な大きさのＣｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ−５００カルボキシメチルゲル（Ａｍｉｃｏｎ）のカラムを用いて作製されたカチオン交換クロマトグラフィーを使用した。
クロマトグラフィー緩衝液はクエン酸緩衝液１０ｍＭ、ｐＨ５．５であり、溶出は０から１．０ＭのＮａＣｌ勾配により行われる。溶出速度はカラムのサイズに依存する。例えば、溶出速度は、直径２．５ｃｍおよび高さ２７ｃｍのカラムに対し１０から１５ｍｌ／分である。
等電点電気泳動
分析的等電点電気泳動は、ＰｈａｓｔシステムにおけるｐＨ３から９用にＰｈａｒｍａｃｉａにより製造された既製ゲルを用いて行われる。顕色は、クマシーブルーを用いて行われる。
分析的等電点電気泳動は、ＰｈａｓｔシステムにおけるｐＨ３から９用にＰｈａｒｍａｃｉａにより製造された既製ゲルを用いて行われる。顕色は、クマシーブルーを用いて行われる。
固体培地における分取等電点電気泳動の場合、酵素溶液は蒸留水（９５ｍｌ）に対して透析され、Ｕｌｔｒｏｄｅｘゲル４．７ｇおよびグリシン０．５ｇを含む３−９両性電解質５ｍｌと混合される。ゲルは４０℃で６時間乾燥される。泳動は、夜間または同等の期間に３Ｗの定電力で起こる。顕色は、クマシーブルーを用いて行われる。
種々のゲルストリップが取り出され、水３ｍｌですすがれ、濾過され、次いでＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液３ｍｌですすがれる。
こうして得られた画分が、このタンパク質分解活性およびタンパク質含量を判定するために次に分析される。試料は、次いでＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液０．３Ｍ、ｐＨ８．０に対して透析される。
液体培地における分取等電点電気泳動の場合、蒸留水に対して透析された酵素溶液が両性電解質（３．５ｍｌ）と混合される。泳動は、４時間の間に８Ｗの定電力で行われる。
画分試料は、次いでＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液０．３Ｍ、ｐＨ８．０に対して透析される。
上に示された実験条件は、得られるべき生成物の量および産業条件での使用に従って適合される。
主要なプロテアーゼがこれにより、７．０付近の等電点（ＩＥＰ）を有する混合物において得られ、ＩＥＰが８．０付近であるプロテアーゼがより少ない割合で得られる。
ＩＥＰが７．０付近である主要なプロテアーゼは、０．４９ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で９ｍｌの容量で得られる。このプロテアーゼの等電点での沈殿のため、精製には特別な注意が必要とされ得る。得られた溶液は、約７５，０００アンソン単位（Ａ．Ｕ）／ｍｌの力価を有する。
このプロテアーゼは、４ｍｇのスケールでの均一化後に精製され、タンパク質１ｍｇ当たり１５０，０００Ａ．Ｕの比活性を有する。
１アンソン単位（ＡＵ）は、変性ヘモグロビンの存在下、２５℃、ｐＨ７．５で１０分間インキュベートされると、トリクロロ酢酸で沈殿され得ない濾液において２８０ｎｍの分光光度吸収により判定された、１マイクログラム当量のチロシンをこの基質から放出する酵素の量として本明細書では定義される。
ＩＥＰが８．０付近であるプロテアーゼは、以前のものと一緒に、ただしより大容量（例えば３５ｍｌの）で回収され、１．４８ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する。この溶液は、約５６，０００ Ａ．Ｕ／ｍｌの力価を有する。
このプロテアーゼは、５０ｍｇのスケールでの均一化後に精製され、タンパク質１ｍｇ当たり約３８，０００ Ａ．Ｕの比活性を有する。
前述の酵素複合体は、プロテアーゼおよび他のタンパク質を本質的に含有する。行われた精製および使用された電気泳動法は、追加の精製およびタンパク質分解活性を持たない汚染物質の除去を証明するものである。
生成された種々のプロテアーゼは、コラーゲン、ケラチン、エラスチンまたはヘモグロビンなどのタンパク質におけるこの活性の判定により良好に特徴付けることができる。
残念ながら、これらの判定は、感度および特異度が欠如しているため複雑である。したがって、検出方法を成す幾つかの活性アッセイ、および主にアンソン方法が頼りにされなければならない。
活性アッセイ
アンソン（Ａｎｓｏｎ）アッセイ
このアッセイにより、特異性なしでタンパク質分解活性を測定できる。該アッセイは、放出されたオリゴペプチドに含有されたチロシンの分光光度測定による、変性ヘモグロビンの加水分解を測定して行われる。
アンソン（Ａｎｓｏｎ）アッセイ
このアッセイにより、特異性なしでタンパク質分解活性を測定できる。該アッセイは、放出されたオリゴペプチドに含有されたチロシンの分光光度測定による、変性ヘモグロビンの加水分解を測定して行われる。
アゾカゼインアッセイ
このアッセイは、オレンジ色素により染色されたカゼインの加水分解を４４０ｎｍの分光光度測定により決められる。このアッセイは特異的でない。酵素とのインキュベーション後、残りのアゾカゼインはトリクロロ酢酸を用いて沈殿する。光学密度を測定することにより、放出されたペプチドの存在を確認でき、したがって酵素活性を確認できる。
このアッセイは、オレンジ色素により染色されたカゼインの加水分解を４４０ｎｍの分光光度測定により決められる。このアッセイは特異的でない。酵素とのインキュベーション後、残りのアゾカゼインはトリクロロ酢酸を用いて沈殿する。光学密度を測定することにより、放出されたペプチドの存在を確認でき、したがって酵素活性を確認できる。
エラスチン分解活性アッセイ
エラスチンコンゴレッドアッセイ
このアッセイは、赤色色素により染色されたエラスチンの加水分解により放出された染色ペプチドを４９５ｎｍで分光光度的に測定することに存する。
エラスチンコンゴレッドアッセイ
このアッセイは、赤色色素により染色されたエラスチンの加水分解により放出された染色ペプチドを４９５ｎｍで分光光度的に測定することに存する。
この線量の起こり得る問題は基質の不溶性にあり、したがってこの感度は、試料精度、インキュベーション培地の撹拌およびインキュベーション容器の壁への基質の接着に依存する。
行われたアッセイは、酵素の活性と量の間に直線性が欠如していることを示す。活性とインキュベーション時間の間に有効な直線性はあるが、これを表す直線は原点を通らない。
したがって、吸光度の差は、インキュベーション時間間（２０分と４０分）で測定することができる。１０倍希釈された１０μｌの複合体で、０．０４９μＤＯ／分の変化量が測定される。したがって、本発明による酵素複合体は、エラスチンに関してタンパク質分解活性を有する。
ＮＢＡアッセイ
（Ｎ−Ｂｌｏｃ−Ｌ−アラニネート−パラ−ニトロフェニルエステル） このアッセイは、放出されたパラニトロフェノールを判定して、エラスターゼに存在するエステラーゼ活性を３４７．５ｎｍで分光光度的に測定して行われる（Ｖｉｓｓｉｅｒ Ｌ．ら Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２６８（１９７２）２０７．２６０）。
（Ｎ−Ｂｌｏｃ−Ｌ−アラニネート−パラ−ニトロフェニルエステル） このアッセイは、放出されたパラニトロフェノールを判定して、エラスターゼに存在するエステラーゼ活性を３４７．５ｎｍで分光光度的に測定して行われる（Ｖｉｓｓｉｅｒ Ｌ．ら Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２６８（１９７２）２０７．２６０）。
この線量はエラスチン分解活性に特異的でないが、極めて迅速であり（３分の反応速度）、良好な感度を有する。
実際、１００倍希釈された５０μｌの複合体で、０．２３５μＤＯ／分の変化量が測定される。したがって、酵素複合体は、パラニトロフェノールの放出を可能にする活性を有する。
コラーゲン分解活性アッセイ
アゾコルアッセイ
このアッセイは、アゾコル（ボルドーレッド色素で染色されたコラーゲン粉末（ｇｒｏｕｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ））の加水分解により放出されたペプチドを５２０ｎｍで分光光度的に測定することに存する（Ｃｈａｖｉｒａ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３６（１９８４） ４４６−４５０頁）。
アゾコルアッセイ
このアッセイは、アゾコル（ボルドーレッド色素で染色されたコラーゲン粉末（ｇｒｏｕｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ））の加水分解により放出されたペプチドを５２０ｎｍで分光光度的に測定することに存する（Ｃｈａｖｉｒａ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３６（１９８４） ４４６−４５０頁）。
このアッセイは、エラスチンコンゴレッドと同じ欠点（不溶性基質）を抱えているが、良好な感度を有する。５０倍希釈された５０μｌの複合体で、０．３９８のＤＯが１０分間のインキュベーション後に測定される。したがって、本発明による酵素複合体は、アゾコルに関してタンパク質分解活性を有する。
したがって、本発明による酵素複合体のタンパク質分解活性が確定されている。前記複合体の精製は、活性を変えなかった。
こうして得られ、特徴付けられたタンパク質複合体は、動物治療薬において、すなわち特に高齢動物のための免疫刺激剤およびパイエル板の再生剤として使用することができる。
さらに、該酵素複合体により、高齢動物（ラット、ニワトリ等）における腸絨毛の再生が可能になり、したがって必須栄養分の腸管吸収を大幅に改善する。
本発明による酵素複合体は、畜産に対して主に意図され、より詳細には家畜用飼料（ウシ、ブタ、ヒツジ）ならびに家禽、ウサギおよび魚用飼料のほか、任意の他の単胃動物用の飼料の改善に対して主に意図される。
０．０２５から１ｇ／ｋｇの用量で飼料組成物に組み込まれると、この酵素複合体はこれらの動物の代謝を増大させ、より良好な全身の健康の確保に寄与する。好ましくは、飼料組成物に導入された複合体の用量は０．０５から０．２ｇ／ｋｇである。
バタリー飼育の場合、良好な全身の健康を維持することが重要である。これは、これが乱交または閉じ込めに起因した病気の伝播を避けるためである。したがって、罹患率は実質的に低下し、家畜の細菌汚染による死亡率は著しく低下する。
この酵素混合物に基づく飼料組成物は、例えば、穀物粉（小麦、トウモロコシ、ライ麦、コメ、キビおよびソルガム）、大豆、炭水化物（ラクトース、マンノース）、増量成分（カゼイン、ふすま、セルロース、セルロース誘導体）および／またはミネラル成分（チョーク、粘土、ベントナイト、シリカ）ならびに動物栄養において使用されている全ての他の成分などの、栄養分のための１つまたは幾つかの賦形剤またはビヒクルを含有する。
これらの組成物は、回転ドラム中で複合体と完全に乾燥混合され、または液体形態、特に水性形態の酵素複合体が、流動床として飼料組成物に噴霧され、次いで顆粒化される。このような操作は、１５℃から６０℃の可変温度で行うことができる。
より純粋でより活性な酵素複合体の使用により、本発明による栄養組成物の生物活性がより良好に測定できるようになり、得られる結果が十分に均一になる。
このため、本発明による飼料組成物は、明白に判定され、且つ一定の酵素複合体含量を有する。
したがってここに、栄養素の賦形剤または適切なビヒクルと混合された本発明による酵素複合体を含有する、家畜用飼料組成物の例の非包括的リストを挙げる。
家禽用飼料組成物
組成物は、酵素複合体を添加する１０ｋｇのバッチに対して調製される：
小麦粉 ２．５ｋｇ
ラクトース ４．５ｋｇ
ふすま ３ｋｇ
本発明による酵素複合体 ０．２ｇ／ｋｇ
このような組成物が、家禽用飼料１トン当たり０．５ｋｇの割合で組み込まれる。
組成物は、酵素複合体を添加する１０ｋｇのバッチに対して調製される：
小麦粉 ２．５ｋｇ
ラクトース ４．５ｋｇ
ふすま ３ｋｇ
本発明による酵素複合体 ０．２ｇ／ｋｇ
このような組成物が、家禽用飼料１トン当たり０．５ｋｇの割合で組み込まれる。
家禽用飼料組成物
組成物は、酵素複合体が添加された２０．１ｋｇのバッチに対して調製され、次いで家禽用飼料に組み込まれる：
小麦粉 １．５ｋｇ
エンバク粉 ４．５ｋｇ
セルロース １４ｋｇ
コロイダルシリカ ０．１００ｋｇ
本発明による酵素複合体 ０．１ｇ／ｋｇ
組成物は、酵素複合体が添加された２０．１ｋｇのバッチに対して調製され、次いで家禽用飼料に組み込まれる：
小麦粉 １．５ｋｇ
エンバク粉 ４．５ｋｇ
セルロース １４ｋｇ
コロイダルシリカ ０．１００ｋｇ
本発明による酵素複合体 ０．１ｇ／ｋｇ
ブタ用飼料組成物
組成物は、酵素複合体が添加された１０ｋｇのバッチに対して調製され、次いでブタ用飼料に組み込まれる：
小麦粉 ４ｋｇ
ふすま ２ｋｇ
カゼイン ３ｋｇ
ジャガイモデンプン １ｋｇ
本発明による酵素複合体 ０．２ｇ／ｋｇ
組成物は、酵素複合体が添加された１０ｋｇのバッチに対して調製され、次いでブタ用飼料に組み込まれる：
小麦粉 ４ｋｇ
ふすま ２ｋｇ
カゼイン ３ｋｇ
ジャガイモデンプン １ｋｇ
本発明による酵素複合体 ０．２ｇ／ｋｇ
畜牛用飼料組成物
組成物は、
コメデンプン ０．５ｋｇ
ジャガイモデンプン ２．５ｋｇ
本発明による酵素複合体 ０．２ｇ／ｋｇ
を用いて同じように調製される。
組成物は、
コメデンプン ０．５ｋｇ
ジャガイモデンプン ２．５ｋｇ
本発明による酵素複合体 ０．２ｇ／ｋｇ
を用いて同じように調製される。
こうして形成されたプレミックスは、ヒツジタンパク質粉末６ｋｇおよびカゼイン１４ｋｇの混合物に少しずつ添加される。均一化された調製物は、飼料１トン当たり０．５ｋｇの割合で畜牛用飼料に組み込まれることが意図される。
家禽用飼料組成物
組成物は、酵素複合体が添加される１０ｋｇのバッチに対して調製される：
トウモロコシ ５．６５ｋｇ
大豆ミール ３．２３ｋｇ
綿実粕 ０．３ｋｇ
小麦胚芽粉 ０．４ｋｇ
チョーク ０．１３ｋｇ
リン酸二カルシウム ０．１６ｋｇ
ＮａＣｌ ０．０３ｋｇ
アミノ酸複合体 ０．１ｋｇ
本発明による酵素複合体 ０．２ｇ／ｋｇ
本発明による酵素複合体はまた、これらの調製物を補うために市販の家禽用飼料組成物に添加することもできる。
組成物は、酵素複合体が添加される１０ｋｇのバッチに対して調製される：
トウモロコシ ５．６５ｋｇ
大豆ミール ３．２３ｋｇ
綿実粕 ０．３ｋｇ
小麦胚芽粉 ０．４ｋｇ
チョーク ０．１３ｋｇ
リン酸二カルシウム ０．１６ｋｇ
ＮａＣｌ ０．０３ｋｇ
アミノ酸複合体 ０．１ｋｇ
本発明による酵素複合体 ０．２ｇ／ｋｇ
本発明による酵素複合体はまた、これらの調製物を補うために市販の家禽用飼料組成物に添加することもできる。
魚用飼料組成物
以下の組成物は、慣例に従って魚用飼料に調製され、組み込まれる。
魚粉 ５０．８％
動物性脂肪および油 ２８％
大豆ミール ９．９％
小麦粉 １０％
ビタミン複合体（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｃ、．．．） １％
本発明による酵素複合体 ０．３％
以下の組成物は、慣例に従って魚用飼料に調製され、組み込まれる。
魚粉 ５０．８％
動物性脂肪および油 ２８％
大豆ミール ９．９％
小麦粉 １０％
ビタミン複合体（Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｃ、．．．） １％
本発明による酵素複合体 ０．３％
腸絨毛に対する本発明による複合体の作用を判定するために、アッセイを比較的高齢のラット（月齢７ケ月を超える）で行った。
これらのラットは、専ら小麦粉、大豆またはトウモロコシタイプの植物性タンパク質に基づく餌を与えられる。前述の本発明による酵素複合体が、０．１または０．２ｇ／ｋｇの割合でこの飼料に添加される。
結果は、図１から４に説明されている。これらの図は、十二指腸および空腸の絨毛の光子顕微鏡像（拡大 ×１２０）である。
これは、高齢動物（ラット、ニワトリ等）の飼料への酵素複合体の添加が、十二指腸および空腸の両方において絨毛のサイズおよび数を増加させることを立証するものである。最大７０％の増加が観察された。
これらの結果は、腸微絨毛に転換することができる。同様の結果が、ニワトリ、ブタおよび魚で得られる。
表面積の増加により、栄養分または医薬品のより迅速な吸収が可能になる。
この改善された吸収は、抗生物質を含有する飼料が与えられているマスで観察される。該アッセイにおいて、飼料はオキシテトラサイクリン４ｇ／ｋｇを含有し、結果は４８時間後に読み取られる。したがって、肝臓で１００％（１ｇ当たり２．５マイクログラムではなく５．７５マイクログラム）、筋肉で４００％（１ｇ当たり０．３２マイクログラムではなく１．７５マイクログラム）および腎臓で１０００％（１ｇ当たり０．５マイクログラムではなく５．７５マイクログラム）の大きさの抗生物質の組織濃度の増加が、観察される。
同様の結果が、ニワトリおよびブタで得られる。
密度のこの増加は、腸ホルモンなどの生理学的に活性な化合物の局所生成の増加をもたらすことができる。
Claims (10)
- 家畜飼料を補うための、ストレプトマイセス・フラジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）菌株を培養して得られたプロテアーゼの混合物を含む酵素複合体の使用であって、プロテアーゼのこの混合物のうち、プロテアーゼの１つが７．０付近の等電点を有し、もう１つが８．０付近の等電点を有することを特徴とし、前記酵素複合体は、前記２つのタイプのプロテアーゼを優勢的に含み、前記２つのプロテアーゼの比率は前記混合物の活性の８０％を超え、前記酵素複合体は、農場動物の全身状態を改善するための、飼料組成物との混合に適した粉末又は液体の飼料サプリメントとしての酵素複合体の使用。
- 等電点が７．０付近であるプロテアーゼが、タンパク質１ｍｇ当たり約１５０，０００アンソン単位の比活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
- 等電点が８．０付近であるプロテアーゼが、タンパク質１ｍｇ当たり約３８，０００アンソン単位の比活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の使用。
- 粉末形態の酵素複合体が、均一化されるまで回転ドラム中で飼料組成物と乾燥混合されることを特徴とする、請求項２又は３に記載の使用。
- 液体形態の酵素複合体が、流動床中で飼料組成物に噴霧され、次いで顆粒化されることを特徴とする、請求項２又は３に記載の使用。
- 家禽用飼料における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
- ブタ用飼料における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
- 魚用飼料における、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
- 請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素複合体を含む、家畜用飼料組成物。
- 請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素複合体の製造方法であって、ストレプトマイセス・フラジエ菌株を培養すること、発酵ブロスを濾過すること、この後に酵素複合体を、限外濾過およびイオン交換クロマトグラフィーとこれに続く等電点電気泳動により抽出すること、最後に、こうして得られた複合体を凍結乾燥することを特徴とする、方法。
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