CN112206202A

CN112206202A - 一种载活菌的微针的制备方法及应用

Info

Publication number: CN112206202A
Application number: CN202011309763.6A
Authority: CN
Inventors: 赵远锦; 陈国璞; 王逢源; 王月桐; 张大淦; 池俊杰
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2020-11-20
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2021-01-12
Also published as: WO2022105824A1

Abstract

本发明提供一种载活菌的微针的制备方法，该方法将活的功能性细菌混入水凝胶溶液，将载有活菌的水凝胶溶液填充微针模板的空隙，固化后移去模板得到载活菌的微针阵列。本发明方法所制备的载活菌的水凝胶微针可用于皮肤病治疗，被包裹的活菌可借助微针从皮肤中获取营养，逃离免疫系统，功能性细菌可连续产生和分泌多种有治疗效果的多肽，避免耐药，并且细菌固定在微针内，使用后可将被包裹的细菌连同微针一起移除，最大限度降低感染风险；微针穿透性强，可增强药物的渗透能力，可根据病变深度调整微针高度，以获得更好的治疗效果。本发明方法简单，操作方便，价格低廉，可重复利用，安全性强，适宜推广。

Description

一种载活菌的微针的制备方法及应用

技术领域：

本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种载活菌的微针的制备方法及应用，该微针可应用于皮肤表层疾病简单、高效且无痛治疗技术领域中。

背景技术：

皮肤病已成为全球日益严重的公共健康问题，严重影响患者生活质量。局部用药是治疗皮肤病的主要方式，但是诸如真菌感染等皮肤病变，病原体极易发生变异产生耐药。而且，药物治疗可引起许多不良反应，包括肝肾毒性、胃肠功能障碍、药疹和过敏反应等。不仅如此，大部分药物是亲脂的，由于致密角质层的阻挡作用，许多药物渗透性不佳，在角质层大量蓄积，极大地降低了药物疗效。因此，亟需研发不耐药、副作用小、渗透性强的新型局部给药方式。

受到有益细菌和其他微生物的自然竞争规律的启发，提出一种新型的载活菌的微针用于皮肤病的治疗。在自然界中，优势细菌能有效地击退、阻挡和干扰其他微生物的繁殖，并通过快速、大规模的繁殖和定殖抢占生存空间。在这个过程中，他们可以分泌大量的抗菌药物，以提高竞争力。因此，这些有益菌已被观察到具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗肿瘤、免疫抑制和抗支原体等。然而，由于无法控制的细菌感染风险、固有的细菌毒性、有限的药物产量，活菌疗法效果往往不理想。此外，如何将细菌定植到治疗靶点，并保护它们不受免疫系统的伤害，以确保疗效仍是一个挑战。因此，活菌仍然缺乏有效的剂型，很少用于实际的临床治疗。

微针阵列给药是近年来新兴的局部皮肤促渗透给药技术，结合了贴膏剂的便捷性和皮下注射给药的有效性，规避了其他给药方式的不足，因具有安全、无痛、高效渗透等特点而备受关注。微针由长度为数百微米的微型针阵列组成，可在不接触毛细血管和神经末梢的前提下，在角质层形成微型通道，突破角质层的阻隔作用，介导药物的渗透，从而减少药物在角质层的蓄积量，增加到达表皮、真皮及皮下组织的药物剂量，且可根据皮损病变深度选择相应长度的微针，实现个性化医疗。除此之外，使用极为方便，不需要专业培训，患者可自行给药，意外针刺风险低，且用后易于处理。基于此，本发明提出一种载活菌的水凝胶微针阵列的制备方法，用于皮肤表层的疾病治疗。

发明内容：

本发明的第一目的是针对现有技术的不足，提供一种载活菌的微针的制备方法，以解决传统药物耐药、副反应多、渗透性差的缺点。

本发明的第二目的是提供一种载活菌的微针的应用。

本发明采用以下技术方案：

一种载活菌的微针的制备方法，包括以下步骤：

S1、激光刻蚀PDMS(聚二甲基硅氧烷)基板，获得不同高度、密度、直径的微针阵列模板；

S2、配制水凝胶溶液，将活的功能性细菌混合在水凝胶溶液中；

S3、将S2中制备的功能性细菌与水凝胶混合液，灌注到S1所制备的微针阵列模板表面，固化后得到不同高度、密度、直径的载活菌的微针。

进一步的，S1中所获得的微针阵列模板，针高200μm～1mm，底端半径50～250μm，相邻微针间距300～800μm，微针阵列模板尺寸0.5～5cm。

进一步的，S2中，所述水凝胶溶液选自聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)、丝素蛋白、甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)、羧甲基纤维素、海藻糖、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)中的一种或多种。

进一步的，S2中，所述功能性细菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌、大肠杆菌、多黏类芽孢杆菌中的一种或多种。

进一步的，S2中，所述功能性细菌在水凝胶溶液中的浓度范围为0～10¹⁰CFU/mL。

本发明还提供上述制备方法所制备的载活菌的微针在皮肤表层疾病治疗中的应用

本发明的有益效果：

(1)本发明方法所制备的载活菌的水凝胶微针阵列可用于皮肤病治疗，微针阵列包裹的有益细菌可直接分泌多肽杀死致病菌，从而避免耐药；并且细菌固定在微针内，使用后可将被包裹的细菌连同微针一起移除，最大限度降低感染风险；

(2)本发明方法可通过不同大小的模具，制造出不同尺寸、针号和高度的微针，所制备的载活菌的水凝胶微针穿透性强，可增强药物的渗透能力，可根据病变深度选择不同高度的微针，以达到更好的治疗效果；

(3)本发明以微针模板倒模制备微针，方法简单，操作方便，价格低廉，可重复利用，不需要很高的技术要求，且易对微针阵列的基本形貌进行控制，安全性强，适宜推广。

附图说明：

图1是载活菌微针示意图；

图2是不同形貌的微针阵列；a为拍摄角度示意图；b为500μm高的微针；c为600μm高的微针；d为800μm高的微针；

图3是微针搭载活菌后不同层面的荧光图；a为微针底座横截面；b为针体中层的横截面；c为针体上层的横截面；

图4为本发明抗真菌实验示意图；a为小鼠真菌感染后分别予以生理盐水、单纯微针、载活菌的微针以及酮康唑治疗后的动物表皮实拍图；b为小鼠真菌感染后分别予以生理盐水、单纯微针、载活菌的微针以及酮康唑治疗治疗14d后PAS染色图。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种载活菌的微针的制备方法，包括以下步骤：

S1、微针阵列模板的制备：微针模板是用激光刻蚀PDMS基板制作而成，获得不同高度、密度、直径的微针阵列模板；

S2、载活菌水凝胶溶液的制备：配制水凝胶溶液，将活的功能性细菌混合在水凝胶溶液中；

S3、载活菌微针的制备：将S2中制备的功能性细菌与水凝胶混合液，灌注到S1所制备的微针阵列模板表面，固化后得到不同高度、密度、直径的载活菌的微针。

本发明步骤S1中所获得的微针阵列模板，针高200μm～1mm，底端半径50～250μm，相邻微针间距300～800μm，微针阵列模板尺寸0.5～5cm。

本发明步骤S2中，所述水凝胶溶液选自聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)、丝素蛋白、甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)、羧甲基纤维素、海藻糖、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸(PLA)、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)中的一种或多种；所述功能性细菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌、大肠杆菌、多黏类芽孢杆菌中的一种或多种；所述功能性细菌在水凝胶溶液中的浓度范围为0～10¹⁰CFU/mL。

实施例1

本实施例载活菌的微针的制备方法，步骤如下：

S1、微针阵列模板的制备：微针模板是用激光刻蚀PDMS基板制作而成，获得微针阵列模板；其中，底板尺寸15mm×15mm，微针阵列为20x20个，每个针是金字塔形状，每根针底部尺寸为230μm x 230μm，高度为500μm；

S2、载活菌水凝胶溶液的制备：将枯草芽孢杆菌的菌种加入到LB琼脂培养皿中，37℃培养箱中孵育过夜，然后将一个菌落转移到装有5mL新鲜LB的玻璃管中，37℃孵育3～6h后得到枯草芽孢杆菌培养液；将250μL PEGDA溶液(50％v/v，溶剂为去离子水)、PVA(10％v/v)和光引发剂2-羟基-2-甲基苯基丙酮(HMPP)(1％v/v)混合形成水凝胶溶液，将枯草芽孢杆菌培养液混合在上述水凝胶溶液中，形成载活菌水凝胶溶液；

S3、载活菌微针的制备：将S2中制备的枯草芽孢杆菌与水凝胶混合液，灌注到S1所制备的微针阵列模板表面，真空5～10分钟，待溶液完全填补针尖，水凝胶溶液在紫外灯下照射5秒进行固化，最后，将固化的载活菌微针阵列轻轻剥离出模板，得到载有枯草芽孢杆菌的微针。

对比例1

本对比例为不载有功能性活菌的水凝胶微针。

制备方法如下：

S2、水凝胶溶液的制备：将250μL PEGDA溶液(50％v/v，溶剂为去离子水)、PVA(10％v/v)和光引发剂2-羟基-2-甲基苯基丙酮(HMPP)(1％v/v)混合形成水凝胶溶液；

S3、水凝胶微针的制备：将S2中制备的水凝胶溶液，灌注到S1所制备的微针阵列模板表面，真空5分钟，待溶液完全填补针尖，水凝胶溶液在紫外灯下照射5秒进行固化，最后，将固化的微针阵列轻轻剥离出模板，得到水凝胶微针，室温密封保存，备用。

将本实施例和对比例进行小鼠皮肤浅表真菌感染治疗试验：

小鼠的处理：BALB/c雄性小鼠，8-12周，体重18-25g，分别于实验第1天、第3天腹腔注射环磷酰胺(150mg/kg体重)，于第3天皮下注射氢化可的松(40mg/kg体重)，此后每隔3天注射环磷酰胺(75mg/kg体重)，保证小鼠处于免疫抑制状态。于第4天将小鼠麻醉，剃除小鼠背部毛发(约2cm*2cm大小)，用磨砂纸反复摩擦皮肤，直至出现小的渗血点，涂抹200μl108/ml的白念珠菌(SC5314菌株)孢子悬液，于感染后第1天开始治疗。

分组：将感染白念珠菌的小鼠随机分为4组，分别为对照组(外用生理盐水，2次/天)、载活菌的微针组(本发明实施例)、水凝胶微针组(本发明对比例)、酮康唑混悬液组(外用2％酮康唑混悬液，2次/天)。

参照上述4组对小鼠进行治疗，于治疗第14天将小鼠处死，取小鼠背部皮损，以10％(V/V)甲醛溶液固定过夜，做病理检查，观察治疗效果。

实验结果参照图4，图4中，a为小鼠真菌感染后分别予以对照组、单纯微针、载活菌的微针以及酮康唑治疗后的动物表皮实拍图；b为小鼠真菌感染后治疗14d后PAS染色图。由图4可看出，对照组以及单纯微针组感染严重，PAS染色可见大量紫红色的真菌，而载活菌的微针组(本发明实施例)基本恢复正常，未见菌丝，效果与酮康唑类似。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种载活菌的微针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、激光刻蚀PDMS基板，获得不同高度、密度、直径的微针阵列模板；

2.根据权利要求1所述的载活菌的微针的制备方法，其特征在于，S1中所获得的微针阵列模板，针高200µm~1mm，底端半径50~250 µm，相邻微针间距300~800µm，微针阵列模板尺寸0.5~5cm。

3.根据权利要求1所述的载活菌的微针的制备方法，其特征在于，S2中，所述水凝胶溶液为聚乙二醇双丙烯酸酯、丝素蛋白、甲基丙烯酸酯明胶、羧甲基纤维素、海藻糖、透明质酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、半乳糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的载活菌的微针的制备方法，其特征在于，S2中，所述功能性细菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌、大肠杆菌、多黏类芽孢杆菌中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的载活菌的微针的制备方法，其特征在于，S2中，所述功能性细菌在水凝胶溶液中的浓度范围为0~10¹⁰CFU/mL。

6.权利要求1所制备的载活菌的微针在皮肤表层疾病治疗中的应用。