CN112190664B - 一种人参与石斛中药合剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人参与石斛中药合剂及其应用。本发明提供的人参与石斛中药合剂包括人参提取物和铁皮石斛提取物，所述人参提取物和铁皮石斛提取物的比例为1:1.5～2.5。本发明技术方案通过将人参和石斛联合使用，两者具有明显的协同作用，能改善人参的副作用，提高机体的抗疲劳作用。将人参和石斛联合使用可影响中枢抗疲劳能力和增加组织对多余血糖的吸收，避免运动过程中的高血糖对机体运动耐力的影响。

Description

一种人参与石斛中药合剂及其应用

技术领域

本发明涉及中药提取与应用技术领域，特别涉及一种人参与石斛中药合剂及其应用。

背景技术

疲劳是指人长期大量劳动或患病后出现的一种亚健康状态，人体一感到疲劳其工作效率和运动耐力等就会降低，对外界的反应也愈加迟钝，严重影响工作和生活。目前，人们对疲劳产生的机制认识还不深，其中，较有说服力的两种疲劳产生机制有运动性疲劳和中枢性疲劳。运动型疲劳主要阐述了机体因过量运动过程中和后期机体产生大量代谢产物，无法及时排除，导致机体的内稳态平衡被打破，继而使机体感觉不适。中枢性疲劳则解释机体使用兴奋药或感觉疲劳时，中枢神经系统（CNS）的某些神经递质会一场排放或者被一直排放，继而给大脑释放疲劳的信息，抑制大脑兴奋，使机体感觉疲劳。

人参，为五加科属多年生植物，盛产于亚洲东部，是中华九大仙草之一。《神农本草经》记载：“人参，味甘微寒，主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智。久服，轻身延年。”因为被人们认为是补元气最佳用药，现代药理研究发现人参具有增强记忆力、提高免疫力、改善心血管、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等功效。

铁皮石斛，为兰科属多年生植物，主要产于中国安徽、浙江、福建等地。与人参同誉为仙草，有生津养胃、清热滋阴、强腰明目等作用。现代研究发现铁皮石斛里面含有丰富的多糖、氨基酸和生物碱等，具有降血糖、抗肿瘤、抗疲劳及增强免疫力等药理作用。

目前，市面上出现了许多人参或铁皮石斛的保健品，其描述的主要功效是抗疲劳和提高免疫力的作用。然而人参味甘微寒，为大补之药，久用人易燥热，继而引发身体不适。石斛为滋阴清热良药，长期单独使用亦会使人体出现阴盛阳衰的现象，对人体健康不利。中医讲究阴阳平衡，长期单独地使用一种药物易使人体平衡发生变化，继而产生疾病。药对是中医临床组方中常见的配伍形式，通过药性的互补，按不同的比例在大处方中协调整体方剂的疗效或降低毒性或必要时单独作为一个小处方使用，通过药对配伍可以发挥协同增效或配伍减毒等作用。

根据唐代药王孙思邈的《千金翼方》中卷第十五补益、补五脏等章节记载有五个汤方，有人参和石斛同时出现，分别是大补肾汤、肾沥散、大五补丸、淮南八公石斛散及琥珀散。可见，人参和石斛在唐代时就作为一对药对在补益汤方中出现，然而，人参和石斛在经方中是与其他中药一起出现，其配伍时用药的比例亦不断在变化，这两种中药是否能脱离大复方组成一个用于抗疲劳的小复方尚待研究。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种人参与石斛中药合剂，旨在减小人参副作用的基础上，增强中药对机体抗疲劳的作用。

为实现上述目的，本发明提出了一种人参与石斛中药合剂，包括人参提取物和铁皮石斛提取物，其特征在于，所述人参提取物和铁皮石斛提取物的比例为1：1.5~2.5。

优选地，所述人参提取物和铁皮石斛提取物的比例为1：2。

优选地，所述中药合剂的剂量范围为0.5687g/kg~9.1g/kg。

优选地，所述中药合剂的剂量范围为0.5687g/kg~3.185g/kg。

优选地，所述人参提取物或铁皮石斛提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）取人参或铁皮石斛用粉碎机打粉过60目筛，电子天平称取人参25g加20倍体积蒸馏水，加热回流反复提取3次；

（2）采用16目纱布挤压出汁，合并提取液后浓缩至原体积1/10，置于-30度冰箱，冻结成冰块；

（3）将步骤（2）得到的冰块置于冻干机中，控制冷阱温度为-90℃，冻干后将产物碾成粉末，即得所述人参提取物或铁皮石斛提取物。

为实现上述目的，本发明还提出一种人参与石斛中药合剂的应用方法，包括上述所述的人参与石斛中药合剂，应用于制备抗疲劳保健品。

本发明技术方案通过将人参和石斛联合使用，两者具有明显的协同作用，能改善人参的副作用，提高机体的抗疲劳作用。将人参和石斛联合使用可影响中枢抗疲劳能力和增加组织对多余血糖的吸收，避免运动过程中的高血糖对机体运动耐力的影响。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所用材料包括：人参、铁皮石斛。

本发明所用仪器包括：电子天平（G&G JJ）（精密度：百分之一），购自双杰兄弟集团有限公司（美国）；FA1004电子分析天平（精密度：万分之一），购自上海精科天美贸易有限公司（中国）；微量移液器，购自Eppendorf公司（德国）；4度冰箱，购自青岛海尔公司（中国）；-80度超低温冰箱（ULT1386），购自Thermo Fisher Scientific 公司（美国）；小型台式高速冷冻离心机，购自Eppendorf公司（德国）；电热恒温水浴锅，购自天津市泰斯特仪器有限公司；全波长酶标仪，购自美国电热公司；数显电热鼓风干燥箱（101A-1），购自上海浦东荣丰科学仪器；500克摇摆式高速万能粉碎机，购自浙江屹立工贸有限公司。

本发明所用试剂盒包括：尿素氮试剂盒（C013-1 二乙酰肟法），南京建成生物工程研究所；乳酸检测试剂盒，购自南京建成生物工程；肝/肌糖原测定试剂盒，购自南京建成生物工程；血糖试纸，购自强生公司。

本发明动物实验中，选用的实验对象为昆明小鼠，雄性，体重18～22g，由汕头大学医学院实验动物中心提供；小鼠基础饲料由汕头大学医学院实验动物中心提供。

本发明采用如下方法制备人参提取物：取适量人参用粉碎机打粉过60目筛，电子天平称取人参25g，加20倍体积蒸馏水，加热回流反复提取3次。16目纱布挤压出汁，合并提取液后于旋转蒸发仪（水浴锅60℃，自来水回流冷凝，真空度0.055MPa）浓缩至原体积1/10即按生药算0.17g/ml，浓缩时间约2小时，置于-30^oC冰箱，冻结成冰块，次日于冻干机（冷阱-90℃）冻干。冻干后将产物碾成粉末并称重。

本发明采用如下方法制备石斛提取物：取适量石斛用粉碎机打粉过60目筛，电子天平称取石斛40g，加20倍体积蒸馏水，加热回流反复提取3次。16目纱布挤压出汁，合并提取液后于旋转蒸发仪（水浴锅60℃，自来水回流冷凝，真空度0.055MPa）浓缩至原体积1/10即按生药算0.17g/ml，浓缩时间大约2小时，置于-30^oC冰箱，冻结成冰块，次日于冻干机（冷阱-90℃）冻干。冻干后将产物碾成粉末并称重。

需要说明的是，根据《中国药典》介绍，人参人用生药量的推荐剂量为3g/天，按人体重为60kg计算，人的推荐剂量为0.05g/kg/天；铁皮石斛（干燥）人用生药量的推荐剂量为6g/天，同样按体重60kg计算，人的推荐剂量为0.1g/kg/天。在本发明中，按小鼠与人的剂量换算公式1计算，公式1如下式所述：

在此基础上，称取适量基础饲料，在粉碎机中打粉过筛，与人参和/或石斛提取物混合制备含药基础饲料。

实施例1

人参、铁皮石斛的负重游泳试剂剂量-效应关系实验

根据中国中药药典规定的最低剂量按0.625倍，1.25倍，2.5倍，5倍和10倍，将人参和铁皮石斛各自分为5个剂量组，即0.568g / kg，1.1375g / kg，2.275g / kg，4.55g / kg和9.1g / kg。在人参和铁皮石斛组中，各自将小鼠分为6组：空白对照组（0g / kg，后续用Ctrl表示），0.568g / kg，1.1375g / kg，2.275g / kg，4.55g / kg和9.1g / kg，每两天记录一次体重。给药14天后，小鼠尾根部套上负荷体重5%的铁丝。放入深30cm四面光滑的水箱中游泳，水温25±3℃ ， 参照MCARDLE 推荐的力竭判断标准，即小鼠沉入水中10s内不能返回水面视为力竭。记录游泳开始时间至力竭的时间作为小鼠游泳时间。

人参组小鼠负重游泳时间影响实验，如表1所示：

表1. 不同剂量人参对小鼠负重游泳时间影响（Mean±SEM）

铁皮石斛组小鼠负重游泳时间影响实验，如表2所示：

表2. 不同剂量铁皮石斛对小鼠负重游泳时间影响（Mean±SEM）

注：数据表示为Mean±SEM（n= 10），并通过使用单因素方差分析（one-wayANOVA）和Dunn's检验进行分析。与对照组相比，*<0.05，**<0.01和***<0.001。

由表1和表2可知，小鼠给药14天后，进行负重游泳试验，人参单药与Ctrl组相比，0.568g/kg、1.1375g/kg、2.275g/kg、4.55g/kg这四个剂量组的游泳时间均明显高于Ctrl组，游泳时间分别是Ctrl组的1.25倍、1.41倍、1.57倍、1.23倍。人参提取物的负重游泳时间在最低剂量时时间延长特别明显，随着剂量的上升负重游泳时间随之延长，然而在剂量为2.275g/kg处，其游泳时间达到顶峰，其后剂量越上升负重游泳时间随之减少。游泳时间的减少显示服用大剂量人参的小鼠出现亚健康状态。

石斛提取物在低剂量时其负重游泳时间延长地不是特别明显，但其效果会随着剂量的增大而上升，在4.55g/kg处达到最大，其后剂量增大其游泳时间没有明显上升。

实施例2

均匀设计实验

以人参、和铁皮石斛为参数，以最低推荐剂量至其十倍剂量为剂量范围，改变不同的用药剂量，采用均匀设计表U5（52）进行研究。将人参和铁皮石斛在设计的剂量范围内设计5个水平，根据均匀设计表安排5种不同组合的水平分组，另设一个空白对照组，即Ctrl组，进行6组试验。采用同实施例1相同的方法测试各组小鼠游泳开始时间至力竭的时间。各组剂量及实验结果如表3、表4所示：

表3.均匀设计组参斛合剂的剂量

表4. 不同剂量参斛合剂对小鼠负重游泳时间影响（Mean±SEM）

注：数据表示为Mean±SEM（n= 10），并通过使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和进行分析。与Ctrl相比，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

采用SPSS软件处理上述数据，使用多元线性回归逐步回归的模型，得到模型

；通过求偏导可得到最佳剂量为PG=2.89g/kg ， DO=6.03g/kg ，即人参与铁皮石斛联合应用约以1：2的比例即可发挥较好的作用。

实施例3

抗疲劳生化指标测定

昆明小鼠96只（6周大，18~22g，n=16/组）分为6组，空白对照组、人参组、石斛组、参斛合剂1、参斛合剂2、参斛合剂3、参斛合剂4、参斛合剂5五组，基础饲料量为750g，14天分别持续给予正常饲料、含人参提取物饲料2.275 g/kg、含石斛提取物饲料2.275 g/kg、含参斛合剂饲料0.5687g/kg、1.137g/kg 、2.275g/kg、4.55g/kg和9.1g/kg，其中，参斛合剂组中人参与铁皮石斛的比例为1：2，参斛合剂组剂量效应关系如表5所示：

表5. 最佳比例（参斛合剂）抗疲劳试验的饲料混合比例

实施例3中各组给药剂量如表6所示：

表6.实施例3中各组给药剂量

负重游泳测试

小鼠按要求给药14天后，末次给予含药饲料2h后，取10只小鼠在小鼠尾根部套上负荷体重5%的铁丝。放入深30cm四面光滑的水箱中游泳，水温25±3℃ ， 参照MCARDLE 推荐的力竭判断标准，即小鼠沉入水中10s内不能返回水面视为力竭。记录游泳开始时间至力竭的时间作为小鼠游泳时间。

血尿素氮测定

给药第15天后，末次给予含药饲料2小时后。取10只小鼠，将小鼠投入水中，不负重游泳90min，捞出小鼠擦干放入干净垫料，休息30min后摘眼球取血于无抗凝剂的1.5ml离心管中，取0.5ml全血放4℃冰箱，2h后取出2000r/min离心15min取血清。按血尿素氮试剂盒测试。

将血液在 2000rpm 下离心 15min 后取血清，按试剂盒说明书方法测定血清中尿素氮的含量，如表7所示：

表7.实施例3中血尿素氮测定方法

混匀后沸水浴15min，立即用自来水冷却。520nm，1cm光径测定各管OD值。按公式2计算血清中尿素氮含量

公式2：

实施例3中小鼠负重游泳时间和血清尿素浓度影响结果如表8所示：

表8. 不同剂量对小鼠负重游泳时间和血清尿素浓度的影响

数据表示为Mean±SEM（n= 10），并通过使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和进行分析。 与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

当机体高强度运动时，机体的肌肉能量代谢失衡，机体从糖和脂肪分解得到的能量不能足够供应肌肉的活动时，机体便会开始分解蛋白质，被分解的蛋白质经过一系列反应后转化为血氨，又经血氨循环转变为血清尿素。在激烈运动及强体力劳动时核苷酸代谢也随之加强，核苷酸以及核苷分解时都要脱下氨基产生氨，再经尿素循环产生尿素，这也使血尿素含量增高。血清尿素氮是机体内蛋白质和氨基酸分解代谢的最终产物，是评价运动时机体内蛋白质和分解代谢的常用指标，它一般反映机体蛋白质氨基酸分解代谢的状况，对于评价机体承受体力负荷的能力是一个非常灵敏的指标。机体对运动负荷的适应性越差，则含量上升越高。

由表8结果可知，小鼠使用参斛合剂后，其抗疲劳能力（负重游泳时间和尿素氮清除能力）明显增强。即使在剂量最低时亦有显著高于普通组的抗疲劳能力，抗疲劳起效浓度与人参相当。而其抗疲劳能力随剂量的增高而增强，没有出现大量使用人参后出现的倒转现象。

小鼠按要求给药14天后，每组随机选取10只小鼠做负重游泳试验得到以下结果。发现同样2.275g/kg剂量的人参和铁皮石斛，人参的游泳时间要比铁皮石斛长。而剂量在2.275g/kg的参斛合剂，其游泳时间与人参相比没有统计学差异，在其剂量为两倍后才有显著的统计学差异；与铁皮石斛相比有显著的统计学差异，在其剂量为两倍后有极显著的统计学差异。第16天小鼠不负重游泳60min，测其血液中尿素氮的含量发现用药的小鼠长时间运动后的血液中的尿素氮明显比不用药的小鼠少，该结果与实验二的结果非常吻合。而将参斛合剂的低、中、高剂量与人参相比，三个剂量组与人参组并无统计学差异；与铁皮石斛组相比，低剂量组无统计学差异，中、高剂量组有统计学差异。这提示，参斛合剂的强清除血尿素的能力来源于人参。

小鼠连续给药15天后，随机选取6只小鼠，测定血糖和血乳酸，并得到以下结果。小鼠在运动过程中血糖均有明显升高的现象。而用药的小鼠血糖升高得比较高，尤其是食用了人参和铁皮石斛的小鼠。而食用了参斛合剂的小鼠，其各组小鼠血糖升高得并不明显。尤其是最高剂量组（剂量为人参和铁皮石斛的两倍）的血糖值，与Ctrl组相比无统计学意义。而小鼠休息20min后Ctrl组小鼠的血糖降低至7.82±1.04，而其他食用药物的小鼠血糖浓度不降反升。观察各组小鼠血糖浓度变化发现参斛合剂的小鼠血糖浓度变化幅度不大且相对稳定，尤其以最高剂量组的血糖升降最为稳定。

通过乳酸试剂盒检测各时间段的小鼠血液中乳酸的浓度。各组小鼠开始时乳酸浓度基本一致，运动10min后Ctrl组小鼠的乳酸值明显升高，而食用药物的小鼠乳酸值低于Ctrl组小鼠的乳酸值，各组与Ctrl组相比具有统计学意义。休息20min后各组的乳酸值均下降至6.50 mmol/L左右，而参斛合剂的中剂量和高剂量要比其他组低，相比具有统计学差异。

血乳酸测定

准确吸取全血50ul（枪头用抗凝剂肝素钠2500U/ml润洗），于0.3ml蛋白沉淀剂中反复吹打30~40下混匀，3500 rpm 下离心10min，取上清液测定血乳酸含量。取5ml离心管，按表9所示方法测定：

表9.实施例3中血乳酸测定方法

按计算公式3、4计算乳酸含量

公式3：

公式4： 乳酸曲线下面积= 1/2×（游泳前血乳酸值+游泳后0min的血乳酸值）×10+1/2（游泳后0min血乳酸值+游泳后休息20min的血乳酸值）×20

本实施例中采用SPSS16.0统计软件进行处理，所有数据均以Mean±SEM表示，采用单因素方差分析；P<0.05，有统计学差异；P<0.01，统计学差异非常显著；P>0.05，不具有统计学意义。

实施例3中人参、石斛及参斛合剂的血液生化指标结果如表10、11所示：

表10. 不同剂量对小鼠短时程运动过程的血糖的影响

表11. 不同剂量对小鼠短时程运动过程的血乳酸浓度及血乳酸的曲线下面积的影响

数据表示为Mean±SEM（n= 10），并通过使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和进行分析。与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

根据公式：乳酸曲线下面积= 1/2×（游泳前血乳酸值+游泳后0min的血乳酸值）×10+1/2（游泳后0min血乳酸值+游泳后休息20min的血乳酸值）×20；将各时间段的乳酸值整合成乳酸曲线下面积后得到的结果：与Ctrl组相比人参组降低了8.82%；铁皮石斛组降低了12.10%；参斛合剂低剂量组降低了6.27%；参斛合剂中剂量组降低了13.93%；参斛合剂高剂量组降低了17.78%。根据结果可知铁皮石斛2.275g/kg的乳酸清除能力与人参2.275g/kg相比更有优势。而参斛合剂的低剂量组与Ctrl组对比低于Ctrl组，且有统计学差异，但与人参和铁皮石斛组相比却高于这两组。参斛合剂的中剂量组和高剂量组的乳酸曲线下面积明显比人参和铁皮石斛低。

根据血乳酸结果来看，参斛合剂对血乳酸的清除能力亦与剂量的升高成正比当剂量达到4.55g/kg后其乳酸清除能力与9.1g/kg的剂量非常接近。

由此可知，参斛合剂以1：2的比例配伍后其增强疲劳的能力与同剂量的人参和石斛相较有明显的优势，如同为2.275g/kg的剂量下参斛合剂的抗疲劳能力与人参相当，比石斛强，而相较下期仅使用了1/3量的人参及2/3量的石斛便有此起效，并且参斛合剂在9.1g/kg的剂量下甚至不会出现类似人参一样的耐疲劳能力下降的现象。根据实验结果，参斛合剂的体现耐疲劳能力的剂量范围为0.5687g/kg~9.1g/kg，按比例算即人参为0.19~3.03 g/kg，石斛0.37~6.06 g/kg，换算成人剂量则为人参为0.02~0.33 g/kg，石斛0.04~0.67 g/kg，按成人60kg算，人参为1.2~19.8 g，石斛2.4~40.2 g，但按药典规定，人参推荐剂量为3g，最大限量为9g，石斛干品推荐剂量为6g，最大限量为12g。据此限制参斛合剂按成人60kg算人参为1.2~9g，石斛剂量为2.4~12g。

将不同剂量的人参、铁皮石斛和参斛合剂应用于小鼠检测小鼠脏器及肝糖原和肌糖原，实验结果见表12、13：

表12. 人参、铁皮石斛和参斛合剂对小鼠的脏器重量比例的影响

表13. 人参、铁皮石斛和参斛合剂对小鼠肝和肌肉糖原含量的影响

通过对比实验小鼠的脏器重量比例，发现服用人参16天的小鼠心脏比例明显增大，服用铁皮石斛的小鼠心脏比例有略微的下降，该数据有统计学差异。虽然参斛合剂的心脏比例在2.275g/kg～4.55g/kg时有增大的趋势，然而与Ctrl组相比没有统计学差异。对比肝重比，服用人参小鼠肝脏的增长有统计学差异，而铁皮石斛的平均值与人参的相近，但没有统计学差异；参斛合剂的肝脏重量比例在剂量为2.275g/kg和4.55g/kg时有显著的统计学差异。对比脾脏的重量比例服用药物的各组小鼠除铁皮石斛组小鼠脾脏比例下降外其余均有增长的趋势；对比各组小鼠的左侧大腿全肌肉，各组小鼠的大腿肌肉组织重量明显比正常组大。

根据表12和表13的结果显示，小鼠肝组织中肝糖原含量明显比Ctrl组小鼠的高。且对比人参和铁皮石斛两者的肝糖原含量，铁皮石斛的肝糖原含量明显比人参高；而与参斛合剂相比参斛合剂的低剂量组（剂量为铁皮石斛的1/2倍）明显比铁皮石斛的高，这表明人参和铁皮石斛联合使用能够刺激小鼠大量合成肝糖原。观察小鼠的肌肉组织中的糖原含量，其结果与肝糖原一致，Ctrl组小鼠的肌糖原含量比连续给药16天的小鼠低，然而对比给药组的小鼠之间的肌糖原含量，各组的肌糖原并无明显的差异性，即人参和铁皮石斛均能提高小鼠肌糖原含量，但在联合使用的情况下并无类似于肝糖原的情况那样刺激肌糖原大量合成。

上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的构思下，利用本发明说明书所作的等效变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (2)

1.一种人参与石斛混合制剂，其特征在于，由人参提取物和铁皮石斛提取物组成，所述人参提取物和铁皮石斛提取物的比例为1:2，其中，所述人参提取物或铁皮石斛提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）取人参或铁皮石斛用粉碎机打粉过60目筛，电子天平称取人参25g加20倍体积蒸馏水，加热回流反复提取3次；

（2）采用16目纱布挤压出汁，合并提取液后浓缩至原体积1/10，置于-30度冰箱，冻结成冰块；

（3）将步骤（2）得到的冰块置于冻干机中，控制冷阱温度为-90℃，冻干后将产物碾成粉末，即得所述人参提取物或铁皮石斛提取物。

2.一种如权利要求1所述的人参与石斛混合制剂的应用，其特征在于，应用于制备抗疲劳保健品。