CN112174963B - 一种苦参碱的加工方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种苦参碱的加工方法，涉及植物化学技术领域，包括：以山豆根或苦参为原料，采用超声波间歇式辅助的提取工序；对提取工序所得提取液的精制工序；上述提取工序中，采用以苦参碱为模板的分子印迹材料辅助提取，并在提取完成后，对分离得到的分子印迹材料进行洗脱；再将精制产物和洗脱产物进行结晶和固液分离的分离工序。本发明提供的加工方法利用分子印迹材料对苦参碱专一的识别选择性与高的吸附容量，提升目标产物苦参碱的纯度，提高收率和提取效率，缩短提取时间，降低资源损耗和生产成本；该苦参碱的金属配合物对肿瘤细胞的半数抑制浓度较苦参碱降低了46.6％，表现出比苦参碱更高的抗肿瘤活性和对细胞增殖更优的抑制作用。

Description

一种苦参碱的加工方法
技术领域
本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种苦参碱的加工方法。
背景技术
苦参，中药名，为豆科槐属植物苦参(Sophora flavescens)的根。苦参又名苦甘草、苦豆根、西豆根、野槐根、山槐根等。苦参性苦、寒，具有清热燥湿、杀虫、利尿等功效；用于热痢、便血、黄疸尿闭、赤白带下、阴肿阴痒等。据文献报道，苦参主要含两种化学成分：生物碱和黄酮。其中苦参碱作为苦参等植物的提取物，是一类具有抗炎、抗肿瘤、抗菌和抗病毒等多种药理作用与功效的生物碱。由于苦参碱作为抗癌药物而具有重大的开发价值，近年来备受关注。
苦参中苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、槐定碱、氧化槐果碱的含量占苦参中总生物碱含量的90％。关于苦参碱的人和其他动物的药理药效作用试验表明，其药品开发应用前景非常广阔，而目前对于苦参碱的提取技术还不够完善。现有技术中，从苦参根中提取分离苦参碱有效成分的技术有水浸泡法、酸水浸泡法、水煎煮法、酸水/醇渗漉法、醇回流法、超临界萃取法、超声提取法等。但传统煎煮、渗漉等方法，工艺流程长，耗时多至48-72h，生产环节多，提取效率不高，还存在难于分离、提取产物纯度低等问题，因而生产成本较高，资源浪费大，尤其在生产过程中环境污染严重。如超临界萃取法，对于苦参碱这类商品价值不太高的生物碱，则提取费用过高，且对有效成分的后续加工、成本控制和加工方法都提出较高的要求和条件。
现如今，随着科学技术的发展以及对中药综合研究的深入，中医药有了新的开发前景，并有着更加广阔的用途。鉴于我国苦参资源丰富，苦参中生物碱类成分良好的药理作用，其在复方制剂中及临床用药上的使用量将会逐渐上升，尚有很大的开发前景及空间。基于这一趋势，开发和研究能替代传统工艺方法，实现高效、节能、环保式提取的新的加工方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用分子印迹材料对苦参碱专一的识别选择性与高的吸附容量，提升目标产物苦参碱的纯度，提高收率和提取效率，缩短提取时间，降低资源损耗和生产成本的苦参碱的加工方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种苦参碱的加工方法，包括：以山豆根或苦参为原料，采用超声波间歇式辅助的提取工序；和，对提取工序所得提取液的精制工序；
上述提取工序中，采用以苦参碱为模板的分子印迹材料辅助提取，并在提取完成后，对分离得到的分子印迹材料进行洗脱；
以及，将精制产物和洗脱产物进行结晶和固液分离的分离工序；
上述提取工序在不超过40℃的温度下进行。
通过上述技术方案，采用超声波和分子印迹材料辅助提取苦参碱，利用分子印迹材料对苦参碱专一的识别选择性与高的吸附容量，提升目标产物苦参碱的纯度，提高了收率和提取效率，缩短了提取时间，目标产物苦参碱纯度高品质好，从而达到降低资源损耗和生产成本的目的。
根据本发明，上述提取工序中，超声波的输出功率为300-600W，频率为20-40kHz；上述间歇式辅助操作如下：超声次数为5-10次，单次时间为2-3min，间隔时间为15-30s。采用超声提取技术，比蒸煮法或回流法的提取时间短，间隔式提取也能避免高温对苦参碱有效成分的破坏，使目标产物苦参碱纯度更高，从而达到降低能耗和生产成本的目的。
根据本发明，上述提取工序中，提取媒介为体积浓度为70-85％的乙醇溶液；上述提取温度为20-40℃，提取时间为10-30min。
根据本发明，上述分子印迹材料通过以下方法制得：将苦参碱、亚甲基丁二酸溶解在氯仿-十二醇体系中，然后加入季戊四醇三丙烯酸酯、水杨羟肟酸、三甲氧基烯丙基硅烷和偶氮二异丁腈，涡旋混合形成均一体系后，通入氮气10-30min，然后将体系置于温度为40-50℃的密闭环境中反应1-3h，反应结束后，用体积比为9:1的甲醇:乙酸洗脱模板分子苦参碱，然后烘干，研磨，过200目筛，即得。
通过上述技术方案，亚甲基丁二酸和季戊四醇三丙烯酸酯在引发剂作用下发生接枝聚合，再将模板分子苦参碱分布在聚合物层间形成印迹空穴，能对提取物中的苦参碱进行结合和吸附，及时降低提取液中苦参碱的浓度，使得目标产物苦参碱不断被释放进入提取液中，提高了提取效率，降低原料损耗率。该分子印迹材料的洗脱性能优良，还具有良好的再生与循环使用性。
进一步设置为，上述苦参碱、亚甲基丁二酸、季戊四醇三丙烯酸酯、水杨羟肟酸、三甲氧基烯丙基硅烷和偶氮二异丁腈的重量份比例为0.5-2:4-10:15-35:0.01-0.03:0.01-0.05:1-3。亚甲基丁二酸、季戊四醇三丙烯酸酯经引发进行接枝聚合，体系中的水杨羟肟酸和三甲氧基烯丙基硅烷可能是进一步调整了模板分子苦参碱在聚合物中的分布，使得形成的印迹空穴在尺寸、吸附位点和空间结构上能与苦参碱高度匹配，从而提升分子印迹材料对苦参碱的专一识别选择性和结合亲和性，进而使得相似结构如氧化苦参碱等物质不能被匹配，从而提升目标产物苦参碱的纯度，还能使得分子印迹材料对目标产物苦参碱的结合性能和吸附容量大大增加，提高目标产物的提取效率和收率。
根据本发明，上述洗脱步骤为：将提取工序分离得到的分子印迹材料先用50-65℃的去离子水洗脱20-30min，再用15-30℃的甲醇-乙酸溶液洗脱60-75min，即可得到洗脱液。该分子印迹材料在较低的温度下拥有高的溶胀度，在高温下溶胀度小，因此在低温下有利于分子印迹材料对苦参碱的吸附和解吸。
为了提升苦参碱的药理活性，克服其在实际应用床中受到的限制，本发明还提供了一种苦参碱的金属配合物，上述苦参碱由上述的加工方法制得，上述金属为铁。该苦参碱的金属配合物对肿瘤细胞的半数抑制浓度较苦参碱降低了46.6％，表现出比苦参碱更高的抗肿瘤活性，以及对细胞增殖更优的抑制作用，具有更优的应用价值。该苦参碱的金属配合物还具有广泛的抗菌、抗炎、抗过敏、消肿利尿、免疫集生物调节等作用，能将其运用到相应的药物制备上。
本发明还提供了一种苦参碱的金属配合物的制备方法，包括：将苦参碱和氯化铁用无水乙醇溶解后，高温回流，然后滴加盐酸溶液至反应体系中无沉淀后，降温，过滤，然后对沉淀淋洗，重结晶，得到呈黄色的苦参碱-铁配合物。
根据本发明，上述苦参碱和氯化铁摩尔比为1:1-1.2，盐酸溶液的浓度为1-1.2mol/L；上述高温回流的温度为80-100℃，时间为40-60min。
本发明还提供了一种用于制备抗肿瘤药物的组合物，包含苦参碱的金属配合物。
本发明由于采用了以苦参碱为模板分子制得的分子印迹材料和超声波辅助提取苦参碱，因而具有如下有益效果：1)该分子印迹材料的制备方法提升了分子印迹材料对苦参碱的专一识别选择性和结合亲和性，使得分子印迹材料对目标产物苦参碱的结合性能和吸附容量大大增加，提升目标产物苦参碱的纯度，提高目标产物的提取效率和收率，降低原料损耗率；2)本发明的加工方法提取时间短，生产效率高，能降低资源损耗和生产成本，获得的苦参碱纯度高品质好，目标产物苦参碱的纯度能达到97％以上；3)利用此目标产物制得的苦参碱的金属配合物表现出比苦参碱更高的抗肿瘤活性，以及对细胞增殖更优的抑制作用，本发明获得的苦参碱和苦参碱的金属配合物能用于制备抗肿瘤药物的组合物。
因此，本发明是一种能提升目标产物苦参碱的纯度，提高收率和提取效率，缩短提取时间，降低资源损耗和生产成本的苦参碱的加工方法，目标产物苦参碱纯度高品质好，以此目标产物苦参碱和制得的苦参碱的金属配合物能用于制备抗肿瘤药物的组合物。
附图说明
图1为不同加工方法对目标产物苦参碱的纯度和收率的影响结果示意图；
图2为不同分子印迹材料对苦参碱、氧化苦参碱和金雀花碱的等温吸附线，A-实施例1，B-对比例1，C-对比例2，D-对比例3；
图3为实施例1制得的分子印迹材料对苦参碱的解吸曲线；
图4为不同加工方法获得的提取液中生物碱的液相色谱对比图，A-实施例1，B-实施例3，C-对比例4，D-对比例5；MT-苦参碱，OMT-氧化苦参碱，OSC-氧化槐果碱，SC-槐果碱；
图5为苦参碱和苦参碱-铁配合物对人宫颈癌细胞的增殖抑制率。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
一种苦参碱的加工方法，包括：以山豆根或苦参为原料，采用超声波间歇式辅助的提取工序；和，对提取工序所得提取液的精制工序；
上述提取工序中，采用以苦参碱为模板的分子印迹材料辅助提取，并在提取完成后，对分离得到的分子印迹材料进行洗脱；
以及，将精制产物和洗脱产物进行结晶和固液分离的分离工序；
上述提取工序在不超过40℃的温度下进行。
在更具体的实施场景中，提取工序前，还包括预处理工序，具体地步骤如下：取山豆根或苦参原料清洗后，进行粉碎处理，过60-80目筛，然后向其中加入5-10倍重量、体积浓度为70-85％的乙醇溶液，浸泡0.5-1.5h，然后再进行提取。
在具体实施场景中，上述提取工序中，超声波的输出功率为300-600W，频率为20-40kHz；上述间歇式辅助操作如下：超声次数为5-10次，单次时间为2-3min，间隔时间为15-30s。
在具体实施场景中，上述提取工序中，提取媒介为体积浓度为70-85％的乙醇溶液；上述提取温度为20-40℃，提取时间为10-30min。进一步地，提取完毕后，将整个混合体系离心，上清液即为提取液，再向沉淀中加水，分离分子印迹材料和原料。具体的，分子印迹材料的用量为原料重量的0.5-1倍。
作为上述方案的改进，以含有紫罗兰酮和2,4-二氨基苯磺酸的乙醇溶液为提取媒介，乙醇溶液的体积浓度为70-85％，上述紫罗兰酮和2,4-二氨基苯磺酸的浓度分别为0.01-0.15wt％和0.01-0.1wt％。新添加的提取媒介能利用超声波产生的空化、振动作用，进一步破坏细胞壁和细胞膜结构，使得目标产物提取效率显著提升，还促使提取液中的氧化苦参碱被还原为苦参碱，虽然具体机理有待验证，但显著提高了目标产物的产量，降低提取液中氧化苦参碱的含量，也有利于提高目标产物苦参碱的纯度，所得产品苦参碱的产量高品质好，提高了生产效益和原料利用率。
在具体实施场景中，上述分子印迹材料通过以下方法制得：将苦参碱、亚甲基丁二酸溶解在3-5倍重量的氯仿-十二醇体系中，然后加入季戊四醇三丙烯酸酯、水杨羟肟酸、三甲氧基烯丙基硅烷和偶氮二异丁腈，涡旋混合10-30min形成均一体系后，通入流量为1-3L/min的氮气10-30min，然后将体系置于温度为40-50℃的密闭环境中反应1-3h，反应结束后，用体积比为9:1的甲醇:乙酸洗脱模板分子苦参碱，然后烘干，研磨，过200目筛，即得。上述氯仿-十二醇体系中氯仿和十二醇的体积比为1:1。
进一步设置为，上述苦参碱、亚甲基丁二酸、季戊四醇三丙烯酸酯、水杨羟肟酸、三甲氧基烯丙基硅烷和偶氮二异丁腈的重量份比例为0.5-2:4-10:15-35:0.01-0.03:0.01-0.05:1-3。最优选的重量份比例为：0.1:1.7:6.7:0.003:0.005:0.05。亚甲基丁二酸、季戊四醇三丙烯酸酯经引发进行接枝聚合，体系中的水杨羟肟酸和三甲氧基烯丙基硅烷可能是进一步调整了模板分子苦参碱在聚合物中的分布，使得形成的印迹空穴在尺寸、吸附位点和空间结构上能与苦参碱高度匹配，从而提升分子印迹材料对苦参碱的专一识别选择性和结合亲和性，进而使得相似结构如氧化苦参碱等物质不能被匹配，从而提升目标产物苦参碱的纯度，还能使得分子印迹材料对目标产物苦参碱的结合性能和吸附容量大大增加，提高目标产物的提取效率和收率。
在具体实施场景中，上述洗脱步骤为：将提取工序分离得到的分子印迹材料先用50-65℃的去离子水洗脱20-30min，再用15-30℃的甲醇-乙酸溶液洗脱60-75min，即可得到洗脱液。上述甲醇-乙酸溶液中，甲醇、乙酸、水的体积比为7:2:1。
在更具体的实施场景中，精制工序步骤如下：将提取液浓缩成浸膏，然后用质量浓度为11-12.5％的盐酸溶液将浸膏进行溶解，再向溶解后的液体中加入氢氧化钠溶液调节pH至中性，再向液体中加入乙醚，静置12-16h后，离心取上清液，备用。上述乙醚的用量为提取液重量的1-3倍。
在更具体的实施场景中，分离工序步骤如下：将精制所得上清液和洗脱步骤所得洗脱液混合，再加入馏程为30-60°的石油醚，静置12-16h后结晶，过滤，所得晶体即为苦参碱。上述石油醚的用量为洗脱液重量的1-3倍。
为了提升苦参碱的药理活性，克服其在实际应用床中受到的限制，本发明还提供了一种苦参碱的金属配合物，上述苦参碱由上述的加工方法制得，上述金属为铁。该苦参碱的金属配合物对肿瘤细胞的半数抑制浓度较苦参碱降低了54％，表现出比苦参碱更高的抗肿瘤活性，以及对细胞增殖更优的抑制作用，具有更优的应用价值。
本发明还提供了一种苦参碱的金属配合物的制备方法，包括：将苦参碱和氯化铁混合，然后以料液比1g:10-20mL的比例添加无水乙醇，搅拌溶解后，高温回流，然后滴加盐酸溶液至反应体系中无沉淀后，降温，静置冷却10-12h后，过滤，然后对沉淀采用无水乙醇淋洗1-2次，再用无水乙醇进行重结晶，得到呈黄色的苦参碱-铁配合物。
在具体实施场景中，上述苦参碱和氯化铁的摩尔比为1:1-1.2，盐酸溶液的浓度为1-1.2mol/L；上述高温回流的温度为80-100℃，时间为40-60min。
本发明还提供了一种用于制备抗肿瘤药物的组合物，包含苦参碱的金属配合物。
本发明及实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，在此不作详细叙述。
应当理解，前面的描述应被认为是说明性或示例性的而非限制性的，本领域普通技术人员可以在所附权利要求的范围和精神内进行改变和修改。特别地，本发明覆盖了具有来自上文和下文上述的不同实施方案的特征的任何组合的其他实施方案，而本发明的范围并不限制于在以下具体实例中。
实施例1：
一种苦参碱的加工方法，包括以下步骤：
1)将苦参碱、亚甲基丁二酸溶解在5倍重量、体积比为1:1的氯仿-十二醇体系中，然后加入季戊四醇三丙烯酸酯、水杨羟肟酸、三甲氧基烯丙基硅烷和偶氮二异丁腈，涡旋混合30min形成均一体系后，通入流量为2.5L/min的氮气20min，然后将体系置于温度为50℃的密闭环境中反应2.5h，反应结束后，用体积比为9:1的甲醇:乙酸洗脱模板分子苦参碱，然后烘干，研磨，过200目筛，即得分子印迹材料；上述苦参碱、亚甲基丁二酸、季戊四醇三丙烯酸酯、水杨羟肟酸、三甲氧基烯丙基硅烷和偶氮二异丁腈的重量份比例为0.1:1.7:6.7:0.003:0.005:0.05；
2)取苦参原料清洗后，进行粉碎处理，过80目筛，然后向其中加入8倍重量、体积浓度为85％的乙醇溶液，浸泡1h，然后再进行提取；
3)向上述浸泡液中加入原料重量1倍的分子印迹材料，形成混合体系，再将混合体系送入超声提取设备中，在超声波的输出功率为400W、频率为30kHz、提取温度为20℃的条件下，提取30min，提取完毕后，将整个混合体系离心，上清液即为提取液，再向沉淀中加水，分离分子印迹材料和原料；上述超声波的间歇式辅助操作如下：超声次数为7次，单次时间为2min，间隔时间为20s；
4)将步骤3)分离得到的分子印迹材料先用60℃的去离子水洗脱30min，去除吸附在印迹材料上的杂质，再用20℃的甲醇-乙酸溶液洗脱65min，即可得到洗脱液；上述甲醇-乙酸溶液中，甲醇、乙酸、水的体积比为7:2:1；
5)将提取液浓缩成浸膏，然后用质量浓度为12.5％的盐酸溶液将浸膏进行溶解，再向溶解后的液体中加入氢氧化钠溶液调节pH至中性，再向液体中加入提取液重量2倍的乙醚，静置12h后，离心取上清液，备用；
6)将步骤5)所得上清液和步骤4)所得洗脱液混合，再加入馏程为30-60°、洗脱液重量1.5倍的石油醚，静置16h后结晶，过滤，所得晶体即为苦参碱。
实施例2：
一种苦参碱的加工方法，与实施例1的区别仅在于：
步骤1)中，苦参碱、亚甲基丁二酸、季戊四醇三丙烯酸酯、水杨羟肟酸、三甲氧基烯丙基硅烷和偶氮二异丁腈的重量份比例为1.3:7.5:33:0.03:0.015:2.5；体系于温度为45℃的密闭环境中反应3h，制得分子印迹材料；
步骤2)中，原料选用山豆根；
步骤3)中，向浸泡液中加入原料重量0.75倍的分子印迹材料，形成混合体系，再将混合体系送入超声提取设备中，在超声波的输出功率为500W、频率为20kHz、提取温度为25℃的条件下，提取25min，上述超声波的间歇式辅助操作如下：超声次数为9次，单次时间为2min，间隔时间为30s；
步骤4)中，将步骤3)分离得到的分子印迹材料先用50℃的去离子水洗脱30min，去除吸附在印迹材料上的杂质，再用30℃的甲醇-乙酸溶液洗脱75min，即可得到洗脱液；
步骤6)中，将步骤5)所得上清液和步骤4)所得洗脱液混合，再加入馏程为30-60°、洗脱液重量1倍的石油醚，静置12h后结晶，过滤，所得晶体即为苦参碱。
实施例3：
一种苦参碱的加工方法，与实施例1的区别仅在于：
步骤2)中，取苦参原料清洗后，进行粉碎处理，过80目筛，然后向其中加入8倍重量、体积浓度为85％的乙醇溶液，浸泡1h，然后再进行提取；上述乙醇溶液中还含有浓度分别为0.011wt％和0.07wt％的紫罗兰酮和2,4-二氨基苯磺酸。
实施例4：
一种苦参碱的金属配合物的制备方法，包括以下步骤：将摩尔比为1:1.0的苦参碱和氯化铁混合，然后以料液比1g:15mL的比例添加无水乙醇，搅拌溶解后，在温度为100℃的条件下高温回流60min，然后向其中滴加浓度为1.1mol/L的盐酸溶液至反应体系中无沉淀后，降温，静置冷却12h后，过滤，然后对沉淀采用无水乙醇淋洗2次，再用无水乙醇进行重结晶，得到呈黄色的苦参碱-铁配合物；上述苦参碱为实施例1加工获得的苦参碱。
实施例5：
一种苦参碱的金属配合物的制备方法，与实施例4的区别仅在于：反应原料苦参碱和氯化铁的摩尔比为1:1.1。
实施例6：
一种苦参碱的金属配合物的制备方法，与实施例4的区别仅在于：反应原料苦参碱和氯化铁的摩尔比为1:1.2。
对比例1：
一种苦参碱的加工方法，与实施例1的区别仅在于：步骤1)中，苦参碱、亚甲基丁二酸、季戊四醇三丙烯酸酯、水杨羟肟酸和偶氮二异丁腈的重量份比例为0.1:1.7:6.7:0.003:0.05，未添加三甲氧基烯丙基硅烷。
对比例2：
一种苦参碱的加工方法，与实施例1的区别仅在于：步骤1)中，苦参碱、亚甲基丁二酸、季戊四醇三丙烯酸酯、三甲氧基烯丙基硅烷和偶氮二异丁腈的重量份比例为0.1:1.7:6.7:0.005:0.05，未添加水杨羟肟酸。
对比例3：
一种苦参碱的加工方法，与实施例1的区别仅在于：步骤1)中，苦参碱、亚甲基丁二酸、季戊四醇三丙烯酸酯和偶氮二异丁腈的重量份比例为0.1:1.7:6.7:0.05，未添加水杨羟肟酸和三甲氧基烯丙基硅烷。
对比例4：
一种苦参碱的加工方法，与实施例3的区别仅在于：步骤2)中，取苦参原料清洗后，进行粉碎处理，过80目筛，然后向其中加入8倍重量、体积浓度为85％的乙醇溶液，浸泡1h，然后再进行提取；上述乙醇溶液中还含有浓度为0.011wt％的紫罗兰酮，未添加2,4-二氨基苯磺酸。
对比例5：
一种苦参碱的加工方法，与实施例3的区别仅在于：步骤2)中，取苦参原料清洗后，进行粉碎处理，过80目筛，然后向其中加入8倍重量、体积浓度为85％的乙醇溶液，浸泡1h，然后再进行提取；上述乙醇溶液中还含有浓度为0.07wt％的2,4-二氨基苯磺酸，未添加紫罗兰酮。
实验例1：
不同加工方法对目标产物苦参碱的纯度和收率的影响
实验方法：分别取100g原料，按照实施例1-3和对比例1-5的方法加工获得苦参碱，测定目标产物苦参碱的收率和纯度。收率(％)＝目标产物的产量/原料量×100。采用HPLC法测定目标产物的纯度，具体色谱条件如下：色谱柱为Zorbax Extend-C18，流动相为pH为8.0、浓度为0.01mol/L的醋酸铵甲醇水溶液(甲醇和水的体积比为9:1)，流速为0.5mL/min，柱温为25℃，进样量为20μL，检测波长为220nm。测定结果如图1所示。
图1为不同加工方法对目标产物苦参碱的纯度和收率的影响结果示意图。实施例1和2的纯度差异不显著，收率不同则是由于原料中苦参碱的含量具有差异。对比实施例1和对比例1-3，发现实施例1的收率和纯度分别达到9.1％和97.3％，显著高于对比例1-3，对比例3的收率和纯度分别为7.4％和92.51％，说明实施例1的方法能提高目标产物的纯度和收率。对比实施例1、3和对比例4、5，发现实施例3的收率和纯度分别达到13.2％和98.87％，显著高于实施例1，说明实施例3的方法显著提高了目标产物的产量和收率，降低提取液中氧化苦参碱的含量，也有利于提高目标产物苦参碱的纯度，所得产品苦参碱的产量高品质好，提高了生产效益和原料利用率。
实验例2：
分子印迹材料的吸附性能测试
1)选择性和吸附容量测试：分别取实施例1和对比例1-3中制备得到的分子印迹材料为实验样品，分别对水介质中的苦参碱、氧化苦参碱及金雀花碱进行了等温吸附实验。具体过程为：室温下，分别配制浓度系列变为0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g/L的苦参碱溶液、氧化苦参碱溶液和金雀花碱溶液，并分别加入准确称取的质量为4.0g的分子印迹材料，在25℃的恒温振荡器中恒温振荡4h，使吸附达到平衡，静置分离，通过分光光度计测定上清液中苦参碱、氧化苦参碱和金雀花碱的平衡浓度，计算苦参碱、氧化苦参碱和金雀花碱的平衡吸附量Qe(mg/g)，平行测定3次取平均值，绘制吸附等温线。如图2所示。
图2为不同分子印迹材料对苦参碱、氧化苦参碱和金雀花碱的等温吸附线，A-实施例1，B-对比例1，C-对比例2，D-对比例3。结果显示，实施例1的分子印迹材料，随着苦参碱、氧化苦参碱和金雀花碱的浓度不断增加，苦参碱的最大吸附量为73.92mg/g，氧化苦参碱和金雀花碱的最大吸附量分别为14.68mg/g和3.24mg/g。对比例3的分子印迹材料的结果显示，苦参碱的最大吸附量为56.21mg/g，氧化苦参碱和金雀花碱的最大吸附量分别为45.62mg/g和37.67mg/g。对比例1和对比例3的结果差异不显著；对比例2的结果显示，苦参碱的最大吸附量为59.83mg/g，氧化苦参碱和金雀花碱的最大吸附量分别为51.89mg/g和39.65mg/g，吸附量均略有增长。
对比各组结果发现，对比例1-3的分子印迹材料对三种生物碱都具有较高的吸附容量，且吸附没有表现出明显的选择性。实施例1的分子印迹材料对金雀花碱基本不识别也不吸附；对氧化苦参碱的吸附容量也显著降低，具有一定的选择性吸附能力；对苦参碱表现出优异的识别选择性，其对苦参碱的结合性能和吸附容量还大大增加。综合说明，实施例1中制备分子印迹材料的方法能协同提升分子印迹材料对苦参碱的专一识别选择性和结合亲和性，进而使得相似结构如氧化苦参碱等物质不能被匹配，对目标产物苦参碱的结合性能和吸附容量大大增加，在利用该材料进行提取时，将提取液中的苦参碱吸附，有利于提升目标产物苦参碱的纯度，还能利用提取液中苦参碱浓度的变化，提高目标产物的提取效率和收率。
2)解吸实验：取实施例1中制备得到的分子印迹材料为实验样品，选用甲醇:乙酸:水溶液(体积比为7:2:1)作为解吸液，量取10mL浓度为30mg/L的苦参碱溶液置于5个20mL不同的锥形瓶中，分别加入30mg分子印迹材料，振荡200min，4000r/min离心10min，静置10min后，移取上清液通过分光光度计测量溶液中的苦参碱的浓度，得到吸附量，弃上清液；向分子印迹材料中加入10mL洗脱液，测定不同时间段解吸液中苦参碱的浓度，得到洗脱量，平行测定3次取平均值，计算解吸率，绘制解吸曲线。解吸率(％)＝洗脱量/吸附量×100。如图3所示。
图3为实施例1制得的分子印迹材料对苦参碱的解吸曲线。结果显示，在60min前，解吸速度较快，在60min后，解吸速度变缓，并逐渐达到平衡。在120min的解吸实验中，分子印迹材料的解吸率能达到98.7％，说明该材料解吸效果优异，具有优良的再生与循环使用性能。
实验例3：
不同加工方法对提取液中生物碱的影响
实验方法：分别按照实施例1、3和对比例4、5的方法加工获得苦参碱，均以提取步骤获得的提取液为实验样品，测定其中苦参碱(MT)、氧化苦参碱(OMT)、氧化槐果碱(OSC)及槐果碱(SC)的含量。仪器及色谱条件为：岛津LC-20A，LC-20AT泵，SPD-20A检测器，SIL-20进样器；LCsoluton色谱工作站；KQ5200B型超声清洗器；甲醇:乙腈:乙醇:0.1％磷酸溶液的体积比为42:36:10:12；色谱柱：GL Sciences Inertsil ODS-SP 5μm 4.6×250mm。结果如图4所示。
图4为不同加工方法获得的提取液中生物碱的液相色谱对比图，A-实施例1，B-实施例3，C-对比例4，D-对比例5；MT-苦参碱，OMT-氧化苦参碱，OSC-氧化槐果碱，SC-槐果碱。结果显示，实施例1和对比例4、5的提取液中均含有苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱和槐果碱，而实施例3的提取液中氧化苦参碱含量显著降低，可能是实施例3的加工方法能协同促使提取液中的氧化苦参碱被还原为苦参碱，有利于提高目标产物的产量，也提高了生产效益和原料利用率。
实验例4：
苦参碱和苦参碱-铁配合物的抗肿瘤细胞活性实验
实验方法：分别取实施例1-6和对比例3的方法加工获得的苦参碱为实验样品。细胞培养：供试的人宫颈癌细胞Hela229，以MEM基础培养基加10％胎牛血清，在5％二氧化碳、37℃及适当湿度的细胞培养箱常规培养。MTT检测细胞活力：选择状态良好的细胞，调整细胞悬液密度至1×105个/mL，以每孔100μL接种到96孔板中，接种24h后，分别加药处理，设置不同浓度序列的药物(1.5、3、4.5、6、7.5、9mM)，培养72h后，向对应的孔，以每孔10μL加入MTT溶液，期间注意避光，于培养箱培养4h后弃去培养液，以每孔150μL加DMSO，室温下轻轻震荡是蓝紫色结晶甲瓒完全溶解，约15min；将96孔放到酶标仪中，设定波长为570mm，测定并记录对应孔的吸光度(OD值)。细胞抑制率(％)＝(1-OD实验组/OD对照组)×100％。以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图，可得到剂量反应图，根据线性回归方程求出该药物对细胞生长抑制率为50％的浓度即半数抑制浓度IC50。结果如图5所示。
图5为苦参碱和苦参碱-铁配合物对人宫颈癌细胞的增殖抑制率。结果显示，实施例1-3和对比例3间抑制率差异不显著，实施例4-6间抑制率差异不显著。对比实施例1、3和对比例3，说明实施例1和实施例3的方法不影响苦参碱的抗肿瘤细胞活性。在相同浓度时，实施例4-6的抑制率明显高于实施例1-3，且计算得各组的半数抑制浓度IC50如下：实施例1为1.124mM，实施例2为1.124mM，实施例3为1.125mM，实施例4为0.657mM，实施例5为0.647mM，实施例6为0.641M，对比例3为1.124mM，均表现出较强的抑制宫颈癌肿瘤细胞的活性；该苦参碱的金属配合物对肿瘤细胞的半数抑制浓度较苦参碱降低了46.6％，表现出比苦参碱更高的抗肿瘤活性，以及对细胞增殖更优的抑制作用，具有更优的应用价值。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (2)

1.一种苦参碱的加工方法，包括：以山豆根或苦参为原料，采用超声波间歇式辅助的提取工序；和，对提取工序所得提取液的精制工序；
所述提取工序中，采用以苦参碱为模板的分子印迹材料辅助提取，并在提取完成后，对分离得到的分子印迹材料进行洗脱；
所述洗脱步骤为：将提取工序分离得到的分子印迹材料先用50-65℃的去离子水洗脱20-30min，再用15-30℃的甲醇-乙酸溶液洗脱60-75min，即可得到洗脱液；所述甲醇-乙酸溶液中，甲醇、乙酸、水的体积比为7:2:1；
以及，将精制产物和洗脱产物进行结晶和固液分离的分离工序；
所述提取工序在不超过40℃的温度下进行；
所述提取工序中，提取媒介为体积浓度为70-85％的乙醇溶液；所述提取温度为20-40℃，提取时间为10-30min；所述乙醇溶液中包含0.01-0.15wt％的紫罗兰酮和0.01-0.1wt％的2,4-二氨基苯磺酸；
所述分子印迹材料通过以下方法制得：将苦参碱、亚甲基丁二酸溶解在氯仿-十二醇体系中，然后加入季戊四醇三丙烯酸酯、水杨羟肟酸、三甲氧基烯丙基硅烷和偶氮二异丁腈，涡旋混合形成均一体系后，通入氮气10-30min，然后将体系置于温度为40-50℃的密闭环境中反应1-3h，反应结束后，用体积比为9:1的甲醇:乙酸洗脱模板分子苦参碱，然后烘干，研磨，过200目筛，即得；所述苦参碱、亚甲基丁二酸、季戊四醇三丙烯酸酯、水杨羟肟酸、三甲氧基烯丙基硅烷和偶氮二异丁腈的重量份比例为0.5-2:4-10:15-35:0.01-0.03:0.01-0.05:1-3；
所述精制工序步骤如下：将提取液浓缩成浸膏，然后用质量浓度为11-12.5％的盐酸溶液将浸膏进行溶解，再向溶解后的液体中加入氢氧化钠溶液调节pH至中性，再向液体中加入乙醚，静置12-16h后，离心取上清液，备用；所述乙醚的用量为提取液重量的1-3倍。
2.根据权利要求1所述的一种苦参碱的加工方法，其特征是：所述提取工序中，超声波的输出功率为300-600W，频率为20-40kHz；所述间歇式辅助操作如下：超声次数为5-10次，单次时间为2-3min，间隔时间为15-30s。
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