CN101606976B

CN101606976B - 原位转化-吸附分离技术联用制备汉防己总生物碱的方法

Info

Publication number: CN101606976B
Application number: CN2009100696125A
Authority: CN
Inventors: 王春红; 施荣富; 麻宁; 夏建军
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2009-07-06
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2029-07-06
Also published as: CN101606976A

Abstract

原位转化-吸附分离技术联用制备汉防己总生物碱的方法，制备过程为：1)将汉防己原药材粉碎，用乙醇水溶液浸泡，保温，搅拌。过滤，滤液经减压蒸馏，回收乙醇，加入乙酸水溶液，过滤，用氨水将滤液pH调节为10～12之间，有沉淀析出，将沉淀溶乙酸水溶液中，离心，收集上清液，简称为吸附溶液；2)将3～5倍床体积的上述吸附溶液通过树脂柱，吸附完成后，树脂床层用大量去离子水清洗，接着用氨水通过树脂柱等步骤得汉防己总生物碱提取物。制备过程中不使用有毒有害溶剂，且其他溶剂也消耗极少，同时树脂无需每次提取周期后的酸碱再生，大大简化操作工艺，并重复使用，节省大量资源，提取效率高，适于工业化大规模生产。制备的汉防己总生物碱纯度高于70％，收率高于95％。

Description

原位转化-吸附分离技术联用制备汉防己总生物碱的方法

【技术领域】：

本发明涉及中药有效成分的提取和分离技术领域，特别是原位转化-吸附分离技术联用制备汉防己总生物碱的方法。

【背景技术】：

汉防己为防己科千金藤属植物粉防己Stephania tetrandra S.Moore的根，在我国有悠久的临床用药历史，其中主要的活性成分为生物碱，如汉防己碱(又称汉防己甲素，tetrandrine)、防己诺林碱(又称汉防己乙素，demethyltetrandrine)、甲基粉防己碱、二小檗胺、轮环藤酚碱等。其中，汉防己甲素和汉防己乙素含量最高，也是汉防己中主要的药效成分。

千金藤属植物在我国民间早有抗癌的说法。其中汉防己甲素具有对肝纤维化的防治作用，此外，还对高血压、心绞痛、眼科疾病等具有很明显的治疗作用(戈升荣，崔岚，王平全，汉防己甲素药理作用的研究进展，中草药，31(8)：附4～附6,2000)。同时，汉防己甲素是临床治疗矽肺病的首选药物。此外，汉防己总生物碱具有很好的镇痛效果，有研究认为汉防己总碱的镇痛效力是吗啡的13％，且有消炎、抗过敏及松弛肌肉等作用，可用于癌症放化疗后的辅助镇痛药，也可用作治疗戒毒过程中的头痛、腹痛、四肢关节痛、周身疼痛等症状(胡皓，汉防己治疗毒品戒断中诸痛，JTCM，45(11)：816，2004)。

随着细胞分离技术及分子生物学研究的长足发展，药理研究已逐渐深入到细胞、亚细胞及分子水平，现代的药理研究也证明汉防己甲素是天然的非选择性钙通道阻滞剂，又是钙调蛋白的天然拮抗剂，影响Ca²⁺跨膜转运及在细胞内的分布利用(徐永红，边城，李定国，蒋祖明，陆汉明，汉防己甲素对成纤维细胞游离Ca²⁺浓度影响的机制探讨，胃肠病学和肝血杂志，12(5)：422～423，2003)，因此，汉防己生物碱具有更广泛的药理作用和临床应用前景，在抗肝细胞纤维化、缺氧性肺动脉高压的防治、特别是逆转肿瘤化疗多药耐药性方面引起了人们的高度重视(刘正，金京顺，张华芳，刘锡玖，汉防己乙素抗肝缺血再灌注损伤，基础医学与临床，26(11)：1262～1263，2006)。

目前，成熟应用于大规模工业化生产制备汉防己总生物碱的方法仍以溶剂萃取为主，主要步骤包括原药材粉粹后经醇提、浓缩、调酸、氯仿脱脂、调碱、氯仿、苯等有机溶剂萃取、活性炭脱色、过滤、乙醚、苯、丙酮等重结晶、回收溶剂等步骤分离得到粗总碱(黄浔阳，从粉防己植物中提取汉防己甲素，中成药研究，3：36-37，1980)。该方法存在以下主要问题：1)提取中多数工艺需要在开放环境中大量使用强毒性的溶剂苯、氯仿等，对操作人员和环境的危害很大；2)活性炭脱色时样品损失较多；3)方法复杂，可操作性差，生产成本较高。富力等为了改善提取过程中使用强度性溶剂苯的缺陷，开发了一个不含苯的提取方法，申请了中国发明专利(富力，不含苯的汉防己甲素及其制备方法，中国发明专利，CN 1850824A)，但是该方法仍然无法避免步骤繁杂，难以连续化生产的缺陷。近年来，树脂吸附法在天然产物的提取分离方面显示了独特的优越性，与常用的溶剂萃取法相比，工艺设备简单，投资较少，提取收率较高，生产成本可大大降低，同时，该方法使用溶剂较少，常常只用水和乙醇，且大部分乙醇可以回收，属于环境友好工艺，在技术水平上有很强的竞争力。王明奎等公开了一种利用离子交换树脂制备高纯度汉防己生物碱的方法(王明奎，崔文峰，鲍玲，李甫，粉防己生物碱的制备工艺，中国发明专利，CN 101288695A)，但是该方法中使用的离子交换树脂D72，需要在每个工艺流程完成后均需用酸碱反复处理，使其再生后，才能用于下一个使用周期，这势必带来工艺操作的复杂，特别是大量含酸、含碱废水的产生，使得树脂的优势有所丧失。更为重要的是，由于离子交换树脂D72结构特点的限制，如聚苯乙烯的强疏水性骨架、功能基含量较低、树脂比表面积较小等，都会带来树脂处理量的降低和吸附选择性的变差，所以，在公开的专利方法中，在经过树脂提取后，得到汉防己粗碱，仍需丙酮、冷苯等萃取、重结晶，才能得到高纯度的汉防己总生物碱。

基于以上的分析，我们期望利用大孔吸附树脂处理量大、使用方便、无需每个提取周期都要再生的优点，只经“吸附-梯度洗脱”一步连续工艺制备高纯度汉防己总生物碱。但是，大孔树脂吸附选择性较差是本方法亟待解决的问题，为此，我们针对汉防己生物碱分子结构的特点，利用它们在不同酸碱条件下分子结构不同、因而分子极性不同的特点，在吸附完成后，于树脂柱上在碱性条件下原位转化成分子状态以实现其强的保留能力，远强于其他杂质与树脂的结合力，使得我们有可能利用梯度解吸的方法将杂质和汉防己生物碱分离，制备高纯度提取物。原位转化与树脂吸附方法联用，在不破坏提取工艺连续性的前提下，大大提高了树脂的吸附选择性，在分离工艺上有明显的技术优势。

【发明内容】

本发明是为了克服现有分离纯化工艺的不足，提供了一种“原位转化-吸附分离”联用技术制备高纯度汉防己总生物碱的工艺方法，提取过程为：

1.原药材的提取与上柱液的制备

将市售汉防己原药材粉碎，用一定比例的乙醇水溶液(80％～95％，v％)浸泡，溶剂体积与药材重量比为3∶1～4∶1(mL∶g)，保温40～60℃，搅拌2～3h。过滤后，将残渣在同样的条件下再次提取2～5次。将多次提取的滤液合并，经减压蒸馏，回收乙醇后，加入含有3～8％(v％)的乙酸水溶液，保持其体积与药材重量比仍为3∶1～4∶1(mL∶g)，过滤，用氨水将滤液pH调节为10～12之间，有沉淀析出，将沉淀溶于3～8％(v％)的乙酸水溶液中，离心，收集上清液，这一步骤过滤了大量的杂质，溶液将用于下一步的树脂纯化，简称为吸附溶液。

2.原位转化-大孔树脂吸附法联用纯化汉防己总生物碱

所用的树脂是商品化大孔吸附树脂(牌号为X-5，购于天津南开和成科技有限公司)。将X-5树脂装入交换柱中(径长比为1∶10～1∶20)，将3～5倍床体积的上述吸附溶液以1～3BV/h的速度通过树脂柱，吸附完成后，树脂床层用大量去离子水清洗，接着用2～4BV的3％～8％(w％)氨水通过树脂柱。依次用2～3BV的50％～65％(v％)乙醇水溶液、2～5BV的75％～90％(v％)乙醇水溶液(含有体积百分数为3～8％的乙酸)梯度洗脱，收集最后一步的洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇后，溶液中加氨水至pH为10～12，出现土白色沉淀，将沉淀滤出，干燥，即得汉防己总生物碱提取物。

步骤1)中，将汉防己原药材粉碎，用体积百分含量为80％～95％的乙醇水溶液浸泡，优选的溶剂体积与药材重量比为3∶1，溶剂体积以mL计，药材重量以g计。

步骤1)中，过滤后，将残渣在同样的条件下再次提取2～5次；将多次提取的滤液合并，经减压蒸馏，回收乙醇后，加入体积百分含量为3％～8％的乙酸水溶液，所述的体积与药材重量比为3∶1～4∶1，溶剂体积以mL计，药材重量以g计。

【本发明的优点和积极效果】

本发明旨在建立汉防己原药材中高纯度总生物碱的制备工艺，该工艺利用汉防己生物碱分子结构的特点，在不同酸碱条件下处于不同的分子状态，因而在树脂上的保留强度不同，为此，我们将原位转化和吸附分离技术有机的结合，在不破坏树脂对生物碱吸附的前提下，用碱性淋洗剂将总生物碱在树脂上原位转化成分子态，大大提高了总生物碱在非极性树脂上的保留能力，使选择性大大提高，所建立的高纯度汉防己总生物碱制备工艺具有明显的技术优势，制备过程中不使用有毒有害溶剂，且其他溶剂也消耗极少，同时树脂无需每次提取周期后的酸碱再生，大大简化操作工艺，并重复使用，节省大量资源，提取效率高，适于工业化大规模生产。制备的汉防己总生物碱纯度高于70％，收率高于95％。

【具体实施方式】：

实施例1：

将25g市售汉防己原药材粉碎，用75mL 80％(v％)乙醇溶液在45℃下保温并搅拌2.5h，相同条件提取4次。将4次的滤液合并，经减压蒸馏，回收乙醇后，加入含有5％(v％)的乙酸水溶液至溶液体积为75mL，过滤，用氨水将滤液pH调为10后，有沉淀析出，将沉淀溶于5％(v％)的乙酸水溶液中，离心，收集上清液，即为吸附溶液(其中，汉防己总碱含量为31.6％，w％)。

X-5树脂装柱(柱径为17mm，柱长为190mm，树脂体积25mL)，将75mL上述吸附溶液以1BV/h的速度通过树脂柱，吸附完成后，树脂床层用大量去离子水清洗，接着用2BV的5％(w％)氨水、3BV的50％(v％)乙醇水溶液、3BV的90％(v％)乙醇水溶液(含有体积百分数为5％的乙酸)依次淋洗树脂柱，收集最后一步的淋洗液，减压蒸馏，回收乙醇后，溶液中加氨水至pH为10，出现土白色沉淀，将沉淀滤出，干燥，即得汉防己总生物碱提取物，其中汉防己总生物碱的纯度为70.8％(w％)，回收率为96.9％(w％)。

实施例2：

将133g市售汉防己原药材粉碎，用400mL85％(v％)乙醇溶液在50℃下保温并搅拌2h，相同条件提取3次。将3次的滤液合并，经减压蒸馏，回收乙醇后，加入含有4％(v％)的乙酸水溶液至溶液体积为400mL，过滤，用氨水将滤液pH调为12后，有沉淀析出，将沉淀溶于6％(v％)的乙酸水溶液中，离心，收集上清液，即为吸附溶液(其中，汉防己总碱含量为33.2％，w％)。

X-5树脂装柱(柱径为20mm，柱长为350cm，树脂体积为100mL)，将400mL上述吸附溶液以2BV/h的速度通过树脂柱，吸附完成后，树脂床层用大量去离子水清洗，接着用2BV的7％(w％)氨水、2BV的55％(v％)乙醇水溶液、5BV的80％(v％)乙醇水溶液(含有体积百分数为3％的乙酸)依次淋洗树脂柱，收集最后一步的淋洗液，减压蒸馏，回收乙醇后，溶液中加氨水至pH为12，出现土白色沉淀，将沉淀滤出，干燥，即得汉防己总生物碱提取物，其中汉防己总生物碱的纯度为72.8％(w％)，回收率为96.3％(w％)。

实施例3：

将500g市售汉防己原药材粉碎，用2000mL90％(v％)乙醇水在60℃下保温并搅拌3h，相同条件提取5次。将5次的滤液合并，经减压蒸馏，回收乙醇后，加入含有6％(v％)的乙酸水溶液至溶液体积为1500mL，过滤，用氨水将滤液pH调为10后，有沉淀析出，将沉淀溶于8％(v％)的乙酸水溶液中，离心，收集上清液，即为吸附溶液(其中，汉防己总碱含量为30.4％，w％)。

X-5树脂装柱(柱径为55mm，柱长为60cm，树脂体积为500mL)，将1500mL上述吸附溶液以3BV/h的速度通过树脂柱，吸附完成后，树脂床层用大量去离子水清洗，接着用4BV的6％(w％)氨水、2BV的60％(v％)乙醇水溶液、4BV的80％(v％)乙醇水溶液(含有体积百分数为5％的乙酸)依次淋洗树脂柱，收集最后一步的淋洗液，减压蒸馏，回收乙醇后，溶液中加氨水至pH为11，出现土白色沉淀，将沉淀滤出，干燥，即得汉防己总生物碱提取物，其中汉防己总生物碱的纯度为73.4％(w％)，回收率为95.4％(w％)。

实施例4：

将100g市售汉防己原药材粉碎，用350mL95％(v％)乙醇水在50℃下保温并搅拌3h，相同条件提取2次。将2次的滤液合并，经减压蒸馏，回收乙醇后，加入含有5％(v％)的乙酸水溶液至溶液体积为300mL，过滤，用氨水将滤液pH调为12后，有沉淀析出，将沉淀溶于4％(v％)的乙酸水溶液中，离心，收集上清液，即为吸附溶液(其中，汉防己总碱含量为32.4％，w％)。

X-5树脂装柱(柱径为15mm，柱长为250mm，树脂体积为50mL)，将300mL上述吸附溶液以5BV/h的速度通过树脂柱，吸附完成后，树脂床层用大量去离子水清洗，接着用3BV的7％(w％)氨水、4BV的60％(v％)乙醇水溶液、5BV的75％(v％)乙醇水溶液(含有体积百分数为7％的乙酸)依次淋洗树脂柱，收集最后一步的淋洗液，减压蒸馏，回收乙醇后，溶液中加氨水至pH为10，出现土白色沉淀，将沉淀滤出，干燥，即得汉防己总生物碱提取物，其中汉防己总生物碱的纯度为74.8％(w％)，回收率为98.6％(w％)。

实施例5：

将266g市售汉防己原药材粉碎，用800mL80％(v％)乙醇水在45℃下保温并搅拌3h，相同条件提取3次。将3次的滤液合并，经减压蒸馏，回收乙醇后，加入含有7％(v％)的乙酸水溶液至溶液体积为800mL，过滤，用氨水将滤液pH调为10后，有沉淀析出，将沉淀溶于5％(v％)的乙酸水溶液中，离心，收集上清液，即为吸附溶液(其中，汉防己总碱含量为30.3％，w％)。

X-5树脂装柱(柱径为20mm，柱长为300mm，树脂体积为200ml)，将800mL上述吸附溶液以3BV/h的速度通过树脂柱，吸附完成后，树脂床层用大量去离子水清洗，接着用2BV的5％(w％)氨水、3BV的50％(v％)乙醇水溶液、3BV的85％(v％)乙醇水溶液(含有体积百分数为5％的乙酸)依次淋洗树脂柱，收集最后一步的淋洗液，减压蒸馏，回收乙醇后，溶液中加氨水至pH为12，出现土白色沉淀，将沉淀滤出，干燥，即得汉防己总生物碱提取物，其中汉防己总生物碱的纯度为71.8％(w％)，回收率为97.9％(w％)。

Claims

1.一种原位转化-吸附分离技术联用制备汉防己总生物碱的方法，包括以下步骤：

1)原药材的提取与上柱液的制备

将市售汉防己原药材粉碎，用体积百分含量为80％～95％的乙醇水溶液浸泡，溶剂体积与药材重量比为3∶1～4∶1，溶剂体积以mL计，药材重量以g计，保温40～60℃，搅拌2～3h；

过滤后，将残渣在同样的条件下再次提取2～5次；将多次提取的滤液合并，经减压蒸馏，回收乙醇后，加入体积百分含量为3％～8％的乙酸水溶液，保持其体积与药材重量比，溶剂体积以mL计，药材重量以g计；

过滤，用氨水将滤液pH调节为10～12之间，有沉淀析出，将沉淀溶于体积百分含量为3％～8％的乙酸水溶液中，离心，收集上清液，简称为吸附溶液；

2)原位转化-大孔树脂吸附法联用纯化汉防己总生物碱

所用的树脂是商品化大孔吸附树脂，将X-5树脂装入交换柱中，交换柱径长比为1∶10～1∶20，将3～5倍于树脂床体积的上述吸附溶液以1～3BV/h的速度通过树脂柱，吸附完成后，树脂床层用大量去离子水清洗，接着用2～4BV的重量百分比3％～8％氨水通过树脂柱；

依次用2～3BV的体积百分比50％～65％的乙醇水溶液、2～5BV的体积百分比75％～90％的乙醇水溶液，后者的乙醇水溶液含有体积百分数为3～8％的乙酸溶液，梯度洗脱，收集最后一步的洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇后，溶液中加氨水至pH为10～12，出现土白色沉淀，将沉淀滤出，干燥，即得汉防己总生物碱提取物。

2.如权利要求1所述的原位转化-吸附分离技术联用制备汉防己总生物碱的方法，其特征在于，步骤1)中，将汉防己原药材粉碎，用体积百分含量为80％～95％的乙醇水溶液浸泡，所述的溶剂体积与药材重量比为3∶1，溶剂体积以mL计，药材重量以g计。

3.如权利要求1所述的原位转化-吸附分离技术联用制备汉防己总生物碱的方法，其特征在于，步骤1)中，过滤后，将残渣在同样的条件下再次提取2～5次；将多次提取的滤液合并，经减压蒸馏，回收乙醇后，加入体积百分含量为3％～8％的乙酸水溶液，所述的体积与药材重量比为3∶1～4∶1，溶剂体积以mL计，药材重量以g计。